JP2006320324A - Bpc−1:前立腺および膀胱の癌細胞によって発現および分泌がなされる分泌型の脳特異的蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前立腺癌細胞に高レベルで発現することが知られる、特定のアミノ酸配列で示される分泌腫瘍抗原BPC−1蛋白質。また、該蛋白質をコードし特定の核酸配列を有するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該発現ベクターを含む組み換え宿主細胞、該宿主細胞を培養することによる蛋白質の製造方法、BPC−1蛋白質と特異的に結合するモノクロナール抗体、これを産生するハイブリドーマ、検出可能なマーカーで標識された該抗体を用いるアッセイ法。
【選択図】なし
Description
本明細書で述べる発明は、BPC-1と命名された、新規遺伝子およびそれによりコードされる分泌腫瘍抗原、ならびに前立腺癌、および膀胱癌を特に含むBPC-1を発現する種々の癌の管理に有用な診断方法および治療方法、ならびに組成物に関する。
癌は、冠動脈疾患に次いで2番目に多いヒトの死因である。世界的にみても毎年何百万もの人々が癌で死亡している。米国だけでも毎年50万人をはるかに上回る人々が癌が原因で死亡しており、毎年140万人が新たに癌と診断されている。心疾患による死亡は大幅に減少しているが、癌による死亡は全体として増加しつつある。次世紀の初頭には、癌が死因の第1位になると予想されている。
Gaoら、1997、前立腺31:264〜281 Cupp & Osterling、1993、Mayo Clin Proc 68:297〜306 Carterら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:749 Bzdegaら、1997、J. Neurochem. 69:2270 Israeliら、1994、Cancer Res. 54:1807 Sodeeら、1996、Clin Nuc Med 21:759〜766 Suら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7252 Reiterら、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735
本発明はBPC-1と命名された新規な分泌蛋白質に関する。正常個体では、BPC-1蛋白質は脳の特定の組織のみで発現される。前立腺癌では、BPC-1は腫瘍細胞で高レベルに発現される。BPC-1は膀胱癌細胞でも発現されるほか、他の癌細胞でも発現される可能性がある。BPC-1の構造にはシグナル配列およびCUBドメインが1つずつ含まれる。BPC-1蛋白質のCUBドメインは他のいくつかの蛋白質のCUBドメインと構造的に類似している。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語、表記およびその他の科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されている意味をもつものとする。いくつかの場合には、明確さおよび/または参照の便宜を図るために、意味が一般に理解されている用語の定義を本明細書で行っているが、このような定義を本明細書に含めたことは、当技術分野において一般に理解されているものと実質的に異なることを意味するとは必ずしもみなされるべきではない。本明細書で記載または参照する技法および手順は、当業者に一般によく理解されており、例えば、サムブルック(Sambrook)ら、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.に記載された、広く用いられている分子クローニング法などの慣例的な方法を用いて一般に行われている。市販のキットおよび試薬を用いる手順は、別に特記する場合を除き、適宜、製造者が指示した手順および/またはパラメーターに従って一般に行われる。
以下の実施例の項でさらに述べるように、数多くの分析手法を用いてBPC-1遺伝子および蛋白質の特徴分析を行った。例えば、ヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列の分析を、関連分子と考えられるもの、さらにはBPC-1 mRNAおよび蛋白質の構造における認識可能な構造ドメイン、トポロジー的特徴および他の要素を同定するために行った。BPC-1メッセージを発現する正常および癌性組織の範囲を確かめるために、BPC-1 mRNAの発現に関するRT-PCRおよびノーザンブロット分析も行った。プロセシングを受けた、または受けていない組換えヒトBPC-1蛋白質の細胞内局在および分泌を明らかにするために、実験的にトランスフェクションを行った細胞におけるBPC-1蛋白質の発現に関するウエスタンブロット分析を行った。また、BPC-1の細胞結合パートナーとの相互作用、および活性を明らかにするためにデザインした機能的アッセイ法も行った。
本発明の1つの局面は、BPC-1蛋白質およびその断片をコードするポリヌクレオチド、BPC-1遺伝子もしくはmRNA配列またはその断片に対して相補的なDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドおよび関連分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、およびBPC-1遺伝子、mRNAまたはBPC-1をコードするポリヌクレオチド(「BPC-1ポリヌクレオチド」と総称する)とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、好ましくは単離された形態のBPC-1遺伝子、mRNAおよび/またはコード配列の全体または一部に対応する、または相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いるBPC-1遺伝子および蛋白質は、本明細書に特に記載されるBPC-1遺伝子および蛋白質、ならびに他のBPC-1蛋白質および上記のものと構造的に類似する変異体に対応する遺伝子および蛋白質を含むものとする。このような他のBPC-1蛋白質および変異体は、BPC-1および/またはBPC-1-2コード配列との相同性が高いコード配列を一般に有すると考えられ、好ましくはアミノ酸の同一性が少なくとも約50%であってアミノ酸の相同性(BLASTの基準を用いる)が少なくとも約60%であり、より好ましくは相同性(BLASTの基準を用いる)が70%またはそれ以上である。
本明細書に記載するBPC-1 cDNA配列は、BPC-1遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離のほか、BPC-1遺伝子産物の相同体、選択的スプライシングを受けたアイソフォーム、対立遺伝子変異体(対立遺伝子variant)および変異型のBPC-1遺伝子産物の単離を可能にする。BPC-1遺伝子をコードする完全長cDNAを単離するために用いうる種々の分子クローニング法が周知である(例えば、サムブルック(Sambrook、J.)ら、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Press、New York、1989、分子生物学における最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、アウスユーベル(Ausubel)ら編、WileyおよびSons、1995を参照)。例えば、市販のクローニングシステム(例えば、Lambda ZAP Express、Stratagene)を用いて、λファージクローニング法を都合良く行うことができる。BPC-1遺伝子のcDNAを含むファージクローンは、標識したBPC-1 cDNAまたはその断片をプローブとして検索することによって同定しうる。例えば、1つの態様では、BPC-1 cDNA(図1)またはその一部を合成し、BPC-1遺伝子に対応する重複性および完全長cDNAを回収するためのプローブとして用いることができる。BPC-1遺伝子自体は、ゲノムDNAライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー(BAC)、酵母人工染色体ライブラリー(YAC)などをBPC-1 DNAプローブまたはプライマーによってスクリーニングすることによって単離することが可能である。
本発明は、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、BACのほか、当技術分野で周知の種々のウイルス性および非ウイルス性ベクター、ならびにこのような組換えDNAまたはRNA分子による形質転換またはトランスフェクションを受けた細胞を非制限的に含む、BPC-1ポリヌクレオチドを含む組換えDNAまたはRNA分子も提供する。本明細書で用いる組換えDNAまたはRNA分子とは、インビトロ分子操作を受けたDNAまたはRNA分子のことである。この種の分子を作製するための方法は周知である(例えば、Sambrookら、1989、前記を参照のこと)。
本発明のもう1つの局面は、BPC-1蛋白質およびそのポリペプチド断片を提供する。本発明のBPC-1蛋白質には、本明細書で具体的に特定されるもののほか、以下に概要を示す方法に従った必要以上の実験を行わなくとも単離/生産および特徴分析を行いうる対立遺伝子変異体、保存的置換変異体および相同体が含まれる。異なるBPC-1蛋白質またはその断片の部分を組み合わせた融合蛋白質のほか、BPC-1蛋白質と異種ポリペプチドとの融合蛋白質も含まれる。このようなBPC-1蛋白質は、BPC-1蛋白質、本発明の蛋白質、またはBPC-1として総称するものとする。本明細書で用いる「BPC-1ポリペプチド」という用語は、少なくとも10アミノ酸、好ましくは少なくとも15アミノ酸からなるポリペプチド断片またはBPC-1蛋白質を意味する。
本発明のもう1つの局面は、BPC-1蛋白質およびポリペプチドと結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、BPC-1蛋白質とは選択的に結合するが、BPC-1以外の蛋白質およびポリペプチドとは結合しない(または結合が弱い)ものと考えられる。特に考慮の対象となる抗BPC-1抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体のほか、これらの抗体の抗原結合ドメインおよび/または1つもしくは複数の相補性決定領域を含む断片が含まれる。本明細書で用いる抗体断片とは、その標的と結合する免疫グロブリン分子の可変領域、すなわち抗原結合領域の少なくとも一部と定義される。
本発明のもう1つの局面は、BPC-1ポリヌクレオチドおよびBPC-1蛋白質を検出するための方法、ならびにBPC-1を発現する細胞を同定するための方法に関する。
個体におけるBPC-1発現パターンの状態の判定は癌の診断に用いることができ、適切な治療選択肢を定める上で有用な予後判定情報をもたらすと思われる。同様に、BPC-1の発現状態は特定の病期に対する感受性、進行および/または腫瘍の悪性度を予測するために重要な情報をもたらすと思われる。本発明は、BPC-1発現状態の判定およびBPC-1を発現する、前立腺癌および膀胱癌などの癌の診断のための方法およびアッセイ法を提供する。
成熟BPC-1は分泌蛋白質である。BPC-1を発現する腫瘍はBPC-1を血管系に分泌する、および/または尿中もしくは精液中に排出すると考えられ、分子診断の技術分野で周知のアッセイ法および技法を用いて、本蛋白質をそこで検出および定量化することができる。排出されたBPC-1は尿および精液中でも検出可能である。循環血中または排出されたBPC-1のレベルの検出および定量化には、前立腺癌、膀胱癌および他のこのようなBPC-1発現性腫瘍の診断、病期判定および予後判定において数多くの用途があると考えられる。当技術分野では、血清蛋白質の検出および定量化のための多種多様な技術的アプローチが周知である。
正常個体では脳組織でのみ発現されるが、前立腺癌では高発現される(さらに膀胱癌およびおそらくは他の癌においても発現される)分泌蛋白質としてのBPC-1の同定は、前立腺癌、膀胱癌およびおそらくは他の癌の治療に向けた数多くの治療的アプローチへの道を開くものである。本出願者らの最初の機能的研究からは、BPC-1がトランスフォーメーション活性を有しており、この活性がBPC-1の細胞蛋白質との相互作用によって、または別の蛋白質との結合もしくは会合によって惹起されることが示唆された。この蛋白質のCUBドメインは、他の分泌分子、細胞外マトリックス分子および/または細胞表面受容体との相互作用を媒介する、蛋白質-蛋白質相互作用ドメインとしての役割も果たすと考えられる。
治療的アプローチの第1の分類に含まれるものとして、本発明は、BPC-1蛋白質の受容体もしくは他の結合パートナーとの結合、またはその他の蛋白質との会合を阻害するためのさまざまな方法および組成物、さらにBPC-1機能を阻害するための方法を含む。
1つのアプローチでは、BPC-1と結合し、それによってBPC-1が協調的結合パートナーと結合する能力、または他の蛋白質と結合もしくは会合する能力を阻害する抗体を、BPC-1が関与する発癌/トランスフォーメーションシグナル伝達経路を弱めるために用いる。結合パートナーを介したシグナルにより、BPC-1が腫瘍細胞の増殖の開始、促進および/または維持に関与する範囲において、このような抗体は治療的に有用と考えられる。
もう1つのアプローチでは、BPC-1と特異的に結合する一本鎖抗体をコードする組換えベクターを遺伝子導入技術によってBPC-1発現細胞に導入し、コードされる一本鎖抗BPC-1抗体を細胞内で発現させ、BPC-1蛋白質と結合させてそれによってその機能を阻害する。このような細胞内一本鎖抗体を作製するための方法はよく知られている。このような細胞内抗体は「イントラボディー(intrabody)」としても知られており、細胞内の特定の区画を特異的な標的とさせて、治療の阻害活性を集中させようとする領域を高度に制御することを可能にする。この技術は当技術分野で首尾よく用いられている(概説については、RichardsonおよびMarasco、1995、TIBTECH 第13巻を参照のこと)。イントラボディーは通常であれば豊富に存在する細胞表面受容体の発現を事実上消失させることが示されている。例えば、リチャードソン(Richardson)ら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137〜3141、ベールリ(Beerli)ら、1994、J. Biol. Chem. 289:23931〜23936、デシェーン(Deshane)ら、1994、Gene Ther. 1:332〜337を参照されたい。
もう1つのアプローチでは、BPC-1と結合し、それによってBPC-1が協調的受容体に到達/結合すること、または発癌シグナルの伝達に関与する別の蛋白質と会合することを妨げることができる組換え分子が、BPC-1の機能を阻害するために用いられる。このような組換え分子は、例えば、BPC-1特異的な抗体分子の反応性部分を含む。1つの具体的な態様では、BPC-1受容体または結合パートナーのBPC-1リガンド結合ドメインが、ヒトIgG1などのヒトIgGのFc部分と連結した2つのBPC-1リガンド結合ドメインを含む二量体融合蛋白質に組み込まれる。このようなIgG部分は、例えば、CH2およびCH3ドメインならびにヒンジ領域を含むが、CH1ドメインは含まない。このような二量体融合蛋白質は、前立腺癌および膀胱癌を非制限的に含む、BPC-1の発現に伴う癌に罹患した患者に可溶性形態として投与することができ、この際、二量体融合蛋白質はBPC-1と特異的に結合し、それによってBPC-1の受容体または他の結合パートナーとの相互作用を阻害する。既知の抗体連結技術を用いて、このような二量体融合蛋白質をさらに組み合わせて多量体蛋白質とすることもできる。
治療的アプローチの第2の分類に含まれるものとして、本発明は、BPC-1遺伝子の転写を阻害するためのさまざまな方法および組成物を提供する。同様に、本発明は、BPC-1 mRNAの蛋白質への翻訳を阻害するための方法および組成物も提供する。
BPC-1を合成する腫瘍細胞に治療用ポリヌクレオチド分子(すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディーおよび他のBPC-1阻害分子をコードするポリヌクレオチド)を送達するために、遺伝子導入および遺伝子治療技術を用いることができる。数多くの遺伝子治療アプローチが当技術分野では知られている。BPC-1アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、BPC-1の転写を妨げることが可能な因子、成熟BPC-1のプロセシングおよび/または分泌を妨げることが可能な因子などをコードする組換えベクターを、このような遺伝子治療アプローチを用いて標的腫瘍細胞に送達することができる。
本発明はさらに、BPC-1蛋白質またはその断片を含む前立腺癌ワクチンを提供する。抗癌療法において体液性および細胞性免疫を生じさせるためのワクチンにおける腫瘍抗原の使用は当技術分野で周知であり、ヒトPSMAおよび齧歯類PAP免疫原を用いて前立腺癌に使用されている(Hodgeら、1995、Int. J. 癌 63:231〜237、Fongら、1997、J. Immunol. 159:3113〜3117)。このような方法は、BPC-1蛋白質もしくはその断片、またはBPC-1免疫原を発現して適切に提示することが可能なBPC-1をコードする核酸分子および組換えベクターを用いることにより、容易に実施しうる。
本発明は、上記において記載および提案した診断的および治療的用途における使用のためのキットも提供する。このようなキットは、バイアル、管などの1つまたは複数の容器手段を密に拘束して収容するために区画化された担体手段を含み、容器手段のそれぞれは本方法に用いる別々の要素の1つを含む。例えば、容器手段の1つは、検出可能な標識がなされているか、またはそれが可能なプローブを含む。このようなプローブは、BPC-1蛋白質またはBPC-1遺伝子もしくはmRNAに対してそれぞれ特異的な抗体またはポリヌクレオチドであってよい。標的核酸を検出するためにキットが核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合には、キットは標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含む容器、および/または酵素性、蛍光性もしくは放射性ヌクレオチド標識などのレポーター分子を結合させたアビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチン結合蛋白質などのレポーター手段を含む容器も有しうる。
以下のいくつかの実施例により、本発明のさまざまな局面の説明および例示をさらに行うが、これらはいずれも発明の範囲を制限するためのものではない。
BPC-1遺伝子のcDNA断片の単離
材料および方法
細胞株およびヒト組織
LAPC異種移植片:
LAPC異種移植片はチャールズ・ソーヤーズ博士(Dr. Charles Sawyers)(UCLA)から入手し、以前の記載の通りに作製した(Kleinら、1997、Nature Med. 3:402〜408)。アンドロゲン依存性および非依存性LAPC-4異種移植片(それぞれLAPC-4 ADおよびAI)ならびにLAPC-9 AD異種移植片を雄性SCIDマウスの体内で増殖させ、小型組織塊としてレシピエントの雄に継代した。LAPC-4 AI異種移植片はLAPC-4 AD腫瘍から得た。LAPC-4 AD腫瘍を有する雄性マウスを去勢し、2〜3カ月間飼育した。LAPC-4腫瘍が再び成長した時点で腫瘍を採取し、去勢雄または雌性SCIDマウスに継代した。
ヒト細胞株(例えば、HeLa)はATCCから入手し、10%ウシ胎児血清を加えたDMEM中で維持した。
全RNAを単離するために、腫瘍組織および細胞株をトリゾール(Trizol)試薬(Life Technologies、Gibco BRL)中にて10ml/ g組織または10ml/ 細胞108個の濃度で用いてホモジネート化した。ポリA RNAは、キアゲン(Qiagen)社のオリゴテックス(Oligotex)mRNAミニ(Mini)およびミィディ(Midi)キットを用いて全RNAから精製した。全RNAおよびmRNAを分光光度分析(O.D. 260/280nm)により定量化し、ゲル電気泳動によって分析した。
アンドロゲン依存性前立腺癌と比較して、アンドロゲン非依存性前立腺癌でダウンレギュレートされると思われる遺伝子に対応するcDNAを同定するために、抑制サブトラクション・ハイブリダイゼーション(SSH)を用いた。
SSH反応によって得た遺伝子断片を増幅するためにPCR増幅を2回行った。第1のPCR反応では、希釈した最終的なハイブリダイゼーション混合物1μlを、1μlのPCRプライマー1(10μM)、0.5μlのdNTP混合物(10μM)、2.5μlの10×反応バッファー(CLONTECH)および0.5μlの50×アドバンテージcDNAポリメラーゼ混合物(Advantage cDNA polymerase Mix)(CLONTECH)に添加し、最終容積25μlとした。PCR 1は以下の条件を用いて行った:75℃ 5分間、94℃ 25秒間の後、94℃ 10秒間、66℃ 30秒間、72℃ 1.5分間を27サイクル。各実験に関して第1のPCR反応を別々に5回ずつ行った。産物は集積し、水で1:10に希釈した。第2のPCR反応では、集積および希釈した第1のPCR反応物1μlに対して、PCRプライマー1の代わりにプライマーNP1およびNP2(10μM)を用いた点を除いてPCR 1に用いたものと同じ反応混合物を添加した。PCR 2は、94℃ 10秒間、68℃ 30秒間、72℃ 1.5分間を10〜12サイクル用いて行った。2%アガロースゲル電気泳動を用いてPCR産物を分析した。
第1のcDNA鎖は、ギブコ社(Gibco-BRL)のスーパースクリプト・プレ増幅システム(Superscript Preamplification system)を用いるオリゴ(dT) 12-18プライミングにより、1μgのmRNAから作製した。製造者の手順を用いたが、これは逆転写酵素とともに42℃で50分間インキュベートした後にRNAse H処理を37℃で20分間行う段階を含む。反応を終えた後、水を加えて容積を200μlに増やしてから標準化を行った。16種の異なる正常ヒト組織に由来する第1のcDNA鎖はクローンテック(Clontech)社から入手した。
前記の材料および方法の項に記載した通りにSSH実験をいくつか行い、候補となる遺伝子断片クローン(SSHクローン)を数多く単離した。対応する遺伝子の同一性に関する情報を得るため、および特定遺伝子の発現の差を分析するための決断を導く一助とするために、すべての候補クローンのシークエンシングを行い、主要な公的遺伝子およびESTデータベース中の全配列に対してホモロジー解析を行った。一般に、検索したいずれのデータベース中の既知の配列とも相同性がなく、このため新規遺伝子と考えられる遺伝子断片、ならびにこれまでにシークエンシングがなされた発現配列タグ(EST)との相同性が認められた遺伝子断片に対して、RT-PCRおよび/またはノーザン解析によるディファレンシャル発現解析を行った。
完全長BPC-1をコードするcDNAの単離
上記の19P1E8 SHHクローン(実施例1)を用いて、完全長19P1E8 cDNAを単離した。簡潔に述べると、LAPC-4 mRNAから作製したcDNAライブラリーを、SSHクローンから作製した標識プローブによってスクリーニングした。具体的には、ラムダZAPエクスプレス(Stratagene)中に作製したLAPC-4 AD cDNAライブラリーから、2639塩基対(bp)の完全長19P1E8 cDNAをクローニングした。
BPC-1遺伝子の発現分析―正常組織では脳特異的である
正常ヒト組織におけるBPC-1 mRNAの発現に関する最初の分析はまず、標識した19P1E8 SSHクローン(実施例1)をプローブとして用いる、クローンテック(Clontech)社(Palo Alto、California)から入手した合計16種の異なる正常ヒト組織を含む2種類の複数組織ブロットに対するノーザンブロット法によって行った。RNA試料はβ-アクチンプローブを用いて定量的に標準化した。
胎児組織におけるBPC-1発現―発生過程ではより広範な発現がみられる
CUBドメイン蛋白質はしばしば発生過程において調節を受ける。BPC-1がヒト胎児組織で発現されるかどうかを明らかにするために、8種の異なる胎児組織に由来する第1ストランドcDNAに対してRT-PCRを行った。その結果、BPC-1が胎児脳で高発現され、他のすべての胎児組織でもこれより低いレベルで検出されることが示された(図8)。このことは、成人における発現は脳に限定され、他の組織での発現は発生過程中に停止することを示唆している。
前立腺癌における高レベルのBPC-1発現
癌組織および細胞株におけるBPC-1の発現を分析するために、LAPC前立腺癌異種移植片ならびに一連の前立腺癌および膀胱癌細胞株に由来するRNAに対してノーザンブロット分析を行った。図9に示す結果から、BPC-1の最も高レベルの発現は、いずれも前立腺癌のリンパ節転移に由来する、LAPC-4 AD前立腺癌異種移植片およびLNCaP前立腺癌細胞株で認められることが明らかになった(Kleinら、1997、Nature Med. 3:402;Horoszewiczら、1983、Cancer Res. 43:1809)。LAPC-4 AI、LAPC-9 ADおよびLAPC-9 AIではこれよりも低いレベルのBPC-1発現が検出された(図9)。検討した膀胱癌細胞株のうち1つ(5637)では、BPC-1の発現が検出された(図9)。前立腺および正常前立腺の基底細胞区画であるPrEC細胞(Clonetics)では全く発現が検出されなかった。
分泌型組換えBPC-1のインビトロでの産生
組換えBPC-1を発現させて、BPC-1蛋白質の細胞内局在を分析するために、カルボキシ末端に6Hisタグを付与する発現ベクター(pCDNA 3.1 myc-his、InVitrogen)中に完全長cDNAをクローニングした。35S-メチオニンで1時間標識した293T細胞にこの作製物をトランスフェクトした。続いて細胞を洗浄し、さまざまな時点での標識蛋白質を追跡するために非放射性培地中でインキュベートした。追跡開始後のさまざまな時点で、細胞抽出物および細胞上清(培地)からの抗His抗体(Santa Cruz)を用いてBPC-1-His付加蛋白質を免疫沈降させた。SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)に続いて35S-メチオニン標識蛋白質を可視化するためのオートラジオグラフィーを行うことにより、免疫沈降物を分析した。
バキュロウイルス系を用いた組換えBPC-1の産生
バキュロウイルス発現系で組換えBPC-1蛋白質を産生させるために、昆虫細胞の培養液中への分泌のためのミツバチメリチンシグナル配列をもたらすバキュロウイルス導入ベクターpMelBac(Invitrogen)中にBPC-1 cDNAをクローニングした。pMelBac-BPC-1をヘルパープラスミドpBlueBac4.5(Invitrogen)とともにSF9(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞に同時トランスフェクトして、組換えバキュロウイルス(詳細についてはInvitrogen社の説明書を参照のこと)を作製した。バキュロウイルスを細胞上清から回収し、プラークアッセイ法によって精製した。
BPC-1ポリクローナル抗体の作製
BPC-1と特異的に結合する抗体試薬を作製するために、BPC-1蛋白質のアミノ酸29〜93を包含するグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合蛋白質を合成し、免疫原として用いた。この融合蛋白質は、以下のプライマーを用いて、BPC-1のcDNAクローンのヌクレオチド877〜1,071(AA 29〜93)をPCRを介して増幅することによって作製した:
BPC-1モノクローナル抗体の作製
BPC-1に対するmAbを作製するために、Balb Cマウス5匹にまず、完全フロイントアジュバント中に混合した200μgのGST-BPC-1融合蛋白質による腹腔内免疫処置を行った。続いてマウスに、不完全フロイントアジュバント中に混合した75μgのGST-BPC-1蛋白質による免疫処置を2週間毎に計3回行った。免疫化マウスから得た血清の完全長BPC-1蛋白質に対する反応性を、293T細胞により発現させたHIS付加BPC-1蛋白質の部分精製調製物を用いるELISAによって観測した。最も強い反応性が認められたマウス2匹を3週間安静にした後、PBS中に溶解した融合蛋白質の最終注射を行い、4日後に屠殺した。屠殺したマウスの脾臓を採取し、標準的な手順を用いてSPO/2骨髄腫細胞と融合させた(HarlowおよびLane、1988)。BPC-1特異的抗体を産生するクローンを同定するために、HAT選択後の増殖用ウェルの上清をELISAおよびウエスタンブロット法によってスクリーニングした。
哺乳動物発現系において発現される組換えBPC-1の産生および精製
C末端に6XHisおよびMYCタグを有するBPC-1をコードするCMV駆動性発現ベクター(pcDNA3.1/mycHIS、Invitrogen)を一時的にトランスフェクトされた293T細胞、またはこれを安定的に発現する293細胞は、精製用の分泌型可溶性BPC-1蛋白質の供給源として役立つ(上記の実施例6を参照のこと)。馴化培地中に分泌されたHIS付加BPC-1蛋白質は以下の方法によって精製される。馴化培地(500ml)を10倍に濃縮し、同時にアミコン(amicon)限外濾過装置をMWカットオフ値10kdの膜とともに用いて、750mM NaClおよび10mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液(pH 8.0)への緩衝液交換を行う。続いてこの調製物を総容積(bed volume)0.5mlのニッケル金属アフィニティー樹脂(Ni-NTA、Qiagen)に通し、10%エタノールおよび300mM NaClを含むリン酸緩衝液(pH 6.0)で十分に洗浄する。続いて、250mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液(pH 6.0)でHIS付加BPC-1蛋白質を溶出させる。高ストリンジェンシー洗浄(75mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液)を含む上記のクロマトグラフィー手順を反復することにより、または抗HIS Abイムノアフィニティーカラムを通過させることにより、高純度の調製物が得られる。この方法を組換えHIS-BPC-1の精製に首尾よく用いた。精製された蛋白質のウエスタンブロットは、図13の最も左側のレーンに示されている。
分泌型ヒトBPC-1のレトロウイルスを介した発現
BPC-1のコード領域をSRαmsvtkneoレトロウイルスベクター(Mullerら、1991 MOB 11:1785〜1792)中にサブクローニングした。BPC-1遺伝子を発現する細胞株を作製するためにレトロウイルスを作製して用いた。作製した細胞株は、3T3/BPC-1およびPC3/BPC-1である。SR-αBPC-1ウイルスを急性感染させた3T3細胞は、図12に示したノーザンブロットによって示されている通り、極めて高レベルのBPC-1 mRNAを発現する。BPC-1蛋白質のN末端部分(aa29〜93)を含むGST融合蛋白質に対するポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析により、PC3/BPC-1可溶化物および上清をBPC-1発現に関して以下の通りに検査した。対照(Neo)またはBPC-1をコードするレトロウイルスを安定的に発現するPC3および3T3細胞、ならびにBPC-1レトロウイルスに急性感染させた3T3細胞を10cm径の組織培養プレート中で4日間培養した。各細胞株から得た25μlの非希釈上清を、マウス抗BPC-1ポリクローナル血清の1:500希釈物を用いるウエスタンブロット分析にかけた。続いてブロットを抗マウスHRP結合二次抗体とともにインキュベートし、BPC-1特異的シグナルをエンハンスト・ケミルミネセンス検出によって可視化した。このウエスタンブロット分析の結果は図13に示されている。
インビトロおよびインビボでのBPC-1発現分析
BPC-1特異的抗体による細胞可溶化物および馴化培地のウエスタンおよび免疫沈降分析を用いて、LAPC4およびLAPC9異種移植片、LNCaP前立腺癌細胞、5637膀胱癌細胞、正常ヒト脳可溶化物(これらはすべてBPC-1 mRNAを発現する)、さらには他のさまざまな癌細胞株、異種移植片および正常組織などの細胞系および組織におけるBPC-1蛋白質の発現の同定および特徴分析を行うことができる。BPC-1とブタおよびウシの精子アドヘシンファミリーの蛋白質との間には構造的相同性があるため(Topfer-Petersenら、Andrologia、1998)、ヒト精液も検出可能なレベルのBPC-1蛋白質を含むと思われる。同じく、膀胱癌における発現からみて、BPC-1蛋白質は膀胱癌患者の尿中にも検出される可能性がある。MYC-HIS BPC-1をトランスフェクトした293T細胞、ならびにレトロウイルスによる形質導入を受けたPC3およびNIH 3T3細胞は、BPC-1蛋白質の発現に関する陽性対照として役立つ(図13)。
BPC-1に関する捕捉ELISA
ヒト血清、精液および尿の臨床試料中に存在するBPC-1蛋白質の同定および定量化は、捕捉ELISAを用いて以下の通りに行うことができる。BPC-1に関する捕捉ELISAは、BPC-1蛋白質の異なるエピトープを認識するアイソタイプの異なる少なくとも2種類のmAb、またはmAbおよび特異的ウサギポリクローナル血清を1つずつ作製することに依存する。一方の試薬は捕捉(またはコーティング)抗体として、もう一方は検出抗体として用いられる。
インビトロでの足場非依存的コロニー形成におけるBPC-1発現の結果
BPC-1の発癌性能力を評価するための軟寒天アッセイ法を行うために、レトロウイルスに感染したBPC-1発現細胞を実施例11に記載した通りに作製し、それぞれのneo対照細胞株とともに用いた。寒天アッセイ法は以前に記載された条件に従って行った(Lugo, T.RおよびO.N.Witte、1989、Molec. Cell. Biol. 9:1263〜1270)。簡潔に述べると、細胞をトリプシン処理し、0.3%ノーブル(Noble)寒天および20%ウシ胎児血清を含むイスコーブ培地中に再懸濁した。この細胞寒天懸濁液(細胞104個/60mmプレート)を0.6%ノーブル寒天および20%ウシ胎児血清を含む培地の底層と上層との間に播いた。プレートには7日後に栄養分を加え、コロニーのサイズに応じて、寒天アッセイ法の開始から2または3週間後にコロニーの検討およびスコア化を行った。コロニーの算定にはアルファイメージャー(Alphalmager)200のソフトウエアを用いた。この結果を以下の表1に示す。
BPC-1の発現は細胞のトランスフォーメーションを誘導する
BPC-1は細胞蛋白質と結合する
BPC-1が前立腺癌細胞および他の癌細胞または正常細胞で発現される細胞蛋白質と結合するか否かを確かめるために、2種類のアプローチを用いた。第1のアプローチでは、組換えHIS付加BPC-1(上記の実施例6)の種々の細胞株との結合に関するインビトロアッセイ法を用いる。もう1つのアプローチでは、BPC-1のさまざまな前立腺癌細胞株との結合を検討するために、ジェンハンター社(GenHunter Corporation)(Nashville、TN、カタログ番号Q202)のAP-TAGシステム、およびAP-TAG融合を用いて、組換えアルカリホスファターゼ-BPC-1融合蛋白質を作製する。
PC-3およびNIH 3T3細胞を、HIS付加BPC-1(293Tトランスフェクト細胞からのもの)を含む馴化培地または精製したHIS付加BPC-1を含む培地または対照培地とともに、4℃で2時間、氷上でインキュベートする。0.5%FBSを加えた氷冷PBSで細胞を十分に洗浄した後、過剰量の抗HISウサギポリクローナル抗体(5ug/ml、PBS 0.5%FBS)とともに4℃で1時間インキュベートする。細胞を再び洗浄し、続いて抗ウサギFITC結合二次Ab(1:4,000、PBS/0.5%FBS中)とともに4℃で30分間インキュベートする。続いて、細胞と結合したBPC-1を、サイトフルオロ(Cytofluor)4000蛍光計(PE Biosystems)での蛍光定量分析によって、および/またはフローサイトメトリーによって検出する。
アルカリホスファターゼ付加BPC-1を以下の通りに作製した。成熟BPC-1(すなわち、シグナル配列をもたないもの)をコードする配列を、pAPtag-5(GenHunter Corp. Nashville、TN)中にクローニングした。以下のBPC-1.HindIIIおよびBPC-1.BamHIプライマーを用いて、プラスミドテンプレートSRa-19P1E8クローン1に由来するアミノ酸23から58までのBPC-1のオープンリーディングフレームを増幅した。IgGKシグナル配列、BPC-1 ORFおよびアルカリホスファターゼをすべてインフレームに保ちながら、HindIIIおよびBamHIで消化したPCR産物をHindIIIおよびBglIIで消化したpAPtag-5と連結した。このBPC-1-AP融合蛋白質は、アルカリホスファターゼのカルボキシ末端にmyc/Hisタグを伴った形での分泌を促進するためのIgGKシグナル配列を含む。
シグナル伝達経路と考えられるものの同定
BPC-1が細胞内の既知のシグナル伝達経路を直接的または間接的に活性化するか否かを明らかにするためには、BPC-1を発現するか、またはBPC-1を外因性に添加した細胞において、ルシフェラーゼ(luc)に基づく転写レポーターアッセイ法を行う。これらの転写レポーターは、詳細に特徴が調べられているシグナル伝達経路の下流に位置する既知の転写因子に関するコンセンサス結合部位を含む。レポーターならびにそれに伴う転写因子、シグナル伝達経路および活性化刺激の例を以下に列挙する。
1.NFκB-luc、NFκB/Rel;Ikキナーゼ/SAPK;増殖/アポトーシス/ストレス
2.SRE-luc、SRF/TCF/ELK1;MAPK/SAPK;増殖/分化
3.AP-1-luc、FOS/JUN;MAPK/SAPK/PKC;増殖/アポトーシス/ストレス
4.ARE-luc、アンドロゲン受容体;ステロイド/MAPK;増殖/分化/アポトーシス
5.p53-luc、p53;SAPK;増殖/分化/アポトーシス
6.CRE-luc、CREB/ATF2;PKA/p38;増殖/アポトーシス/ストレス
BPC-1機能のインビトロアッセイ法
A.細胞浸潤/移動/化学誘引アッセイ法
マトリゲル(matrigel)コート多孔性膜チャンバー(Becton Dickinson)の通過を測定することにより、BPC-1を発現する細胞株を浸潤および移動特性の変化に関してアッセイすることができる。膜の反対側への細胞の通過は、カルセイン-Am(Molecular Probes)を添加した指標細胞を用いる蛍光アッセイ法(Becton Dickinson技術報告書第428号)を用いて観測される。分析する細胞株にはPC3、3T3およびLNCaP細胞の親細胞およびBPC-1過剰発現細胞が含まれる。BPC-1が化学誘引特性を有する否かをアッセイするためには、BPC-1馴化培地の勾配に向かっての親指標細胞の多孔性膜の通過を観測し、対照培地と比較する。
BPC-1が確立された前立腺および非前立腺細胞株の増殖速度を変化させるか否かを明らかにするためには、対照レトロウイルスベクターによる形質導入を行った親細胞とBPC-1遺伝子をコードするレトロウイルスによる形質導入を行った細胞を比較する増殖曲線を作成する。アッセイする細胞株には、LNCaP、PC3、TsuPR前立腺細胞株およびマウスNIH 3T3線維芽細胞ならびに種々の他のヒト非前立腺細胞株が含まれる。さらに、外因性に添加した精製MYC-HIS BPC-1の存在下および非存在下における親細胞の増殖速度をアッセイする。外因性BPC-1の代替的な供給源としては、BPC-1レトロウイルスによる形質導入を行ったそれぞれの細胞株の馴化培地を用いることができる。細胞株の増殖は、96ウェルを用いるMTT比色アッセイ法で観測する(RaitanoおよびKorc、1990、J. Biol. Chem. 265:10466〜10472)。
BPC-1の研究および前立腺癌治療的組成物の試験のためのインビボモデル
A.外因性(xenogenic)腫瘍を有するマウスにおける血清BPC-1レベルの測定
ノーザンブロット分析による判定では、LNCaP前立腺癌細胞およびLAPC-4 AD異種移植片細胞は高レベルのBPC-1を発現する。血清診断マーカーとしてのBPC-1を評価するには、SCIDマウスに1×106個のLNCaPまたはLAPC-4 AD細胞を皮下または同所的に注入する。注射はマウスの両脇腹に行い、長さ×幅×高さ(L×W×H)を反映するキャリパー測定によって腫瘍の増殖を観測する。触知可能な腫瘍が最初に出現した時点でマウスから採血し、以降は腫瘍のサイズが1,000mm3になるまで毎週採血する。上記のELISAアッセイ法により、連続採血したものをBPC-1の有無に関してスクリーニングする。対照としては、特異的ELISAキットを用いて、腫瘍を有するマウスから採取した血清をPSAの分泌に関して評価する。BPC-1の発現を確認するためには、腫瘍をマウスから採取し、BPC-1の発現をウエスタンブロット法によってスクリーニングする。
腫瘍細胞の増殖に対するBPC-1蛋白質の影響は、遺伝子の過剰発現、または腫瘍を有するマウスに可溶性の精製BPC-1蛋白質を投与することによってインビボで評価しうる。第1の例では、tkNeoエンプティベクターまたはBPC-1を含む1×106個のPC3、TSUPR1またはDU145細胞のいずれかをSCIDマウスの両脇腹に皮下注射する。少なくとも2種類の戦略を用いることができる:(1)LTRプロモーターの調節下にある構成的なBPC-1発現、および(2)エクジソン誘導ベクター系の制御下にある調節性発現。続いて、BPC-1発現細胞がより早い速度で増殖するかどうかを判定するために、触知可能な腫瘍が出現した時点で腫瘍体積を測定し、経時的に追跡する。さらに、BPC-1が前立腺における局所的増殖、または細胞の転移能、特に肺、リンパ節および骨髄への転移能に影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、1×105個の同一細胞をマウスに同所的に移植することもできる。
腫瘍の形成および増殖に対するBPC-1特異的mAbの効果を検討するために、BPC-1陽性のLNCaP、LAPC-4 ADおよびPC3-BPC-1腫瘍、またはBPC-1を発現しないPC3-tkNeoのいずれかに関する群にマウスを分ける。腫瘍形成に対する効果を評価するには、マウスに1×106個の腫瘍細胞を皮下注射し、それと同じ日に一定範囲のBPC-1特異的mAbまたは対照Ig(例えば100、500または1,000μg)の腹腔内注射を行う。mAbの注射は毎週2回、連続4週間にわたって行う。腫瘍の増殖は上記の通りに追跡する。または、確立した腫瘍に対する効果を評価するために、100mm3のサイズの確立した腫瘍を有する各群にマウスを分け、以前に述べた投与量および方式に従ってmAbの腹腔内注射を行う。確立した腫瘍の増殖に対するmAbの効果を判定するために、腫瘍体積を追跡する。
BPC-1受容体または結合パートナーの分子クローニング
タルタリア(Tartaglia)ら、1995、Cell 83:1263〜1271、ならびにチェン(Cheng)およびフラナガン(Flanagan)、1994、Cell 79:157〜168などに記載されたものといった発現クローニング法を用いて、BPC-1に対する受容体をクローニングすることができる。まず、BPC-1-AP結合を示す細胞から発現ライブラリーを作製する。約1000個のクローンのプールでライブラリーを作製した後に、姉妹選択法によってスクリーニングを行ってもよい。各プールからのDNAによるCOS細胞の一時的トランスフェクションに続いて、BPC-1-AP結合によるスクリーニング、洗浄、およびAP活性に関する染色を行うことにより、BPC-1と結合する細胞、すなわちBPC-1受容体を発現する細胞が同定される。プールの細分およびスクリーニングを連続して行うことにより、BPC-1-APと結合する単一のコロニーを同定することができる。
Claims (71)
- 図1のアミノ酸残基1位からアミノ酸残基158位までに示されたアミノ酸配列を有する、単離されたBPC-1蛋白質。
- 図1のアミノ酸残基24位からアミノ酸残基158位までに示されたアミノ酸配列を有する、単離されたBPC-1蛋白質。
- 図1のアミノ酸残基約51位からアミノ酸残基約152位までに示されたBPC-1蛋白質のCUBドメインを少なくとも1つ含む、単離された蛋白質。
- 請求項1記載の蛋白質の少なくとも15個の連続したアミノ酸からなる単離されたポリペプチド。
- 請求項2記載の蛋白質のアミノ酸配列との全長にわたる同一性が少なくとも90%である、単離ポリペプチド。
- (a)TがUであってもよい、図1に示された配列を有するポリヌクレオチド、(b)TがUであってもよい、図1のヌクレオチド残基793位からヌクレオチド残基1269位までに示された配列を有するポリヌクレオチド、(c)TがUであってもよい、図1のヌクレオチド残基862位からヌクレオチド残基1269位までに示された配列を有するポリヌクレオチド、(d)アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)に登録番号98833として登録されたプラスミドp19P1E8クローン6.1中に含まれるcDNAによって配列がコードされるBPC-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(e)請求項1記載のBPC-1蛋白質をコードするポリヌクレオチド、(f)請求項2記載のBPC-1蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および(g)請求項3記載のBPC-1蛋白質をコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
- 図1のヌクレオチド残基793位から1269位までに示されたBPC-1前駆体のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 図1のヌクレオチド残基862位から1269位までに示された成熟BPC-1のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 図1のヌクレオチド残基943位から1248位までに示されたBPC-1 CUBドメインのコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドに対して完全に相補的である、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 請求項11記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 検出可能なマーカーで標識された、請求項6記載の単離ポリヌクレオチド。
- ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項12記載の宿主細胞を培養すること、および培養物からBPC-1蛋白質を回収することを含む、BPC-1蛋白質を生産するための方法。
- BPC-1蛋白質が培養液中に分泌される、請求項14記載の方法。
- 請求項14または15記載の方法によって生産されるBPC-1ポリペプチド。
- 請求項1記載のBPC-1蛋白質と免疫特異的に結合する抗体。
- 請求項2記載のBPC-1蛋白質と免疫特異的に結合する抗体。
- 請求項3記載のBPC-1蛋白質と免疫特異的に結合する抗体。
- 請求項4記載のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体。
- 請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体。
- 検出可能なマーカーで標識された、請求項21記載のモノクローナル抗体。
- 検出可能なマーカーが放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群より選択される、請求項22記載のモノクローナル抗体。
- 請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体のFab、F(ab')2、FvまたはSfv断片。
- 検出可能なマーカーで標識された、請求項24記載のモノクローナル抗体の断片。
- 検出可能なマーカーが放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群より選択される、請求項25記載のモノクローナル抗体の断片。
- マウス抗原結合領域残基およびヒト抗体残基を含む、請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体。
- ヒト抗体である、請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体。
- 請求項28記載のモノクローナル抗体を産生するトランスジェニック動物。
- 請求項21記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む組換え蛋白質。
- 検出可能なマーカーで標識された、請求項31記載の組換え蛋白質。
- 検出可能なマーカーが放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群より選択される、請求項32記載の組換え蛋白質。
- 請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む、一本鎖モノクローナル抗体。
- 請求項34記載の一本鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 有効量の前記抗体で治療された患者におけるBPC-1を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項17、18、19または20記載のモノクローナル抗体。
- 成熟BPC-1蛋白質内部の2種類のエピトープと結合する、二重特異性モノクローナル抗体。
- 試料を請求項22記載の抗体、請求項25記載の抗体断片または請求項32記載の組換え蛋白質と接触させること、およびそれに対する試料中のBPC-1蛋白質の結合を検出することを含む、生物試料中のBPC-1蛋白質の存在を検出するためのアッセイ法。
- 生物試料が血清である、請求項38記載のアッセイ法。
- 生物試料が精液である、請求項38記載のアッセイ法。
- 生物試料が尿である、請求項38記載のアッセイ法。
- 生物試料中のBPC-1ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイ法であって、
(a)試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)に登録番号98833として登録されたプラスミドp19P1E8クローン6.1中に含まれるBPC-1 cDNAまたは図1に示すポリヌクレオチドもしくはその相補物と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
(b)ハイブリダイゼーション複合体の存在によって試料中にBPC-1ポリヌクレオチドが存在することが示されるような、プローブと試料中のBPC-1ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する段階
を含むアッセイ法。 - 生物試料中のBPC-1 mRNAの存在を検出するためのアッセイ法であって、
(a)少なくとも1つのプライマーを用いる逆転写によって試料からcDNAを作製する段階、
(b)そのようにして作製したcDNAを、その中のBPC-1 cDNAを増幅するために、BPC-1ポリヌクレオチドをセンスおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅する段階、
(c)増幅されたBPC-1 cDNAの存在を検出する段階
を含み、
センスおよびアンチセンスプローブとして用いるBPC-1ポリヌクレオチドが図1に示すポリヌクレオチドを増幅しうるアッセイ法。 - 請求項38記載のアッセイ法を用いて個体の血清中に存在するBPC-1蛋白質を検出することを含む、個体におけるBPC-1蛋白質を発現する癌の存在を検出するための方法。
- 個体の被験血清試料中に存在するBPC-1蛋白質の量を定量化して、正常個体の同等の血清試料中に存在するBPC-1蛋白質の量と比較することをさらに含み、正常血清試料と比べて被験血清試料中により多量のBPC-1蛋白質が存在することによってBPC-1蛋白質を発現する癌の存在が示されるような、請求項44記載の方法。
- 癌が前立腺癌である、請求項44または45記載の方法。
- 癌が膀胱癌である、請求項44または45記載の方法。
- 請求項38記載のアッセイ法を用いて個体の尿中に存在するBPC-1蛋白質を検出することを含む、個体におけるBPC-1蛋白質を発現する膀胱癌の存在を検出する方法。
- BPC-1蛋白質を発現する癌の存在を検出する方法であって、個体から得た被験組織試料中、または個体から得た血清、精液もしくは尿試料中の細胞によって発現されるBPC-1蛋白質のレベルを測定すること、およびこのようにして測定したレベルを対応する正常試料で発現されるBPC-1のレベルと比較することを含み、正常試料と比べて被験試料中のBPC-1蛋白質が増加していることによって個体にこのような癌が存在することが示されるような方法。
- 個体における癌の存在を診断する方法であって、
(a)個体から組織の被験試料を採取する段階、
(b)被験試料中で発現されるBPC-1 mRNAのレベルを測定する段階、および
(c)そのようにして測定したレベルを既知の同等の正常組織試料で発現されるBPC-1 mRNAのレベルと比較する段階を含み、
正常組織試料と比べて被験試料におけるBPC-1 mRNAの発現が増加していることによって癌の存在が示されるような方法。 - 癌が前立腺癌であり、被験および正常組織試料が前立腺組織、骨組織、リンパ組織、血清、血液または精液からなる群より選択される、請求項50記載の方法。
- 癌が膀胱癌であり、被験および正常組織試料が膀胱組織、リンパ組織、血清、血液、精液または尿からなる群より選択される、請求項50記載の方法。
- 個体における癌の存在を診断する方法であって、
(a)個体から組織の被験試料を採取する段階、
(b)被験試料中で発現されるBPC-1蛋白質のレベルを測定する段階、および
(c)そのようにして測定したレベルを既知の同等の正常組織試料で発現されるBPC-1蛋白質のレベルと比較する段階を含み、
正常組織試料と比べて被験試料におけるBPC-1蛋白質が増加していることによって癌の存在が示されるような方法。 - 癌が前立腺癌であり、被験および正常組織試料が前立腺組織、リンパ組織、骨組織、血清、血液または精液からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
- 癌が膀胱癌であり、被験および正常組織試料が膀胱組織、リンパ組織、血清、血液、精液または尿からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
- BPC-1を発現する癌に罹患しやすいまたはそれを有する患者を治療する方法であって、BPC-1の機能を阻害するのに十分な量の請求項18または19記載の抗体を該患者に投与することを含む方法。
- 癌が前立腺癌および膀胱癌からなる群より選択される、請求項56記載の方法。
- BPC-1を発現する癌の患者を治療する方法であって、ベクターが一本鎖モノクローナル抗体コード配列を癌細胞に送達し、コードされている一本鎖抗体がその細胞内で発現されるように、請求項35記載のベクターを該患者に投与することを含む方法。
- 癌が前立腺癌および膀胱癌からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
- BPC-1を発現する癌の患者を治療する方法であって、該癌の細胞内でのBPC-1の転写を阻害することを含む方法。
- BPC-1の転写が、BPC-1遺伝子を請求項6記載のポリヌクレオチドに対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドと接触させることによって阻害される、請求項60記載の方法。
- BPC-1を発現する癌の患者を治療する方法であって、該癌の細胞内でのBPC-1 mRNAの翻訳を阻害することを含む方法。
- BPC-1 mRNAの翻訳が、BPC-1 mRNAを請求項6記載のポリヌクレオチドに対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドと接触させることによって阻害される、請求項62記載の方法。
- BPC-1 mRNAの翻訳が、BPC-1 mRNAをBPC-1 mRNAの5' UTRに対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドと接触させることにより阻害される、請求項62記載の方法。
- BPC-1 mRNAの翻訳が、BPC-1 mRNAを該BPC-1 mRNAを切断できるリボザイムと接触させることにより阻害される、請求項62記載の方法。
- BPC-1を発現する癌の患者を治療する方法であって、該癌の細胞内でのBPC-1のプロセシングを阻害することを含む方法。
- BPC-1を発現する癌の患者を治療する方法であって、該癌の細胞からのBPC-1の分泌を阻害することを含む方法。
- 化学療法または放射線療法を患者に施すことをさらに含む、請求項66記載の方法。
- 請求項2記載のBPC-1蛋白質の免疫原性部分および生理学的に許容される担体を含む、BPC-1を発現する癌の治療のためのワクチン組成物。
- 請求項2記載のBPC-1蛋白質の免疫原性部分をコードするポリペプチドおよび生理学的に許容される担体を含む、BPC-1を発現する癌の治療のためのワクチン組成物。
- 請求項69または70記載のワクチン組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者におけるBPC-1を発現する癌の発生を抑制する方法。
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