DE69934694T2

DE69934694T2 - Bpc-1: ein ausgeschiedenes gehirnspezifisches protein das von prostata- und blasen-krebszellen exprimiert und ausgeschieden wird

Info

Publication number: DE69934694T2
Application number: DE69934694T
Authority: DE
Inventors: E. Daniel AFAR; S. Rene Los Angeles HUBERT; Kahan Playa Del Rey LEONG; B. Arthur Los Angeles RAITANO; C. Douglas Los Angeles SAFFRAN; Aya Beverly Hills JAKOBOVITS
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: CA2338982A1; EP1104462B1; US20050148012A1; JP2002522076A; US7785811B2; AU5556199A; WO2000009691A2; ATE350474T1; DE69934694D1; WO2000009691A9; CA2338982C; US8003758B2; US20100168027A1; US20020161212A1; JP4282906B2; EP1104462A2; IL141061A0; US6277972B1; AU756452B2; JP4637055B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die hierin beschriebene Erfindung betrifft ein neues Gen und sein codiertes sekretiertes Tumorantigen, bezeichnet als BPC-1, als auch diagnostische und therapeutische Methoden und Zusammensetzungen, die in der Behandlung verschiedener Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, was insbesondere Prostatakrebs und Blasenkrebs umfasst, nützlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs stellt die zweithäufigste Todesursache beim Menschen nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar. Weltweit sterben jedes Jahr Millionen von Menschen an Krebs. Alleine in den Vereinigten Staaten ist Krebs die Todesursache bei weit über einer halben Million Menschen pro Jahr, wobei jährlich etwa 1,4 Millionen neue Fälle diagnostiziert werden. Zwar sind die Sterberaten durch Herzerkrankungen beträchtlich zurückgegangen, doch sind die durch Krebs bedingten allgemein ansteigend. Für den ersten Teil des kommenden Jahrhunderts wird Krebs als Todesursache Nummer Eins prognostiziert.
Weltweit tun sich mehrere Krebsarten als häufigste Todesursachen besonders hervor. Insbesondere stellen Karzinome von Lunge, Prostata, Brust, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse und Eierstock die Hauptursachen des Krebstodes dar. Diese und nahezu alle anderen Karzinome teilen ein gemeinsames todbringendes Merkmal. Mit sehr wenigen Ausnahmen ist eine von einem Karzinom ausgehende metastatische Erkrankung tödlich. Darüber hinaus hat selbst bei jenen Krebspatienten, die ihren Primärkrebs ursprünglich überlebt haben, die übliche Erfahrung gezeigt, dass sie eine enorme Lebensveränderung erfahren. Viele Krebspatienten erleben starke Ängste, angetrieben durch das Bewusstsein über ein potenzielles Wiederauftreten oder ein Behandlungsversagen. Viele Krebspatienten erleben nach der Behandlung eine physische Schwächung. Bei vielen Krebspatienten erfolgt ein Rückfall.
Allgemein gesprochen stellt das fundamentale Problem in der Behandlung der tödlichsten Krebsformen das Fehlen wirksamer und nicht-toxischer systemischer Therapien dar. Die Molekularmedizin, die noch sehr in ihren Kinderschuhen steckt, verspricht, die Wege neu zu definieren, auf denen diese Krebsarten behandelt werden. Ohne Frage werden weltweit intensive Anstrengungen unternommen, die sich auf die Entwicklung neuer molekularer Ansätze der Krebsdiagnose und -behandlung richten. Zum Beispiel besteht ein starkes Interesse an der Identifizierung der tatsächlich Tumor-spezifischen Gene und Proteine, die als diagnostische und prognostische Marker und/oder therapeutische Ziele oder Agenzien eingesetzt werden könnten. Die Forschungsanstrengungen in diesen Bereichen sind ermutigend, und die zunehmende Verfügbarkeit nützlicher Molekulartechnologien hat den Erwerb bedeutsamer Erkenntnisse über Krebs beschleunigt. Nichtsdestotrotz sind die Fortschritte langsam und generell holprig.
Wie oben erörtert, dient die Behandlung von Prostatakrebs als ein gutes Beispiel des begrenzten Umfangs, in dem die Molekularbiologie in einen tatsächlichen Fortschritt in der klinischen Anwendung übersetzt worden ist. Mit beschränkten Ausnahmen ist die Situation bei den anderen, oben erwähnten wichtigsten Karzinomarten mehr oder weniger dieselbe.
Weltweit ist Prostatakrebs die vierthäufigste Krebsart bei Männern. In Nordamerika und Nordeuropa ist sie die mit Abstand häufigste Krebsart beim Mann und stellt die zweithäufigste Ursache für Krebstod bei Männern dar. Allein in den Vereinigten Staaten sterben jährlich weit über 40.000 Männer an dieser Krankheit – an zweiter Stelle lediglich nach Lungenkrebs. Trotz der Größe dieser Zahlen gibt es noch immer keine wirksame Behandlung für metastatischen Prostatakrebs. Die Festlegung auf eine operative Prostatektomie, Bestrahlungstherapie, Hormonablationstherapie und Chemotherapie als den hauptsächlichen Behandlungsmodalitäten bleibt bestehen. Ungünstigerweise sind diese Behandlungsformen für viele unwirksam und sind oftmals mit beträchtlichen unerwünschten Konsequenzen verbunden.
An der diagnostischen Front bleibt das Fehlen eines Prostata-Tumormarkers, der lokalisierte Tumoren im Frühstadium akkurat nachweisen kann, eine beträchtliche Beschränkung in der Behandlung dieser Krankheit. Obschon der Serum-PSA-Assay sich als ein sehr nützliches Werkzeug erwiesen hat, wird seine Spezifität und allgemeine Nützlichkeit weithin als in mehreren wichtigen Hinsichten mangelhaft erachtet, wie unten weiter erörtert. Die meisten Prostatakrebsarten treten anfänglich in der peripheren Zone der Prostatadrüse, entfernt von der Harnröhre, auf. Tumoren innerhalb dieser Zone erzeugen möglicherweise keinerlei Symptome, weshalb die meisten Männer mit einem Prostatakrebs im Frühstadium keine klinischen Symptome der Erkrankung aufweisen werden, bis dieser nicht beträchtlich vorangeschritten ist. Das Fortentwicklung des Tumors in die Übergangszone der Prostata kann zu einem Harnröhrenverschluss führen, was die ersten Symptome der Erkrankung erzeugt. Allerdings sind diese klinischen Symptome nicht unterscheidbar von dem verbreiteten nicht-malignen Zustand einer benignen prostatischen Hyperplasie (BPH). Der frühe Nachweis und die Diagnose von Prostatakrebs beruhen derzeit auf Rektaluntersuchungen mit dem Finger (digital rectal examination – DRE), Prostata-spezifischen Antigen-(PSA)-Messungen, der transrektalen Ultrasonographie (TRUS) und der transrektalen Nadelbiopsie (TRNB). Derzeit stellen die Serum-PSA-Messung in Kombination mit DRE die hauptsächlich für den Nachweis und die Diagnose von Prostatakrebs angewandten Mittel dar. Beide weisen wesentliche Begrenzungen auf, die intensive Forschungsbestrebungen in Gang gesetzt haben, um bessere diagnostische Marker für diese Erkrankung zu finden.
Entsprechend gibt es keinen verfügbaren Marker, der das Auftreten des typischerweise tödlichen metastatischen Stadiums des Prostatakrebs vorhersagen kann. Die Diagnose des metastatischen Stadiums wird derzeit durch offene chirurgische oder laparoskopische Beckenlymphadenektomie, Ganzkörper-Radionuklid-Scans, Skelettradiographie und/oder Knochenläsions-Biopsieanalyse vorgenommen. Eindeutig bieten eine bessere Bildgebung und andere weniger invasive diagnostische Methoden das Versprechen, die Erschwernisse für den Patienten durch diese Prozeduren zu mildern, als auch die diagnostische Akkuratheit zu verbessern und therapeutische Optionen zu eröffnen. Ein ähnliches Problem liegt im Fehlen eines effektiven pro gnostischen Markers, um zu bestimmen, welche Krebsarten indolent sind und welche aggressiv sind oder sein werden. PSA beispielsweise versagt darin, akkurat zwischen indolenten und aggressiven Krebsarten zu unterscheiden. Bis es nicht Prostata-Tumormarker gibt, die zur zuverlässigen Identifizierung der Erkrankung im Frühstadium, Vorhersage der Anfälligkeit für Metastasen und präzisen Abbildung der Tumoren in der Lage sind, wird die Behandlung von Prostatakrebs weiterhin extrem schwierig bleiben.
PSA stellt derzeit den am breitesten eingesetzten Tumormarker für das Screening, die Diagnose und die Überwachung von Prostatakrebs dar. Insbesondere sind mehrere Immunoassays für den Nachweis des Serum-PSA in weit verbreiterer klinischer Anwendung. Vor kurzem ist ein Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions-(RT-PCR)-Assay für PSA mRNA in Serum entwickelt worden. PSA ist jedoch nicht ein Krankheits-spezifischer Marker, da erhöhte Mengen an PSA bei einem großen Prozentsatz an Patienten mit BPH und Prostatitis nachweisbar sind (25 bis 86%) (Gao et al., 1997, Prostate 31: 264–281), als auch bei anderen nicht-malignen Störungen und bei einigen gesunden Männern, ein Faktor, der die diagnostische Spezifität dieses Markers wesentlich begrenzt. Zum Beispiel werden Erhöhungen des Serum-PSA von zwischen 4 und 10 ng/ml bei BPH beobachtet, und sogar noch höhere Werte werden bei Prostatitis, insbesondere akuter Prostatitis, beobachtet. BPH ist eine extrem häufige Erkrankung bei Männern. Was die Situation weiter verwirrt, ist die Tatsache, dass die Serum-PSA-Erhöhungen beobachtet werden können, ohne irgendeinen Hinweis auf die Erkrankung durch die DRE zu erhalten, und umgekehrt. Darüber hinaus ist nun erkannt worden, dass PSA nicht Prostata-spezifisch ist (Gao et al., supra, für einen Überblick).
Verschiedene Methoden, die zur Verbesserung der Spezifität des auf PSA basierenden Nachweises entworfen worden sind, sind beschrieben worden, wie etwa die Messung der PSA-Dichte und das Verhältnis von freiem zu komplexiertem PSA. Allerdings ist keine dieser Methodiken zur reproduzierbaren Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Prostataerkrankungen in der Lage gewesen. Außerdem weist die PSA-Diagnostik Empfindlichkeiten von zwischen 57 und 79% auf (Cupp & Osterling, 1993, Mayo Clin Proc 68: 297–306) und versagt somit darin, den Prostatakrebs bei einem signifikanten Anteil der Männer mit der Erkrankung zu identifizieren.
Es gibt einige bekannte Marker, die hauptsächlich in der Prostata exprimiert werden, wie etwa das Prostata-spezifische Membranantigen (PSM), eine Hydrolase mit 85% Identität zu einer Ratten-Neuropeptidase (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 749; Bzdega et al., 1997, J. Neurochem. 69: 2270). Die Expression von PSM im Dünndarm und Gehirn (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54: 1807), als auch seine potenzielle Rolle im Neuropeptid-Katabolismus im Gehirn, erregt allerdings Bedenken hinsichtlich einer potenziellen Neurotoxität mit Anti-PSM-Therapien. Die vorläufigen Ergebnisse unter Verwendung von Indium-111-markiertem Anti-PSM-monoklonalem Antikörper zur Darstellung von wiederkehrendem Prostatakrebs sind in einiger Hinsicht vielversprechend (Sodee et al., 1996, Clin Nuc Med 21: 759–766). Zu den in jüngerer Zeit identifizierten Prostatakrebs-Markern zählen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252) und Prostata-Stammzellantigen (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735). PCTA-1, ein neues Galectin, wird großteils in das Medium von exprimierenden Zellen sekretiert und entspricht möglicherweise den Erwartungen als ein diagnostischer Serummarker für Prostatakrebs (Su et al., 1996). PSCA, ein GPI-verknüpftes Zelloberflächenmolekül, wurde von LAPC-4 cDNA kloniert und ist darin einzigartig, dass es primär in Basalzellen des gesunden Prostatagewebes und in Krebsepithelien exprimiert wird (Reiter et al., 1998). Impfstoffe für Prostatakrebs werden ebenfalls mit einer Vielzahl von Antigenen, einschließlich PSM und PSA, aktiv beforscht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues sekretiertes Protein, bezeichnet als BPC-1. In normalen Individuen wird BPC-1-Protein lediglich in bestimmten Geweben des Gehirns exprimiert. Bei Prostatakrebs wird BPC-1 in hohen Mengen in Tumorzellen exprimiert. BPC-1 wird auch in Blasenkrebszellen exprimiert und wird möglicherweise in weiteren Krebszellen exprimiert. Die Struktur des BPC-1 beinhaltet eine Signalsequenz und eine CUB-Domäne. Die CUB-Domäne des BPC-1-Proteins ist den CUB-Domänen mehrerer anderer Proteine strukturell ähnlich.
Das BPC-1-Gen codiert daher ein sekretiertes Tumorantigen, das als ein diagnostischer, einstufender (Staging) und/oder prognostischer Marker nützlich sein kann und/oder als ein ausgezeichnetes Ziel für verschiedene Ansätze zur Behandlung von Prostata-, Blasen- und anderen Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, dienen kann. Obschon die präzise Funktion von BPC-1 derzeit unbekannt ist, legt der vorläufige experimentelle Nachweis nahe, das BPC-1 direkt an der Onkogenese oder Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps der Krebszellen, die BPC-1 exprimieren, beteiligt ist. BPC-1 scheint auch spezifisch an ein zelluläres Protein zu binden, das in Prostata-Krebszellen und anderen Zellen exprimiert wird. Zusammengefasst weist dieser Nachweis darauf hin, dass BPC-1 an einem onkogenen Weg funktionell beteiligt ist. Wie hierin weiter beschrieben, führt dieses Verständnis zu einer Anzahl potenzieller Ansätze für die Behandlung von Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, unter Einbeziehung der Hemmung der BPC-1-Funktion.
Demgemäß stellt die Erfindung ein isoliertes BPC-1-Protein bereit, umfassend (a) die Aminosäuresequenz, wie in 1 gezeigt, von Aminosäurerest Nummer 24 bis Aminosäurerest 158; (b) wenigstens 15 aufeinander folgende Aminosäuren aus der Sequenz von (a), wobei das Protein dazu fähig ist, die Generierung von Antikörpern auszulösen, die spezifisch das Protein von (a) binden; oder (c) ein Polypeptid, das zu wenigstens 90% identisch zu der Aminosäuresequenz von (a) über seine gesamte Länge ist.
Ebenfalls hierin beschrieben werden Polynukleotide entsprechend oder komplementär zu allem oder einem Teil der BPC-1-Gene, mRNAs und/oder Codierungssequenzen, vorzugsweise in isolierter Form, einschließlich Polynukleotiden, die BPC-1-Proteine und Fragmente davon, DNA, RNA, DNA/RNA-Hybrid und verwandte Moleküle codieren, Polynukleotide oder Oligonukleotide, die zu den BPC-1-Genen oder mRNA-Sequenzen oder Teilen davon komplementär sind, und Polynukleotide oder Oligonukleotide, die an die BPC-1-Gene, mRNAs oder an BPC-1-codierende Polynukleotide hybridisieren. Demgemäß stellt die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polynukleotid, wie in 1 gzeigt, worin T auch U sein kann; (b) einem Fragment eines Polynukleotids von (a) von Nukleotidrest Nummer 793 bis Nukleotidrest Nummer 1269, wie in 1 gezeigt, worin T auch U sein kann; (c) einem Polynukleotid, umfassend die Sequenz, wie in 1 gezeigt, von Nukleotidrest Nummer 793 bis 1269; (d) einem Fragment eines Polynukleotids von (a) von Nukleotidrest Nummer 862 bis Nukleotidrest Nummer 1269, wie in 1 gezeigt, worin T auch U sein kann; (e) einem Polynukleotid, umfassend die Sequenz, wie in 1 gezeigt, von Nukleotidrest Nummer 862 bis 1269; oder (f) einem Polynukleotid, umfassend die Sequenz, wie in 1 gezeigt, von Nukleotidrest Nummer 943 bis 1248; (g) einem Polynukleotid, das ein BPC-1-Polypeptid codiert, dessen Sequenz durch die cDNA codiert ist, die in Plasmid p19P1E8 Klon 6.1, wie bei der American Type Culture Collection als Zugriffs-Nr. 98833 hinterlegt, enthalten ist; (h) einem Polynukleotid, das das Protein der Erfindung codiert; und (i) einem isolierten Polynukleotid, das vollständig komplementär zu einem Polynukleotid nach einem von (a) bis (f) ist.
Ebenfalls hierin beschrieben werden Methoden zur Isolierung der cDNAs und der Gene, die BPC-1 codieren. Rekombinante DNA-Moleküle, die BPC-1-Polynukleotide enthalten, Zellen, die mit solchen Molekülen transformiert oder transduziert sind, und Wirts-Vektorsysteme für die Expression der BPC-1-Genprodukten sind hierin ebenfalls beschrieben. Die Erfindung stellt ferner BPC-1-Proteine und Polypeptid-Fragmente davon bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin Antikörper bereit, die an BPC-1-Proteine und Polypeptid-Fragmente davon binden, einschließlich polyklonaler und monoklonaler Antikörper, muriner und anderer Säuger-Antikörper, chimärer Antikörper, humanisierter und vollhumaner Antikörper, Antikörper, die mit einem detektierbaren Marker markiert sind, und Antikörper, die an Radionuklide, Toxine oder andere therapeutische Zusammensetzungen konjugiert sind. Hierin beschrieben werden Methoden für den Nachweis des Vorhandenseins von BPC-1-Polynukleotiden und Proteinen in verschiedenen biologischen Proben, als auch Methoden zur Identifizierung von Zellen, die ein BPC-1 exprimieren. Ebenfalls hierin beschrieben werden verschiedene therapeutische Zusammensetzungen und Strategien zur Behandlung von Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, wie etwa Prostata- und Blasenkrebs, einschließlich der Antikörper-, Impfstoff- und Kleinmolekül-Therapie, als auch Therapien, die auf die Hem mung der Transkription, Translation, Prozessierung oder Funktion von BPC-1 abzielen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1. Molekulare Struktur von humanem BPC-1: Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen von BPC-1-Klon 6-cDNA. Die Signalsequenz ist fettgedruckt angegeben, die CUB-Domäne ist unterstrichen und fettgedruckt gezeigt, und die SSH-abgeleitete Nukleinsäuresequenz ist fettgedruckt gezeigt.
2. Molekulare Struktur von humanem BPC-1: Schematische Darstellung der humanen BPC-1-Struktur. Prozentuale CG-Gehalte über die Regionen der Sequenz sind ebenfalls gezeigt.
3. Molekulare Struktur von humanem BPC-1: Alignment der Aminosäuresequenz der CUB-Domäne von BPC-1 mit CUB-Domänen von verschiedenen bekannten Proteinen. (A) Alignment von BPC-1 mit CUB-Domänen-Protein von C. elegans (Wilson et al., 1994, Nature 368: 32–38) und (B) Alignments mit den CUB-Domänen von murinem BMP-1 (Fukagawa et al., 1994, Dev. Biol 163: 175–183). Prozentuale Sequenzidentitäten sind in der Figur gezeigt.
4. Nothern-Blot-Analyse der humanen BPC-1-Expression in verschiedenen normalen Geweben, die eine ausschließliche Expression im Gehirn zeigt.
5. Halbquantitative RT-PCR-Expressionsanalyse, die die humane BPC-1-Expression in Prostatakrebs-Xenograften und einer begrenzten Anzahl normaler humaner Gewebe zeigt.
6. RNA-Dot-Blot-Analyse der humanen BPC-1-mRNA-Expression in 37 normalen Geweben, die die Expression lediglich in spezifischen Regionen des Gehirns zeigt.
7. Northern-Blot-Analyse der humanen BPC-1-mRNA-Expression in kortikalen Regionen des Gehirns, die eine Expression lediglich in spezifischen Regionen des Kortex zeigt.
8. Halbquantitative RT-PCR-Expressionsanalyse der humanen BPC-1-Expression in fetalen Geweben, die zeigt, dass die BPC-1-Expression im Fötusgehirn vorwiegt und es auch in geringeren Mengen in einer Anzahl weiterer fetaler Gewebe exprimiert wird.
9. Northern-Blot-Analyse der humanen BPC-1-mRNA-Expression in einem Panel von Prostata- und Blasenkarzinom-Xenograften und/oder -Zelllinien, die eine Expression in allen Prostatakrebs-Xenograftproben, der LnCAP-Prostatakrebs-Zelllinie und einer Blasenkarzinom-Zelllinie zeigt.
10. SDS-PAGE-Autoradiographie von immunpräzipiertem rekombiniertem humanem BPC-1-Protein, das in das Gewebekulturmedium von BPC-1-transfizierten 293T-Zellen sekretiert ist.
11. Western-Blot-Analyse des rekombinanten humanen BPC-1-Proteins, wie in HighFive-Insektenzellen exprimiert, die mit einem BPC-1-codierenden Baculovirus infiziert sind, die das prozessierte reife BPC-1 und unprozessierte Vorläufer-BPC-1 in Zelllysaten und geringe Mengen an prozessiertem reifem BPC-1 in Zellmedium zeigt.
12. Northern-Blot-Analyse des rekombinanten humanen BPC-1, wie durch PC3- und 3T3CL7-Zellen exprimiert, die mit BPC-1 codierendem Retrovirus infiziert sind.
13. Western-Blot-Nachweis des BPC-1-Proteins in Gewebekultur-Überständen von Zellen, die das BPC-1-Gen exprimieren. 25 μl des reinen Überstands von verschiedenen Zelllinien wurden einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung einer 1:500-Verdünnung des murinen Anti-BPC-1-polyklonalen Serums unterzogen. Der Blot wurde dann mit Anti-Maus-HRP-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert, und BPC-1-spezifische Signale wurden mittels verstärktem Chemilumineszenz-Nachweis sichtbar gemacht. Linker Blot. Bahn 1: Affinitäts-(Nickel)-gereinigter MYC/HIS BPC-1; Bahn 2: 293T-Kontrollzellen, 24 Std. konditioniertes Medium. Rechter Blot. Bahn 1: 293T-Kontrollzellen, 24 Std. konditioniertes Medium; Bahn 2: 293T, transfiziert mit einem MYC/HIS-getaggten BPC-1-Vektor, 24 Std. konditioniertes Medium; Bahn 3: 293T-Zellen, transfiziert mit einem Alkalische Phosphatase (AP)/BPC-1-Fusionsvektor, 24 Std. konditioniertes Medium; Bahn 4: PC3-Zellen, infiziert mit Kontroll-Neo-Retrovirus und G418-selektiert, 4 Tage konditioniertes Medium; Bahn 5: PC3-Zellen, infiziert mit BPC-1-Retrovirus und G418-selektiert, 4 Tage konditioniertes Medium, eine Woche gelagert bei 4°C; Bahn 6: PC3-Zellen, infiziert mit BPC-1-Retrosvirus und G418-selektiert, 4 Tage konditioniertes Medium; Bahn 7: NIH3T3-Zellen, akut infiziert mit Kontroll-Neo-Retrovirus, 4 Tage konditioniertes Medium; Bahn 8: NIH3T3-Zellen, infiziert mit BPC-1-Retrovirus und G418-selektiert, 4 Tage konditioniertes Medium; Bahn 8: NIH3T3-Zellen, akut infiziert mit BPC-1-Retrovirus, 4 Tage konditioniertes Medium.
14. Western-Blot-Analyse, die zeigt, dass BPC-1-AP in konditioniertem Medium vorhanden ist. Die Bahnen enthalten 20 μl konditioniertes Medium aus 293T-Zellen oder 293T-Zellen, die 48 Stunden nach Austausch des Mediums von Transfektionen mit dem BPC-1-AP-Konstrukt oder mit einem Konstrukt mit lediglich AP gesammelt sind. Anti-HIS-Antikörper wurden zum Nachweis der Proteine verwendet.
15. BPC-1-AP bindet an ein 45 kDa-Protein unter Anwendung einer Far-Western-Analyse. Lysate aus dem Gehirn, Hoden, Prostata, den Xenograften LAPC4AD und LAPC9AD, und den Zelllinien 3T3, LAPC4, LNCaP und PC-3 wurden zur Durchführung der Western-Blots verwendet. Die Blots wurden mit konditioniertem Medium aus einer 293T-Zelllinie, die lediglich sekretierte Alkalische Phosphatase (B) produzierte, und mit Medium, das BPC-1-AP (A) enthielt, inkubiert. Die Alkalische Phosphatase-Signale wurden unter Verwendung eines chemilumineszierenden AP-Detektionssystems nachgewiesen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Sofern nicht anders definiert, sollen alle Begriffe des Fachgebiets, Notationen und die weitere, hierin verwendete wissenschaftliche Terminologie die Bedeutungen aufweisen, wie sie allgemein von Fachleuten des Gebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. In einigen Fällen sind Begriffe mit den herkömmlicherweise verstandenen Bedeutungen hierin zu Zwecken der Klarheit und/oder der einfachen Bezugnahme definiert, und die Aufnahme dieser Definitionen hierin sollte nicht notwendigerweise so verstanden werden, dass sie einen wesentlichen Unterschied gegenüber dem, was im Fachgebiet allgemein verstanden wird, herausstreicht. Die hierin beschriebenen oder darauf Bezug genommenen Techniken und Verfahrensweisen sind im Allgemeinen wohlverstanden und werden unter Anwendung der herkömmlichen Methodologie von Fachleuten des Gebiets allgemein verwendet, wie zum Beispiel die breit eingesetzten molekularen Klonierungs-Methodologien, wie beschrieben bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Wo geeignet, werden die Verfahrensweisen unter Einbeziehung der Verwendung von kommerziell verfügbaren Kits und Reagenzien allgemein entsprechend den vom Hersteller definierten Protokollen und/oder Parametern durchgeführt, sofern nicht anderweitig angegeben.
Wie hierin verwendet, meinen die Begriffe "fortgeschrittener Prostatakrebs", "lokal fortgeschrittener Prostatakrebs", "fortgeschrittene Erkrankung" und "lokal fortgeschrittene Erkrankung" einen Prostatakrebs, die sich durch die Prostatakapsel ausgebreitet hat, und sollen eine Stadium C-Erkrankung unter dem American Urological Association (AUA)-System, eine Stadium C1–C2-Erkrankung unter dem Whitmore-Jewett-System und eine Stadium T3–T4 und N+-Erkrankung unter dem TNM-(Tumor, Knoten, Metastase)-System umfassen. Im Allgemeinen wird ein chirurgischer Eingriff bei Patienten mit einer lokal fortgeschrittenen Erkrankung nicht empfohlen, und diese Patienten erwartet ein wesentlich weniger günstiger Folgezustand im Vergleich zu Patienten mit klinisch lokalisiertem (Organ-beschränktem) Prostatakrebs. Eine lokal fortgeschrittene Erkrankung wird durch einen tastbaren Nachweis der Verhärtung jenseits der seitlichen Begrenzung der Prostata oder einer Asymmetrie oder Verhärtung oberhalb der Prostatabasis klinisch identifiziert. Ein lokal fortgeschrittener Prostatakrebs wird derzeit nach einer Radikalprostatektomie pathologisch diagnostiziert, wenn der Tumor in die Prostatakapsel eindringt oder sie durchdringt, sich in den Operationsrand erstreckt oder in die seminalen Vesikel eindringt.
Wie hierin verwendet, meinen die Begriffe "metastatischer Prostatakrebs" und "metastatische Erkrankung" Prostatakrebsformen, die sich auf regionale Lymphknoten oder entfernte Stellen ausgebreitet haben, und sollen die Stadium-D-Erkrankung unter dem AUA-System und das Stadium T×N×M+ unter dem TNM-System umfassen. Wie es mit lokal fortgeschrittenem Prostatakrebs der Fall ist, ist ein operativer Eingriff für Patienten mit einer metastatischen Erkrankung allgemein nicht indiziert, und eine hormonale (Androgenablations)-Therapie stellt die bevorzugte Behandlungsmodalität dar. Patienten mit metastatischem Prostatakrebs entwickeln schließlich einen Androgen-refraktorischen Zustand innerhalb von 12 bis 18 Monaten nach Behandlungsbeginn, und etwa die Hälfte dieser Patienten stirbt innerhalb von 6 Monate danach. Die häufigste Stelle für die Prostatakrebs-Metastasierung ist der Knochen. Prostatakrebs-Knochenmetastasen sind per saldo charakterischerweise osteoblastisch und nicht osteolytisch (d.h. führen zu Nettoknochenbildung). Knochenmetastasen werden am häufigsten in der Wirbelsäule gefunden, gefolgt vom Oberschenkelknochen, Beckenknochen, Brustkorb, Schädelknochen und Oberarmknochen. Zu weiteren häufigen Stellen für Metastasen zählen Lymphknoten, Lunge, Leber und Gehirn. Metastatischer Prostatakrebs wird typischerweise durch offene oder laparoskopische Beckenlymphadenektomie, Ganzkörper-Radionuklid-Scans, Skelettradiographie und/oder Knochenläsionsbiopsie diagnostiziert.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff "Polynukleotid" eine polymere Form von Nukleotiden von wenigstens 10 Basen oder Basenpaaren in der Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide oder eine modifizierte Form beider Typen des Nukleotids, und soll einzel- und doppelsträngige Formen der DNA umfassen.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff "Polypeptid" ein Polymer von wenigstens 10 Aminosäuren. Während der gesamten Beschreibung werden standardmäßige Dreibuchstaben- oder Einbuchstaben-Bezeichnungen für die Aminosäuren verwendet.
Wie hierin verwendet, meinen die Begriffe "hybridisieren", "hybridisierend", "hybridisiert" und ähnliches, wie im Zusammenhang mit den Polynukleotiden verwendet, eine Bezugnahme auf die herkömmlichen Hybridisationsbedingungen, vorzugsweise etwa eine Hybridisation in 50% Formamid/6 × SSC/0,1% SDS/100 μg/ml ssDNA, wobei die Temperaturen für die Hybridisation oberhalb von 37°C und die Tempera turen für das Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS oberhalb von 55°C liegen, und am bevorzugtesten stringente Hybridisationsbedingungen.
Im Zusammenhang mit den Vergleichen der Aminosäuresequenzen wird der Begriff "Identität" als Ausdruck für den prozentualen Anteil der Aminosäurereste an derselben relativen Position, die gleich sind, verwendet. Ebenfalls in diesem Zusammenhang wird der Begriff "Homologie" als Ausdruck für den prozentualen Anteil der Aminosäurereste an denselben relativen Positionen, die entweder identisch sind oder ähnlich sind, unter Anwendung der Kriterien der BLAST-Analyse für konservierte Aminosäuren, wie dies allgemein im Fachgebiet verstanden wird, verwendet. Weitere Einzelheiten bezüglich der Aminosäure-Substitutionen, die unter diesen Kriterien als konservativ betrachtet werden, sind nachstehend angegeben.
Weitere Definitionen sind in den gesamten Unterabschnitten, die folgen, angegeben.
MOLEKULARE UND BIOCHEMISCHE MERKMALE DES BPC-1
Wie in den Beispielen, die folgen, weiter beschrieben ist, sind das BPC-1-Gen und Protein unter Anwendung einer Anzahl analytischer Ansätze charakterisiert worden. Zum Beispiel wurden die Analysen der Nukleotid-Codierung und Aminosäuresequenzen durchgeführt, um potenziell verwandte Moleküle, sowie erkennbare strukturelle Domänen, topologische Merkmale und weitere Elemente innerhalb der BPC-1 mRNA und Proteinstruktur zu identifizieren. RT-PCR und Northern-Blot-Analysen der BPC-1 mRNA-Expression wurden durchgeführt, um den Bereich der normalen und kanzerösen Gewebe, der die BPC-1-Message exprimiert, zu etablieren. Western-Blot-Analysen der Expression des BPC-1-Proteins in experimentell transfizierten Zellen wurden vorgenommen, um die Zelllokalisation und -sekretion von prozessiertem und unprozessiertem rekombiniertem humanem BPC-1-Protein zu bestimmen. Funktionelle Assays, die zur Bestimmung der BPC-1-Interaktion mit zellulären Bindungspartner(n) entworfen waren, wurden ebenfalls vorgenommen.
BPC-1 ist ein onkogenes, sekretiertes, eine CUB-Domäne enthaltendes Protein, das in Prostata- und Blasenkarzinomzellen exprimiert wird und an ein zelluläres Protein bindet. Die BPC-1-Expression ist höchst Gehirn-spezifisch in normalen adulten menschlichen Geweben. In fetalen Geweben herrscht die BPC-1-Expression im Gehirn vor, ist aber auch in einer Anzahl anderer sich entwickelnder Organe und Gewebe angeschaltet. Die BPC-1-Genexpression ist bei humanem Prostatakrebs aktiviert. Insbesondere wird BPC-1 in sehr hohen Mengen in Androgen-abhängigen humanen Prostatatumor-Xenograften exprimiert, die ursprünglich von einem Patienten mit hochgradig metastatischem Prostatakrebs stammen, und ist bei geringeren, aber signifikanten Mengen in anderen Prostatakrebs-Proben exprimiert. BPC-1 wird ebenso in hohen Mengen in zumindest einigen Blasenkarzinomen exprimiert.
Das BPC-1-Protein wird anfänglich zu einem Vorläufer aus 158 Aminosäuren translatiert, der eine Signalsequenz enthält. Während der posttranslationalen Prozessierung wird die Signalsequenz gespalten, was ein reifes sekretiertes Protein von 135 Aminosäuren ergibt. Die 5' nicht-codierende Region des BPC-1-Gens ist extrem G/C-reich (etwa 72% G/C-Gehalt, verglichen zu 42% in der codierenden Region und 30% in der 3' nicht-codierenden Region), was bedeutet, dass diese Region des Gens Elemente enthält, die an der Transkriptions- oder Translationskontrolle beteiligt sind (1).
Die BPC-1-Primärstruktur enthält eine erkennbare CUB-Domäne (Complement-Subkomponenten C1r/C1s, Uegf, Bmp1) (Borck und Beckmann, 1993, J. Mol. Biol. 231: 539–545), die eine Homologie mit anderen CUB-Domäne-Proteinen teilt (1; 3). CUB-Domänen wurden ursprünglich in den Komplement-Subkomponenten C1r und C1s gefunden, und wurden anschließend in Uegf (auf epidermalen Wachstumsfaktor bezogenes Seeigel-Protein) und Bmp1 (knochenmorphogenetisches Protein 1), einer Protease, die an der Knochenentwicklung beteiligt ist, identifiziert. Funktionell sind CUB-Domänen mit der Protein-Interaktion, Rezeptorbindung und anderen Aktivitäten assoziiert worden. Anders als andere CUB-Domänen-Proteine, die zusätzliche enzymatische Funktionen aufweisen, ist BPC-1 darin einzigartig, dass es im wesentlichen eine sekretierte CUB-Domäne ohne weitere erkennbare funktionelle Domänen ist. Die CUB-Domäne von BPC-1 könnte als eine Protein-Protein-Interaktions-Domäne fungieren, die Interaktionen mit anderen sekretierten Molekülen, extrazellulären Matrixmolekülen und/oder Zelloberflächen-Rezeptoren vermittelt. Dies würde eine potenzielle Wachstumsfaktor- oder Zellstimulator-Funktion implizieren.
Das Vorhandensein einer CUB-Domäne in der BPC-1-Struktur stützt die Folgerung weiter, dass BPC-1 mit anderen Proteinen interagiert und wahrscheinlich an sie bindet. Die CUB-Domäne, betrachtet als einer extrazellulären Domäne, die an der Protein-Protein-Interaktion beteiligt ist, tritt in vielen unterschiedlichen sekretierten oder Zelloberflächenproteinen auf, die an eine Vielfalt von Entwicklungsprozessen beteiligt sind (Borck und Beckmann, 1993, J. Mol. Biol. 231: 539–545). Eine Familie der durch CUB-Domänen charakterisierten Proteine, zu der BPC-1-Protein in einer gewissen Beziehung stehen kann, sind die Spermadhäsine. Die Spermadhäsine sind eine CUB-Domäne enthaltende sekretierte Proteine, die durch die seminalen Vesikeln produziert werden und eine Größe von schätzungsweise etwa 15–18 kD (140 Aminosäuren) aufweisen; diese Proteine dienen der Hemmung der Spermamotilität und werden durch Proteolyse inaktiviert (Iwamoto et al., 1995, FEBS Letters 368: 420–424).
Der vorläufige experimentelle Nachweis legt nahe, dass BPC-1 direkt an der Onkogenese oder Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps der Krebszellen, die BPC-1 exprimieren, beteiligt ist. Diesbezüglich zeigt BPC-1 eine transformierende Aktivität in Weichagar-Assays und bindet an ein zelluläres Protein, das durch Zellen exprimiert wird, einschließlich jener, die BPC-1 exprimieren. Zusammengefasst zeigt dieser Nachweis, dass BPC-1 an einem onkogenen Weg funktionell beteiligt ist und dass die BPC-1-Aktivität bei diesem Weg durch Interaktion mit einem BPC-1-Bindungspartner oder durch Bindung an oder Assoziation mit anderen/m Protein(en) erfolgen kann. Wie hierin weiter beschrieben, führt dieses Verständnis zu einer Anzahl potenzieller Ansätze für die Behandlung von Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, welche die Hemmung der BPC-1-Funktion einbeziehen.
BPC-1-POLYNUKLEOTIDE
Hierin beschrieben werden Polynukleotide, die allem oder einem Teil eines BPC-1-Gens, mRNA und/oder Codierungssequenz, vorzugsweise in isolierter Form, entsprechen oder komplementär dazu sind, einschließlich Polynukleotiden, die ein BPC- 1-Protein oder Fragmente davon, DNA, RNA, DNA/RNA-Hybrid und verwandte Moleküle codieren, Polynukleotide oder Oligonukleotide, die zu einem BPC-1-Gen oder mRNA-Sequenz oder einem Teil davon komplementär sind, und Polynukleotide oder Oligonukleotide, die an ein BPC-1-Gen, mRNA oder an ein BPC-1-codierendes Polynukleotid (kollektiv als "BPC-1-Polynukleotide" bezeichnet) hybridisieren. Wie hierin verwendet, soll das BPC-1-Gen und Protein das hierin spezifisch beschriebene BPC-1-Gen und Protein und die Gene und Proteine, die anderen BPC-1-Proteinen und strukturell ähnlichen Varianten der vorangegangenen entsprechen, umfassen. Diese anderen BPC-1-Proteine und Varianten werden generell Codierungssequenzen aufweisen, die hochgradig homolog zu den BPC-1- und/oder BPC-1-2-Codierungssequenzen sind, und werden vorzugsweise wenigstens etwa 50% Aminosäure-Identität und wenigstens etwa 60% Aminosäure-Homologie (unter Zugrundelegung der BLAST-Kriterien), bevorzugter 70% oder mehr Homologie (unter Zugrundelegung der BLAST-Kriterien) teilen.
Ein BPC-1-Polynukleotid kann ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz des humanen BPC-1, wie in 1 gezeigt, eine Sequenz, die zu der vorangegangenen komplementär ist, oder ein Polynukleotid-Fragment von einer der vorangegangenen aufweisen. Ein BPC-1-Polynukleotid kann zum Hybridisieren unter stringenten Hybridisationsbedingungen an die humane BPC-1 cDNA, wie in 1 gezeigt, oder an ein Polynukleotid-Fragment davon fähig sein.
Spezifisch erwogen werden genomische DNA, cDNAs, Ribozyme und Antisense-Moleküle, als auch Nukleinsäure-Moleküle, die auf einem alternativen Rückgrat basieren oder alternative Basen enthalten, ob nun von natürlichen Quellen abgleitet oder synthetisiert. Zum Beispiel können Antisense-Moleküle RNAs oder andere Moleküle sein, einschließlich Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) oder Nicht-Nukleinsäure-Moleküle, wie etwa Phosphorthioat-Derivate, die spezifisch DNA oder RNA in einer Basenpaar-abhängigen Weise binden. Ein geübter Fachmann kann diese Klassen der Nukleinsäure-Moleküle unter Verwendung der hierin beschriebenen BPC-1-Polynukleotide und Polynukleotid-Sequenzen ohne weiteres erhalten.
Ebenfalls hierin beschrieben werden Primer und Primerpaare, die die spezifische Amplifikation der Polynukleotide der Erfindung oder jeglicher spezifischer Teile davon zulassen, und Sonden, die selektiv oder spezifisch an Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung oder jeglichen Teil davon hybridisieren. Die Sonden können mit einem nachweisbaren Marker, wie zum Beispiel einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, biolumineszierenden Verbindung, chemilumineszierenden Verbindung, Metalchelator oder Enzym markiert sein. Solche Sonden und Primer können zum Nachweisen des Vorhandenseins eines BPC-1-Polynukleotids in einer Probe und als ein Mittel zum Nachweisen einer Zelle, die ein BPC-1-Protein exprimiert, verwendet werden. Zu Beispielen solcher Sonden zählen Polypeptide, die alles oder einen Teil der humanen BPC-1 cDNA-Sequenz, wie in 1 gezeigt, umfassen. Beispiele der Primerpaare, die zum spezifischen Amplifizieren der BPC-1 mRNAs fähig sind, sind ebenfalls in den folgenden Beispielen beschrieben. Wie ein geübter Fachmann erkennen wird, kann eine Großzahl unterschiedlicher Primer und Sonden basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen präpariert werden und effektiv zur Amplifikation und/oder dem Nachweis einer BPC-1 mRNA verwendet werden.
Wie hierin verwendet, wird ein Polynukleotid als "isoliert" bezeichnet, wenn es im Wesentlichen von kontaminierenden Polynukleotiden getrennt ist, die anderen Genen als dem BPC-1-Gen entsprechen oder dazu komplementär sind oder die andere Polypeptide als das BPC-1-Genprodukt oder Fragmente davon codieren. Ein geübter Fachmann kann ohne weiteres Nukleinsäure-Isolierungsverfahren anwenden, um ein isoliertes BPC-1-Polynukleotid zu erhalten.
Die BPC-1-Polynukleotide der Erfindung sind für eine Vielfalt von Zwecken nützlich, einschließlich, doch nicht beschränkt auf ihre Verwendung als Sonden und Primer für die Amplifikation und/oder den Nachweis des/der BPC-1-Gens/e, mRNA(s) oder Fragmente davon; als Reagenzien für die Diagnose und/oder Prognose von Prostatakrebs und anderen Krebsarten; als Codierungssequenzen, die zum Steuern der Expression der BPC-1-Polypeptide fähig sind; als Mittel zur Modulierung oder Inhibierung der Expression des/der BPC-1-Gens/e und/oder Translation des/der BPC-1-Transkripts/e; und als therapeutische Mittel.
METHODEN ZUR ISOLIERUNG VON BPC-1-CODIERENDEN NUKLEINSÄURE-MOLEKÜLEN
Die hierin beschriebenen BPC-1 cDNA-Sequenzen ermöglichen die Isolierung weiterer Polynukleotide, die BPC-1-Genprodukt(e) codieren, als auch die Isolierung der Polynukleotide, die BPC-1-Genprodukt-Homologa codieren, alternativ gespleißter Isoformen, alleler Varianten und mutierter Formen des BPC-1-Genprodukts. Verschiedene molekulare Klonierungsmethoden, die zur Isolierung der Volllängen-cDNAs, die ein BPC-1-Gen codieren, angewendet werden können, sind wohlbekannt (siehe zum Beispiel Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Hrsg., Wiley & Sons, 1995). Zum Beispiel können Lambda-Phage-Klonierungsmethodologien in bequemer Weise unter Verwendung kommerziell verfügbarer Klonierungssysteme (z.B. Lambda ZAP Express, Stratagene) angewendet werden. Phagen-Klone, die BPC-1-Gen-cDNAs enthalten, können durch Sondieren mit einer markierten BPC-1 cDNA oder einem Fragment davon identifiziert werden. Zum Beispiel kann die BPC-1 cDNA (1) oder ein Abschnitt davon synthetisiert und als eine Sonde zur Auffindung von überlappenden und Volllängen-cDNAs, entsprechend einem BPC-1-Gen, verwendet werden. Das BPC-1-Gen selbst kann durch Screenen genomischer DNA-Bibliotheken, bakterieller künstlicher Chromosomen-Bibliotheken (BACs), künstlicher Hefechromosomen-Bibliotheken (YACs) und ähnlichem mit BPC-1-DNA-Sonden oder Primern isoliert werden.
REKOMBINANTE DNA-MOLEKÜLE UND WIRTS-VEKTORSYSTEME
Hierin beschrieben werden rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein BPC-1-Polynukleotid enthalten, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Phagen, Plasmide, Phagemide, Cosmide, YACs, BACs, als auch verschiedene virale und nicht-virale Vektoren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, und Zellen, die mit diesen rekombinanten DNA- oder RNA-Molekülen transformiert oder transfiziert sind. Wie hierin verwendet, ist ein rekombinantes DNA- oder RNA-Molekül ein DNA- oder RNA-Molekül, das einer molekularen Manipulation in vitro unterzogen worden ist. Methoden zur Generierung solcher Moleküle sind wohlbekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, supra).
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Wirts-Vektorsystem, das ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst, welches ein BPC-1-Polynukleotid innerhalb einer geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle enthält. Beispiele geeigneter eukaryotischer Wirtszelle umfassen eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle, wie etwa eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle (z.B. eine mit Baculovirus infizierbare Zelle, wie z.B. eine Sf9- oder HighFive-Zelle). Beispiele geeigneter Säugerzellen umfassen verschiedene Prostatakrebs-Zelllinien, wie LnCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, andere transfizierbare oder transduzierbare Prostatakrebs-Zelllinien, als auch eine Anzahl von Säugerzellen, die routinemäßig für die Expression rekombinierter Proteine verwendet werden (z.B. COS-, CHO-, 293-, 293T-Zellen). Genauer gesagt kann ein Polynukleotid, das die Codierungssequenz eines BPC-1 umfasst, zur Erzeugung von BPC-1-Proteinen oder Fragmenten davon unter Verwendung jeglicher Anzahl von Wirts-Vektorsystemen, die routinemäßig eingesetzt werden und im Fachgebiet breit bekannt sind, verwendet werden.
Ein breiter Bereich von Wirts-Vektorsystemen, der für die Expression von BPC-1-Proteinen oder Fragmenten davon geeignet ist, steht zur Verfügung, siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Bevorzugte Vektoren für die Säuger-Expression umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) und den retroviralen Vektor pSRαtkneo (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785). Unter Verwendung dieser Expressionsvektoren kann BPC-1 vorzugsweise in mehreren Prostatakrebs- und Nicht-Prostata-Zelllinien exprimiert werden, einschließlich zum Beispiel 293, 293T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP und TsuPr1. Diese Wirts-Vektorsysteme sind für die Produktion eines BPC-1-Proteins oder Fragments davon nützlich. Solche Wirts-Vektorsysteme können zur Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von BPC-1 und BPC-1-Mutationen verwendet werden.
Reifes rekombiniertes humanes BPC-1-Protein kann durch Säugerzellen, die mit einem das Vorläufer-BPC-1 codierenden Konstrukt transfiziert sind, produziert und sekretiert werden. Wie in den Beispielen beschrieben, werden 293T-Zellen mit einem Expressionsplasmid transfiziert, das die Vorläuferform von BPC-1 codiert (d.h. einschließlich der Signalsequenz), und reifes BPC-1-Protein wird in das Zellkultur medium sekretiert, wo es unter Anwendung standardmäßiger Ausreinigungsmethoden bequem isoliert werden kann. Reifes rekombiniertes humanes BPC-1 kann auch durch Zellen produziert werden, die das reife Protein prozessieren, doch nicht sekretieren. Ein Beispiel eines solchen Systems ist eine BPC-1-codierende Baculovirusinfizierte Zelle. Wie in den Beispielen beschrieben, exprimieren und prozessieren solche Zellen hohe Mengen an BPC-1 intrazellulär. Das reife BPC-1-Protein kann in solchen Fällen aus den Zelllysaten unter Anwendung standardmäßiger Verfahrensweisen rückgewonnen werden. Ob das reife BPC-1 nun sekretiert oder intrazellulär durch die Wirtszelle zurückgehalten wird, kann BPC-1 aus Medien oder Zelllysaten unter Verwendung von BPC-1-Antikörpern affinitätsgereinigt werden.
Durch die BPC-1-Gene oder durch Fragmente codierte Proteine werden vielfältige Anwendungen finden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Erzeugung von Antikörpern, als auch bei Methoden zur Identifizierung von Liganden und anderen Agenzien und zellulären Bestandteilen, die an ein BPC-1-Genprodukt binden. Gegen ein BPC-1-Protein oder Fragment davon gezüchtete Antikörper können in diagnostischen und prognostischen Assays, bildgebenden Methodologien (einschließlich insbesondere der Krebs-Bildgebung) und therapeutischen Methoden in der Behandlung menschlicher Krebsarten, die durch die Expression eines BPC-1-Proteins charakterisiert sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf den Krebs der Prostata, nützlich sein. Verschiedene immunologische Assays, die für den Nachweis von BPC-1-Proteinen nützlich sind, werden erwogen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf verschiedene Typen von Radioimmunoassays, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Enyzme-linked Immunofluorescent Assays (ELIFA), immunzytochemische Methoden und ähnliches. Diese Antiköper können markiert und als immunologische bildgebende Reagenzien verwendet werden, die zum Nachweisen von Prostatazellen (z.B. bei radioszintigraphischen bildgebenden Methoden) fähig sind. BPC-1-Proteine können auch in der Herstellung von Krebs-Impfstoffen besonders nützlich sein, wie unten weiter beschrieben.
BPC-1-Proteine
Hierin beschrieben werden BPC-1-Proteine und Polypeptid-Fragmente davon. Zu den BPC-1-Proteinen zählen die hierin spezifisch identifizierten, als auch allelische Varianten, konservative Substitutions-Varianten und Homologa, die ohne übermäßiges Experimentieren bei Befolgung der nachstehend skizzierten Methoden isoliert/generiert und charakterisiert werden können. Auch Fusionsproteine, die Teile verschiedener BPC-1-Proteine oder Fragmente davon kombinieren, als auch Fusionsproteine eines BPC-1-Proteins und eines heterologen Polypeptids sind davon umfasst. Solche BPC-1-Proteine werden kollektiv als die BPC-1-Proteine oder BPC-1 bezeichnet. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "BPC-1-Polypeptid" auf ein Polypeptid-Fragment oder ein BPC-1-Protein von wenigstens 10 Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 15 Aminosäuren.
Ein spezifisches Beispiel eines BPC-1-Proteins umfasst ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des menschlichen BPC-1, wie in 1 gezeigt, von etwa Aminosäurerest Nummer 1 bis etwa Aminosäurerest Nummer 158, wie darin gezeigt. Ein anderes spezifisches Beispiel eines BPC-1-Proteins umfasst ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des menschlichen BPC-1, wie in 1 gezeigt, von etwa Aminosäurerest Nummer 24 bis etwa Aminosäurerest Nummer 158, wie darin gezeigt.
Im Allgemeinen werden natürlich vorkommende allelische Varianten des menschlichen BPC-1 einen hohen Grad an Strukturidentität und -homologie (z.B. 90% oder mehr Identität) teilen. Typischerweise werden allelische Varianten des BPC-1-Proteins konservative Aminosäure-Substitutionen innerhalb der hierin beschriebenen BPC-1-Sequenzen enthalten oder werden eine Substitution einer Aminosäure von einer entsprechenden Position in einem BPC-1-Homologon enthalten. Eine Klasse der allelischen BPC-1-Varianten werden Proteine sein, die einen hohen Grad an Homologie mit zumindest einer kleinen Region einer bestimmten BPC-1-Aminosäuresequenz teilen, doch werden außerdem eine radikale Abweichung von der Sequenz, wie etwa eine nicht-konserverative Substitution, Verkürzung, Insertion oder Frame-Shift, enthalten.
Konservative Aminosäure-Substitutionen können häufig in einem Protein vorgenommen werden, ohne dabei die Konformation noch die Funktion des Proteins zu verändern. Zu solchen Veränderungen zählen die Substitution irgendeiner der Aminosäuren Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) durch irgendeine andere dieser hy drophoben Aminosäuren; Aspartinsäure (D) für Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) für Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) für Threonin (T) und umgekehrt. Andere Substitutionen können ebenfalls als konservativ betrachtet werden, was von der Umgebung der jeweiligen Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins abhängt. Zum Beispiel können Glycin (G) und Alanin (A) häufig gegeneinander austauschbar sein, ebenso wie Alanin (A) und Valin (V). Methionin (M), welches relativ hydrophob ist, kann häufig gegen Leucin und Isoleucin ausgetauscht werden, und manchmal mit Valin. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig in Lokalisationen gegeneinander austauschbar, in denen das signifikante Merkmal des Aminosäurerests seine Ladung ist und die abweichenden pK's dieser beiden Aminosäurereste nicht signifikant sind. Noch weitere Veränderungen können als "konservativ" in bestimmten Umgebungen betrachtet werden.
BPC-1-Proteine können in vielen Formen ausgeführt sein, vorzugsweise in isolierter Form. Wie hierin verwendet, wird ein Protein als "isoliert" bezeichnet, wenn physikalische, mechanische oder chemische Methoden zur Entfernung von dem BPC-1-Protein der zellulären Bestandteilen, die normalerweise mit dem Protein assoziiert sind, angewendet werden. Ein geübter Fachmann kann ohne weiteres standardmäßige Reinigungsmethoden anwenden, um ein isoliertes BPC-1-Protein zu erhalten. Ein gereinigtes BPC-1-Proteinmolekül wird im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Molekülen sein, die die Bindung des BPC-1 an Antikörper oder einen anderen Liganden beeinträchtigen. Die Natur und der Grad der Isolierung und Reinigung werden von der angestrebten Verwendung abhängen. Ausführungsformen eines BPC-1-Proteins umfassen ein gereinigtes BPC-1-Protein und ein funktionelles, lösliches BPC-1-Protein. Bei einer Form behalten solche funktionellen, löslichen BPC-1-Proteine oder Fragmente davon die Fähigkeit zur Bindung an Antikörper oder einen anderen Liganden bei.
Ebenfalls hierin beschrieben werden BPC-1-Polypeptide, die biologisch aktive Fragmente der BPC-1-Aminosäuresequenz, wie etwa ein Polypeptid entsprechend einem Teil der Aminosäuresequenzen für BPC-1, umfassen, wie in 1 gezeigt. Solche Polypeptide zeigen Eigenschaften des BPC-1-Proteins, wie etwa die Fähigkeit zur Hervorrufung der Generierung von Antikörpern, die spezifisch an ein mit dem BPC-1-Protein assoziiertes Epitop binden.
BPC-1-Polypeptide können unter Anwendung einer standardmäßigen Peptid-Synthesetechnologie oder unter Anwendung von im Fachgebiet wohlbekannten chemischen Spaltungsmethoden, die auf den hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen der humanen BPC-1-Proteine basieren, generiert werden. Alternativ können rekombinante Methoden zur Erzeugung von Nukleinsäure-Molekülen angewendet werden, die ein Polypeptid-Fragment eines BPC-1-Proteins codieren. Diesbezüglich liefern die hierin beschriebenen BPC-1-codierenden Nukleinsäure-Moleküle die Mittel zur Erzeugung definierter Fragmente der BPC-1-Proteine. BPC-1-Polypeptide sind besonders nützlich bei der Generierung und Charakterisierung der Domänespezifischen Antikörper (z.B. Antikörper, die ein extrazelluläres oder intrazelluläres Epitop eines BPC-1-Proteins erkennen), bei der Identifizierung von Agenzien oder zellulären Faktoren, die an BPC-1 oder eine bestimmte strukturelle Domäne davon binden, und in verschiedenen therapeutischen Zusammenhängen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Krebsimpfstoffe. BPC-1-Polypeptide, die besonders interessierende Strukturen enthalten, können unter Anwendung verschiedener analytischer, im Fachgebiet wohlbekannter Techniken prädiziert und/oder identifiziert werden, einschließlich beispielsweise der Methoden von Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder der Jameson-Wolf-Analyse, oder auf der Basis der Immunogenität. Fragmente, die solche Strukturen enthalten, sind besonders nützlich in der Erzeugung von Untereinheit-spezifischen Anti-BPC-1-Antikörpern oder in der Identifizierung von zellulären Faktoren, die an BPC-1 binden.
In den folgenden Beispielen kann reifes sekretiertes BPC-1 in bequemer Weise in 293T-Zellen exprimiert werden, die mit einem CMV-gesteuerten Expressionsvektor, der BPC-1 mit einem C-terminalen 6XHis und MYC-Tag (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen) codiert, transfiziert werden. Das sekretierte HIS-tagged BPC-1 in dem Kulturmedium kann unter Verwendung einer Nickelsäule mittels standardmäßiger Techniken gereinigt werden.
BPC-1-ANTIKÖRPER
Hierin beschrieben werden Antikörper, die an BPC-1-Proteine und Polypeptide binden. Die bevorzugtesten Antikörper werden selektiv an ein BPC-1-Protein binden und werden nicht an Nicht-BPC-1-Proteine und Polypeptide binden (oder werden schwach binden). Anti-BPC-1-Antikörper, die besonders in Erwägung gezogen werden, umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper, als auch Fragmente, die die Antigen-bindende Domäne und/oder eine oder mehrere Komplementaritätsbestimmende Regionen dieser Antikörper enthalten. Wie hierin verwendet, ist das Antikörper-Fragment als wenigstens ein Abschnitt der variablen Region des Immunglobulin-Moleküls, der an sein Ziel bindet, d.h. die Antigenbindungsregion, definiert.
Hierin beschrieben wird ein Fab-, F(ab')2-, Fv- oder Sfv-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der immunspezifisch an ein BPC-1-Protein der Erfindung bindet. Ebenfalls hierin beschrieben wird ein rekombiniertes Protein, welches die Antigenbindungsregion eines monoklonalen Antikörpers umfasst, der immunspezifisch an ein BPC-1-Protein der Erfindung bindet. Ebenfalls hierin beschrieben wird ein einzelkettiger monoklonaler Antikörper, der die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers umfasst, der immunspezifisch an ein BPC-1-Protein der Erfindung bindet. Ein Vektor wird ebenfalls hierin beschrieben, der ein Polynukleotid umfasst, das solch einen einzelkettigen Antikörper codiert. Ein monoklonaler Antikörper der Erfindung kann wahlweise an zwei Epitope innerhalb der reifen BPC-1-Proteinsequenz binden, wie dargestellt als Reste 24 bis 158 der 1.
BPC-1-Antikörper der Erfindung können besonders nützlich bei Prostatakrebs-Behandlungsstrategien, diagnostischen und prognostischen Assays und bildgebenden Methoden sein. In ähnlicher Weise können diese Antikörper in der Behandlung, Diagnose und/oder Prognose anderer Krebsarten nützlich sein, in dem Maße, in dem BPC-1 auch in anderen Krebsarten exprimiert oder überexprimiert wird. Ein solcher Krebs, der BPC-1 exprimiert, ist das Blasenkarzinom.
Ebenfalls hierin beschrieben werden verschiedene immunologische Assays, die für den Nachweis und die Quantifizierung von BPC-1 und mutierten BPC-1-Proteinen und Polypeptiden nützlich sind. Diese Assays umfassen generell ein oder mehrere BPC-1-Antikörper, die zur Erkennung und Bindung eines BPC-1- oder mutierten BPC-1-Proteins, wie geeignet, fähig sind, wobei sie innerhalb verschiedener immunologischer Assay-Formate vorgenommen werden können, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf verschiedene Typen von Radioimmunoassays, Enzmye-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Enzyme-linked Immunofluorescent Assays (ELIFA) und ähnlichem. Außerdem werden auch immunologische bildgebende Methoden, die zum Detektieren von Prostatakrebs in der Lage sind, durch die Erfindung bereitgestellt, einschließlich, doch nicht beschränkt auf radioszintigraphische bildgebende Methoden unter Verwendung von markierten BPC-1-Antikörpern. Solche Assays können für den Nachweis, die Überwachung und die Prognose von Prostatakrebs, insbesondere fortgeschrittenem Prostatakrebs, klinisch nützlich sein.
BPC-1-Antikörper können auch bei Methoden zur Reinigung von BPC-1- und mutierten BPC-1-Proteinen und Polypeptiden und zur Isolierung von BPC-1-Homologa und verwandten Molekülen verwendet werden. Zum Beispiel kann die Methode zur Reinigung eines BPC-1-Proteins das Inkubieren eines BPC-1-Antikörpers, der an eine feste Matrix gekoppelt worden ist, mit einem Lysat oder einer anderen Lösung, die BPC-1 enthält, unter Bedingungen umfassen, die dem BPC-1-Antikörper das Binden an BPC-1 erlauben; Waschen der festen Matrix zur Beseitigung von Unreinheiten; und Eluieren des BPC-1 von dem angelagerten Antikörper. Zu weiteren Verwendungen der BPC-1-Antikörper der Erfindung zählen die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern, die das BPC-1-Protein nachahmen.
BPC-1-Antikörper können auch therapeutisch, zum Beispiel zur Modulierung oder Inhibierung der biologischen Aktivität eines BPC-1-Proteins oder zum Anzielen und Zerstören von Krebszellen, die ein BPC-1-Protein oder einen BPC-1-Bindungspartner exprimieren, verwendet werden. Da BPC-1 ein sekretierendes Protein ist, welches an ein zelluläres Protein zu binden scheint, und da BPC-1 scheinbar eine onkogene Aktivität aufweist, können Antikörper zur Blockierung der Fähigkeit von BPC-1, an seinen Rezeptor zu binden oder mit anderen Proteinen zu interagieren, wodurch es seine onkogene biologische Aktivität ausübt, therapeutisch nützlich sein.
In einem spezifischen Beispiel kann ein BPC-1-spezifischer Antikörper oder eine Kombination davon (vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper oder eine Kombination davon) an einen Patienten verabreicht werden, der an einem BPC-1-exprimierenden Tumor leidet, so dass der Antikörper an BPC-1 bindet und dessen Fähigkeit zur Ausübung seiner Funktion hemmt. Die BPC-1-Antikörpertherapie ist in dem nachfolgenden Unterabschnitt THERAPEUTISCHE METHODEN UND ZUSAMMENSETZUNGEN spezifischer beschrieben.
Verschiedene Methoden zur Präparierung von Antikörpern sind im Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel können Antikörper durch Immunisieren eines geeigneten Säugerwirts unter Verwendung eines BPC-1-Proteins, -Peptids oder -Fragments in isolierter oder immunkonjugierter Form präpariert werden (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Hrsg., Harlow und Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Außerdem können auch Fusionsproteine von BPC-1 verwendet werden, wie etwa ein BPC-1-GST-Fusionsprotein. In einer besonderen Ausführungsform kann ein GST-Fusionsprotein, das alles oder den Großteil des offenen Leserahmens der Aminosäuresequenz der 1 umfasst, erzeugt und als ein Immunogen zur Generierung geeigneter Antikörper verwendet werden. Zellen, die BPC-1 exprimieren oder überexprimieren, können ebenfalls für Immunisierungen verwendet werden. Entsprechend kann jegliche Zelle, die zur Exprimierung von BPC-1 konstruiert ist, verwendet werden. Diese Strategien können zur Produktion monoklonaler Antikörper mit erhöhten Kapazitäten zur Erkennung von endogenem BPC-1 führen. Ein anderes nützliches Immunogen umfasst BPC-1-Proteine, die an die Plasmamembran von roten Blutzellen des Schafs geknüpft sind. Außerdem können im Fachgebiet bekannte Immunisierungstechniken mit nackter DNA angewendet werden (mit oder ohne gereinigtes BPC-1-Protein oder BPC-1-exprimierende Zellen), um eine Immunantwort auf das codierte Immunogen zu generieren (für einen Überblick, siehe Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617–648).
Die Aminosäuresequenz von BPC-1, wie in 1 gezeigt, kann zum Selektieren spezifischer Regionen des BPC-1-Proteins für die Generierung von Antikörpern verwendet werden. Zum Beispiel können Analysen der Hydrophobizität und Hydrophilizität der BPC-1-Aminosäuresequenz zur Identifizierung hydrophiler Regionen in der BPC-1-Struktur angewendet werden. Regionen des BPC-1-Proteins, die eine immunogene Struktur zeigen, als auch andere Regionen und Domänen, können ohne weiteres unter Anwendung verschiedener anderer, im Fachgebiet bekannter Methoden, wie etwa der Chous-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson-Wolf-Analyse, identifiziert werden.
Die Methoden zur Generierung von BPC-1-Antikörpern werden anhand der hierin bereitgestellten Beispiele weiter veranschaulicht.
Methoden zur Präparierung eines Proteins oder Polypeptids zur Verwendung als ein Immunogen und zur Präparierung immunogener Konjugate eines Proteins mit einem Träger, wie BSA, KLH oder anderen Trägerproteinen, sind im Fachgebiet wohlbekannt. In einigen Fällen kann eine direkte Konjugation unter Verwendung beispielsweise von Carbodiimid-Reagenzien angewendet werden; in anderen Fällen können Verknüpfungsreagenzien, wie etwa die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, beziehbaren, wirksam sein. Die Verabreichung eines BPC-1-Immunogens wird generell durch Injektion über einen geeigneten Zeitraum und unter Verwendung eines geeigneten Ajduvans durchgeführt, wie im Fachgebiet allgemein gut verstanden. Während des Immunisierungsprotokolls können die Antikörper-Titer zur Bestimmung einer entsprechenden Antikörperbildung genommen werden.
BPC-1-monoklonale Antikörper sind bevorzugt und können anhand verschiedener, im Fachgebiet wohlbekannter Methoden produziert werden. Zum Beispiel können immortalisierte Zelllinien, die einen gewünschten monoklonalen Antikörper sekretieren, unter Anwendung der standardmäßigen Methode von Kohler und Milstein präpariert werden, oder von Modifikationen, die die Immortalisation von Lymphozyten oder Milzzellen bewirken, wie allgemein bekannt ist. Die immortalisierten Zelllinien, die die gewünschten Antikörper sekretieren, werden mittels Immunoassay gescreent, in welchem das Antigen das BPC-1-Protein oder BPC-1-Fragment ist. Wird die geeignete immortalisierte Zellkultur, die den gewünschten Antikörper sekretiert, identifiziert, so können die Zellen expandiert und die Antikörper entweder aus in vitro-Kulturen oder aus Aszitesflüssigkeit produziert werden.
Die Antikörper oder Fragmente können auch, unter Ausnutzung der aktuellen Technologie, mittels rekombinanter Methoden produziert werden. Regionen, die spezifisch an die gewünschten Regionen des BPC-1-Proteins binden, können ebenfalls im Zusammenhang mit chimären oder CDR-gegrafteten Antikörpern von vielfältigem Spezies-Ursprung produziert werden. Humanisierte oder humane BPC-1-Antikörper können ebenfalls produziert werden und sind zur Verwendung in therapeutischen Zusammenhängen bevorzugt. Methoden für die Humanisierung von murinen und anderen nicht-menschlichen Antikörpern durch Substituieren einer oder mehrerer der nicht-menschlichen Antikörper-CDRs durch entsprechende humane Antikörpersequenzen sind wohlbekannt (siehe zum Beispiel Jones et al., 1986, Nature 321: 522–525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323–327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534–1536). Siehe auch Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 und Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296. Zu Methoden zur Erzeugung vollhumaner monoklonaler Antikörper zählen die Phagen-Display- und transgenen Methoden (für einen Überblick, siehe Vaughan et al., 1988, Nature Biotechnology 16: 535–539).
Vollhumane BPC-1-monoklonale Antikörper können unter Anwendung von Klonierungstechnologien unter Verwendung großer humaner IgG-Gen-kombinatorischer Bibliotheken (d.h. Phagen-Display) generiert werden (Griffiths und Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Clark, M. (Hrsg.), Nottingham Academic, S. 45–64 (1993); Burton und Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries, Id., S. 65–82). Vollhumane BPC-1- monoklonale Antikörper können auch unter Verwendung transgener Mäuse produziert werden, die gentechnisch so manipuliert wurden, dass sie humane Immunglobulin-Gen-Loci enthalten, wie beschrieben in der PCT-Patentanmeldung WO 98/24893, Kucherlapati und Jakobovits et al., veröffentlicht am 3. Dezember 1997 (siehe auch Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607–614). Diese Methode vermeidet die in vitro-Manipulation, die für die Phagen-Display-Technologie erforderlich ist, und produziert wirksam hochaffine authentische humane Antikörper.
Die Reaktivität der BPC-1-Antikörper mit einem BPC-1-Protein kann mittels einer Reihe wohlbekannter Methoden, einschließlich der Western-Blot-, Immunpräzipitations-, ELISA- und FACS-Analysen, unter Verwendung, je nach Eignung, von BPC-1-Proteinen, Peptiden, BPC-1-exprimierenden Zellen oder Extrakten davon, festgestellt werden.
Ein BPC-1-Antikörper oder Fragment davon kann mit einem nachweisbaren Marker markiert werden oder an ein zweites Molekül, wie etwa ein zytotoxisches Agens, konjugiert und zum Targeting des zweiten Moleküls auf eine BPC-1-positive Zelle verwendet werden (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, In DeVita, Jr., V.T. et al., Hrsg., Cancer: Principles and Practice of Onoclogy, 4. Aufl., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624–2636). Zu Beispielen der zytotoxischen Agenzien zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ricin, Ricin A-Kette, Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Dihydroxyanthrazindion, Actinomycin D, Diphtherietoxin, Pseudomonas-Exotoxin (PE) A, PE40, Abrin, Abrin A-Kette, Modeccin A-Kette, Alpha-Sarcin, Gelonin, Mitogelin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin, Curicin, Crotin, Calicheamicin, Saponaria officinalis-Inhibitor, und Glucocorticoide und andere chemotherapeutische Mittel, als auch Radioisotope, wie ²¹²Bl, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁸Re. Zu geeigneten nachweisbaren Markern zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, ein Metallchelator oder ein Enzym. Die Antikörper können auch an ein Anti-Krebs-Pro-Drug-aktivierendes Enzym konjugiert werden, das zur Umwandlung der Prodrug zu ihrer aktiven Form fähig ist. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,975,287.
Weiterhin können bispezifische Antikörper, die für zwei oder mehr BPC-1-Epitope spezifisch sind, unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Methoden generiert werden. Außerdem können Antikörper-Effektorfunktionen so modifiziert werden, dass die therapeutische Wirkung der BPC-1-Antikörper auf das Wachstum von Krebszellen gesteigert wird. Homodimere Antikörper können ebenfalls durch im Fachgebiet bekannte Vernetzungstechniken generiert werden (z.B. Wolff et al., Can cer Res. 53: 2560–2565). Diese Antikörper können ein Mittel zur Erzielung einer verstärkten BPC-1-Hemmung bieten.
METHODEN FÜR DEN NACHWEIS VON BPC-1
Methoden für den Nachweis von BPC-1-Polynukleotiden und BPC-1-Proteinen werden hierin beschrieben, ebenso wie Methoden zur Identifizierung einer Zelle, die BPC-1 exprimiert.
Genauer gesagt werden Assays für den Nachweis von BPC-1-Polynukleotiden in einer biologischen Probe, wie etwa Serum, Knochen, Prostata und anderen Geweben, Urin, Samen, Zellpräparaten und ähnlichem, beschrieben. Zu nachweisbaren BPC-1-Polynukleotiden zählen zum Beispiel ein BPC-1-Gen oder Fragmente davon, BPC-1 mRNA, alternative Spleiß-Varianten-BPC-1 mRNAs und rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein BPC-1-Polynukleotid enthalten. Eine Anzahl von Methoden zur Amplifizierung und/oder Detektierung des Vorhandenseins von BPC-1-Polynukleotiden ist im Fachgebiet wohlbekannt und kann bei der Ausführung dieses Aspekts der Erfindung eingesetzt werden.
Bei einem Beispiel kann eine Methode zur Detektierung einer BPC-1 mRNA in einer biologischen Probe das Erzeugen von cDNAs aus der Probe durch reverse Transkription unter Verwendung mindestens eines Primers; Amplifizieren der so produzierten cDNA unter Verwendung eines BPC-1-Polynukleotids als Sense- und Antisense-Primer zur Amplifizierung der BPC-1 cDNAs darin; und Detektieren des Vorhandenseins der amplifizierten BPC-1 cDNA umfassen. Bei einem anderen Beispiel kann eine Methode zum Detektieren eines BPC-1-Gens in einer biologischen Probe zunächst das Isolieren der genomischen DNA aus der Probe; Amplifizieren der isolierten genomischen DNA unter Verwendung von BPC-1-Polynukleotiden als Sense- und Antisense-Primern zur Amplifizierung des BPC-1-Gens darin; und Detektieren des Vorhandenseins des amplifizierten BPC-1-Gens umfassen. Eine beliebige Anzahl geeigneter Kombinationen von Sense- und Antisense-Sonden kann aus den für BPC-1 (1) bereitgestellten Nukleotidsequenzen designed und für diesen Zweck verwendet werden.
Assays zum Nachweisen des Vorhandenseins eines BPC-1-Proteins in einer Gewebe- oder anderen biologischen Probe, wie etwa Serum, Knochen, Prostata und andere Gewebe, Urin, Zellpräparate und ähnliches, werden hierin beschrieben. Methoden zum Nachweisen eines BPC-1-Proteins sind ebenfalls wohlbekannt und umfassen zum Beispiel die Immunpräzipitation, immunhistochemische Analyse, Western Blot-Analyse, molekulare Bindungsassays, ELISA, ELIFA und ähnliches. Zum Beispiel kann eine Methode zum Nachweisen des Vorhandenseins eines BPC-1-Proteins in einer biologischen Probe zunächst das Kontaktieren der Probe mit einem BPC-1-Antikörper, einem BPC-1-reaktiven Fragment davon oder einem rekombinierten Protein, das eine Antigenbindungsregion eines BPC-1-Antikörpers enthält; und dann Detektieren der Bindung des BPC-1-Proteins in der Probe daran umfassen.
Methoden zum Identifizieren einer Zelle, die BPC-1 exprimiert, werden hierin ebenfalls beschrieben. Bei einem Beispiel kann ein Assay zum Identifizieren einer Zelle, die ein BPC-1-Gen exprimiert, das Detektieren des Vorhandenseins von BPC-1 mRNA in der Zelle umfassen. Methoden für den Nachweis bestimmter mRNAs in Zellen sind wohlbekannt und umfassen zum Beispiel Hybridisationsassays unter Verwendung komplementärer DNA-Sonden (wie etwa die in situ-Hybridisation unter Verwendung markierter BPC-1-Ribosonden, Northern Blot und verwandte Techniken) und verschiedene Nukleinsäure-Amplifikationsassays (wie etwa RT-PCR unter Verwendung komplementärer Primer, die für BPC-1 spezifisch sind, und andere Detektionsmethoden vom Amplifikationstyp, wie zum Beispiel verzweigte DNA, SISBA, TMA und ähnliches). Alternativ umfasst ein Assay zum Identifizieren einer Zelle, die ein BPC-1-Gen exprimiert, das Nachweisen des Vorhandenseins eines BPC-1-Proteins in der Zelle oder sekretiert durch die Zelle. Verschiedene Methoden für den Nachweis von Proteinen sind im Fachgebiet wohlbekannt und können für den Nachweis von BPC-1-Proteinen und BPC-1-exprimierenden Zellen angewendet werden.
BPC-1-Expressionsanalysen können ebenfalls als ein Mittel zum Identifizieren und Evaluieren von Agenzien nützlich sein, die die BPC-1-Genexpression modulieren. So ist beispielsweise die BPC-1-Expression bei Prostatakrebs signifikant heraufreguliert, und BPC-1 kann auch in anderen Krebsarten exprimiert werden. Die Identifizierung eines Moleküls oder biologischen Agens, das die BPC-1-Expression oder Überex pression in Krebszellen hemmen könnte, kann von therapeutischem Nutzen sein. Solch ein Agens kann unter Anwendung eines Screenings identifiziert werden, das die BPC-1-Expression durch RT-PCR, Nukleinsäure-Hybridisation oder Antikörperbindung quantifiziert.
ASSAYS FÜR DIE BESTIMMUNG DES BPC-1-EXPRESSIONSSTATUS
Eine Bestimmung des Status des BPC-1-Expressionsmusters in einem Individuum kann für die Diagnose von Krebs vorgenommen werden und kann eine prognostische Information liefern, die zur Definierung geeigneter therapeutischer Optionen nützlich ist. In ähnlicher Weise kann der Expressionsstatus von BPC-1 eine Information liefern, die zur Vorhersage der Anfälligkeit für bestimmte Krankheitsstadien, das Fortschreiten und/oder die Tumoraggressivität nützlich ist. Hierin beschrieben werden Methoden und Assays zur Bestimmung des BPC-1-Expressionsstatus und für die Diagnose von Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, wie etwa Prostata- und Blasenkrebs.
Bei einem Beispiel können Assays, die zur Bestimmung des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum, wie etwa Prostata- und Blasenkrebs, nützlich sind, das Nachweisen eines signifikanten Anstiegs der BPC-1 mRNA oder der Proteinexpression in einer Testzelle oder Gewebeprobe, relativ zu den Expressionshöhen in den entsprechenden normalen Zellen oder Geweben, umfassen. Das Vorhandensein von BPC-1 mRNA kann zum Beispiel in Gewebeproben von Dickdarm, Lunge, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Blase, Brust, Eierstock, Gebärmutter, Hoden, Kopf und Nacken, Gehirn, Magen etc. ausgewertet werden. Das Vorhandensein einer signifikanten BPC-1-Expression in irgendeinem dieser Gewebe kann zur Angabe des Auftretens, des Vorhandenseins und/oder des Schweregrads dieser Krebsarten nützlich sein, da die entsprechenden normalen Gewebe keine BPC-1 mRNA exprimieren oder sie in geringeren Mengen exprimieren.
In einem darauf bezogenen Beispiel kann der BPC-1-Expressionsstatus auf der Protein-Ebene anstelle der Nukleinsäure-Ebene bestimmt werden. Zum Beispiel würde solch eine Methode oder Assay das Bestimmen der Menge des BPC-1-Proteins, die durch Zellen in einer Testgewebeprobe oder in Serum, Samen oder Urin exprimiert wird, und Vergleichen der derart bestimmten Menge zu der Menge an BPC-1, die in einer entsprechenden normalen Probe exprimiert wird, umfassen. Bei einer Ausführungsform wird das Vorhandensein von BPC-1-Protein zum Beispiel unter Anwendung immunhistochemischer Methoden ausgewertet. BPC-1-Antikörper oder Bindungspartner, die zum Detektieren der BPC-1-Proteinexpression fähig sind, können bei einer Vielzahl von Assay-Formaten, die im Fachgebiet für diesen Zweck wohlbekannt sind, verwendet werden. Bei einem anderen Beispiel kann das Vorhandensein von sekretiertem BPC-1-Protein in Serum oder Urin oder anderen Körperflüssigkeiten untersucht werden.
Da BPC-1 ein sekretiertes Protein ist, das in Prostata-, Blasen- und möglicherweise anderen Krebsarten exprimiert wird, wird von Assays zum Detektieren und Quantifizieren von BPC-1 in Blut oder Serum erwartet, dass sie für den Nachweis, die Diagnose, die Prognose und/oder das Staging eines BPC-1-exprimierenden Tumors in einem Individuum nützlich sind. Zum Beispiel wird BPC-1 in normaler Prostata nicht exprimiert, bei Prostata- und Blasenkrebs jedoch exprimiert. Demgemäß kann der Nachweis des Serum-BPC-1 einen Hinweis auf das Vorhandensein eines Prostata- oder Blasentumors liefern. Die Diagnose von Prostata- oder Blasenkrebs kann auf der Grundlage dieser Information und/oder einer anderen Information vorgenommen werden. Bezüglich des Prostatakrebses beispielsweise kann diese andere Information Serum-PSA-Messungen, DRE und/oder Ultrasonographie umfassen. Weiterhin kann die Menge an BPC-1, die in Serum nachgewiesen wird, eine Information liefern, die für das Staging oder die Prognose nützlich ist. Zum Beispiel lassen sehr hohe Mengen an BPC-1-Protein im Serum einen größeren und/oder aggressiveren Tumor vermuten.
Die Gehirn-spezifische Expression von BPC-1 in normalen Geweben wird erwartetermaßen einen wichtigen Vorteil dieses Aspekts der Erfindung liefern, nämlich sehr geringe oder nicht-existente Hintergrund-Levels an zirkulierendem BPC-1, was in einer hohen Korrelation zwischen dem Vorhandensein von Serum-BPC-1-Protein und dem Vorhandensein von Krebs resultiert. Dieser Vorteil wird erwartetermaßen aus den Eigenschaften der Blut-Gehirn-Schranke resultieren, einem System von feinen Kapillar-Verästelungen des zentralen Nervensystems, das sich der Passage von Zellen, Pathogenen und Makromolekülen in und aus dem subarachnoidalen Raum widersetzt. Demgemäß wird von im Gehirn exprimiertem BPC-1 nicht erwartet, dass es in das Gefäßsystem freigesetzt wird. Da kein anderes getestetes normales Gewebe eine signifikante Expression von BPC-1 gezeigt hat, würde das Vorhandensein von Serum-BPC-1 das Vorhandensein eines BPC-1-exprimierenden Tumors stark vermuten lassen.
Außerdem kann peripheres Blut in bequemer Weise auf das Vorhandensein von Krebszellen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Prostatakrebs, unter Anwendung der RT-PCR zum Nachweis der BPC-1-Expression analysiert werden. Das Vorhandensein von durch RT-PCR amplifizierbarer BPC-1-mRNA liefert einen Hinweis auf das Vorhandensein von Prostatakrebs. RT-PCR-Detektions-Assays für Tumorzellen in peripherem Blut werden derzeit zur Verwendung in der Diagnose und Behandlung einer Reihe von festen Tumoren des Menschen ausgewertet. Im Bereich des Prostatakrebses zählen zu diesen die RT-PCR-Assays für die Detektion von Zellen, die PSA und PSM exprimieren (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373–384, Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195–2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687–1688). RT-PCR-Assays sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Ebenfalls hierin beschrieben werden Methoden in Bezug auf die Vorhersage einer Anfälligkeit für die Entwicklung von Krebs in einem Individuum. Bei einem Beispiel kann eine Methode zur Vorhersage der Anfälligkeit für Krebs den Nachweis von BPC-1 mRNA oder BPC-1-Protein in einer Gewebeprobe umfassen, wobei ihr Vorhandensein eine Anfälligkeit für Krebs indiziert, wobei der Grad der vorhandenen BPC-1 mRNA-Expression proportional zum Grad der Anfälligkeit ist. In einem spezifischen Beispiel kann das Vorhandensein von BPC-1 in Prostatagewebe untersucht werden, wobei das Vorhandensein von BPC-1 in der Probe einen Hinweis auf die Anfälligkeit für Prostatakrebs (oder das Auftreten oder Vorliegen eines Prostatatumors) liefert. In einem anderen spezifischen Beispiel kann das Vorhandensein von BPC-1 im Blasengewebe untersucht werden, wobei das Vorhandensein von BPC-1 in der Probe einen Hinweis auf eine Anfälligkeit für Blasenkrebs (oder das Auftreten oder Vorliegen eines Blasentumors) liefert. In noch einem weiteren spezifischen Beispiel kann das Vorhandensein von BPC-1 in Serum untersucht werden, wobei das Vorhandensein von BPC-1 einen Hinweis auf eine Anfälligkeit für (oder das Vorhandensein von) einen BPC-1-exprimierenden Tumor, wie etwa einen Blasen- oder Prostatatumor, liefert. In einem anderen Beispiel kann das Vorhandensein von BPC-1 in Urin untersucht werden, wobei das Vorhandensein von BPC-1 darin einen Hinweis auf eine Anfälligkeit für (oder das Vorhandensein von) einen BPC-1-exprimierenden Blasentumor liefert.
Ebenfalls hierin beschrieben werden Methoden zur Messung der Tumoraggressivität. Bei einem Beispiel kann eine Methode zur Messung der Aggressivität eines Tumors das Bestimmen der Menge an BPC-1 mRNA oder BPC-1-Protein, das durch die Zellen in einer Probe des Tumors exprimiert wird, Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an BPC-1 mRNA oder BPC-1-Protein, das in einem entsprechenden normalen, von demselben Individuum stammenden Gewebe exprimiert wird, oder das von einer normalen Referenz-Gewebeprobe exprimiert wird, wobei der Grad der BPC-1-mRNA- oder BPC-1-Protein-Expression in der Tumorprobe relativ zu der normalen Probe den Grad der Aggressivität anzeigt, umfassen. In einem spezifischen Beispiel kann die Aggressivität von Prostatatumoren zur Bestimmung des Umfangs ausgewertet werden, in welchem BPC-1 in den Tumorzellen exprimiert ist, wobei höhere Expressionsmengen aggressivere Tumoren anzeigen.
In einem darauf bezogenen Beispiel können die Serummengen an BPC-1 verwendet werden, um einen Hinweis auf den Umfang und die Aggressivität eines BPC-1-exprimierenden Tumors zu liefern, wobei höhere Mengen des Serum-BPC-1 einen fortgeschritteneren und aggressiveren Tumor nahe legen können. Serum-BPC-1-Messungen über die Zeit würden erwartetermaßen eine weitere Information liefern, wobei ein Anstieg im BPC-1 erwartetermaßen das Fortschreiten wiederspiegeln würde, und die Rate der Zunahme erwartetermaßen mit seiner Aggressivität korrelieren würde. In entsprechender Weise würde eine Abnahme des Serum-BPC-1 erwartetermaßen ein langsameres Wachstum oder einen sich rückbildenden Tumor wiederspiegeln. Die Identifizierung von BPC-1 im Serum kann zum Detektieren der Tumorinitiation und einer Erkrankung im Frühstadium nützlich sein, insbesondere, da die Hintergrund-BPC-1-Interferenz erwatertermaßen minimal bis nicht-existent im Hinblick auf das Gehirn-spezifische BPC-1-Expressionsprofil bei normalen Individuen ist. Bei Patienten, die einer Operation oder Therapie unterzogen wurden, wären die Serum-BPC-1-Mengen zur Überwachung der Reaktion auf die Behandlung und eines potenziellen Wiederauftretens nützlich. Als einer Alternative oder zusätzlich zu Serum-BPC-1-Messungen kann das Vorhandensein oder die Mengen an in Urin sekretiertem BPC-1 in Bezug auf Blasenkrebs nützlich sein.
Methoden zum Detektieren und Quantifizieren der Expression von BPC-1 mRNA oder -Protein sind hierin beschrieben und wenden die standardmäßige Nukleinsäure- und Protein-Detektions- und Quantifikations-Technologien an, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Zu standardmäßigen Methoden für die Detektion und Quantifizierung von BPC-1 mRNA zählen die in situ-Hybridisation unter Verwendung von markierten BPC-1-Ribosonden, Northern Blot und verwandte Techniken unter Verwendung von BPC-1-Polynukleotid-Sonden, die RT-PCR-Analyse unter Verwendung von Primern, die für BPC-1 spezifisch sind, und weitere Detektionsmethoden vom Amplifikations-Typ, wie zum Beispiel verzweigte DNA, SISBA, TMA und ähnliches. In einem spezifischen Beispiel kann eine halbquantitative RT-PCR zum Detektieren und Quantifizieren der BPC-1 mRNA-Expression angewendet werden, wie in den folgenden Beispielen beschrieben. Eine beliebige Anzahl von Primern, die zum Amplifizieren von BPC-1 fähig ist, kann zu diesem Zweck verwendet werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die verschiedenen Primer-Sets, die hierin spezifisch beschrieben sind. Standardmäßige Methoden für den Nachweis und die Quantifizierung von Protein können für diesen Zweck angewendet werden. In einem spezifischen Beispiel können polyklonale oder monoklonale Antikörper, die mit dem Wildtyp-BPC-1-Protein spezifisch reaktiv sind, in einem immunhistochemischen Assay von biopsiertem Gewebe verwendet werden.
ASSAYS FÜR ZIRKULIERENDES UND EXKRETIERTES BPC-1
Das reife BPC-1 ist ein sekretiertes Protein. Tumoren, die BPC-1 exprimieren, würden erwartungsgemäß BPC-1 in das Gefäßsystem sekretieren und/oder in Urin oder Samen ausscheiden, wo das Protein unter Anwendung von Assays und Techniken detektiert und quantifiziert werden kann, die im Gebiet der Molekulardiagnostik wohlbekannt sind. Exkretiertes BPC-1 kann auch im Urin und Samen nachgewiesen werden. Von der Detektierung und Quantifizierung der Mengen an zirkulierendem oder ausgeschiedenem BPC-1 steht eine Reihe von Anwendungen in der Diagnose, dem Staging und der Prognose von Prostata-, Blasen- und anderen solchen BPC-1-exprimierenden Tumoren zu erwarten. Eine Reihe unterschiedlicher technischer Ansätze für die Detektierung und Quantifizierung von Serumproteinen ist im Fachgebiet wohlbekannt.
Der Nachweis von BPC-1-Protein im Urin kann einen Hinweis auf das Vorhandensein eines Blasenkrebses geben, der BPC-1 sekretiert. Normalerweise werden keine signifikanten Mengen an Protein im Urin nachgewiesen, vorausgesetzt, dass die Nierenfunktion normal ist. Allerdings können Proteine, die durch Blasenkrebszellen exprimiert und sekretiert werden, direkt in den Urin in der Blase gelangen, was ihren Nachweis im Urin ermöglicht. Interessanterweise zeigt das BPC-1-Protein einen relativ hohen Grad an Stabilität in rekombinanten Zellkulturmedien, was annehmen lässt, dass das Protein auch im Urin stabil bleiben kann.
Bei einem Beispiel kann ein Fang-ELISA zum Detektieren und Quantifizieren von BPC-1 in Serum, Urin oder Samen angewendet werden. Ein Fang-ELISA für BPC-1 umfasst allgemein mindestens zwei monoklonale Antikörper unterschiedlicher Isotypen, die unterschiedliche Epitope des BPC-1-Proteins erkennen, oder einen Anti-BPC-1- monoklonalen Antikörper und ein spezifisches polyklonales Serum, das von einer anderen Spezies (z.B. Kaninchen, Ziege, Schaf, Hamster, etc.) stammt. Bei diesem Assay dient ein Reagenz als Fang-(oder Beschichtungs)-Antikörper und das andere als Nachweis-Antikörper (siehe hierin angegebenes Beispiel 13).
THERAPEUTISCHE METHODEN UND ZUSAMMENSETZUNGEN
Die Identifizierung von BPC-1 als einem sekretierten Protein, das in normalen Individuen nur in Geweben des Gehirns exprimiert wird, das aber bei Prostatakrebs in hohem Grade exprimiert wird (als auch bei Blasenkarzinom und möglichen anderen Krebsarten exprimiert wird), eröffnet eine Reihe von therapeutischen Ansätzen für die Behandlung von Prostata-, Blasen- und möglicherweise weiteren Krebsarten. Die anfängliche funktionelle Forschungsarbeit der Anmelder legt nahe, dass BPC-1 eine Transformations-Aktivität aufweist und dass diese Aktivität durch die Interaktion von BPC-1 mit einem zellulären Protein, oder durch die Bindung an oder Assoziation mit einem anderen Protein, ausgelöst wird. Die CUB-Domäne des Proteins kann auch als einer Protein-Protein-Interaktions-Domäne fungieren, die Interaktionen mit anderen sekretierten Molekülen, extrazellulären Matrixmolekülen und/oder Zelloberflächen-Rezeptoren vermittelt.
Demgemäß wird von therapeutischen Ansätzen, die auf eine Hemmung der Aktivität des BPC-1-Proteins abzielen, erwartet, dass sie für Patienten, die an Prostatakrebs, Blasenkrebs und anderen Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, leiden, nützlich sind. Diese therapeutischen Ansätze fallen generell in zwei Klassen. Eine Klasse umfasst verschiedene Methoden zur Hemmung der Bindung des BPC-1-Proteins an seinen Rezeptor, oder Hemmung seiner Bindung an oder Assoziation mit einem anderen Protein. Eine andere Klasse umfasst eine Vielfalt von Methoden zur Hemmung der Transkription des BPC-1-Gens oder der Translation der BPC-1 mRNA.
A. THERAPEUTISCHE METHODEN, BASIEREND AUF DER HEMMUNG DER BPC-1-PROTEINFUNKTION
Innerhalb der ersten Klasse der therapeutischen Ansätze werden hierin verschiedene Methoden und Zusammensetzungen zur Hemmung der Bindung von BPC-1 an seinen Rezeptor oder andere Bindungspartner oder seiner Assoziation mit einem/mehreren anderen Proteinen, als auch Methoden zur Hemmung der BPC-1-Funktion beschrieben.
A.1. THERAPEUTISCHE HEMMUNG VON BPC-1 MIT BPC-1-ANTIKÖRPERN
Bei einem Ansatz können Antikörper, die an BPC-1 binden und dabei die Fähigkeit von BPC-1 hemmen, an seinen zugehörigen Bindungspartner zu binden, oder an ein/mehrere andere Proteine zu binden oder damit zu assoziieren, zur Abschwächung eines onkogenen/Transformations-Signalwegs unter Einbeziehung von BPC-1 verwendet werden. In dem Maße, in dem BPC-1 an der Auslösung, Förderung und/oder Unterhaltung des Tumorzell-Wachstums oder anderer Tumorzell-Eigenschaften durch ein Bindungspartner-vermitteltes Signal beteiligt ist, wird von diesen Antikörpern ein therapeutischer Nutzen erwartet.
BPC-1-Antikörper und Fragmente davon, die zur Hemmung der BPC-1-Funktion fähig sind, werden als nützlich in der Behandlung von Prostata-, Blasen- und möglicherweise weiteren Krebsarten erachtet. Diese Antikörper können darin wirksam sein, die BPC-1-Aktivität in unterschiedlichen Weisen zu hemmen. Zum Beispiel kann ein BPC-1-Antikörper die BPC-1-Bindung an seinen Rezeptor oder die Bindung an/Assoziation mit einem anderen Protein verhindern.
Alternativ kann ein BPC-1-Antikörper an eine biologisch aktive Domäne des BPC-1-Proteins binden und dadurch seine Funktion hemmen. In dieser Hinsicht können Antikörper, die spezifisch auf die CUB-Domäne von BPC-1 gerichtet sind (siehe 1), besonders wirksam entweder in der Hemmung der BPC-1-Bindung (wenn die CUB-Domäne funktionell an der Bindung beteiligt ist) oder in einer anderweitigen Hemmung der Funktion der CUB-Domäne sein. Solche Domäne-spezifischen BPC-1-Antikörper können wie zuvor beschrieben erzeugt werden. Zum Beispiel kann die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz der CUB-Domäne zur Generierung eines CUB-Domänen-Immunogens für die Generierung solcher Antikörper verwendet werden.
Bezüglich der Behandlung von Krebs mit BPC-1-Antikörpern kann eine Anzahl von Faktoren erwogen werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die folgenden. Zunächst sind monoklonale Antikörper generell bevorzugt, insbesondere solche mit sehr hoher Bindungsaffinität für das sekretierte BPC-1-Protein. Zweitens sind vollhumane oder humanisierte monoklonale Antikörper, die wenig oder keine Antigenität im Patienten zeigen, bevorzugt. Die Verwendung von murinen oder anderen nicht-humanen monoklonalen Antikörpern und Mensch/Maus-chimären mAbs kann mäßige bis starke Immunantworten bei einigen Patienten induzieren. Drittens kann die Methode, mittels derer die Antikörper dem Patienten zugeführt werden, in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Typ von Krebs variieren.
Generell kann dort, wo das therapeutische Ziel die Hemmung der BPC-1-Aktivität oder Signaltransduktion in dem Ziel-Tumorgewebe ist, die Verabreichung von BPC-1-Antikörpern direkt an die Tumorstelle eine lokale Eliminierung der BPC-1-Funktion schaffen, die ausreicht, um eine klinische Reaktion zu erzielen. Die direkte Verabreichung der BPC-1-mAbs ist ebenso möglich und kann in einem bestimmten Zusam menhang Vorteile aufweisen. Zum Beispiel können die BPC-1-mAbs für die Behandlung von Blasenkarzinom direkt in die Blase injiziert werden.
Alternativ können BPC-1-Antikörper systemisch verabreicht werden, was zur Ausschaltung der BPC-1-Funktion im Primärtumor, in zirkulierenden Mikrometastasen und/oder in etablierten Metastasen führen kann. Der Grad der Tumorvaskularisation kann eine Richtlinie dafür liefern, welcher Darreichungsansatz empfehlenswert ist. In entsprechender Weise stünde von dem Grad und/oder dem Stadium der Erkrankung zu erwarten, dass sie eine nützliche Information in dieser Hinsicht liefern. Zum Beispiel kann ein hochgradigerer, fortgeschrittenerer Tumor mit größerer Wahrscheinlichkeit Metastasen streuen, was eine systemische Verabreichung nahe legt, um das Auftreten von Metastasen zu behandeln oder zu verhindern.
BPC-1-mAbs können entweder alleine als auch in Kombinationen, oder "Cocktails", verschiedener mAbs, wie etwa solchen, die unterschiedliche Epitope erkennen, therapeutisch nützlich sein. Solche mAbs-Cocktails können bestimmte Vorteile insofern aufweisen, als sie mAbs enthalten, die an unterschiedliche Epitope binden und die funktionelle Hemmung des BPC-1 verstärken. Außerdem kann die Verabreichung von BPC-1-mAbs mit anderen therapeutischen Mitteln kombiniert werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf verschiedene chemotherapeutische Mittel, Androgen-Blocker und Immunmodulatoren (z.B. IL-2, GM-CSF).
Die Behandlung von Krebs mit einem BPC-1-Antikörper wird allgemein die Verabreichung des BPC-1-Antikörper-Präparats über einen akzeptablen Verabreichungsweg, wie etwa die intravenöse Injektion (IV) oder Bolusinfusion, typischerweise bei einer Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 200 mg/kg Körpergewicht, einbeziehen. Dosen im Bereich von 10–500 mg mAb pro Woche (oder mehr) können wirksam sein und gut toleriert werden. Eine initiale Ladedosis, gefolgt von kleineren wöchentlichen Dosen des mAb-Präparats, können angewendet werden. Wie ein Fachmann des Gebiets verstehen wird, werden verschiedene Faktoren das ideale Dosierungsschema in dem jeweiligen Fall beeinflussen. Zu solchen Faktoren können zum Beispiel die Bindungsaffinität und die Halbwertszeit des oder der verwendeten mAbs, der Grad der BPC-1-Expression in dem Patienten, die gewünschte Steady-State- Konzentrationshöhe an Antikörper, die Häufigkeit der Behandlung und der Einfluss der chemotherapeutischen Mittel oder anderer, in Kombination mit der therapeutischen Zusammensetzung angewendeten Therapien umfassen.
A.2 THERAPEUTISCHE HEMMUNG DES BPC-1 MIT INTRAZELLULÄREN ANTIKÖRPERN
Bei einem anderen Ansatz können rekombinierte Vektoren, die einzelkettige Antikörper codieren, die spezifisch an BPC-1 binden, in BPC-1-exprimierende Zellen über Gentransfer-Technologien eingeführt werden, worin der codierte einzelkettige Anti-BPC-1-Antikörper intrazellulär exprimiert wird, an BPC-1-Protein bindet und dadurch seine Funktion hemmt. Methoden für die Herstellung dieser intrazellulären einzelkettigen Antikörper sind wohlbekannt. Diese intrazellulären Antikörper, auch bekannt als "Intrakörper", können spezifisch auf ein bestimmtes Kompartiment innerhalb der Zelle gezielt werden, was ein großes Maß an Kontrolle darüber liefert, wo sich die inhibitorische Aktivität der Behandlung konzentrieren wird. Diese Technologie ist im Fachgebiet erfolgreich angewendet worden (für einen Überblick, siehe Richardson und Marasco, 1995, TIBTECH Bd. 13). Von Intrakörpern ist gezeigt worden, dass sie die Expression der ansonsten abundanten Zelloberflächen-Rezeptoren nahezu eliminieren. Siehe zum Beispiel Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137–3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931–23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332–337.
Einzelkettige Antikörper umfassen die variablen Domänen der schweren und der leichten Kette, die durch ein flexibles Linker-Polypeptid verbunden sind, und werden als ein einzelnes Polypeptid exprimiert. Wahlweise können einzelkettige Antikörper als ein einzelkettiges Fragment der variablen Region, das an die konstante Region der Leichtkette gebunden ist, exprimiert werden. Wohlbekannte intrazelluläre Trafficking-Signale können in rekombinante Polynukleotid-Vektoren eingebaut werden, die solche einzelkettigen Antikörper codieren, um den exprimierten Intrakörper präzise auf das gewünschte intrazelluläre Kompartiment zu zielen. Zum Beispiel können Intrakörper, die auf das endoplasmatische Retikulum (ER) gezielt werden, so konstruiert werden, dass sie ein Leader-Peptid und wahlweise ein C-terminales ER-Retentionssignal, wie etwa das KDEL-Aminosäure-Motiv, enthalten. Intrakörper, die zur Ausübung einer Aktivität im Kern vorgesehen sind, können so konstruiert werden, dass sie ein Kernlokalisierungssignal enthalten. Lipid-Komponenten können an Intrakörper gebunden werden, um den Intrakörper an die zytosolische Stelle der Plasmamembran anzubinden. Intrakörper können auch zielgerichtet werden, um eine Funktion im Zytosol auszuüben. Zum Beispiel können zytosolische Intrakörper zur Sequestrierung von Faktoren innerhalb des Zytosols verwendet werden, wodurch sie daran gehindert werden, an ihren natürlichen zellulären Bestimmungsort transportiert zu werden.
Bei einem Beispiel können Intrakörper zum Einfangen von BPC-1 im ER verwendet werden, wodurch seine Reifung und die Sekretion aus der Zelle heraus verhindert wird. ER-anzielende Signale und/oder Leader-Peptide können in solche BPC-1-Intrakörper eingebaut werden, um das gewünschte Targeting zu erreichen. Von solchen Intrakörpern sollte erwartet werden können, dass sie BPC-1 einfangen, wenn es durch das ER prozessiert wird, wodurch die BPC-1-Prozessierung oder sein Transport durch die Plasmamembran der Zelle gehemmt wird. Diese Methode würde das Vorhandensein von sekretiertem reifem bioaktivem BPC-1 auf der Ebene des ER im wesentlichen verhindern. Solche BPC-1-Intrakörper können zur spezifischen Bindung an eine bestimmte BPC-1-Domäne, umfassend die Signalsequenz des Vorläufer-BPC-1, designed sein. Endoplasmatische Retikulum anzielende Intrakörper, die mit dem BPC-1-Protein reaktiv sind, würden erwartetermaßen das BPC-1 im endoplasmatischen Retikulum einfangen. Bei einem anderen Beispiel können Intrakörper, die spezifisch mit der CUB-Domäne von BPC-1 reaktiv sind, zur Blockierung der Funktion der BPC-1-CUB-Domäne innerhalb des Zytosols verwendet werden.
A.3. THERAPEUTISCHE HEMMUNG DES BPC-1 MIT REKOMBINIERTEN PROTEINEN
Bei einem anderen Ansatz können rekombinierte Moleküle, die zur Bindung an BPC-1 fähig sind und dadurch das BPC-1 am Zugang/Bindung an seinen zugehörigen Rezeptor oder der Assoziation mit einem anderen Protein, das am Transmittieren eines onkogenen Signals beteiligt ist, hindern, zur Hemmung der BPC-1-Funktion verwendet werden. Solche rekombinierten Moleküle können zum Beispiel den/die reaktiven Teil(e) eines BPC-1-spezifischen Antikörper-Moleküls enthalten. Bei einer speziellen Ausführungsform kann die BPC-1-Ligand-Bindungsdomäne eines BPC-1-Rezeptors oder -Bindungspartners in ein dimeres Fusionsprotein eingebaut werden, das zwei BPC-1-Ligand- Bindungsdomänen enthält, die an den Fc-Abschnitt eines humanen IgG, wie etwa humanes IgG1, geknüpft sind. Solche IgG-Abschnitte können zum Beispiel die C_H2- und C_H3-Domänen und die Gelenkregion enthalten, doch nicht die C_H1-Domäne. Solche dimeren Fusionsproteine können in löslicher Form an Patienten verabreicht werden, die an einem Krebs leiden, der mit der Expression von BPC-1 assoziiert ist, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Prostata- und Blasenkrebs, wobei das dimere Fusionsprotein spezifisch an BPC-1 bindet und dadurch die BPC-1-Interaktion mit seinem Rezeptor oder anderem Bindungspartner blockiert. Solche dimere Fusionsproteine können weiter zu multimeren Proteinen unter Anwendung bekannter Antikörper-Verknüpftungstechnologien kombiniert werden.
B. THERAPEUTISCHE METHODEN. BASIEREND AUF DER HEMMUNG DER BPC-1-TRANSKRIPTION ODER -TRANSLATION
Innerhalb der zweiten Klasse der therapeutischen Ansätze werden hierin verschiedene Methoden und Zusammensetzungen zur Hemmung der Transkription des BPC-1-Gens beschrieben. Entsprechend werden hierin Methoden und Zusammensetzungen zur Hemmung der Translation der BPC-1 mRNA in Protein beschrieben.
Bei einem Ansatz umfasst eine Methode zur Hemmung der Transkription des BPC-1-Gens das Kontaktieren des BPC-1-Gens mit einem BPC-1-Antisense-Polynukleotid. Bei einem anderen Ansatz umfasst eine Methode zur Hemmung der BPC-1-mRNA-Translation das Kontaktieren der BPC-1 mRNA mit einem Antisense-Polynukleotid. Bei einem weiteren Ansatz kann ein BPC-1-spezifisches Ribozym zur Spaltung der BPC-1-Message verwendet werden, wodurch die Translation gehemmt wird. Solche Antisense- und Ribozym-basierte Methoden können auch auf die regulatorischen Regionen des BPC-1-Gens gerichtet sein, wie etwa die BPC-1-Promotor- und/oder Enhancer-Elemente. Entsprechend können Proteine, die zur Hemmung eines BPC-1-Gentranskriptionsfaktors fähig sind, zur Hemmung der BPC-1-mRNA-Transkription verwendet werden. Die verschiedenen Polynukleotide und Zusammensetzungen, die bei den zuvor genannten Methoden nützlich sind, sind oben be schrieben worden. Die Verwendung von Antisense- und Ribozym-Molekülen zur Hemmung der Transkription und Translation ist im Fachgebiet wohlbekannt.
Die 5' untranslatierte Region (UTR) der BPC-1 cDNA der 1 ist eine extrem GC-reiche Sequenz, was das Vorhandensein von Translationskontrollelementen innerhalb dieses Teil der BPC-1 mRNA stark impliziert. Dieses Charakteristikum des BPC-1-Gens legt nahe, dass eine Blockierung der Zugänglichkeit der 5' UTR zur Hemmung der BPC-1-Translation führen kann. Bei einem Ansatz wird ein Antisense-Molekül, das zu der 5' UTR der BPC-1 mRNA komplementär ist, mit der 5' UTR der BPC-1-Message kontaktiert, was zu einer Hybridisation führt, die die endogenen BPC-1-Translationsfaktoren am Zugang zu dem/den erforderlichen Aktivierungselement(en) in der BPC-1 5' UTR hindert. Eine Modifikation dieses Ansatzes verwendet ein Polynukleotid, das eine Sequenz umfasst, die zu der 5' UTR BPC-1 mRNA komplementär ist, in Bindung an ein Ribozym oder ein ähnlich aktives Polynukleotid, das zum Spleißen der BPC-1 mRNA fähig ist, was dem eine zweite Stufe der Translationshemmung hinzuaddiert.
Obschon bei der obigen Methode ein BPC-1-Spleißing-Ribozym mit der BPC-1 mRNA separat kontaktiert werden kann, d.h. nicht gebunden an eine heterologe Sequenz, wie etwa die oben erwähnte Anti-5'-UTR, würde das Bereitstellen des Ribozyms oder eines ähnlich aktiven Polynukleotids als Teil solch eines heterologen BPC-1-hybridisierenden Polynukleotids der Erwartung nach dazu führen, dass das Ribozym in die direkte Nähe zu der Zielsequenz gebracht wird, was zu einem höheren Grad an inhibitorischer Aktivität führen kann.
Weitere Faktoren, die die Transkription des BPC-1 durch Beeinträchtigung der Transkriptionsaktivierung von BPC-1 hemmen, können ebenfalls für die Behandlung von Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, nützlich sein, und Behandlungsmethoden für Krebs, die diese Faktoren ausnützen, befinden sich ebenfalls innerhalb des Rahmens der Erfindung. Entsprechend können Faktoren, die zur Beeinträchtigung der BPC-1-Prozesierung fähig sind, für die Behandlung von Krebsarten, die BPC-1 exprimieren, nützlich sein.
C. ALLGEMEINE ÜBERLEGUNGEN
Gentransfer- und Gentherapie-Technologien können für den Transport therapeutischer Polynukleotid-Moleküle (d.h. Antisense-, Ribozym-, Poynukleotide, die Intrakörper codieren, und andere BPC-1-inhibitorische Moleküle) zu Tumorzellen, die BPC-1 synthetisieren, verwendet werden. Eine Anzahl gentherapeutischer Ansätze ist im Fachgebiet bekannt. Rekombinierte Vektoren, die BPC-1-Antisense-Polynukleotide, Ribozyme, Faktoren, die zur Beeinflussung der BPC-1-Transkription fähig sind, Faktoren, die zur Beeinflussung der Prozessierung und/der Sekretion des reifen BPC-1 fähig sind, und so weiter, codieren, können zu Ziel-Tumorzellen unter Verwendung dieser gentherapeutischer Ansätze transportiert werden.
Die obigen therapeutischen Ansätze können mit Chemotherapie- oder Strahlentherapie-Regimen kombiniert werden. Diese therapeutischen Ansätze können auch die Anwendung herabgesetzter Dosierungen der begleitenden Chemotherapie, insbesondere bei Patienten, die die Toxizität der chemotherapeutischen Mittel nicht gut tolerieren, möglich machen.
Die Antitumor-Aktivität einer bestimmten Zusammensetzung (z.B. Antikörper, Ribozym, rekombiniertes Fusionsprotein), oder einer Kombination solcher Zusammensetzungen, kann unter Anwendung verschiedener in vitro- und in vivo-Assaysysteme ausgewertet werden. In-vitro-Assays zur Auswertung des therapeutischen Potenzials umfassen Zellwachstums-Assays, Weichagar-Assays und andere Assays, die für die Tumor-fördernde Aktivität Indikativ sind, Bindungsassays, die zur Bestimmung des Umfangs fähig sind, in dem eine therapeutische Zusammensetzung die Bindung von BPC-1 an seinen zugehörigen Rezeptor oder anderen Bindungspartner hemmen wird, Zelladhäsions-Assays und ähnliche. Zum Beispiel hemmt ein Antikörper gegen HER2 die Bindung des Liganden an den Rezeptor und führt zur Hemmung des Tumorwachstums. Außerdem hemmen zum Beispiel Antikörper zu EGFR die Bindung von EGF an Rezeptor, was zum Wachstumsstillstand und zur Tumorhemmung führt. Siehe auch die nachstehenden Beispiele.
Verschiedene in-vitro-Assays zur Bestimmung der Bindungsaffinität der therapeutischen Zusammensetzung für ihr Ziel sind ebenfalls bekannt. Zum Beispiel können die Bindungsaffinitäten von BPC-1-Antikörpern unter Anwendung einer Reihe von im Fachgebiet wohlbekannten Techniken (z.B. BIAcore-Technologie) bestimmt werden. Von BPC-1-Antikörpern mit höherer Affinität wird erwartet, dass sie höhere Levels der gewünschten Inhibition liefern, weshalb sie bevorzugt sind.
In vivo kann der Effekt einer BPC-1-therapeutischen Zusammensetzung in einem geeigneten Tiermodell ausgewertet werden. Zum Beispiel sind xenogene Prostatakrebsmodelle, worin humane Prostatakrebs-Explantate oder passagierte Xenograft-Gewebe in immungeschwächte Tiere, wie etwa Nackt- oder SCID-Mäuse, eingeführt werden, in Bezug auf Prostatakrebs geeignet und sind beschrieben worden (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402–408). Zum Beispielt beschreibt die PCT-Patentanmeldung WO 98/16628, Sawyers et al., veröffentlicht am 23. April 1998, verschiedene Xenograft-Modelle des humanen Prostatakrebses, die zur Rekapitulierung der Entwicklung von Primärtumoren, Mikrometastasen und der Bildung von osteoblastischen Metastasen, die für die Erkrankung im Spätstadium charakteristisch sind, fähig sind. Verschiedene Blasenkarzinommodelle sind bekannt (siehe zum Beispiel Russell et al., 1986, Cancer Res. 46: 2035–2040; Raghavan et al., 1992, Semin. Surg. Oncol. 8: 279–284; Rieger et al., 1995 Br. J. Cancer 72: 683–690; Oshinsky et al., 1995, J. Urol. 154: 1925–1929). Die Wirksamkeit kann unter Anwendung von Assays vorausgesagt werden, die die Hemmung der Tumorbildung, Tumorregression oder Metastasenbildung und ähnliches messen. Siehe auch die nachstehenden Beispiele.
In-vivo-Assays, die die Förderung der Apoptose qualifizieren, können ebenfalls zur Auswertung der potenziellen therapeutischen Zusammensetzungen nützlich sein. In einem Beispiel können Xenografte von solche tragenden Mäusen, die mit der therapeutischen Zusammensetzung behandelt sind, in Gegenwart der apoptotischen Foki untersucht und zu unbehandelten Xenograft-tragenden Kontrollmäusen verglichen werden. Der Umfang, in dem apoptotische Foki in den Tumoren der behandelten Mäuse gefunden werden, würde eine Indikation der therapeutischen Wirksamkeit der Zusammensetzung liefern.
Die in der Ausführung der vorangegangenen Methoden verwendeten therapeutische Zusammensetzungen können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die einen Träger umfassen, der für die gewünschte Transfermethode geeignet ist. Zu geeigneten Trägern zählen jegliche Materialien, welche in Kombination mit der therapeutischen Zusammensetzung die Antitumor-Funktion der therapeutischen Zusammensetzung beibehalten und nicht-reaktiv mit dem Immunsystem des Patienten sind. Zu Beispielen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, jegliche aus einer Anzahl standardmäßiger pharmazeutischer Träger, wie etwa sterile Phosphatgepufferte Salinelösungen, bakteriostatisches Wasser und ähnliches (siehe generell Remington's Pharmaceutical Sciences 16. Auflage, A. Osal., Hrsg., 1980).
Therapeutische Formulierungen können solubilisiert und über jeglichen Weg verabreicht werden, der zum Transport der therapeutischen Zusammensetzung an die Tumorstelle in der Lage ist. Potenziell wirksame Verabreichungswege umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, den intravenösen, parenteralen, intraperitonealen, intramuskulären, intratumoralen, intradermalen, intraorganischen, orthotopischen und ähnliche. Eine bevorzugte Formulierung für die intravenöse Injektion umfasst die therapeutische Zusammensetzung (d.h. BPC-1- monoklonalen Antikörper) in einer Lösung von konserviertem bakteriostatischem Wasser, sterilem unkonserviertem Wasser und/oder verdünnt in Polyvinylchlorid- oder Polyethylenbeuteln, die 0,9% steriles Natriumchlorid für die Injektion, USP, enthalten. Das Anti-BPC-1-mAb-Präparat kann lyophilisiert und als ein steriles Pulver, vorzugsweise unter Vakuum, gelagert und dann in bakteriostatischem Wasser, das zum Beispiel Benzylalkohol-Konservierungsstoff enthält, oder in sterilem Wasser vor der Injektion rekonstitutiert werden.
Die Dosierungen und Verabreichungsprotokolle für die Behandlung von Krebsarten unter Anwendung der vorangegangenen Methoden werden je nach Methode und Ziel-Krebs variieren und werden generell von einer Anzahl weiterer Faktoren, die im Fachgebiet anerkannt sind, abhängen.
KREBS-IMPFSTOFFE
Hierin beschrieben werden Prostatakrebs-Impfstoffe, die ein BPC-1-Protein oder Fragment davon umfassen. Die Verwendung eines Tumorantigens in einem Impfstoff zur Erzielung einer humoralen und zellvermittelten Immunität zur Anwendung in der Antikrebstherapie ist im Fachgebiet wohlbekannt und ist bei Prostatakrebs unter Verwendung von humanen PSMA- und Nager-PAP-Immunogenen eingesetzt worden (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231–237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113–3117). Diese Methoden können ohne weiteres unter Verwendung eines BPC-1-Proteins oder Fragments davon oder eines BPC-1-codierenden Nukleinsäure-Moleküls und rekombinanten Vektors, der zur Exprimierung und entsprechenden Präsentierung des BPC-1-Immunogens fähig ist, durchgeführt werden.
Zum Beispiel können virale Gentransfersysteme zur Übertragung eines BPC-1-codierenden Nukleinsäure-Moleküls verwendet werden. Verschiedene virale Gentransfersysteme, die in der Ausführung dieses Aspekts der Erfindung angewendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Vaccinia-, Geflügelpocken-, Kanarienpocken-, Adenovirus, Influenza-, Polyvirus, Adeno-assoziiertes Virus, Lentivirus und Sindbus-Virus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658–663). Nicht-virale Transfersysteme können ebenfalls unter Verwendung nackter DNA, die ein BPC-1-Protein oder Fragment davon codiert, verwendet und in den Patienten zur Induzierung einer Antitumorreaktion eingeführt werden (z.B. intramuskulär). In einem Beispiel kann eine humane Volllängen-BPC-1 cDNA verwendet werden. In einem anderen Beispiel können BPC-1-Nukleinsäure-Moleküle verwendet werden, die spezifische zytotoxische T-Lymphozyten-(CTL)-Epitope codieren. Die CTL-Epitope können unter Verwendung spezifischer Algorithmen (z.B. Epimer, Brown University) zur Identifizierung von Peptiden innerhalb eines BPC-1-Proteins, die zur optimalen Bindung an spezifische HLA-Allele fähig sind, bestimmt werden.
Verschiedene ex vivo-Strategien können ebenfalls angewendet werden. Ein Ansatz bezieht die Verwendung dendritischer Zellen ein, um das BPC-1-Antigen dem Immunsystem eines Patienten zu präsentieren. Dendritische Zellen exprimieren MHC Klasse I und II, B7-Costimulator und IL-12 und sind somit hochspezialisierte Antigenpräsentierende Zellen. Bei Prostatakrebs werden autologe dendritische Zellen, die mit Peptiden des Prostata-spezifischen Membranantigens (PSMA) gepulst sind, in einer klinischen Studie der Phase I zur Stimulierung der Immunsysteme von Prostatakrebs-Patienten verwendet (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65–69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371–380). Dendritische Zellen können zum Präsentieren von BPC-1-Peptiden an T-Zellen im Zusammenhang mit den MHC Klasse I und II-Molekülen verwendet werden. IN einem Beispiel können autologe dendritische Zellen mit BPC-1-Peptiden gepulst werden, die zur Bindung an MHC-Moleküle fähig sind. In einem anderen Beispiel können dendritische Zellen mit dem vollständigen BPC-1-Protein gepulst werden. Noch ein anderes Beispiel bezieht das gentechnische Herbeiführen der Überexpression des BPC-1-Gens in dendritischen Zellen unter Verwendung verschiedener, im Fachgebiet bekannter implementierender Vektoren ein, wie etwa Adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17–25), Retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763–3770), Lentivirus, Adeno-assoziiertes Virus, DNA-Transfektion (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865–2869) und Tumor-abgeleitete RNA-Transfektion (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177–1182). BPC-1 exprimierende Zellen können ebenfalls zur Exprimierung von Immunmodulatoren, wie etwa GM-CSF, gentechnisch konstruiert und als immunisierende Agenzien verwendet werden.
Anti-idiotypische Anti-BPC-1-Antikörper können können in der Antikrebstherapie auch als ein Impfstoff zum Induzieren einer Immunantwort auf Zellen, die ein BPC-1-Protein exprimieren, verwendet werden. Spezifisch ist die Generierung anti-idiotypischer Antikörper im Fachgebiet wohlbekannt und kann ohne weiteres zur Generierung anti-idiotypischer Anti-BPC-1-Antikörper, die ein Epitop eines BPC-1-Proteins nachahmen, adaptieren werden (siehe zum Beispiel Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33–40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334–342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65–76). Solch ein anti-idiotypischer Antikörper kann bei Krebsimpfstoff-Strategien verwendet werden.
Genetische Immunisierungsmethoden können zur Generierung prophylaktischer oder therapeutischer humoraler und zellulärer Immunantworten, die sich gegen BPC-1 exprimierende Krebszellen richten, angewendet werden. Konstrukte, die DNA, die ein BPC-1-Protein/Immunogen codiert, und entsprechende regulatorische Sequen zen umfassen, können direkt in den Muskel oder die Haut eines Individuums injiziert werden, so dass die Zellen des Muskels oder der Haut das Konstrukt aufnehmen und das codierte BPC-1-Protein/Immunogen exprimieren. Die Expression des BPC-1-Protein-Immunogens führt zur Schaffung einer prophylaktischen oder therapeutischen humoralen und zellulären Immunität gegen Prostatakrebs. Verschiedene, im Fachgebiet bekannte prophylaktische und therapeutische genetische Immunisierungstechniken können angewendet werden (für einen Überblick, siehe die in der Internet-Adresse www.genweb.com veröffentlichte Information und Literaturverweise).
KITS
Zur Verwendung bei den oben beschriebenen oder vorgeschlagenen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen können auch Kits bereitgestellt werden. Solche Kits können eine Trägervorrichtung umfassen, die zur Aufnahme in dichter Enge einer oder mehrerer Behältervorrichtungen kompartimentalisiert ist, wie zum Beispiel Phiolen, Röhrchen und ähnliches, wobei jede der Behältervorrichtungen eines der bei der Methode zu verwendenden Elemente separat enthält. Zum Beispiel kann eine der Behältervorrichtungen eine Sonde umfassen, die nachweisbar markiert ist oder werden kann. Diese Sonde kann ein Antikörper oder Polynukleotid sein, das für ein BPC-1-Protein oder ein BPC-1-Gen bzw. Message spezifisch ist. Wo der Kit die Nukleinsäure-Hybridisation zum Nachweis der Ziel-Nukleinsäure anwendet, kann der Kit auch Behälter aufweisen, die Nukleotid(e) für die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäuresequenz enthalten, und/oder einen Behälter, der ein Reporter-Element enthält, wie etwa Biotin-bindendes Protein, z.B. Avidin oder Streptavidin, in Bindung an ein Reporter-Molekül, wie etwa eine enzymatische, fluoreszierende oder radioisotopische Markierung.
BEISPIELE
Verschiedene Aspekte der Erfindung werden anhand der mehreren Beispiele, die folgen, weiter beschrieben und veranschaulicht werden, von denen aber keines zur Beschränkung des Rahmens der Erfindung beabsichtigt ist.
BEISPIEL 1:
ISOLIERUNG DES cDNA-FRAGMENTS DES BPC-1-GENS
MATERIALIEN UND METHODEN
LAPC-Xenografte:
LAPC-Xenografte wurden erhalten von Dr. Charles Sawyers (UCLA) und wie beschrieben generiert (Klein et al., 1997, Nature Med. 3: 402–408). Androgenabhängige und -unabhängige LAPC-4-Xenografte (LAPC-4 AD bzw. Al) und LAPC-9 AD-Xenografte wurden in männlichen SCID-Mäusen gezüchtet und wurden als kleine Gewebeklumpen in männlichen Empfängern passagiert. Die LAPC-4 Al-Xenografte waren von LAPC-4 AD-Tumoren abgeleitet. Männliche Mäuse, die LAPC-4 AD-Tumoren trugen, wurden kastriert und für 2–3 Monate gehalten. Nachdem die LAPC-4-Tumoren wieder gewachsen waren, wurden die Tumoren geerntet und in kastrierten Männchen oder in weiblichen SCID-Mäusen passagiert.
Zelllinien:
Humane Zelllinien (z.B. HeLa) wurden von der ATCC erhalten und wurden in DMEM mit 10% fetalem Kälberserum aufbewahrt.
RNA-Isolierung:
Tumorgewebe und Zelllinien wurden in Trizol-Reagenz (Life Technologies, Gibco BRL) unter Verwendung von 10 ml/g Gewebe oder 10 ml/10⁸ Zellen zur Isolierung der Gesamt-RNA homogenisiert. Poly A-RNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von Qiagen Oligotex mRNA Mini und Midi-Kits ausgereinigt. Gesamt-RNA und mRNA wurden mittels spektrophotometrischer Analyse (O.D. 260/280 nm) quantifiziert und mittels Gelelektrophorese analysiert.
Oligonukleotide:
Die folgenden HPLC-gereinigten Oligonukleotide wurden verwendet.
DPNCDN (cDNA-Synthese-Primer):

5'TTTTGATCAAGCTT₃₀3'

Adaptor 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' 3'GGCCGTCCTAG5'

Adaptor 2:

5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' 3'CGGCTCCTAG5'

PCR-Primer 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3'

Nested Primer (NP)1:

5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3'

Nested Primer (NP)2:

5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3'

Suppressions-subtraktive Hybridisierung:
Eine Suppressions-subtraktive Hybridisierung (SSH) wurde angewendet, um die cDNAs entsprechend der Gene zu identifizieren, die bei Androgen-unabhängigem Prostatakrebs im Vergleich zu Androgen-abhängigem Prostatakrebs herabreguliert sein können.
Doppelsträngige cDNAs entsprechend dem LAPC-4 AD-Xenograft (Tester) und dem LAPC-4 AI-Xenograft (Driver) wurden aus 2 μg an poly(A)* RNA, isoliert aus Xenograftgewebe, wie oben beschrieben, unter Verwendung des CLONTECH PCR-Select cDNA-Subtraktions-Kit und von 1 ng an Oligonukleotid-DPNCDN als Primer synthetisiert. Eine Erst- und Zweitstrang-Synthese wurden durchgeführt, wie im Protokoll der Gebrauchsanleitung des Kits (CLONTECH Protokoll Nr. PT1117-1, Katalog-Nr. K1804-1) beschrieben. Die resultierende cDNA wurde mit Dpn II für 3 Std. bei 37°C verdaut. Die verdaute cDNA wurde mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.
Driver-cDNA (LAPC-4 AI) wurde durch Kombinieren in einem 1:1-Verhältnis von mit Dpn II verdauter LAPC-4 AI cDNA mit einem Gemisch aus verdauten cDNAs, die von humaner benigner Prostatahyperplasie (BPH), den humanen Zelllinien HeLa, 293, A431, Colo205 und Mäuseleber stammten, erzeugt.
Tester-cDNA (LAPC-4 AD) wurde durch Verdauen von 1 μl an mit Dpn II verdauter LAPC-4 AD cDNA (400 ng) in 5 μl Wasser erzeugt. Die verdünnte cDNA (2 μl, 160 ng) wurde dann an 2 μl von Adaptor 1 und Adapter 2 (10 μM) in separaten Ligationsreaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 μl bei 16°C über Nacht unter Verwendung von 400 μ an T4 DNA-Ligase (CLONTECH) ligiert. Die Ligation wurde mit 1 μl an 0,2 M EDTA und Erhitzen bei 72°C für 5 min. beendet.
Die erste Hybridisation wurde durch Zugabe von 1,5 μl (600 ng) an Driver-cDNA zu jedem der beiden Röhrchen, die 1,5 μl (20 ng) Adaptor 1- und Adaptor 2-ligierte Tester-cDNA enthielten, vorgenommen. Bei einem Endvolumen von 4 μl wurden die Proben mit Mineralöl überschichtet, in einem MJ Research-Wärmezyklierer bei 98°C für 1,5 Minuten denaturiert, woraufhin sie für 8 Stunden bei 68°C hybridisieren durften. Die beiden Hybridisationen wurden dann mit einem weiteren 1 μl der frischen denaturierten Driver-cDNA gemischt und durften über Nacht bei 68°C hybridisieren. Die zweite Hybridisation wurde dann in 200 μl an 20 mM Hepes, pH 8,3, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA verdünnt, bei 70°C für 7 min. erhitzt und bei –20°C gelagert.
PCR-Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung der durch SSH generierten Genfragmente:
Um die Genfragmente zu amplifizieren, die aus den SSH-Reaktionen resultierten, wurden 2 PCR-Amplifikationen vorgenommen. In der primären PCR-Reaktion wurde 1 μl des verdünnten fertigen Hybridisationsgemischs 1 μl des PCR-Primers 1 (10 μM), 0,5 μl dNTP-Gemisch (10 mM), 2,5 μl an 10 × Reaktionspuffer (CLONTECH) und 0,5 μl an 50 × Advantage cDNA-Polymerase-Mix (CLONTECH) in einem Endvolumen von 25 μl zugegeben. Die PCR 1 wurde unter den folgenden Bedingungen vorgenommen: 75°C für 5 min., 94°C für 25 sek., dann 27 Zyklen von 94°C für 10 sek., 66°C für 30 sek., 72°C für 1,5 min. Fünf separate primäre PCR-Reaktionen wurden für jedes Experiment vorgenommen. Die Produkte wurden gepoolt und 1:10 mit Wasser verdünnt. Für die zweite PCR-Reaktion wurde 1 μl aus der gepoolten und verdünnten primären PCR-Reaktion demselben Reaktionsgemisch wie für PCR 1 verwendet zugegeben, außer, dass Primer NP1 und NP2 (10 μM) anstelle des PCR-Primers 1 verwendet wurden. Die PCR 2 wurde mittels 10–12 Zyklen von 94°C für 10 sek., 68°C für 30 sek., 72°C für 1,5 Minuten vorgenommen. Die PCR-Produkte wurden unter Anwendung einer 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Die PCR-Produkte wurden in pCR2.1 unter Verwendung des T/A-Vektor-Klonierungskits (Invitrogen) inseriert. Transformiertes E. coli wurde einer Blau/Weiß- und Ampicillin-Selektion unterzogen. Weiße Kolonien wurden gepickt und in 96-Well-Platten vereinzelt und in Flüssigkultur über Nacht gezüchtet. Um Inserte zu identifizieren, wurde eine PCR-Amplifikation an 1 ml der Bakterienkultur unter Anwendung der Bedingungen der PCR1 und von NP1 und NP2 als Primern vorgenommen. Die PCR-Produkte wurden unter Anwendung einer 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Die Bakterienklone wurden in 20% Glycerol in einem 96-Well-Format gelagert. Plasmid-DNA wurde präpariert, sequenziert und Nukleinsäure-Homologie-Durchsuchungen der GenBank-, dBest- und NCI-CGAP-Datenbanken unterzogen.
RT-PCR-Expressionsanalyse:
Erststrang-cDNAs wurden aus 1 μg mRNA mit Oligo (dt)12-18-Priming unter Verwendung des Gibco-BRL-Superscript-Präamplifikationssystems generiert. Die Protokoll des Herstellers wurde befolgt, welches eine Inkubation für 50 min. bei 42°C mit Reverser Transkriptase beinhaltete, gefolgt von einer RNAse H-Behandlung bei 37°C für 20 min. Nach Vollständigkeit der Reaktion wurde das Volumen auf 200 μl mit Wasser vor der Normalisation erhöht. Erststrang-cDNAs aus 16 verschiedenen normalen menschlichen Geweben wurden von Clontech erhalten.
Die Normalisation der Erststrang-cDNAs aus multiplen Geweben wurde unter Verwendung der Primer 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' und 5'agccacacgcagctcattgtagaagg3' zur Amplifikation von β-Aktin vorgenommen. Erststrang-cDNA (5 μl) wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das 0,4 μM Primer, 0,2 μM jeder dNTPs, 1 × PCR-Puffer (Clontech, 10 mM Tris-HCL, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, pH 8,3) und 1 × Klentaq DNA-Polymerase (Clontech) enthielt, amplifiziert. Fünf μl der PCR-Reaktion wurden nach 18, 20 und 22 Zyklen entfernt und für die Agarose-Gelelektrophorese verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung eines MJ Research-Thermozyklierers unter den folgenden Bedingungen vorgenommen: die anfängliche Denaturierung war bei 94°C für 15 sek., gefolgt von 18, 20 und 22 Zyklen von 94°C für 15 min., 65°C für 2 min., 72°C für 5 sek. Eine abschließende Extension bei 72°C wurde für 2 min. vorgenommen. Nach der Agarose-Gelelektrophorese wurden die Bandenintensitäten der 283 bp β-Aktin-Banden von multiplen Geweben durch Inaugenscheinnahme verglichen. Die Verdünnungsfaktoren für die Erststrang-cDNAs wurden berechnet, was gleiche β-Aktin-Bandenintensitäten für alle Gewebe nach 22 Zyklen der PCR ergab. Drei Runden einer Normalisation waren erforderlich, um gleiche Bandenintensitäten in allen Gewebe nach 22 Zyklen der PCR zu erreichen.
Um die Epressionshöhen des 19P1E8-Gens zu bestimmen, wurden 5 μl an normalisierter Erststrang-cDNA mittels PCR unter Anwendung von 25, 30 und 35 Zyklen der Amplifikation unter Verwendung der folgenden Primerpaare analysiert, die designed waren mit Hilfe von (MIT; für Einzelheiten, siehe www.genome.wi.mit.edu):
5'-TGC CGT ATG TCA CTG TCT CTA GGT-3'
5'-GAA ATC ATG GGT ATT TCA TGT GCT-3'
Diese Primer wurden aus der Sequenz des SSH-Fragments des ursprünglich isolierten 19P1E8-Gens designed. Die Verwendung des folgenden Primerpaars, basierend auf Sequenzen innerhalb des offenen Leserahmens des 19P1E8-Gens, erzielte dasselbe Expressionsmuster.
5'-CTC CCA ACT ATC CCA GCA AGT ATC-3'
5-AAA TCC CAT AGA TTC CAG CTC TCC-3'
Eine halbquantitative Expressionsanalyse wurde durch Vergleich der PCR-Produkte bei Zykluszahlen erreicht, die geringe Bandenintensitäten ergaben.
ERGEBNISSE:
Mehrere SSH-Experimente wurden durchgeführt, wie beschrieben bei obigen Materialien und Methoden, die zur Isolierung zahlreicher Kandidaten-Genfragment-Klone (SSH-Klone) führten. Alle Kandidaten-Klone wurden sequenziert und einer Homologieanalyse gegen alle Sequenzen in den großen öffentlichen Gen- und EST-Datenbanken unterzogen, um eine Information zur Identität des entsprechenden Gens zu liefern und um eine Hilfestellung für die Entscheidung zu bieten, ein bestimmtes Gen auf eine differenzielle Expression hin zu analysieren. Ganz allgemein wurden Genfragmente, die keine Homologie zu irgendeiner bekannten Sequenz in irgendeiner der durchsuchten Datenbanken aufwiesen und somit als neue Gene darstellend betrachtet wurden, als auch Genfragmente, die eine Homologie zu zuvor sequenzierten exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) aufwiesen, einer differenziellen Expressionsanalyse mittels RT-PCR und/oder Northern-Analyse unterzogen.
Einer der SSH-Klone, der etwa 700 by umfasste, zeigte keine Homologie zu irgendeinem bekannten Gen oder der EST-Sequenz und wurde als 19P1E8 bezeichnet. Die Nukleotidsequenz dieses SSH-Klons ist in 1 gezeigt, nämlich etwa die Nukleotidreste 1883-2583. Die differenzielle Expressionsanalyse mittels Northern-Blot zeigte, dass 19P1E8 in LAPC-4 AD-Xenograft exprimiert wird, und in einem wesentlich geringeren Umfang in LAPC-4 AI, LAPC-9 AD und LAPC-9 AI (9). Keine Expression wurde in normaler Prostata detektiert (9). Drei unterschiedliche Transkripte sind gezeigt, mit Größen von 3,5 kb, 8 kb und größer als 9 kb.
Die RT-PCR-Analyse der 19P1E8-Expression ergab im Wesentlichen identische Ergebnisse (5, Panel A). Außerdem detektierte eine weitere RT-PCR-Expressionsanalyse der Erststrang-cDNAs von 16 normalen Geweben die Expression des 19P1E8-Gens lediglich in Gehirn, Milz und Hodengewebe, und lediglich bei sehr geringen Mengen, die bei 35 und nicht 30 Zyklen der PCR-Amplifikation detektierbar waren (5, Panels B und C). Im Vergleich dazu wurde eine beträchtliche Expression in LAPC-4 AD bei lediglich 30 Zyklen detektiert (5).
BEISPIEL 2:
ISOLIERUNG DER VOLLLÄNGEN-BPC-1-CODIERENDEN cDNA
Der obige 19P1E8-SSH-Klon (Beispiel 1) wurde zur Isolierung einer Volllängen-19P1E8 cDNA verwendet. Kurz gesagt wurde eine cDNA-Bibliothek, die aus LAPC-4 mRNA generiert war, mit einer markierten Sonde gescreent, die aus dem SSH-Klon erzeugt war. Spezifisch wurde eine Volllängen-19P1E8 cDNA aus 2639 Basenpaaren (bp) aus einer LAPC-4 AD cDNA-Bibliothek kloniert, die in Lambda ZAP Express (Stratagene) generiert war.
Die cDNA codiert einen offenen Leserahmen (ORF) von 158 Aminosäuren, der eine Signalsequenz und eine CUB-Domäne (Complement Sub-Komponenten C1r/C1s, Uegf, Bmp1) enthält (Borck und Beckmann, 1993, J. Mol. Biol. 231: 539–545). Die 5' UTR (untranslatierte Region) ist sehr GC-reich, was vermuten lässt, dass diese Region regulatorische Elemente für die Translation enthält. CUB-Domänen wurden ursprünglich in Komplement-Sub-Komponenten Clr und Cls gefunden, und wurden anschließend in Uegf (auf epidermalen Wachstumsfaktor bezogenes Seeigel-Protein) und Bmp1 (knochenmorphogenetisches Protein 1), einer Protease, die an der Knochenentwicklung beteiligt ist, gefunden.
Im Hinblick auf die ausschließliche Expression dieses Gens im Gehirn und seine Heraufregulierung in Prostatakrebs-Xenograften wurde dieses Gen als BPC-1 (Brain/Prostate Cancer CUB protein) bezeichnet. Die Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der isolierten BPC-1 cDNA sind in 1 gezeigt. Eine schematische Darstellung der BPC-1-Struktur ist in 2 gezeigt. Ein Aminosäure-Alignment zwischen der CUB-Domäne von BPC-1 und den CUB-Domänen von anderen Proteinen ist in 3 gezeigt. Bezugnehmend auf 3 ist von besonderem Interesse, dass die CUB-Domäne von BPC-1 zu 30–40% identisch zu den CUB-Domänen in BMP-1 ist.
Die Vollängen-BPC-1-cDNA (p19P1E8, Klon 6.1) wurde bei der American Type Culture Collection am 7. August 1998 hinterlegt und ihr die ATCC-Zugriffsnummer 98833 zugeordnet.
BEISPIEL 3:
BPC-1-GENEXPRESSIONSANALYSE – GEHIRN-SPEZIFISCH IN NORMALEN GEWEBEN
Die Ausgangsanalyse der BPC-1-mRNA-Expression in normalen menschlichen Geweben wurde mittels Northern-Blotting zweier multipler Gewebe-Blots durchgeführt, die erhalten waren von Clontech (Palo Alto, Kalifornien), umfassend insgesamt 16 verschiedene normale menschliche Gewebe, unter Verwendung des markierten 19P1E8 SSH-Klons (Beispiel 1) als einer Sonde. RNA-Proben wurden mit einer β-Aktin-Sonde quantitativ normalisiert.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Die Expression wurde lediglich in normalem Gehirn detektiert. Die Northern-Blots zeigten zwei Transkripte von 3,5 kb und 8,0 kb (5). Das 3,5 kb-Transkript entspricht der von LAPC-4 AD identifizierten cDNA, die das BPC-1 ORF codiert. Das größere Transkript kann eine unprozessierte Message oder eine alternative Isoform des Gens codieren.
Um die BPC-1 Expression in normalen Geweben weiter zu erforschen, wurde ein Multi-Gewebe-RNA-Dot-Blot mit einer BPC-1-Sonde sondiert. Von den 37 getesteten unterschiedlichen normalen Geweben zeigten lediglich Gehirnregionen detektierbare Mengen an BPC-1 (6). Interessanterweise war die Expression von BPC-1 auf kortikale Regionen des Gehirns beschränkt, wie etwa die Schläfen-, Stirn- und Hinterhauptslappen. Eine Expression war auch im Hippocampus, Amygdala, Nukleus caudate und Putamen erkennbar. Weitere Gehirnregionen, wie Thalamus, subthalamischer Nukleus und die Substantia nigra, exprimierten BPC-1 nicht. Entsprechend war keine Expression in anderen zentralen Nervensystem-(ZNS)-Strukturen detektierbar, wie etwa dem Cerebellum, Rückenmark und der Medulla oblongata (Mittelhirn). Die Ergebnisse des RNA-Dot-Blots wurden durch einen Northern-Blot bestätigt, der RNA für verschiedene ZNS-Gewebe enthielt (7).
BEISPIEL 4:
BPC-1-EXPRESSION IN FETALEN GEWEBEN – BREITERE EXPRESSION IN DER ENTWICKLUNG
CUB-Domänen-Proteine sind oftmals entwicklungsabhängig reguliert. Um zu bestimmen, ob BPC-1 in humanem Fötusgewebe exprimiert wird, wurde eine RT-PCR an Erststrang-cDNA durchgeführt, die von 8 unterschiedlichen fetalen Geweben abgeleitet war. Die Ergebnisse zeigen, dass BPC-1 im Fötusgehirn hochgradig exprimiert wird, wobei geringere Mengen in allen anderen fetalen Gewebe nachgewiesen werden (8). Dies legt nahe, dass die Expression bei einem Erwachsenen ausschließlich im Gehirn erfolgt, wohingegen die Expression in anderen Geweben während der Entwicklung abgeschaltet wird.
BEISPIEL 5:
HOCHGRADIGE BPC-1-EXPRESSION BEI PROSTATAKREBS
Um die BPC-1-Expression in Krebsgeweben und Zelllinien zu analysieren, wurde eine Northern-Blot-Analyse an RNA vorgenommen, die von den LAPC-Prostatakrebs-Xenograften als auch einem Panel von Prostata- und Blasenkrebs-Zelllinien abgeleitet war. Die in 9 gezeigten Ergebnisse lassen die höchsten Mengen der BPC-1-Expression im LAPC-4 AD-Prostatakrebs-Xenograft und in der LNCaP-Prostatakrebs-Zelllinie erkennen, die beide aus Lymphknotenmetastasen des Prostatakrebses stammten (Klein et al., 1997, Nature Med. 3: 402, Horoszewicz et al., 1983, Cancer Res. 43: 1809). Eine geringere Expressionshöhe des BPC-1 wurde bei LAPC-4 AI, LAPC-9 AD und LAPC-9 AI detektiert (9). Unter den getesteten Blasenkrebs-Zelllinien zeigte eine (5637) eine nachweisbare BPC-1-Expression (9). Keine Expression wurde in PrEC-Zellen (Clonetics), welche das Basalzellkompartiment der Prostata darstellen, und normaler Prostata detektiert.
BEISPIEL 6:
PRODUKTION VON SEKRETIERTEM REKOMBINANTEM BPC-1 IN VITRO
Um rekombinantes BPC-1 zu exprimieren und die subzelluläre Lokalisation des BPC-1-Proteins zu analysieren, wurde Volllängen-cDNA in einen Expressionsvektor kloniert, der einen 6His-Tag am Carboxyl-Terminus trägt (pCDNA 3.1 myc-his, Invitrogen). Das Konstrukt wurde in 293T-Zellen transfiziert, die für eine Stunde mit ³⁵S- Methionin markiert wurden. Die Zellen wurden dann gewaschen und in nicht-radioaktivem Medium inkubiert, um die markierten Proteine für verschiedene Zeitpunkte zu verfolgen. BPC-1-His-getaggtes Protein wurde unter Verwendung von Anti-His-Antikörpern (Santa Cruz) aus Zellextrakten und aus Zellüberstand (Medium) bei verschiedenen Zeitpunkten nach der Verfolgung immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) mit anschließender Autoradiographie zur Sichtbarmachung von ³⁵S-Methionin-markiertem Protein analysiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass BPC-1-Protein in dem Zellextrakt und dem Zellmedium sofort nach der ³⁵S-Methionin-Markierungsperiode auftritt (10). Innerhalb von zwei Stunden nach der Verfolgung ist nahezu das gesamte BPC-1-Protein in das Medium sekretiert und bleibt in dem Medium für mehrere Stunden stabil. Die Halbwertszeit des Proteins wird auf länger als 24 Stunden geschätzt. Vektor-transfizierte Zellen wurden ebenfalls markiert und unter Verwendung desselben Protokolls analysiert. Interessanterweise taucht ein nicht-spezifisches Protein sowohl in dem Vektor als auch den BPC-1-transfizierten Zellen auf. Dieses Protein scheint eine sehr kurze Halbwertszeit im Medium im Vergleich zu BPC-1 aufzuweisen, da es nach dem 4-Stunden-Zeitpunkt verschwindet. Diese Ergebnisse zeigen, dass BPC-1 tatsächlich ein sekretiertes Protein ist, das im Zellkulturmedium sehr stabil zu sein scheint.
BEISPIEL 7:
PRODUKTION VON REKOMBINANTEM BPC-1 UNTER VERWENDUNG DES BACULOVIRUS-SYSTEMS
Um rekombinantes BPC-1-Protein in einem Baculovirus-Expressionssystem zu generieren, wurde BPC-1 cDNA in den Baculovirus-Transfervektor pMelBac (Invitrogen) kloniert, welcher die Honigbienen-Mellitin-Signalsequenz für die Sekretion in das Medium von Insektenzellen enthält. pMelBac-BPC-1 wurde mit Helferplasmid pBlueBac4.5 (Invitrogen) in SF9-(Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen cotransfiziert, um rekombinanten Baculovirus zu generieren (siehe die Anleitungsbroschüre von Invitrogen für Einzelheiten). Baculovirus wurde aus dem Zellüberstand gesammelt und wurde mittels Plaque-Assay gereinigt.
Rekombinantes BPC-1-Protein wurde durch Infektion von HighFive-Insektenzellen (Invitrogen) mit gereinigtem Baculovirus generiert. Rekombinantes BPC-1-Protein wurde sowohl im Zellextrakt als auch im Zellüberstand unter Verwendung eines Anti-BPC-1-Maus-polyklonalen Antikörpers detektiert (siehe untenstehendes Beispiel 8). Interessanterweise enthält der Zellextrakt zwei Formen von BPC-1, nämlich Signalsequenz-gespaltenes BPC-1 und unprozessiertes BPC-1 (11). Der Überstand enthielt lediglich gespaltenes reifes BPC-1. Dieses rekombinante BPC-1-Protein kann gereinigt und in verschiedenen Zell-basierten Assays oder als Immunogen zur Generierung von für BPC-1 spezifischen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern verwendet werden.
BEISPIEL 8:
GENERIERUNG VON BPC-1-POLYKLONALEN ANTIKÖRPERN
Um Antikörper-Reagenzien zu generieren, die spezifisch an BPC-1 binden, wurde ein Glutathion-S-Transferase-(GST)-Fusionsprotein, das die Aminosäuren 29–93 des BPC-1-Proteins umfasste, synthetisiert, um als ein Immunogen zu dienen. Dieses Fusionsprotein wurde mittels PCR-vermittelter Amplifikation der Nukleotide 877–1.071 (AA 29–93) des cDNA-Klons des BPC-1 mit den folgenden Primern generiert:
5' PRIMER TTGAATTCCAAGCAAACCACCTCAGA
EcoRI
3' PRMER AAGCTCGAGTCAGACGGTTCAATAGAGT
XhoI
Das resultierende Produkt wurde in die EcoRI- und XhoI-Restriktionsstellen des pGES-2T GST-Fusionsvektors (Pharmacia) kloniert. Rekombinantes GST-BPC-1-Fusionsprotein wurde zu größer als 90% Reinheit von induzierten Bakterien mittels Glutathion-Sepharose-Affinitätschromatographie gereinigt.
Um polyklonale Seren zu BPC-1 zu generieren, wurde das gereinigte Fusionsprotein wie folgt verwendet. Ein Kaninchen wurde anfänglich mit 200 μg an GST-BPC-1-Fusionsprotein, gemischt in komplettes Freund-Adjuvans, immunisiert. Das Kanin chen wurde jede zweite Woche mit 200 μg des GST-BPC-1-Proteins in inkomplettem Freund-Adjuvans injiziert. Testblutentnahmen wurden etwa 7–10 Tage nach jeder Immunisierung genommen. ELISA, Western-Blotting und Immunpräzipitations-Analysen wurden zur Bestimmung der Spezifität und des Titers des Kaninchenserums zu BPC-1 verwendet. Zelllinien, die BPC-1 endogen exprimieren, wie etwa LNCaP, und Zelllinien, die zur Überexpression von BPC-1 durch Transfektion (293T) und durch retrovirale Infektion (PC-3 und NIH3T3) konstruiert waren, wurden für die Charakterisierung des Antiserums verwendet. Antiserum, das einen spezifisch hohen Titer zu BPC-1-Protein zeigte, wird mittels eines 3-stufigen Prozesses gereinigt: (1) Entfernung des GST-reaktiven Antikörpers durch Depletion über eine GST-Affinitätssäule, (2) BPC-1-spezifischer IgG-Antikörper wurde durch Passage über eine GST-BPC-1-Affinitätssäule isoliert, und (3) Protein G-Chromatographie.
Der Maus-polyklonale Antikörper wurde erfolgreich für den Nachweis von rekombinantem BPC-1, wie in einem Baculovirus-Expressionssystem exprimiert (siehe obiges Beispiel 7), von Affinitäts-(Nickel)-gereinigten MYC/HIS-BPC-1-Protein (13) und rekombinantem BPC-1-Protein in Gewebekultur-Überständen der Zellen, die das BPC-1-Gen exprimieren, verwendet (13). Kaninchen-polyklonales Serum wurde ebenfalls generiert und war in ähnlicher Weise zum Detektieren des BPC-1 in Gewebekultur-Überständen der Zellen, die das BPC-1-Gen exprimieren, fähig.
BEISPIEL 9:
GENERIERUNG DER BPC-1-MONOKLONALEN ANTIKÖRPER
Um mAbs zu BPC-1 zu generieren, wurden 5 Balb C-Mäuse anfänglich mit 200 μg an GST-BPC-1-Fusionsprotein, gemischt in komplettes Freund-Adjuvans, intraperitoneal immunisiert. Die Mäuse wurden anschließend alle 2 Wochen mit 75 μg an GST-BPC-1-Protein, gemischt in inkomplettes Freund-Adjuvans, für insgesamt 3 Immunisierung immunisiert. Die Reaktivität des Serums aus den immunisierten Mäusen auf Volllängen-BPC-1-Protein wurde mittels ELISA unter Verwendung eines teilgereinigten Präparats an HIS-getaggtem BPC-1-Protein, exprimiert aus 293T-Zellen, überwacht. Zwei Mäusen mit der stärksten Reaktivität wurde eine Pause von 3 Wochen gegeben und ihnen dann eine abschließende Injektion an Fusionsprotein in BPC-1 verabreicht, und sie wurden 4 Tage später geopfert. Die Milzen der geopfer ten Mäuse wurden entnommen und an SPO/2-Myelomzellen unter Anwendung standardmäßiger Verfahrensweisen (Harlow und Lane, 1988) fusioniert. Die Überstände aus den Kultur-Wells werden nach der HAT-Selektion mittels ELISA und Western-Blot gescreent, um BPC-1-spezifische Antikörper-produzierende Klone zu identifizieren.
Die Bindungsaffinität eines BPC-1-monoklonalen Antikörpers kann unter Verwendung einer standardmäßigen Technologie bestimmt werden. Affinitätsmessungen quantifizieren die Stärke des Antikörpers für die Epitop-Bindung und können dabei unterstützend eingesetzt werden, zu definieren, welche BPC-1-monoklonalen Antikörper für die diagnostische oder therapeutische Anwendung bevorzugt sind. Das BIAcore-System (Uppsala, Schweden) stellt eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der Bindungsaffinität dar. Das BIAcore-System wendet die Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR, Welford, K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1; Morton und Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) zur Überwachung der biomolekularen Interaktionen in Realzeit an. Die BIAcore-Analyse generiert in bequemer Weise Assoziationsratenkonstanten, Dissoziationsratenkonstanten, Äquilibriumdissoziationskonstanten und Affinitätskonstanten.
BEISPIEL 10:
PRODUKTION UND REINIGUNG VON REKOMBINANTEM BPC-1. EXPRIMIERT IN EINEM SÄUGER-EXPRESSIONSSYSTEM
Transient transfizierte 293T-Zellen oder 293-Zellen, die einen CMV-gesteuerten Expressionsvektor, der BPC-1 mit einem C-terminalen 6XHIs und MYC-Tag (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen) codiert, stabil exprimieren, dienen als einer Quelle an sekretiertem löslichem BPC-1-Protein für die Reinigung (siehe obenstehendes Beispiel 6). Das HIS-getaggte BPC-1-Protein, das in das konditionierte Medium sekretiert worden ist, wird unter Anwendung der folgenden Methode gereinigt. Konditioniertes Medium (500 ml) wird 10-fach konzentriert und gleichzeitig der Puffer ausgetauscht zu einem Phosphat-Puffer (pH 8,0), der 750 mM NaCl und 10 mM Imidazol enthält, unter Anwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit mit einer 10 kd MW-Cutoff-Membran. Das Präparat wird dann über ein Nickelmetall-Affinitätsharz mit einem 0,5 ml Bettvolumen (Ni-NTA, Qiagen) geleitet und ausgiebig mit Phosphat- Puffer (pH 6,0), der 10% Ethanol und 300 mM NaCl enthält, gewaschen. Das HIS-getaggte BPC-1-Protein wird dann mit Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Präparate einer höheren Reinheit werden durch Wiederholen des obigen Chromatographieschritts mit höherer Stringenz der Waschung (Phosphat-Puffer, enthaltend 75 mM Imidazol) oder durch Passage über eine Anti-HIS-Ab-Immunaffinitätssäule erhalten. Diese Methode wurde erfolgreich zur Reinigung von rekombinantem HIS-BPC-1 angewendet. Ein Western-Blot des gereinigten Proteins ist in der ganz links gezeigten Bahn der 13 gezeigt.
BEISPIEL 11:
RETROVIRUS-VERMITTELTE EXPRESSION VON SEKRETIERTEM HUMANEM BPC-1
Die BPC-1-codierende Region wurde in den retroviralen SRαmsvtkneo-Vektor (Muller et al., 1991 MCB 11: 1785–1792) subkloniert. Retroviren wurden hergestellt und zur Generierung von Zelllinien verwendet, die das BPC-1-Gen exprimieren. Die erzeugten Zelllinien sind 3T3/BPC-1 und PC3/BPC-1. 3T3-Zellen, die akut mit dem SR-αBPC-1-Virus infiziert sind, exprimieren eine sehr hohe Menge an BPC-1 mRNA, wie durch den in 12 gezeigten Northern-Blot demonstriert. Das PC3/BPC-1-Lysat und Überstand wurden auf die BPC-1-Expression durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen ein GST-Fusionsprotein getestet, das den N-terminalen Abschnitt des BPC-1-Proteins (aa29–93) wie folgt enthält. PC3- und 3T3-Zellen exprimieren entweder Kontroll(Neo)- oder BPC-1-codiernden Retrovirus stabil, und 3T3-Zellen, die mit BPC-1-Retrovirus akut infiziert waren, wurden in 10 cm-Gewebekulturplatten für 4 Tage kultiviert. 25 μl des reinen Überstands von jeder Linie wurden einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung einer 1:500-Verdünnung von murinem Anti-BPC-1-polyklonalen Serum unterzogen. Der Blot wurde dann mit Anti-Maus-HRP-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert, und BPC-1-spezifische Signale wurden durch verstärkten Chemilumineszenz-Nachweis sichtbar gemacht. Die Ergebnisse dieser Western-Blot-Analyse sind in 13 gezeigt.
BEISPIEL 12:
BPC-1-EXPRESSIONSANALYSE IN VITRO UND IN VIVO
Western- und Immunpräzipitations-Analysen der Zelllysate und konditionierten Medien mit BPC-1-spezifischen Antikörpern können zur Identifizierung und Charakterisierung der BPC-1-Proteinexpression in Zelllinien und Geweben verwendet werden, wie etwa LAPC4- und LAPC9-Xenograften, LNCaP-Prostatakrebszellen, 5637 Blasenkarzinomzellen, normalem humanem Gehirnlysat, die alle BPC-1 mRNA exprimieren, als auch einer Vielzahl weiterer Karzinomzelllinien, Xenograften und normalen Geweben. Aufgrund der strukturellen Homologie von BPC-1 zu der porcinen und bovinen Spermadhäsion-Familie der Proteine (Topfer-Petersen et al., Andrologia, 1998) kann menschlicher Samen ebenfalls nachweisbare Mengen an BPC-1-Protein enthalten. In Anbetracht seiner Expression in Blasenkarzinom kann das BPC-1-Protein auch im Urin von Blasenkarzinom-Patienten detektierbar sein. MYC-HIS-BPC-1-transfizierte 293T-Zellen und retroviral transduzierte PC3- und NIH3T3-Zellen dienen als positiven Kontrollen für die BPC-1-Proteinexpression (13).
Die Identifizierung und Quantifizierung von in klinischen Proben von menschlichem Serum, Samen und Urin vorhandenem BPC-1-Protein kann mittels eines Fang-ELISA vorgenommen werden, wie in dem folgenden Beispiel beschrieben. Eine immunhistochemische Analyse des BPC-1-Proteins in normalen und kanzerösen Geweben kann an Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten oder gefrorenen Gewebeschnitten unter Anwendung der im Fachgebiet wohlbekannten standardmäßigen immunhistochemischen Methoden und der hierin bereitgestellten BPC-1-Antikörper vorgenommen werden. Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Schnitte der LNCaP-Zellen können als einer positiven Kontrolle verwendet werden.
BEISPIEL 13:
BPC-1-FANG-ELISA
Ein Fang-ELISA kann zum Identifizieren und Quantifizieren von BPC-1-Protein, das in klinischen Proben von menschlichen Seren, Samen und Urin vorhanden ist, wie folgt angewendet werden. Der Fang-ELISA für BPC-1 hängt von der Erzeugung wenigstens zweier mAbs von unterschiedlichen Isotypen, die unterschiedliche Epitope des BPC-1-Proteins erkennen, oder eines mAb und eines spezifischen Kaninchen- polyklonalen Serums ab. Ein Reagenz wird als dem Fang-(oder Beschichtungs-)-Ab dienen und das andere als dem Nachweis-Ab. Eingefangenes BPC-1 wird dann durch die Zugabe eines sekundären Ab-HRP-Konjugats gegen den Nachweis-Antikörper, gefolgt durch die Inkubation mit TMB-Substrat, sichtbar gemacht. Die optische Dichte der Wells wird dann in einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät bei 450 nm gemessen. Gereinigtes MYC/HIS-getaggtes BPC-1-Protein dient als einem Standardisierungs-Antigen für den ELISA.
BEISPIEL 14:
BPC-1-EXPRESSIONS-ERGEBNISSE BEI DER ANKER-UNABHÄNGIGEN KOLONIEBILDUNG IN VITRO
Retroviral infizierte Zellen, die BPC-1 exprimieren, wurden erzeugt, wie in Beispiel 11 beschrieben, und zusammen mit den jeweiligen Neo-Kontroll-Zelllinien verwendet, um Weichagar-Assays zur Auswertung des onkogenen Potenzials von BPC-1 vorzunehmen. Der Agar-Assay wurde gemäß den zuvor beschriebenen Bedingungen durchgeführt (Lugo, T.R. und O.N. Witte, 1989, Molec. Cell. Biol. 9: 1263–1270). Kurz gesagt wurden die Zellen trypsiniert und in Iscove-Medium, das 0,3% Noble-Agar und 20% fetales Rinderserum enthielt, resuspendiert. Diese Zellagar-Suspension (10⁴ Zellen/60 mm Platte) wurde zwischen eine Boden- und eine oberste Schicht des Mediums ausplattiert, die 0,6% Noble-Agar und 20% fetales Rinderserum enthielt. Die Platten wurden nach 7 Tagen gefüttert und die Kolonien untersucht und 2 oder 3 Wochen nach Einrichtung des Agar-Assays, in Abhängigkeit von der Größe der Kolonien, punktbewertet. Die Kolonien wurden unter Verwendung einer Software von Alphalmager 200 gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 tabellarisch dargestellt.
3T3CL7-Zellen, die mit BPC-1 oder Neo exprimierendem Retrovirus infiziert waren, wurden verwendet. Die Kolonien wurden 3 Wochen, nachdem die Agar-Assays eingerichtet waren, punktbewertet. Die 3T3CL7/BPC-1-Zellen generierten etwa 8-mal mehr Kolonien im Vergleich zu der Kontrollplatte für die akut infizierten Zellen. Unter Verwendung von G418-selektierten Zellen liegen etwa 3,6-mal mehr Kolonien in den 3T3CL7/BPC-1-Platten im Vergleich zu den 3T3CL7/neo-Platten vor.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass das BPC-1-Protein ein Anker-unabhängiges Wachstum bei Zellen, die experimentell zum Exprimieren und Sekretieren von BPC-1 hergestellt waren, induziert und somit eine transfomierende Wirkung auf diese Zellen ausübt.
BEISPIEL 15:
BPC-1-BINDET AN EIN ZELLULÄRES PROTEIN
Um festzustellen, ob BPC-1 an zelluläre Proteine bindet, die in Prostatakrebszellen und anderen Krebszellen oder normalen Zellen exprimiert werden, wurden zwei Ansätze gewählt. Bei dem ersten Ansatz wird ein in vitro-Assay für die Bindung von rekombiniertem HIS-getaggtem BPC-1 (obiges Beispiel 6) an verschiedene Zelllinien verwendet. Bei dem anderen Ansatz wird ein rekombiniertes Alkalische Phosphatase-BPC-1-Fusionsprotein unter Verwendung des AP-TAG-Systems von GenHunter Corporation (Nashville, TN, Kat# Q202) verwendet und die AP-TAG-Fusion zum Testen der BPC-1-Bindung an eine Vielzahl von Prostatakrebs-Zelllinien genützt.
A. HIS-GETAGGTE BPC-1-ZELLOBERFLÄCHEN-BINDUNGSANALYSE
PC-3- und NIH3T3-Zellen werden auf Eis bei 4 Grad C für 2 Stunden mit konditioniertem Medium, das HIS-getaggtes BPC-1 (von 293T-transfizierten Zellen) enthält, oder Medium, das gereinigtes HIS-getaggtes BPC-1 enthält, oder Kontrollmedium inkubiert. Die Zellen wurden ausgiebig mit eiskaltem PBS mit 0,5% FBS gewaschen und dann mit einem Überschuss an Anti-HIS-Kaninchen-polyklonalem Antikörper (5 μg/ml, PBS 0,5% FBS) bei 4 Grad C für 1 Stunde inkubiert. Die Zellen wurden nochmals gewaschen und dann mit Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem sekundärem Ab (1:4.000 in BPS/0,5% FBS) für 30 Minuten bei 4 Grad C inkubiert. Zell gebundenes BPC-1 wird dann durch fluorimetrische Analyse der Zellen in einem Cytofluor 4000 Fluorimeter (PE Biosystems) und/oder durch Flusszytometrie detektiert.
Als einer Alternative zu dem oben verwendeten Fluoreszenz-basierten Assay können Bindungsassays mit ¹²⁵I-markiertem BPC-1-Protein durchgeführt werden. Die Bestimmung der BPC-1-Rezeptoranzahl und die Affinität an Zellen und die Überwachung der Internalisierung von Rezeptor-gebundendem BPC-1-Protein wird mittels standardmäßiger veröffentlichter Verfahrensweisen vorgenommen (Raitano und Korc, J. Biol. Chem., 1990, J. Biol. Chem. 265: 10466–10472).
B. ALKALISCHE PHOSPHATASE-GETAGGTES BPC-1 ERZEUGT EINE ZELLOBERFLÄCHEN-FÄRBUNG BEI PROSTATAKREBSZELLEN
Alkalische Phosphatase-getaggtes BPC-1 wurde wie folgt erzeugt. Die Sequenz, die reifes BPC-1 (d.h. ohne der Signalsequenz) codiert, wurde in pAPtag-5 (GenHunter Corp., Nashville, TN) kloniert. Die untenstehenden BPC-1.HindIII und BPC-1.BamHI-Primer wurden zum Amplifizieren des offenen Leserahmens von BPC-1 zwischen Aminosäuren 23 und 58 von der Plasmid-Template SRa-19P1E8 Klon 1 verwendet. Das HindIII und BamHI-verdaute PCR-Produkt wurde in HindIII- und BglII-verdautes pAPtag-5 ligiert, wobei die IgGK-Signalsequenz, BPC-1 ORF und Alkalische Phosphatase alle in-frame gehalten wurden. Das BPC-1-AP-Fusionsprotein enthält eine IgGK-Signalsequenz, um die Sekretion zusammen mit myc/His-Tags am Carboxy-Terminus von Alkalischer Phosphatase zu fördern.
BPC1.HINDIII-PRIMER:

GTGTAAGCTTCCACCAAGAAAGGAACAGAA

BPC1.BAMHI-PRIMER:

CACAGGATCCCTTACCAGGTGTGAAATTG

Um zu detektieren, ob BPC-1 mit einem Zelloberflächen-Rezeptor an Prostatakrebszellen bindet, werden mehrere Prostatakrebs-Zelllinien und Xenograftgewebe mit dem BPC-1-AP-Fusionsprotein inkubiert, wie beschrieben (Cheng und Flanagan, 1994, Cell 79: 157–168). Nach dem Waschen der Zellen und Zugeben des AP-Substrats BCIP, welches ein unlösliches blaues Präzipitat auf die Dephosphorylierung hin bildet, wird die BPC-1-Rezeptorbindung durch Identifizieren von Zellen bestimmt, die sich unter dem Lichtmikroskop als blaugefärbt zeigen. Verschiedene Krebszelllinien können untersucht werden, einschließlich, ohne Beschränkung, verschiedener Prostatakrebs-Zelllinien (z.B. LNCaP, PC-3, DU145, TSUPR, LAPC4) und Blasenkarzinom-Zelllinien. Weitere Zelllinien, wie etwa PREC-Prostata-Zelllinie, 293T und NIH3T3 etc. können ebenfalls untersucht werden. Darüber hinaus können die LAPC und weitere Prostatakrebs-Xenografte getestet werden.
Die Äquilibriumdissoziationsratenkonstanten können durch Auswerten der Stärke der Bindungsinteraktion berechnet werden. Außerdem kann die Anzahl der Zelloberflächen-Rezeptoren pro Zelle bestimmt werden. Zelllinien oder Gewebe mit der höchsten Bindungskapazität für BPC-1 wären zur Klonierung des BPC-1-Rezeptors oder anderer Bindungspartner bevorzugt.
Das BPC-1-AP-Fusionsprotein wurde in dem konditionierten Medium der 293T-Zellen, die mit dem obigen Konstrukt transfiziert waren, mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Alkalische Phosphatase- und Anti-His-Antikörpern detektiert das BPC-1-AP-Fusionsprotein, das bei etwa 90 kDa läuft (14).
Das konditionierte Medium, das dieses Fusionsprotein enthält, wurde zum Nachweis eines 45 kDa-Bindungspartners für BPC-1 (15) wie folgt verwendet. Ein Western-Blot-Verfahren wurde zum Identifiieren eines 45 kDa-Rezeptors, der mit BPC-1 interagiert, verwendet. Lysate von Gehirn, Hoden, Prostata, den Xenograften LAPC4AD und LAPC9AD, und den Zelllinien 3T3, LAPC4, LNCaP und PC-3 wurden zur Erzeugung zweier Duplikat-Western-Blots verwendet. Nach Blockieren in 5 Milch in PBS für 1 Stunde und zweimaligem Waschen mit PBS-Tween für jeweils 7 Minuten wurden die Blots mit konditioniertem Medium aus einer 293T-Zelllinie, das lediglich sekretierte Alkalische Phosphatase produziert, und mit einem Medium, das BPC-1-AP-Fusionsprotein enthält, inkubiert (siehe 14). Nach 3 Waschgängen mit PBS-Tween wurde der Blot unter Verwendung eines chemilumineszierenden Alkalische Phosphatase-Substrats (Immune-Star, BioRad, Kat. 170-5010) entwickelt. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt. Der Pfeil (15) zeigt die BPC-1-AP-Bindung an ein 45 kDa-Protein in 3T3, LAPC9AD, LNCaP, PC-3, und in einem geringeren Umfang in LAPC4AD- und LAPC-4-Zelllinien. Das 45 kDa-Protein wird in Gehirn, Hoden oder Prostata nicht detektiert. Die Protein-Interaktion ist auf BPC-1 und nicht AP zurückzuführen, da der in 15 gezeigte Blot (der mit AP-konditioniertem Medium inkubiert war) die Bindung des 45 kDa-Proteins nicht detektierte.
BEISPIEL 16:
IDENTIFIZIERUNG VON POTENZIELLEN SIGNALTRANSDUKTIONS-WEGEN
Um zu bestimmen, ob BPC-1 bekannte Signaltransduktions-Wege in Zellen direkt oder indirekt aktiviert, werden auf Luciferase (luc) basierende Transkriptions-Reporterassays bei Zellen vorgenommen, die BPC-1 exprimieren oder die exogen zugesetztem BPC-1 ausgesetzt werden. Diese Transkriptionsreporter enthalten Konsensus-Bindungsstellen für bekannte Transkriptionsfaktoren, die stromabwärts der wohlcharakterisierten Signaltransduktions-Wege liegen. Die Reporter und Beispiele der dort assoziierten Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktions-Wege und Aktivierungsstimuli sind nachstehend aufgelistet.

1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-Kinase/SAPK; Wachstum/Apoptose/Stress
2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; Wachstum/Differenzierung
3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; Wachstum/Apoptose/Stress
4. ARE-luc, Androgen-Rezeptor; Steroide/MAPK; Wachstum/Differenzierung/Apoptose
5. p53-luc, p53; SAPK; Wachstum/Differenzierung/Apoptose
6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; Wachstum/Apoptose/Stress

Die auf die BPC-1-vermittelten Wirkungen zu untersuchenden Zellen umfassen LAPC4, LNCaP, PC3 und NIH3T3. Die Luciferase-Reporterplasmide können mittels Lipid-vermittelter Transfektion (TFX-50, Promega) eingeführt werden. Die Luciferaseaktivität, ein Indikator der relativen Transkriptionsaktivität, wird durch Inkubieren der Zellextrakte mit Luciferinsubstrat gemessen, und die Lumineszenz der Reaktion wird in einem Luminometer überwacht.
BEISPIEL 17:
IN VITRO-ASSAYS DER BPC-1-FUNKTION
A. ZELLINVASIONS/MIGRATIONS/CHEMOATTRAKTIONS-ASSAY
Zelllinien, die BPC-1 exprimieren, können auf eine Veränderung der invasiven und migratorischen Eigenschaften durch Messen der Passage von Zellen durch eine Matrigel-beschichtete poröse Membrankammer (Becton Dickinson) untersucht werden. Die Passage von Zellen durch die Membran zur gegenüberliegenden Seite wird unter Verwendung eines Fluoreszenz-Assays (Becton Dickinson Technical Bulletin #428) unter Verwendung von Calcein-Am (Molecular Probes)-geladenen Indikatorzellen überwacht. Zu den analysierten Zelllinien zählen parentale und BPC-1-überexprimierende PC3-, 3T3- und LNCaP-Zellen. Um zu untersuchen, ob BPC-1 chemoattraktive Eigenschaften aufweist, werden parentale Indikatorzellen auf die Passage durch die poröse Membran zu einem Gradienten des BPC-1-konditionierten Mediums im Vergleich zu Kontrollmedium überwacht.
Dieser Assay kann auch zum Qualifizieren und Quantifizieren der spezifischen Neutralisation des BPC-1-induzierten Effekts durch Kandidaten-Krebs-therapeutische Zusammensetzungen angewendet werden.
B. ZELLWACHSTUMS-ASSAY
Um zu bestimmen, ob BPC-1 die Wachstumsrate der etablierten Prostata- und Nicht-Prostata-Zelllinien verändert, wurden Wachstumskurven generiert, die Parentalzellen, die mit einem retroviralen Kontroll-Vektor transduziert waren, zu Zellen verglichen, die mit einem Retrovirus, der das BPC-1-Gen codiert, transduziert waren. Zu den zu untersuchenden Zelllinien zählen LNCaP, PC3, TsuPR-Prostata-Zelllinien und murine NIN3T3-Fibroblasten und verschiedene weitere humane Nicht-Prostata-Zelllinien. Außerdem wird die Wachstumsrate von parentalen Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von exogen zugesetztem gereinigtem MYC-HIS-BPC-1 untersucht. Als einer alternativen Quelle des exogenen BPC-1 kann konditioniertes Medium von der jeweiligen BPC-1-retroviral transduzierten Zelllinie verwendet werden. Das Wachstum der Zelllinien wird in einem MTT-kolorimetrischen Assay im 96-Well-Format überwacht (Raitano und Korc, 1990, J. Biol. Chem. 265: 10466–10472).
BEISPIEL 18:
IN VIVO-MODELLE ZUR UNTERSUCHUNG VON BPC-1 UND TESTEN DER PROSTATAKREBS-THERAPEUTISCHEN ZUSAMMENSETZUNGEN
A. BESTIMMUNG DER SERUM-BPC-1-MENGEN IN XENOGENE TUMOREN TRAGENDEN MÄUSEN
LNCaP-Prostatakrebszellen und LAPC-4 AD-Xenograftzellen exprimieren hohe Mengen an BPC-1, wie durch Northern-Blot-Analyse bestimmt. Um BPC-1 als einen diagnostischen Serum-Marker auszuwerten, werden SCID-Mäuse SQ oder orthotopisch entweder mit 1 × 10⁶ LNCaP oder LAPC-4 AD-Zellen injiziert. Die Mäuse werden in jede Flanke injiziert, und das Tumorwachstum wird durch Kalipermessungen überwacht, um die Länge × Breite × Höhe (L × W × H) zu erhalten. Die Mäuse werden beim ersten Auftreten von tastbaren Tumoren und jede Woche danach bluten gelassen, bis die Tumoren 1.000 mm³ in der Größe betragen. Reihenblutungen werden auf das Vorhandensein von BPC-1 mittels eines ELISA-Assays, wie oben beschrieben, gescreent. Als einer Kontrolle wird Serum von den Tumor-tragenden Mäusen auf die Sekretion von PSA unter Verwendung eines spezifischen ELISA-Kit ausgewertet. Um die BPC-1-Expression zu bestätigen, werden die Tumoren von den Mäusen geerntet und auf die BPC-1-Expression mittels Western-Blot gescreent.
Außerdem wurde von der 5637-Blasenkrebs-Zelllinie mittels der Northern-Blot-Analyse gezeigt, dass sie BPC-1 exprimiert. Um die Blasenkrebs-BPC-1-Expression auszuwerten, werden 5637 Blasentumor-Xenografte in SCID-Mäusen etabliert und das Serum entnommen und auf das BPC-1-Protein mittels ELISA ausgewertet, wie beschrieben.
Alternativ können Prostatakrebs-Zelllinien, die endogenes BPC-1 nicht exprimieren, und die so konstruiert sind, dass sie BPC-1 überexprimieren, in SCID-Mäuse injiziert werden, um die BPC-1-Sekretion zu bestätigen. Zu diesen zählen PC-3, TSUPR1 und DU145. Einzelne Mäuse werden SQ entweder mit 1 × 10⁶ PC3-, TSUPR1- und DU145-Zellen injiziert, die einen leeren tkNeo-Vektor (tkNeo) oder einen BPC-1 enthaltenden Vektor exprimieren. Alle Mäuse werden in jede Flanke injiziert, und das Tumorwachstum wird mittels Kalipermessungen wie oben beschrieben überwacht. Die Mäuse werden nach dem ersten Auftreten von tastbaren Tumoren und jede Woche danach bluten gelassen, bis die Tumoren 1.000 mm³ groß sind. Unterschiede in der Tumorwachstumsrate, sofern erkennbar, werden vermerkt und weiter untersucht (siehe unten). Blutungsreihen können auf das Vorhandensein von BPC-1 mittels eines ELISA-Assays gescreent werden. Um die BPC-1-Expression zu bestätigen, können die Tumoren von den Mäusen geerntet und auf die BPC-1-Expression mittels Western-Blots gescreent werden.
B. IN VIVO-ASSAY AUF DIE FÖRDERUNG DES BPC-1-TUMORWACHSTUMS
Die Wirkung des BPC-1-Proteins auf das Tumorzellwachstum kann in vivo entweder durch Genüberexpression oder durch Zugabe von löslichem, gereinigtem BPC-1-Protein zu Tumor-tragenden Mäusen ausgewertet werden. Bei dem ersten Beispiel werden SCID-Mäuse SQ in jede Flanke mit 1 × 10⁶ entweder von PC3-, TSUPR1- oder DU145-Zellen, die leeren tkNeo-Vektor oder BPC-1 enthalten, injiziert. Mindestens zwei Strategien können angewendet werden: (1) Konstitutive BPC-1-Expression unter der Regulation eines LTR-Promotoren, und (2) regulierte Expression unter der Kontrolle des Ecdyson-induzierbaren Vektorsystems. Das Tumorvolumen wird dann beim Auftreten von tastbaren Tumoren überwacht und über den Zeitverlauf nachuntersucht, um zu bestimmen, ob BPC-1-exprimierende Zellen bei einer schnelleren Rate wachsen. Außerdem können Mäuse mit 1 × 10⁵ derselben Zellen orthotopisch implantiert werden, um zu bestimmen, ob BPC-1 eine Wirkung auf das lokale Wachstum in der Prostata oder auf die Fähigkeit der Zellen, Metastasen zu bilden, spezifisch in Lungen, Lymphknoten und Knochenmark, ausübt.
In dem zweiten Beispiel wird gereinigtes BPC-1-Protein auf eine Wirkung auf das Tumorzellwachstum in vivo ausgewertet. Die Mäuse werden zunächst in zwei Gruppen eingeteilt, die SQ entweder mit 1 × 10⁶ LNCaP- der LAPC-4 AD-Zellen, die BPC-1 exprimieren, oder PC3-Zellen, die BPC-1 nicht exprimieren, injiziert werden. An demselben Tag der Injektion der Tumorzellen werden die Gruppen mit einem Be reich an gereinigtem BPC-1-Protein (zum Beispiel 100, 500 oder 1.000 μg) IV injiziert. Als einer Kontrolle wird eine Gruppe jedes Tumortyps lediglich mit PBS injiziert. Die Injektionen werden 2-mal pro Woche für 4 aufeinanderfolgende Wochen fortgesetzt, bis die Tumoren wachsen und eine Größe von 1.000 mm³ erreichen. Das Tumorvolumen wird nachuntersucht, um zu bestimmen, ob BPC-1 einen Dosis-Wirkungs-Effekt auf das Tumorwachstum zeigt.
Bei einem separaten Satz von Experimenten zur Bestimmung dessen, ob BPC-1 das Tumorwachstum beschleunigt, können sich LNCaP-, LAPC-4 AD- und PC3-Tumoren SQ zu einer Größe von 100 mm³ etablieren, zu welchem Zeitpunkt gereinigtes BPC-1-Protein in den oben gezeigten Dosen und Regimen IV injiziert wird. Um zu bestimmen, ob BPC-1 die Metastasenbildung fördert, können dieselben Tumoren auch orthotopisch implantiert werden, und nachdem sich die Tumoren etabliert haben (wie durch zirkulierende PSA-Mengen bestimmt), kann gereinigtes BPC-1 wie beschrieben verabreicht und das Metastasenwachstum ausgewertet werden.
Die obigen Assays sind auch zur Bestimmung der BPC-1-inhibitorischen Wirkung der Kandidaten-therapeutischen Zusammensetzungen, wie zum Beispiel BPC-1-Antikörper und Intrakörper, BPC-1-mRNA-Antisense-Moleküle und Ribozyme, und BPC-1-Rezeptor-Zusammensetzungen, nützlich.
C. IN VIVO-ASSAY DER TUMORINHIBITION DURCH BPC-1-ANTIKÖRPER
Um die Wirkung von BPC-1-spezifischen mAbs auf die Bildung und den Wachstum von Tumoren zu untersuchen, werden Mäuse in Gruppen entweder von BPC-1-positiven LNCaP-, LAPC-4 AD- und PC3-BPC-1-Tumoren, oder von PC-tkNeo, welches kein BPC-1 exprimiert, eingeteilt. Um einen Effekt auf die Tumorbildung auszuwerten, werden die Mäuse mit 1 × 10⁶ Tumorzellen SQ injiziert und werden an demselben Tag IP mit einem Bereich von BPC-1-spezifischem mAb oder Kontroll-Ig (zum Beispiel 100, 500 oder 1.000 μg) injiziert. Die Injektionen der mAbs werden 2-mal pro Woche für 4 aufeinanderfolgende Wochen fortgesetzt. Das Tumorwachstum wird wie oben beschrieben nachuntersucht. Um alternativ einen Effekt auf etablierte Tumoren auszuwerten, werden die Mäuse in Gruppen eingeteilt, die etablierte Tumoren von 100 mm³ Größe tragen, und werden IP mit mAbs gemäß den zuvor be schriebenen Dosen und Regimen injiziert. Das Tumorvolumen wird nachuntersucht, um die Wirkung des mAb auf das Wachstum der etablierten Tumoren zu bestimmen.
Um die Wirkung auf die Metastasenbildung zu untersuchen, werden 1 × 10⁵ LAPC-4 AD-Zellen orthotopisch in SCID-Mäuse injiziert. Zum selben Zeitpunkt werden die Mäuse IP mit einem Bereich von Anti-BPC-1-mAb oder Kontroll-Ig wie oben beschrieben injiziert. Das Tumorwachstum wird durch wöchentliche Bestimmungen der zirkulierenden PSA nachuntersucht. Am Ende der Antikörper-Verabreichung werden die Mäuse geopfert und das lokale Tumorwachstum und die Metastasenbildung an Lungen, Lymphknoten und Knochenmark ausgewertet. Um einen Effekt auf Mäuse mit etablierten Tumoren zu untersuchen, werden LAPC-4 AD orthotopisch injiziert und die PSA-Mengen wöchentlich nachuntersucht. Wenn PSA messbare Höhen erreicht, werden die Mäuse mit derselben Dosis und Regime der mAbs, wie beschrieben, injiziert. Die Mäuse werden nach Vervollständigung der Antikörper-Injektionen geopfert, um das lokale Tumorwachstum als auch die Metastasenbildung auszuwerten.
BEISPIEL 19:
MOLEKULARE KLONIERUNG DES BPC-1-REZEPTORS ODER -BINDUNGSPARTNERS
Expressions-Klonierungsstrategien, wie etwa beschrieben bei Tartaglia et al., 1995, Cell 83: 1263–1271 und Cheng und Flanagan, 1994, Cell 79: 157–168 und anderen, können zur Klonierung des Rezeptors für BPC-1 angewendet werden. Eine Expressions-Bibliothek wird zunächst aus Zellen konstruiert, die eine BPC-1-AP-Bindung zeigen. Die Bibliothek kann in Pools von etwa 1000 Klonen konstruiert und dann mittels eines sib-Selektionsverfahrens gescreent werden. Die transiente Transfektion von COS-Zellen mit DNA aus jedem Pool und das anschließende Screening mit BPC-1-AP-Bindung, Waschen und Anfärben für die AP-Aktivität identifiziert Zellen, die BPC-1 binden, und die anschließende Expression des BPC-1-Rezeptors. Nach aufeinanderfolgenden Runden der Pool-Unterteilung und des Screenings, können einzelne Kolonien, die an BPC-1-AP binden, identifiziert werden.
Ein alternativer Ansatz für die Klonierung von BPC-1-Rezeptor/Bindungspartner-Genen wendet die Expressionsklonierung in Phagen an (Stone J. in Current Protocols in Molecular Biology (1997): 20.3.1–20.3.9). Zum Beispiel kann eine LAPC-9 AD-Phagenexpressions-Bibliothek in Lambda Zap Express (Stratagene) verwendet werden. Membranabhebungen können unter Verwendung von BPC-1-AP sondiert werden, und positive Klone können mit einem Alkalische Phosphatase-chemilumineszierenden Reagenz (z.B. BioRad) detektiert werden. Plaques, die BPC-1-AP binden und ein blaues Präzipitat erzeugen, werden selektiert und Plasmide isoliert und auf die Rezeptor/Bindungspartner-Sequenzen ausgewertet. Dieser Ansatz kann auch zur Identifizierung von zytoplasmatischen oder sekretierten Proteinen führen, die mit BPC-1 interagieren.

Claims

Isoliertes BPC-1-Protein, umfassend: (a) die Aminosäuresequenz, wie in 1 gezeigt, von Aminosäurerest Nummer 24 bis Aminosäurerest 158; (b) wenigstens 15 aufeinander folgende Aminosäuren aus der Sequenz von (a), wobei das Protein dazu fähig ist, die Generierung von Antikörpern auszulösen, die spezifisch das Protein von (a) binden; oder (c) ein Polypeptid, das zu wenigstens 90% identisch zu der Aminosäuresequenz von (a) über seine gesamte Länge ist.
Isoliertes BPC-1-Protein nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz, wie in 1 gezeigt, von Aminosäurerest Nummer 1 bis Aminosäurerest 158.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, umfassend wenigstens eine CUB-Domäne des BPC-1-Proteins, wie in 1 gezeigt, von etwa Aminosäurerest Nummer 51 bis etwa Aminosäurerest Nummer 152.
Isoliertes Polynukleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polynukleotid, wie in 1 gzeigt, worin T auch U sein kann; (b) einem Fragment eines Polynukleotids von (a) von Nukleotidrest Nummer 793 bis Nukleotidrest Nummer 1269, wie in 1 gezeigt, worin T auch U sein kann; (c) einem Polynukleotid, umfassend die Sequenz, wie in 1 gezeigt, von Nukleotidrest Nummer 793 bis 1269; (d) einem Fragment eines Polynukleotids von (a) von Nukleotidrest Nummer 862 bis Nukleotidrest Nummer 1269, wie in 1 gezeigt, worin T auch U sein kann; (e) einem Polynukleotid, umfassend die Sequenz, wie in 1 gezeigt, von Nukleotidrest Nummer 862 bis Nukleotidrest Nummer 1269; oder (f) einem Polynukleotid, umfassend die Sequenz, wie in 1 gezeigt, von Nukleotidrest Nummer 943 bis Nukleotidrest Nummer 1248; (g) einem Polynukleotid, das ein BPC-1-Polypeptid codiert, dessen Sequenz durch die cDNA codiert ist, die in Plasmid p19P1E8 Klon 6.1, wie bei der American Type Culture Collection als Zugriffs-Nr. 98833 hinterlegt, enthalten ist; (h) einem Polynukleotid, das das Protein nach Anspruch 1, 2 oder 3 codiert; und (i) einem isolierten Polynukleotid, das vollständig komplementär zu einem Polynukleotid nach einem von (a) bis (f) ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, welcher ein Polynukleotid nach Anspruch 4 enthält.
Wirtszelle, welche einen Expressionsvektor nach Anspruch 5 enthält.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 4, welches mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.
Verfahren zum Produzieren eines BPC-1-Proteins, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 6 unter Bedingungen, die ausreichend sind für die Produktion des Polynukleotids, und Rückgewinnen des BPC-1-Proteins aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das BPC-1-Protein in das Kulturmedium sekretiert wird.
Antikörper, der immunspezifisch an das BPC-1-Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt als Reste 24 bis 158 der 1, bindet.
Antikörper nach Anspruch 10, der monoklonal ist.
Fab-, F(ab)₂-, Fv- oder Sfv-Fragment eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 11.
Rekombinantes Protein, umfassend die Antigenbindungsregion eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 11.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, ein Fragment nach Anspruch 12 oder ein Protein nach Anspruch 13, der/das mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.
Monoklonaler Antikörper, Fragment oder Protein nach Anspruch 14, wobei die nachweisbare Markierung ein Radioisotop, fluoreszierende Verbindung, biolumineszierende Verbindung, chemilumineszierende Verbindung, Metallchelatbildner oder Enzym ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, der murine Antigenbindungsregion-Reste und humane Antikörper-Reste umfasst.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, der ein humaner Antikörper ist.
Transgenes nicht-humanes Tier, das einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 17 produziert.
Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 11 produziert.
Einzelkettiger monoklonaler Antikörper, der die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 11 umfasst.
Vektor, umfassend ein Polynukleotid, das einen einzelkettigen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 20 codiert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, der das Wachstum von Tumorzellen, die BPC-1 in einem Patienten exprimieren, der mit einer wirksamen Menge des Antikörpers behandelt ist, hemmt.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, der an zwei Epitope innerhalb der Sequenz bindet.
Assay für den Nachweis des Vorhandenseins eines BPC-1-Proteins in einer biologischen Probe, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit einem Antikörper, Fragment oder Protein nach Anspruch 14, und das Nachweisen der Bindung von BPC-1-Protein in der Probe.
Assay nach Anspruch 24, wobei die biologische Probe Serum, Samen oder Urin ist.
Assay für den Nachweis des Vorhandenseins eines BPC-1-Polynukleotids in einer biologischen Probe, umfassend: (a) das Zusammenbringen der Probe mit einer Polynukleotid-Sonde, welche spezifisch an die BPC-1-cDNA hybridisiert, die innerhalb Plasmid p19P1E8 Klon 6.1, wie bei der American Type Culture Collection als Zugriffs-Nr. 98833 hinterlegt, enthalten ist, oder des Polynukleotid, wie in 1 gezeigt, oder der Komplemente davon; und (b) Nachweisen des Vorhandenseins eines Hybridisationskomplexes, wie gebildet durch die Hybridisation der Sonde mit BPC-1-Polynukleotid in der Probe, wobei das Vorhandensein des Hybridisationskomplexes das Vorhandensein von BPC-1-Polynukleotid innerhalb der Probe anzeigt.
Assay für den Nachweis des Vorhandenseins von BPC-1-mRNA in einer biologischen Probe, umfassend: (a) Produzieren von cDNA aus der Probe durch reverse Transkription unter Verwendung wenigstens eines Primers; (b) Amplifizieren der so produzierten cDNA unter Verwendung von BPC-1-Polynukleotiden als Sense- und Antisense-Primer, um BPC-1-cDNAs darin zu amplifizieren; (c) Nachweisen des Vorhandenseins der amplifizierten BPC-1-cDNA; wobei die als den Sense- und Antisense-Sonden verwendeten BPC-1-Polynukleotide zum Amplifizieren des in 1 gezeigten Polynukleotids fähig sind.
Assay nach Anspruch 24, wobei die Probe Serum von einem mit Krebs diagnostizierten Individuum ist.
Assay nach Anspruch 28, welcher außerdem das mengenmäßige Bestimmen und Vergleichen der Menge an BPC-1-Protein, die in einer Testserumprobe von dem Individuum vorhanden ist, mit der Menge an BPC-1-Protein, die in einer vergleichbaren Serumprobe von einem normalen Individuum vorhanden ist, umfasst, wobei das Vorhandensein einer höheren Menge des BPC-1-Proteins in der Testserumprobe relativ zur normalen Serumprobe das Vorhandensein eines Krebs-exprimierenden BPC-1-Proteins anzeigt.
Assay nach Anspruch 28 oder 29, wobei der Krebs Prostatakrebs oder Blasenkrebs ist.
Assay nach Anspruch 24, wobei die Probe Urin von einem Individuum ist, das für Blasenkrebs diagnostiziert wird.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Krebs-exprimierenden BPC-1-Proteins, welches das Bestimmen der Menge eines BPC-1-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wie durch Zellen in einer Testgewebeprobe von einem Individuum, oder in einer Serum-, Samen- oder Urinprobe von einem Individuum exprimiert, und Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge des BPC-1-Proteins, das in einer entsprechenden normalen Probe exprimiert ist, umfasst, wobei das Vorhandensein von erhöhtem BPC-1-Protein in der Testprobe relativ zur normalen Probe eine Indikation des Vorhandenseins eines derartigen Krebses in dem Individuum liefert.
In-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum, umfassend: (a) Bestimmen der Menge an BPC-1-mRNA, die in einer Testgewebeprobe von einem Individuum exprimiert ist, wobei diese mRNA ein Polynukleotid nach Anspruch 4 ist; (b) Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an BPC-1-mRNA, die in einer vergleichbaren bekannten normalen Gewebeprobe exprimiert ist; wobei das Vorhandensein einer erhöhten BPC-1-mRNA-Expression in der Testprobe relativ zu der normalen Gewebeprobe eine Indikation des Vorhandenseins von Krebs in dem Individuum liefert.
In-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum, umfassend: (a) Bestimmen der Menge eines BPC-1-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die in einer Testgewebeprobe von einem Individuum exprimiert ist; (b) Vergleichen der so bestimmten Menge zu der Menge an BPC-1-Protein, die in einer vergleichbaren bekannten normalen Gewebeprobe exprimiert ist; wobei das Vorhandensein von erhöhtem BPC-1-Protein in der Testprobe relativ zu der normalen Gewebeprobe eine Indikation des Vorhandenseins von Krebs in dem Individuum liefert.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei der Krebs Prostatakrebs ist und die Test- und normalen Gewebeproben von Prostatagewebe, Knochengewebe, lymphatischem Gewebe, Serum, Blut oder Samen sind.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei der Krebs Blasenkrebs ist und die Test- und normalen Gewebeproben von Blasengewebe, lymphatischem Gewebe, Serum, Blut, Samen oder Urin sind.
Antikörper nach Anspruch 10 oder 11, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der anfällig ist für oder bereits einen Krebs aufweist, der BPC-1 exprimiert, welches Verfahren das Verabreichen des Antikörpers an den Patienten in einer ausreichenden Menge, um die Funktion von BPC-1 zu hemmen, umfasst.
Vektor nach Anspruch 21, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einem Krebs, der BPC-1 exprimiert, welches das Verabreichen an den Patienten des Vektors umfasst, so dass der Vektor die einzelkettigen monoklonalen Antikörper-codierende Sequenz an die Krebszellen überträgt und der codierte Einzelketten-Antikörper intrazellulär darin exprimiert wird.
Antikörper oder Vektor nach Anspruch 37 oder 38, wobei der Krebs Prostatakrebs oder Blasenkrebs ist.
Antisense-Polynukleotid, das zu einem BPC-1-Polynukleotid komplementär ist, wie in Anpruch 4 Teil (a), (b), (d) oder (g) definiert, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Krebs.
Antisense-Polynukleotid nach Anspruch 40, welches komplementär zu der 5'UTR der BPC-1-mRNA ist.
Ribozym, das zur Spaltung von BPC-1-mRNA fähig ist, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Krebs, wobei die BPC-1-mRNA eine Polynukleotidsequenz, wie in Anspruch 4 definiert, aufweist.
Impfstoffzusammensetzung für die Behandlung eines BPC-1 exprimierenden Krebses, umfassend ein Protein nach Anspruch 1(b) und einen physiologisch akzeptablen Träger.
Impfstoffzusammensetzung für die Behandlung eines BPC-1 exprimierenden Krebses, umfassend ein Polynukleotid, das ein Protein nach Anspruch 1(b) codiert, und einen physiologisch akzeptablen Träger.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 43 oder 44, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Hemmung der Entwicklung eines BPC-1-exprimierenden Krebses in einem Patienten, umfassend das Verabreichen an den Patienten einer wirksamen Menge des Impfstoffs.
Verwendung von: (a) einem Antikörper nach Anspruch 10 oder 11; (b) einem Vektor nach Anspruch 23; (c) einem Antisense-Polynukleotid nach Anspruch 40 oder 41; oder (d) einem Ribozym nach Anspruch 42; für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten mit dem Krebs.