DE60018964T2

DE60018964T2 - Diagnose und behandlung von krebs unter verwendung von sgp28-zugehörigen molekülen

Info

Publication number: DE60018964T2
Application number: DE60018964T
Authority: DE
Inventors: S. Rene HUBERT; B. Arthur RAITANO; E. Daniel AFAR; Chappell Steve MITCHELL; Mary Faris; Aya Jakobovits
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2020-10-28
Also published as: JP2006187290A; IL207012A; IL149045A; CA2386865A1; AU1237201A; JP2003512825A; WO2001031343A3; AU781223B2; JP3779926B2; DE60018964D1; JP4325943B2; CA2386865C; IL149045A0; IL207012A0; ES2240192T3; ATE291738T1; WO2001031343A2; EP1228373A2; EP1228373B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung von Krebs, einschließlich Prostatakrebs, unter Verwendung von isolierten Polynukleotiden, Polypeptiden, Antikörpern und zugehörigen Molekülen, welche mit menschlichem SGP28/CRISP-3 korrespondieren oder mit diesem reaktiv sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs stellt nach Herzerkrankungen die zweithäufigste menschliche Todesursache dar. Weltweit sterben jährlich Millionen von Menschen an Krebs. In den Vereinigten Saaten von Amerika ist Krebs für den Tod von deutlich über einer halben Million Menschen im Jahr verantwortlich, wobei jedes Jahr etwa 1,4 Millionen neue Fälle diagnostiziert werden. Während die Todesfälle infolge von Herzerkrankungen deutlich abgenommen haben, steigen diejenigen infolge von Krebs generell an. Im frühen Abschnitt des nächsten Jahrhunderts wird vorausgesagt, daß Krebs die häufigste Todesursache sein wird.
Weltweit fallen einige Krebsarten als führende Todesursachen auf. Insbesondere Karzinome der Lungen, der Prostata, der Brust, des Dickdarms, der Bauchspeicheldrüse und der Eierstöcke stellen die Hauptursachen für den Krebstod dar. Diese und praktisch alle anderen Karzinome teilen ein gemeinsames tödliches Merkmal. Mit sehr wenigen Ausnahmen enden Metastasen eines Karzinoms tödlich. Darüber hinaus hat die allgemeine Erfahrung auch bei solchen Krebspatienten, die zunächst ihren primären Krebs überlebt haben, gezeigt, daß sich ihr Leben dramatisch ändert. Viele Krebspatienten erleben große Angstzustände, ausgelöst durch das Bewußtsein eines potentiellen Rückfalls oder eines Mißerfolgs der Behandlung. Viele Krebspatienten erfahren eine physische Schwächung im Anschluß an die Behandlung. Viele Krebspatienten erfahren einen Rückfall.
Weltweit stellt Prostatakrebs den am vierthäufigst verbreiteten Krebs bei Männern dar. In Nordamerika und Nordeuropa stellt dieser die bei weitem am verbreitetsten auftretende männliche Krebsart und die zweithäufigste Ursache für den Krebstod von Männern dar. Allein in den Vereinigten Staaten von Amerika sterben jährlich deutlich über 40.000 Männer an dieser Krankheit – an zweiter Stelle hinter Lungenkrebs. Ungeachtet des Ausmaßes dieser Zahlen existiert immer noch keine wirksame Behandlung für metastasierten Prostatakrebs. Chirurgische Prostatektomie, Strahlentherapie, Hormonablation und Chemotherapie stellen weiterhin die hauptsächlichen Behandlungsarten dar. Indes sind diese Behandlungen leider vielfach unwirksam und häufig mit unerwünschten Folgen verbunden.
In diagnostischer Hinsicht stellt das Fehlen eines Markers für Prostatatumore, welcher lokalisierte Tumore im frühen Stadium exakt feststellt, nach wie vor die Hauptbeschränkung dar, um diese Krankheit in den Griff zu bekommen. Obgleich sich der Serum PSA-Test als ein sehr nützliches Mittel erwiesen hat, wird seine Spezifität und sein allgemeiner Nutzen verbreitet als in vielen wichtigen Aspekten unzureichend erachtet.
Der Fortschritt bei der Identifizierung von zusätzlichen, spezifischen Markern für Prostatakrebs wurde durch die Erzeugung von Prostatakrebs-Heterotransplantaten (Xenotransplantaten) verbessert, welche verschiedene Stadien dieser Krankheit in Mäusen zu rekapitulieren vermögen. Die LAPC (Los Angeles Prostate Cancer) Heterotransplantate (Xenotransplantate) stellen Prostatakrebs-Heterotransplantate dar, welche die Passage in Mäusen mit schwerem kombiniertem Immundefekt (severe combined immune deficiency, SCID) überlebt und die Fähigkeit gezeigt haben, das Fortschreiten der Krankheit einschließlich des Übergangs von Androgen-abhängig zu Androgen-unabhängig sowie der Entwicklung von metastatischer Läsion zu imitieren (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3: 402). In jüngerer Zeit identifizierte Marker für Prostatakrebs umfassen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), Prostata-Stammzellen Antigen (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735) und STEAP (Hubert et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14523).
Während bislang identifizierte Marker, wie PSA, PSM, PCTA und PSCA, die Bemühungen im Hinblick auf die Diagnose und die Behandlung von Prostatakrebs erleichtert haben, besteht ein Bedarf an der Identifizierung von zusätzlichen Markern sowie therapeutischen Targets für Prostatakrebs und zugehörige Krebsarten, um die Diagnose und die Behandlung weiter zu verbessern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung von Prostata krebs. Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden isolierte Polynukleotide, welche mit menschlichem SGP28 korrespondieren, Proteine, welche von dem SGP28 Gen kodiert werden, und Fragmente hiervon, sowie Antikörper, welche in der Lage sind, SGP28 Proteine zu erkennen und spezifisch an diese zu binden. Die erfindungsgemäßen Verfahren basieren zum Teil auf der molekularen Klonierung eines Gens, welches mit SGP28 identisch ist und welches in menschlichen Prostatakrebsen stark über-exprimiert wird. Die Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, daß – wie immunhistochemisch untersucht wurde – sehr hohe Niveaus an SGP28 Protein exprimiert und in das Lumen der kanzerösen Prostatadrüsen und in PIN, einer nicht invasiven, präkanzerösen Läsion der Prostata, sowie in die Knochen- und Lymphknotenmetastasen sekretiert werden. Das vorliegend beschriebene Expressionsprofil von SGP28 zeigt, daß SGP28 einen nützlichen diagnostischen Marker und/oder ein nützliches therapeutisches Target für Prostatakrebs darstellt. Darüber hinaus deutet die Expression von SGP28 in PIN darauf hin, daß dieses ein Marker für die frühe Diagnose von Prostatakrebs sein könnte, was eine dringend benötigte Verbesserung gegenüber dem gegenwärtig unter Verwendung von PSA möglichen darstellt. Das Expressionsmuster von SGP28 in individuellen klinischen Proben deutet darauf hin, daß SGP28 dazu verwendet werden kann, Patienten individuell dahingehend zu identifizieren, ob sie bezüglich einer oder einer anderen Behandlungsart besser ansprechen. Ferner kann SGP28 als Ersatzmarker zur Überwachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung von Prostatakrebs dienen. SGP28 Moleküle stellen aufgrund ihrer Expression in Lymphknoten- und Knochenmetastasen einen besonders attraktiven Marker für die Verwendung in in vivo bildgebenden Verfahren (Imaging-Verfahren) dar.
Die SGP28 mRNA Expression ist auf die Prostata und auf die Eierstöcke beschränkt und ist in Tumoren der Pro stata merklich ausgeprägter. Die Expression von SGP28 in zusammengehörigen Proben normaler Prostata/Tumoren von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs unter Einsatz von sowohl mRNA- als auch Protein-Nachweismethoden zeigt eine hohe Rate an überregulierter Expression in Tumorgewebe, was darauf hindeutet, daß SGP28 einen nützlichen Marker für den Nachweis von Prostatakrebs darstellt.
SGP28 ist ein extrazelluläres lösliches Protein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 29 kDa und einen pI von 8,08 aufweist. SGP28 besitzt ein Signalpeptid, welches zwischen den Aminosäure-Resten 32 und 33 angeordnet ist, und umfaßt zwei extrazelluläre SCP-Proteinmotive (Prosite-Domäne PDOC00772), eines an den Aminosäuren 150–160 und ein weiteres an den Aminosäuren 170–182, jeweils der SEQ ID Nr. 3. Das Protein weist starke Homologie mit Defensin-Proteinen, insbesondere mit Beta-Defensinen, auf, welche sekretierte Produkte darstellen, die vornehmlich von Epithelzellen produziert werden (O'Neil et al., 1999, J. Immunol. 163: 6718–24; Schröder et al., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 645–51). Wie auch ein Defensin mag das SGP28 Protein die Fähigkeit besitzen, den Zelltod von Tumoren zu induzieren und/oder als Chemoattraktant zu dienen. SGP28 mag ferner bei der Zellbindung und/oder beim Induzieren von Zellwachstum eine Rolle spielen.
Vorliegend sind eine Anzahl an potentiellen Ansätzen zur Behandlung von Prostatakrebs und anderen Krebsarten, welche SGP28 exprimieren, beschrieben. Die extrazelluläre und lösliche Eigenschaft dieses Proteins bietet eine Mehrzahl an therapeutischen Ansätzen unter Verwendung von Molekülen, welche auf SGP28 und seine Funktion abzielen, sowie von Molekülen, welche auf andere Proteine, Faktoren und Liganden abzielen, die mit SGP28 wechselwirken. Solche thera peutischen Ansätze umfassen eine Antikörper-Behandlung mit anti-SGP18 Antikörpern, Small-Molecule Therapien und Impftherapien. Darüber hinaus ist SGP28 aufgrund seiner überregulierten Expression in Prostatakrebs nützlich als ein diagnostischer Marker, Staging-Marker und/oder prognostischer Marker für Prostatakrebs und kann – auf ähnliche Weise – ein Marker für andere Krebsarten sein, welche dieses Protein exprimieren.
Die Erfindung stellt Polynukleotide, welche mit dem gesamten oder einem Teil des vorliegend beschriebenen SGP28 Gens korrespondieren oder zu diesem komplementär sind, mRNAs und/oder kodierende Sequenzen, vorzugsweise in isolierter Form, einschließlich Polynukleotiden, welche SGP28 Proteine und Fragmente hiervon kodieren, DNA, RNA, DNA/RNA Hybride und zugehörige Moleküle, Polynukleotide oder Oligonukleotide, welche zu dem SHP28 Gen oder mRNA Sequenzen oder Teilen hiervon komplementär sind, sowie Polynukleotide oder Oligonukleotide, welche zu dem SGP28 Gen, mRNAs oder zu SGP28 kodierenden Polynukleotiden hybridisieren, zur Verfügung. Ferner werden Mittel zur Isolierung von cDNAs und den SGP28 kodierenden Genen zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden rekombinante DNA-Moleküle, welche SGP28 Polynukleotide enthalten, Zellen, welche mit solchen Molekülen transformiert oder transduziert worden sind, und Klonierungssysteme für die Expression von SGP28 Genprodukten zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung stellt überdies SGP28 Proteine und Polypeptid-Fragmente hiervon sowie Antikörper, welche an SGP28 Proteine und Polypeptid-Fragmente hiervon binden, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen Antikörper umfassen polyklonale und monoklonale Antikörper, Antikörper aus Mäusen und anderen Säugetieren, chimäre Antikörper, humanisierte und gänzlich humane Antikörper, mit nachweisbaren Markern gelabelte Antikörper sowie Antikörper, welche zu Radionukliden, Toxinen oder anderen therapeutischen Zusammensetzungen konjugiert sind, zur Verfügung.
Die Erfindung stellt darüber hinaus Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins von SGP28 Polynukleotiden und Proteinen in verschiedenen biologischen Proben sowie Verfahren zur Identifizierung von Zellen, welche SGP28 exprimieren, zur Verfügung. Schließlich stellt die Erfindung verschiedene therapeutische Zusammensetzungen und Strategien zur Behandlung von Krebsen der Prostata zur Verfügung, insbesondere einschließlich Antikörper-Behandlungen, Impftherapien und Small-Molecule Therapien.
KURZE BESCHREIBUNG DER Figuren
Es zeigen:
1A–C je eine Northern-Blotting Analyse der SGP28 mRNA Expression in normalen Geweben (1A und 1B) und hochgradige überregulierte Expression in Prostatakrebs-Heterotransplantaten (Feld C). Das geringere Molekulargewichtssignal in normalen Hoden ist wahrscheinlich bedingt durch Kreuzhybridisierung der Probe (SSH Fragment) zu CRISP/TPX-1 Message. Ein identisches Transkript ist für CRISP2 auf diesem normalen Feld erkennbar unter Verwendung einer genspezifischen Oligonukleotid-Probe, wie sie von Krätzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem 236 (3): 827–36, beschrieben ist. In 1A ist Linie 1 Herz, Linie 2 Gehirn, Linie 3 Plazenta, Linie 4 Lunge, Linie 5 Leber, Linie 6 Musculus skeleti, Linie 7 Niere und Linie 8 Bauchspeicheldrüse. In 1B ist Linie 1 Milz, Linie 2 Brustdrüse, Linie 3 Prostata, Linie 4 Hoden, Linie 5 Eierstock, Linie 6 Dünndarm, Linie 7 Dickdarm und Linie 8 Leukozyten. In 1C ist Linie 1 Prostata, Linie 2 LAPC-4 AD, Linie 3 LAPC-4 AI, Linie 4 LAPC-9 AD und Linie 5 LAPC-9 AI.
2 eine Northern-Blotting Analyse der SGP28/36P1G3 mRNA Expression in einem Feld von drei Paaren von Prostatatumoren (Linien 2, 4, 6) und umgebendem, normalem Gewebe (Linien 1, 3, 5), wobei eine Überregulierung in drei der drei Tumorproben ersichtlich ist.
3 ein Western-Blot, welcher zeigt, daß ein anti-SGP28 polyklonaler Antikörper SGP28 Protein in LAPC4 und LAPC9 Heterotransplantat-Lysaten und in Überständen der LAPC4 Zellinie und der transfizierten 293T Zellinie identifiziert. Die gesamten Zellysate (WCL) und Überstände von LAPC4 Zellen und MYC/HIS SGP28 transient transfizierten 293T Zellen und LAPC4 und LAPC9 Heterotransplantat-Lysaten wurden dem Western-Blotting unter Verwendung von affinitätsgereinigtem anti-SGP28 pAb von Kaninchen (1 μg/ml) unterworfen. Die SGP28 immunreaktiven Bereiche wurden durch Inkubation der Blots mit HRP-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper (HRP-conjugated anti-rabbit secondary antibody), gefolgt von verstärktem Chemilumineszenznachweis, visualisiert.
4 eine Western-Blotting Analyse, welche zeigt, daß der anti-SGP28/CRISP-3 monoklonale Antikörper spezifisch SGP28/CRISP-3 Protein in Prostatakrebs-Zellinien und Überständen, Prostatakrebs-Heterotransplantaten und klinischem Prostata krebsgewebe erkennt. Zellinien und konditionierte Medien von der LAPC4 Prostatakrebs-Zellinie und Lysate von LAPC4 und LAPC9 Prostatakrebs-Heterotransplantaten und von einer zugehörigen normalen bzw. kanzerösen klinischen Probe wurden mittels SDS-PAGE separiert und in Nitrocellulose überführt. Der Blot wurde anschließend der Western-Analyse mit einer Verdünnung des Überstandes des 4G6 anti-SGP28/CRISP-3 monoklonalen Antikörpers von 1:2 unterworfen. Spezifische SGP28/CRISP-3 immunreaktive Bereiche wurden sodann durch Inkubation mit IgG-HRP-konjugiertem anti-Maus Sekundär-Antikörper (IgG-HRP conjugated anti-mouse secondary antibody) und Entwicklung mittels verstärkter Chemilumineszenz sowie Aussetzen eines autoradiografischen Films visualisiert.
5A eine Western-Blotting Analyse, welche eine hochgradige Expression von SGP28 in Prostatakrebs von klinischen Proben und LAPC Heterotransplantaten zeigt. Die zugehörigen klinischen Gewebelysate von Prostatakrebs (PCa) und normalem umgebendem Gewebe (NAT) sowie LAPC4 Heterotransplantaten wurden dem Western-Blotting mit 1 μg/ml affinitätsgereinigtem anti-SGP28 pAb von Kaninchen unterzogen. Die SGP28 immunreaktiven Bereiche wurden durch Inkubation der Blots mit HRP-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper (HRP-conjugated anti-rabbit secondary antibody), gefolgt von verstärktem Chemilumineszenznachweis, visualisiert. Das SGP28/CRISP-3 immunreaktive Proteindoublet ist mit Pfeilen angezeigt.
5B eine Western-Blotting Analyse, welche eine hochgradige Expression von SGP28 in LAPC Heterotransplantaten und eine geringe Expression in normalen Hoden und Lungen zeigt. Die normalen Gewebelysate der Milz, der Hoden, der Leber und der Lunge und die LAPC4 Zellinie sowie das Heterotransplantat wurden auf die in 5A beschriebene Weise dem Western-Blotting unterworfen. Das SGP28/CRISP-3 immunreaktive Proteindoublet ist mit Pfeilen angezeigt.
6A–B jeweils eine immumhistochemische Analyse von SGP28 Protein in Prostatakrebs mit einer Gleason-Summe (Gleason Score) von 7 (6A) und in hochgradiger PIN (6B), welche eine hochgradige Expression und Sekretion von SGP28 in das Lumen der Prostatadrüsen zeigen, unter Verwendung von affinitätsgereinigtem polyklonalem Antikörper. In den Epithelzellen der Prostatadrüsen, insbesondere an den lumenalen Grenzen, wurde eine starke Färbung beobachtet. Eine Färbung wurde ferner im Innern des Lumens beobachtet, was auf eine hochgradige Expression und Sekretion von SGP28 in Prostatakrebs und PIN schließen läßt.
7A–B jeweils eine immunhistochemische Analyse, welche die Expression von SGP28 Protein in Prostatakrebsmetastasen in Knochen (7A) und Lymphknoten (7B) zeigt.
8A–D jeweils eine immunhistochemische Analyse von SGP28 Protein in Prostatakrebs und in PIN. 8A zeigt einen immunhistochemischen Nachweis von SGP28 in Prostatakrebs in einer Vergrößerung von 200 ×; 8B zeigt denselben Nachweis in einer Vergrößerung von 800 ×. Die SGP28 Expression in PIN ist in 8C in einer Vergrößerung von 200 × und in 8D in einer Vergrößerung von 800 × gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung von Prostatakrebs unter Verwendung von isolierten Polynukleotiden, welche mit dem menschlichen SGP28 Gen, Proteinen, welche von dem SGP28 Gen kodiert werden, und Fragmenten hiervon, sowie Antikörpern, welche in der Lage sind, SGP28 Proteine spezifisch zu erkennen und an diese zu binden, korrespondieren. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Isolierung eines mit dem SGP28 Gen korrespondierenden cDNA Fragmentes mittels Klonierung durch Suppression Substractive Hybridization. Diese, mit 36P1G3 bezeichnete cDNA wurde für die Homologie mit bekannten Genen und ESTs in den wichtigen öffentlichen Datenbanken sequenziert und analysiert. Die 36P1G3 cDNA wies Identität mit einem Teil der angegebenen Sequenz des menschlichen SGP28 Gens auf. Zur spezifischen Amplifikation des der 36P1G3 entsprechenden Gens ausgebildete Primer wurden anschließend dazu verwendet, die Expression von SGP28 in Prostatakrebs-Heterotransplantaten (Xenotransplantaten), in normaler Prostata und ein einer Vielzahl anderer, normaler Gewebe zu charakterisieren. Über die Nukleotide und Aminosäuresequenzen von SGP28 wurde bereits berichtet (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246–250; Krätzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem 236 (3): 827–36).
Das Expressionsprofil von SGP28 legt nahe, daß es einen idealen diagnostischen und therapeutischen Marker für Prostatakrebs darstellt. Wie durch die Expressionsanalyse durch Northern-Blotting untersucht, ist die Expression von SGP28 mRNA in normalen Geweben stark auf die Prostata, die Hoden und die Eierstöcke beschränkt (1A–B). Eine sehr geringe Expression ist in der Bauchspeicheldrüse festzustellen (1A). Interessanterweise zeigen die Prostata und die Eierstöcke ein 2,4 kb Transkript, während die Hoden eine 1,6 kb Message exprimieren (die 1,6 kb Message könnte eine andere SGP28 Familie darstellen). Des weiteren ist die SGP28 mRNA Expression in Prostatakrebs-Heterotransplantaten, welche nach fortgeschrittener Metastasenbildung erhalten worden sind, stark überreguliert (1C). Überdies wird SGP28 Protein in denselben Prostatakrebs-Heterotransplantaten wie auch in Prostatakrebs klinischer Proben in hohen Niveaus exprimiert (2). In zusammengehörigen normalen/kanzerösen klinischen Proben von Prostatakrebs läßt sich eine hochgradige Über-Expression von SGP28 Protein gegenüber normal feststellen, was darauf hinweist, daß SGP28 einen exzellenten diagnostischen Marker und/oder ein therapeutisches Target für Prostatakrebs darstellt. Die immunhistochemische Analyse zeigt, daß SGP28 Protein hochgradig exprimiert und in das Lumen kanzeröser und präkanzeröser Prostatadrüsen sowie in Metastasen sekretiert wird. Wie PSA wird SGP28 in das Lumen sekretiert und gelangt in das Serum in Geweben, in welchen die normale Architektur gestört ist.
Sofern nicht anderweitig definiert, sind sämtliche hierin verwendeten Fachbegriffe, Bezeichnungen und wissenschaftliche Terminologie so aufzufassen, daß sie die Bedeutung haben, wie sie vom Fachmann, an den sich die Erfindung richtet, gemeinhin verstanden werden. In einigen Fällen sind Ausdrücke mit gemeinhin verstandener Bedeutung hierin zum Zwecke der Klarheit und/oder zum klaren Verweis definiert, wobei die Einbeziehung solcher Definitionen in diesem Zusammenhang nicht notwendigerweise so aufgefaßt werden sollte, daß sie einen wesentlichen Unterschied gegenüber dem darstellt, was von der Fachwelt allgemein darunter verstanden wird. Die hierin beschriebenen und angeführten Methoden und Verfahren sind allgemein wohl verständlich und werden von der Fachwelt unter Verwendung von herkömmlicher Methodik gemeinhin verwendet, wie z.B. die verbreitet eingesetzte und in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labaratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Labaratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. beschriebene Methodik der molekularen Klonierung (molecular cloning). Soweit erforderlich, werden Verfahren, welche den Einsatz von kommerziell erhältlichen Packungen (Kits) und Reagenzien umfassen, im allgemeinen gemäß den vom Hersteller definierten Protokollen und/oder Parametern durchgeführt, soweit nichts anderes erwähnt ist.
Die hierin verwendeten Begriffe "fortgeschrittener Prostatakrebs", "lokal fortgeschrittener Prostatakrebs", "fortgeschrittene Krankheit" und "lokal fortgeschrittene Krankheit" bedeuten Prostatakrebs, welcher die Prostata-Kapsel durchdrungen hat, wobei das Krankheitsstadium C gemäß dem AUA-System (American Urologic Association), die Krankheitsstadien C1–C2 gemäß dem Whitmore-Jewett System sowie die Krankheitsstadien T3–T4 und N+ gemäß dem TNM-System (Tumor, Node, Metastasis) mit umfaßt sein sollen. Im allgemeinen wird für Patienten mit lokal fortgeschrittener Krankheit keine Operation empfohlen und erreichen solche Patienten erheblich ungünstigere Ergebnisse im Vergleich mit Patienten, welche unter klinisch lokalisiertem (Organ-beschränktem) Prostatakrebs leiden. Die lokal fortgeschrittene Krankheit wird durch augenfälligen Nachweis einer Abhärtung jenseits der seitlichen Ränder der Prostata oder einer Asymmetrie oder Abhärtung oberhalb der Prostatabasis klinisch identifiziert. Lokal fortgeschrittener Prostatakrebs wird gegenwärtig im Anschluß an eine radikale Prostatektomie pathologisch diagnostiziert, wenn der Tumor in die Prostata-Kapsel eingedrungen ist oder diese durchdrungen hat, sich in den operativen Rand erstreckt oder in die Samenbläschen eingedrungen ist.
Die hierin verwendeten Begriffe "metastatischer Prostatakrebs" und "Metastasierung" bedeuten Prostatakrebs, welcher sich in regionalen Lymphknoten oder entfernten Stellen ausgebreitet hat, wobei die Krankheitsstadien D gemäß dem AUA-System und das Stadium TxNxMx gemäß dem TNM-System mit umfaßt sein sollen. Wie es bei lokal fortgeschrittenem Prostatakrebs der Fall ist, ist bei Patienten, welche unter einer Metastasierung leiden, im allgemeinen keine Operation angezeigt und stellt eine Hormontherapie (Androgen-Ablation) die bevorzugte Behandlungsmethode dar. Patienten mit metastatischem Prostatakrebs entwickeln letztendlich innerhalb von 12 bis 18 Monaten ab Behandlungsbeginn eine Androgen-Refraktärphase, wobei etwa die Hälfte dieser Patienten innerhalb der darauf folgenden sechs Monaten stirbt. Die verbreitetste Stelle für Metastasen von Prostatakrebs stellen die Knochen dar. Knochenmetastasen von Prostatakrebs sind im Mittel charakteristischerweise eher osteoplastisch als osteolytisch (d.h. es ergibt sich eine Netzknochenbildung "net bone formation"). Knochenmetastasen finden sich am häufigsten an der Wirbelsäule, gefolgt vom Oberschenkelknochen, dem Becken, dem Brustkorb, dem Schädel und dem Oberarmknochen. Andere verbreitete Stellen für Metastasen stellen die Lymphknoten, die Lunge, die Leber und das Gehirn dar. Metastatischer Prostatakrebs wird üblicherweise durch offene oder laparoskopische Becken-Lymphadenektomie, Radionuklid-Scannung des gesamten Körpers, skelettale Radiographie und/oder Knochenläsion-Biopsie diagnostiziert.
Der hierin verwendete Begriff "Polynukleotid" bedeutet eine polymere Form von Nukleotiden mit wenigstens zehn Basen oder Basenpaaren Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide oder eine modifizierte Form beider Typen von Nukleotiden, wobei einfache und mehrsträngige Formen von DNA mit umfaßt sein sollen.
Der hierin verwendete Begriff "Polypeptid" bedeutet ein Polymer mit wenigstens zehn Aminosäuren. Im Rahmen der gesamten Offenbarung werden für die Aminosäuren die standardisierten dreibuchstabigen oder einbuchstabigen Bezeichnungen verwendet.
Die hierin verwendeten Begriffe "hybridisieren", "hybridisierend", "hybridisiert" und dergleichen im Zusammenhang mit Polynukleotiden sind so aufzufassen, daß sie sich auf herkömmliche Hybridisierungsbedingungen beziehen, vorzugsweise wie eine Hybridisierung in 50% Formamid/6 × SSC/0,1% SDS/100 μg/ml ssDNA, wobei die Temperaturen bei der Hybridisierung oberhalb 37°C liegen und die Temperaturen zum Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS oberhalb 55°C liegen, höchst vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
Eine "Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen ist vom Fachmann auf einfache Weise ermittelbar und stellt im allgemeinen eine empirische Berechnung in Abhängigkeit von dem Probenumfang, der Waschtemperatur und den Salzbedingungen dar. Im allgemeinen erfordern größere Proben höhere Temperaturen für eine einwandfreie Anlagerung (Annealing), während kleiner Proben niedrigere Temperaturen erfordern. Die Hybridisierung hängt allgemein von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, sich wieder anzulagern (Re-Annealing), wenn in einer Umgebung unterhalb ihrer Schmelztemperatur komplementäre Stränge vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homologie zwischen der Probe und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, welche eingesetzt werden kann. Demzufolge ergibt sich, daß höhere relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Im Hinblick auf weitere Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen wir auf Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995) verwiesen.
"Stringente Bedingungen" oder "hoch stringente Bedingungen", wie sie hierin definiert sind, lassen sich dahingehend festlegen, daß: (1) eine geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen beim Waschen angewandt werden, z.B. 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumzitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie Formamid, angewandt wird, z.B. 50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Bovin Serum Albumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphat-Puffer bei einem PH von 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumzitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumzitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, mit Ultraschall behandelte (sonicated) Salmon Sperm DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C angewandt wird, was bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumzitrat) und 50% Formamid bei 55°C gewaschen wird, gefolgt von hoch stringentem Waschen, bestehend in 0,1 × SSC enthaltend EDTA bei 55°C.
"Mäßig stringente Bedingungen" lassen sich dahingehend festlegen, wie sie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 beschrieben sind, und schließen die Verwendung von Waschlösungen und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) mit geringerer Stringenz wie vorstehend erläutert mit ein. Als Beispiel mäßig stringenter Bedingungen sei erwähnt die Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung aus: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumzitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte Sheared Salmon Sperm DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37 bis 50°C. Der Fachmann ist sich bewußt, wie die Temperatur, die Ionenstärke etc. eingestellt werden soll, um Faktoren, wie die Probengröße und dergleichen, wie erforderlich anzupassen.
Im Zusammenhang mit Vergleichen der Aminosäuresequenzen wird der Begriff "Identität" verwendet, um den Prozentsatz der Aminosäure-Reste an denselben Relativpositionen auszudrücken, welche identisch sind. Ebenfalls wird in diesem Zusammenhang der Begriff "Homologie" verwendet, um den Prozentsatz der Aminosäure-Reste an denselben Relativpositionen auszudrücken, welche entweder identisch oder ähnlich sind, wobei die im Stand der Technik allgemein bekannte BLAST-Analyse unter Heranziehen der konservierten Aminosäuremerkmale verwendet wurde. So kann beispielsweise ein % Identitätswert mittels WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460–480 (1996): http://blast.wustl/edu/blast/README.html) erzeugt werden. Weitere Details hinsichtlich Aminosäuresubstitutionen, welche unter solchen Bedingungen als konserviert erachtet werden, sind im Folgenden angegeben.
Zusätzliche Definitionen sind in der gesamten nachfolgenden Beschreibung angegeben.
SGP28 Polynukleotide
Ein Aspekt der Erfindung betrifft Polynukleotide, vorzugsweise in isolierter Form, welche mit dem gesamten oder einem Teil des SGP28 Gens, der mRNA und/oder kodierenden Sequenzen korrespondieren oder zu diesen komplementär sind, einschließlich Polynukleotide, welche ein SGP28 Protein oder Fragmente hiervon kodieren, DNA, RNA, DNA/RNA Hybride und zugehörige Moleküle, Polynukleotide oder Oligonukleotide, welche zu dem SHP28 Gen oder mRNA Sequenzen oder Teilen hiervon komplementär sind, sowie Polynukleotide oder Oligonukleotide, welche zu dem SGP28 Gen, mRNA oder zu SGP28 kodierenden Polynukleotiden hybridisieren (insgesamt "SGP28 Polynukleotide"). Die hierin verwendeten Begriffe SGP28 Gen und Protein sind so aufzufassen, daß sie SGP28 Gene und Proteine einschließen, wie sie hierin speziell beschrieben sind, wobei die Gene und Proteine mit anderen SGP28 Proteinen und strukturell ähnlichen Varianten der vorgenannten korrespondieren. Solche anderen SGP28 Proteine und Varianten weisen allgemein kodierende Sequenzen auf, welche mit der SGP28 kodierenden Sequenz hoch homolog sind, und besitzen vorzugsweise wenigstens etwa 50% Aminosäure-Identität und wenigstens etwa 60% Aminosäure-Homologie (unter Verwendung der BLAST Merkmale), höchst vorzugsweise 70% oder höhere Homologie (unter Verwendung der BLAST Merkmale).
Eine Ausführungsform eines SGP28 Polynukleotides ist das SGP28 Polynukleotid, welches die in Tabelle 1 (SEQ ID Nr. 2) wiedergegebene Sequenz aufweist. Ein SGP28 Polynukleotid kann ein Polynukleotid, welche die Nukleotidsequenz von menschlichem SGP28 aufweist, wie in Tabelle 1 gezeigt ist (SEQ ID Nr. 2), wobei T auch U sein kann; ein Polynukleotid, welches das gesamte oder einen Teil des SGP28 Proteins kodiert; eine zum Vorstehenden komplementäre Sequenz; oder ein Polynukleotid-Fragment eines beliebigen Vorstehenden umfassen. Eine weitere Ausführungsform umfaßt ein Polynukleotid, welches die in Tabelle 1 wiedergegebene Sequenz (SEQ ID Nr. 2) von dem Nukleotid-Rest Nr. 3 bis zu dem Nukleotid-Rest Nr. 776 umfaßt, wobei T auch U sein kann.
Typische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen SGP28 Polynukleotide, welche spezifische Teile der SGP28 mRNA Sequenz kodieren, wie solche, welche das Protein und Fragmente desselben kodieren. So umfassen beispielsweise charakteristische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung: Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 1 bis zu der Aminosäure von etwa 10 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 20 bis zu der Aminosäure von etwa 30 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 30 bis zu der Aminosäure von etwa 40 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 40 bis zu der Aminosäure von etwa 50 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 50 bis zu der Aminosäure von etwa 60 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 60 bis zu der Aminosäure von etwa 70 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 70 bis zu der Aminosäure von etwa 80 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 80 bis zu der Aminosäure von etwa 90 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 90 bis zu der Aminosäure von etwa 100 des in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren; etc. Gemäß diesem Schema stellen Polynukleotide (mit wenigstens zehn Aminosäuren), welche Teile der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 100–258 des in Tabel le 2 wiedergegebenen SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren, typische Ausführungsformen der Erfindung dar. Ferner sind Polynukleotide, welche größere Teile des SGP28 Proteins kodieren, ebenfalls angedacht. So lassen sich z.B. Polynukleotide, welche die Aminosäure von etwa 1 (oder 20 oder 30 oder 40 etc.) bis zu der Aminosäure von etwa 20 (oder 30 oder 40 oder 50 etc.) des in Tabelle 2 wiedergegebenen SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) kodieren, mittels einer Vielzahl an aus dem Stand der Technik bekannten Methoden erzeugen.
Weitere, der Veranschaulichung dienende Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen SGP28 Polynukleotid-Fragmente, welche eines oder mehrere der in der SGP28 Proteinsequenz enthaltenen biologischen Motive kodieren. Gemäß einer Ausführungsform vermögen typische Polynukleotid-Fragmente gemäß der Erfindung eine oder mehrere der Regionen von SGP28 zu kodieren, welche Homologie mit Beta-Defensinen aufweisen. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß typische Polynukleotid-Fragmente eine oder mehrere der extrazellulären Proteine SCP/Tpx-1/Ag5/PR-1/Sc7 Signatursequenzen zu kodieren vermögen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß typische Polynukleotid-Fragmente Sequenzen zu kodieren vermögen, welche auf eine oder mehrere alternative Spleißvarianten von SGP28 beschränkt sind.
Die Polynukleotide gemäß den vorstehenden Absätzen besitzen eine Vielzahl an verschiedenen Einsatzmöglichkeiten. Da bei SGP28 gezeigt werden konnte, daß es in Prostatakrebs über-exprimiert wird, können diese Polynukleotide in Verfahren zur Beurteilung des Zustandes von SGP28 Genprodukten in normalen gegenüber kanzerösen Geweben verwendet werden. Typischerweise können Polynukleotide, welche spezifische Regionen des SGP28 Proteins kodieren, verwendet werden, um das Vorhandensein von Perturbationen (wie Deletionen, Insertionen, Punktmutationen etc.) in spezifischen Regionen des SGP28 Genproduktes zu beurteilen. Exemplarische Untersuchungen beinhalten sowohl RT-PCR Untersuchungen als auch die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) (vgl. z.B. Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26 (8): 369–378 (1999)), welche beide Polynukleotide verwenden, die spezifische Regionen eines Proteins kodieren, um diese Regionen innerhalb des Proteins zu untersuchen. Untersuchungen und Methoden zur Sequenzanalyse, um Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphism) zu ermitteln, sind ebenfalls zugänglich (Irizarry et al., 2000, Nature Genetics 26 (2): 223–236).
Weitere, speziell angedachte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind genomische DNA, cDNAs, Ribozyme und Antisense-Moleküle, einschließlich Morpholino Antisense-Moleküle, sowie Nukleinsäuremoleküle, welche auf alternativem Backbone basieren oder alternative Basen enthalten, wiewohl sie aus natürlichen Quellen erhalten worden oder synthetisiert sind. So können Antisense-Moleküle z.B. RNAs oder andere Moleküle, einschließlich Peptidnukleinsäuren (PNAs), oder Moleküle nicht auf Nukleinsäurebasis, wie Phosphorthioat-Derivate, sein, welche spezifisch an DNA oder RNA auf Basenpaar-abhängige Weise binden. Der Fachmann erhält diese Klassen an Nukleinsäuremolekülen auf einfache Weise unter Verwendung der hierin offenbarten SGP28 Polynukleotide und Polynukleotidsequenzen.
Die Antisense-Technologie bedingt den Einsatz von exogenen Oligonukleotiden, welche an ein Target-Nukleotid im Innern der Zellen binden. Der Begriff "Antisense" be zieht sich auf die Tatsache, daß solche Oligonukleotide zu ihren intrazellulären Targets, z.B. SGP28, komplementär sind; vgl. z.B. Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; und Synthesis 1: 1–5 (1988). Die SGP28 Antisense-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Derivate, wie S-Oligonukleotide (Phosphorthioat-Derivate oder S-Oligos, vgl. Jack Cohen, s.o.), welche eine stark inhibitorische Wirkung auf das verstärkte Wachstum von Krebszellen aufweisen. S-Oligos (Nukleosid-Phosphorthioate) sind isoelektronische Analoge eines Oligonukleotides (O-Oligo), bei welchen ein nicht überbrückendes Sauerstoffatom an der Phosphatgruppe durch ein Schwefelatom ersetzt ist. Die S-Oligos gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Behandlung der entsprechenden O-Oligos mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid hergestellt werden, welches ein Schwefel-Übertragungsmittel ist; vgl. Iyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693–4698 (1990); und Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253–1254 (1990), deren Offenbarung hiermit vollumfänglich zum Gegenstand der Erfindung gemacht wird. Weitere SGP28 Antisense-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen aus dem Stand der Technik bekannte Morpholino Antisense-Oligonukleotide (vgl. z.B. Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169–175).
Die SGP28 Antisense-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung kann typischerweise RNA oder DNA sein, welche zu den ersten 100 N-terminalen Codonen oder zu den letzten 100 N-terminalen Codonen komplementär ist und mit diesen stabil hybridisiert, oder welche mit der ATG Anfangsstelle (Start Site) des SGP28 Genoms oder der entsprechenden mRNA überlappt. Während absolute Komplementärheit nicht erforderlich ist, sind hohe Grade an Komplementärheit bevorzugt. Die Verwendung eines Oligonukleotides, welches zu dieser Region komplementär ist, ermöglicht die selektive Hybridisierung zu SGP28 mRNA und nicht zu mRNA, welche andere regulatorischen Untereinheiten von Proteinkinase spezifiziert. Die SGP28 Antisense-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise ein 15 bis 30-mer Fragment des Antisense-DNA-Moleküls, welches eine Sequenz besitzt, die zu SGP28 mRNA hybridisiert. Optional ist das SGP28 Antisense-Oligonukleotid ein 30-mer Oligonukleotid, welches zu einer Region in den ersten 10 N-terminalen Codonen und den letzten 10 C-terminalen Codonen von SGP28 komplementär ist. Alternativ können die Antisense-Moleküle auch modifiziert werden, um Ribozyme bei der Inhibierung der SGP28 Expression einzusetzen; L. A. Couture & D. T. Stinchcomb, Trends Genet. 12: 510–515 (1996).
Weitere spezielle Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung umfassen Primer und Primerpaare, welche die spezifische Amplifikation der erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder beliebiger spezifischer Teile derselben ermöglichen, sowie Proben, welche selektiv oder spezifisch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder Teilen derselben hybridisieren. Die Proben können mit einem nachweisbaren Marker, wie z.B. einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszenten Verbindung, einer chemilumineszenten Verbindung, einem Metall-Chelatbildner oder einem Enzym, gelabelt werden. Solche Proben und Primer können verwendet werden, um das Vorhandensein eines SGP28 Polynukleotides in einer Probe festzustellen und als Mittel zum Feststellen eine SGP28 Protein exprimierenden Zelle. Beispiele solcher Proben umfassen Polypeptide, welche die gesamte oder einen Teil der in Tabelle 1 (SEQ ID Nr. 2) wiedergegebenen menschlichen SGP28 cDNA-Sequenz aufweisen. Beispiele von Primerpaaren, welche in der Lage sind, spezifisch SGP28 mRNAs zu amplifizieren, sind ebenfalls in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Ein Beispiel eines Primerpaares, welches in der Lage ist, spezifisch SGP28 mRNAs zu amplifizieren, ist:
Wie dem Fachmann ohne weiteres bewußt, lassen sich sehr viele anderen Primer und Proben auf der Basis der vorliegend zur Verfügung gestellten Sequenzen erzeugen und lassen sich diese einsetzen, um SGP28 mRNA wirksam zu amplifizieren und/oder nachzuweisen.
Bei einem Polynukleotid wird hierin von "isoliert" gesprochen, wenn es im wesentlichen von kontaminierenden Polynukleotiden, welche mit anderen Genen als dem SGP28 Gen korrespondieren oder zu diesen komplementär sind oder welche andere Polypeptide als das SGP28 Genprodukt oder Fragmente hiervon kodieren, separiert worden ist. Der Fachmann vermag auf einfache Weise Verfahren der Nukleinsäure-Isolierung durchzuführen, um ein isoliertes SGP28 Polynukleotid zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen SGP28 Polynukleotide sind für eine Vielzahl an Anwendungszwecken nützlich, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – für ihre Verwendung als Proben und Primer für die Amplifikation und/oder die Feststellung von SGP28 Gen(en), mRNA(s) oder Fragmenten hiervon; als Reagenzien für die Diagnose und/oder die Prognose von Prostatakrebs und anderen Krebsarten; als Werkzeug zur Identifizierung von Molekülen, welche den Eintritt von Calcium (Calcium Entry) spezifisch in Prostatazellen inhibieren; als kodierende Sequenzen, welche in der Lage sind, die Expression von SGP28 Polypeptiden zu regeln; als Werkzeug zur Modulierung oder Inhibierung der Expression von SGP28 Gen(en) und/oder zur Translation des/der SGP28 Transkripte(s); und als therapeutische Mittel.
Molekulare und biochemische Merkmale von SGP28
Das sogenannte Specific Granule Protein (SGP28) ist ein sekretiertes Molekül, welches in spezifischer Granula von menschlichen Neutrophilen identifiziert und exprimiert wird (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246–250). SGP28 ist mit dem als Cystein-reiches Sekret-Protein 3 (Cysteine-rich Secretory Protein 3, CRISP-3) bekannten Protein identisch (Krätzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236: 827–36). SGP28/CRISP-3 (nachfolgend als SGP28 bezeichnet) ist ein 29 kD Protein mit 258 Aminosäuren, welche eine C-terminale Cystein-reiche Sequenz enthalten, die 16 Cystein-Reste umfaßt, welche in einigen Mitgliedern der CRISP-Proteinfamilie konserviert sind. SGP28 gehört zu einer Familie von Cystein-reichen Sekret-Proteinen, welche bei Menschen, Nagern und Pferden vorkommen und welche CRISP-1 (Brooks et al., 1986, Eur. J. Biochem. 161: 13–18; Haendler et al., 1993, Endocrinology 133: 192–198; Krätzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236: 827–36), CRISP-2/TPX-1 (Kasahara et al., 1989, Genomics 5: 527–534; Mizuki et al., 1992, Mamm. Genome 3: 274–280) und CRISP-3/SGP28 (Haendler et al., 1993, Endocrinology 133: 192–198; Schambony et al., 1998, Biochimica et Biophysica Acta 1387: 206–216; Schwidetzky et al., 1995, Biochem. J. 309: 831–836) umfaßt.
Menschliches SGP28 ist in der Granula von Neutrophilen identifiziert worden und eine Expression von SGP28 ist in den Speicheldüsen, der Bauchspeicheldrüse, der Prostata, den Nebenhoden, den Eierstöcken und dem Dickdarm festgestellt worden (Krätzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236: 827–36). Eine Expression von murinen (Maus) Proteinen aus der CRISP-Familie ist in den B-Zellen, den Speichel- und Tränendrüsen, den Nebenhoden, den Hoden und in Schleimhautzellen festgestellt worden (Pfisterer et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 6160–6168; Haendler et al., 1999, J. Cell. Physiology 178: 371–378; Haendler et al., 1997, Eur. J. Biochem. 250: 440–446), während murines CRISP-2 und CRISP-3 Androgen-reguliert sind (Haendler et al., 1999, J. Cell. Physiology 178: 371–378; Haendler et al., 1997, Eur. J. Biochem. 250: 440–446). Es wurde behauptet, daß SGP28 und andere Mitglieder aus der CRISP-Familie bei der nicht spezifischen, angeborenen Immunität eine Rolle spielen mögen (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246–250; Pfisterer et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 6160–6168; Haendler et al., 1999, J. Cell. Physiology 178: 371–378).
Wie weiterhin in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, wurden das SGP28 Gen und das Protein auf viele Arten charakterisiert. So wurden beispielsweise Analysen der Nukleotid-Codierung und der Aminosäuresequenzen durchgeführt, um konservierte strukturelle Elemente innerhalb der SGP28 Sequenz, Topologiemerkmale, post-translatorische Modifikationen und potentiell zugehörige Moleküle zu identifizieren. Es wurden Northern-Blotting Analysen der SGP28 mRNA Expression durchgeführt, um den Bereich von normalen und kanzerösen Geweben herauszufinden, welche verschiedene SGP28 Messages exprimieren. Western-Blotting und immunhistochemische Analysen der SGP28 Proteinexpression in experimentell transfizierten und kanzerösen Zellen und Geweben wurden durchgeführt, um Expressions- und Sekretionsmuster zu untersuchen. SGP28 weist einen pI von 8,08 und ein errechnetes Molekulargewicht von 29,0 kDa auf.
Mehrere sekretierte Proteine sind bei Prostatakrebs beschrieben worden, wobei bei einer Mehrzahl derselben ge zeigt wurde, daß sie an dem Vorgang der Tumorbildung und -progression teilnehmen (Inoue K., 1000, Clin. Cancer Res. 6: 2104–19; Dow J. K. et al., 2000, Urology 55: 800–6). Da SGP28 ein sekretiertes Protein ist, besteht eine seiner potentiellen Funktionen darin, die Mikroumgebung des Prostatakrebses und der Metastasierung zu regulieren. Um diese Möglichkeit zu testen, kann SGP28 als rekombinante GST-SGP28 Form oder SGP28-Myc/His Form exprimiert und gereinigt werden. Das gereinigte rekombinante SGP28 (wie GST-SGP28 oder SGP28-Myc/His) wird dann mit einer Mehrzahl an verschiedenen Zelltypen inkubiert, welche die Umgebung der Prostata rekapitulieren, einschließlich Epithelzellen der Prostata, Prostatatumor-Zellinien, Stromazellen der Prostata, Endothelzellen der Prostata und Endokrinzellen der Prostata. Zusätzlich wird rekombinantes SGP28 auch mit Zellen inkubiert, welche an metastatischen Stellen aufgefunden worden sind, wie Knochenmarkszellen und Zellen des Immunsystems. Die Bindung von SGP28 an intakte Zellen wird mittels FACS Analyse und durch kalorimetrische Untersuchung ermittelt. Eine solche Analyse ist nützlich, weil sie eine Zellpopulation identifiziert, welche an SGP28 bindet und auf dieses reagiert. Ferner kann die Identifizierung einer Target-Zellpopulation ein Mittel zum Isolieren und Identifizieren von SGP28 Rezeptoren darstellen.
SGP28 weist eine starke Homologie mit Defensin-Proteinen, insbesondere mit β-Defensinen, auf. Beta-Defensine sind sekretierte Produkte, welche vornehmlich von Epithelzellen produziert werden (O'Neil D. A. et al., 1999, J. Immunol. 163: 6718–24; Schröder J. M., Harder J., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 645–51). Defensine spielen eine wichtige Rolle bei der Vorbeugung vor Infektionen und Überwachung der Immunität von Epithelgeweben. Ferner wurde von menschlichem HNP-1 Defensin gezeigt, daß es in vitro den Tod von Tumorzellen induziert. Um die Rolle von SGP28 beim Zelltod zu untersuchen, wird gereinigtes rekombinantes SGP28 mit einer Mehrzahl an verschiedenen Zelltypen der vorgenannten Art inkubiert, wonach die apoptotische Aktivität unter Verwendung der FACS Analyse von Annexin V-gefärbten Zellen analysiert wird. SGP28 kann auch die Funktion als Chemoattraktant besitzen, wie es für andere Defensinmoleküle gezeigt wurde (Yang D. et al., Leukoc. Biol. 2000, 68: 9–14; Yang D. et al., Science, 1999, 286 (5439): 525–8). Durch chemotaktische Untersuchung kann der Effekt von SGP28 auf die Migration von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Stromazellen, Endothelzellen, sowie auf Monozyten, Lymphozyten und dendritische Zellen beurteilt werden.
Isolierung von SGP28 kodierenden Nukleinsäuremolekülen
Die vorliegend beschriebenen SGP28 cDNA Sequenzen ermöglichen die Isolierung von anderen Polynukleotiden, welche SGP28 Genprodukt(e) kodieren, sowie die Isolierung von Polynukleotiden, welche Homologe von SGP28 Genprodukten kodieren, alternativ gespleißte Isoformen, allelische Varianten und mutante Formen des SGP28 Genproduktes. Verschiedene molekulare Klonierungsverfahren, welche eingesetzt werden können, um die cDNAs, welche ein SGP28 Gen kodieren, in voller Länge zu isolieren, sind bekannt (vgl. z.B. Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., Wiley and Sons, 995). So können beispielsweise Lambda-Phagen Klonierungsverfahren unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Klonierungssystemen auf einfache Weise angewandt werden (z.B. Lambda ZAP Express, Stratagene). Phagen-Klone, welche SGP28 Gen cDNAs aufweisen, lassen sich durch Proben mit gelabelter SGP28 cDNA oder einem Fragment hiervon identifizieren. So kann z.B. gemäß einer Ausfüh rungsform die SGP28 cDNA (Tabelle 1; SEQ ID Nr. 2) oder ein Teil derselben synthetisiert und als Probe verwendet werden, um überlappende und cDNAs voller Länge, welche mit einem SGP28 Gen korrespondieren, aufzufinden. Das SGP28 Gen selbst kann durch Screening von Datenbanken genomischer DNA, Datenbanken künstlicher Bakterienchromosomen (Bacterial Artificial Chromosome Libraries, BACs), Datenbanken künstlicher Hefechromosomen (Yeast Artificial Chromosome Libraries, YACs) und dergleichen mit SGP28 DNA Proben oder Primern isoliert werden.
Rekombinante DNA-Moleküle und Klonierungssysteme
Die Erfindung betrifft auch rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, welche ein SGP28 Polynukleotid enthalten, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – Phagen, Plasmide, Phagemide, Cosmide, YACs, BACs, sowie verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte virale und nicht virale Vektoren und Zellen, welche mit solchen rekombinanten DNA- oder RNA-Molekülen transformiert oder transfiziert worden sind. Der hierin verwendete Begriff eines rekombinanten DNA- oder RNR-Moleküls bedeutet ein DNA- oder RNA-Molekül, welches in vitro einer molekularen Manipulation unterworfen worden ist. Verfahren zum Erzeugen solcher Moleküle sind bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al., 1989, s.o.).
Die Erfindung betrifft ferner ein Klonierungssystem, welches ein rekombinantes DNA-Molekül mit einem SGP28 Polynukleotid in einer geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle enthält. Beispiele für geeignete eukaryontische Wirtszellen umfassen eine Hefezelle, eine pflanzliche Zelle oder eine tierische Zelle, wie eine Zelle eines Säugetieres oder eines Insekts (z.B. eine Baculovirus-infizierbare Zelle, wie eine Sf9 Zelle). Beispiele für geeignete Zellen von Säugetieren umfassen mehrere Prostatakrebs-Zellinien, wie LNCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, andere transfizierbare oder transduzierbare Prostatakrebszellen sowie eine Mehrzahl an Säugetierzellen, welche routinemäßig für die Expression von rekombinanten Proteinen verwendet werden (z.B. COS-, CHO-, 293-, 293T-Zellen). Insbesondere kann ein Polynukleotid, welches die kodierende Sequenz von SGP28 enthält, zur Erzeugung von SGP28 Proteinen oder Fragmenten hiervon unter Verwendung einer beliebigen Anzahl an routinemäßig eingesetzten und aus dem Stand der Technik bekannten Klonierungssystemen verwendet werden.
Für die Expression von SGP28 Proteinen oder Fragmenten hiervon ist ein breites Spektrum an geeigneten Klonierungssystemen erhältlich; vgl. z.B. Sambrook et al., 1989, s.o.; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, s.o. Bevorzugte Vektoren für säugetierische Expression umfassen pcDNA3.1 myc-His-tag (Invitrogen) und den retroviralen Vektor pSRαtkneo (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785), ohne auf diese beschränkt zu sein. Unter Verwendung der genannten Expressionsvektoren kann SGP28 vorzugsweise in mehreren Zellinien von Prostatakrebs oder nicht von der Prostata exprimiert werden, welche z.B. 293, 293T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP und TsuPr1 umfassen. Die erfindungsgemäßen Klonierungssysteme sind für die Produktion eines SGP28 Proteins oder eines Fragmentes hiervon nützlich. Solche Klonierungssysteme können eingesetzt werden, um die funktionellen Eigenschaften von SGP28 und SGP28 Mutationen zu untersuchen.
Von SGP28 Genen oder Fragmenten hiervon kodierte Proteine besitzen eine Vielzahl an Anwendungszwecken, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – die Erzeugung von Antikörpern und für Verfahren zur Identifizierung von Liganden und anderer Verbindungen und Zellbestandtei len, welche an ein SGP28 Genprodukt binden. Antikörper gegen ein SGP28 Protein oder ein Fragment hiervon können nützlich sein für diagnostische und prognostische Untersuchungen, bildgebende Verfahren (Imaging-Verfahren; insbesondere einschließlich Krebs-Imaging) und therapeutische Verfahren bei der Behandlung von menschlichem Krebs, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein SGP28 Protein exprimiert, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – Prostatakrebs. Verschiedene immunologische Untersuchungen, welche für die Feststellung von SGP28 Proteinen einsetzbar sind, sind denkbar, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – verschiedene Arten von Radioimmunoassays, Enzyme-linked-Immunosorbent-Assays (ELISA), Enzyme-linked-Immunofluorescent-Assays (ELIFA), immunzytochemische Verfahren und dergleichen. Solche Antikörper können gelabelt und als immunologische Imaging-Verbindung (Imaging Agent) verwendet werden, welche in der Lage ist, Prostatazellen festzustellen (z.B. bei radioszintigrafischen Imaging-Verfahren). SGP28 Proteine können des weiteren insbesondere bei der Herstellung von Impfstoffen gegen Krebs nützlich sein, wie es weiter unten näher beschrieben ist.
SGP28 Proteine
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft SGP28 Proteine und Polypeptid-Fragmente hiervon. Die erfindungsgemäßen SGP28 Proteine umfassen die vorliegend speziell beschriebenen sowie allelische Varianten, konservative Substitutionsvarianten und Homologe bis zu einem Grad, daß solche Varianten und Homologen ohne übermäßigen Experimentieraufwand gemäß den nachfolgend erläuterten Verfahren isoliert/erzeugt und charakterisiert werden können. Fusionsproteine, welche Teile verschiedender SGP28 Proteine oder Fragmente hiervon kombinieren, sowie Fusionsproteine eines SGP28 Proteins und eines heterologen Polypeptides sind ebenfalls mit umfaßt. Solche SGP28 Proteine sind nachfolgend insgesamt als SGP Proteine, erfindungsgemäße Proteine oder SGP28 bezeichnet. Der hierin verwendete Begriff "SGP28 Polypeptid" bedeutet ein Polypeptid-Fragment oder ein SGP28 Protein mit wenigstens zehn Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 15 Aminosäuren.
Eine spezielle Ausführungsform eines SGP28 Proteins umfaßt ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenem, menschlichem SGP28 von dem dort dargestellten Aminosäure-Rest Nr. 1 bis zu dem Aminosäure-Rest Nr. 258 enthält. Eine weitere spezielle Ausführungsform eines SGP28 Proteins umfaßt ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenem, menschlichem SGP28 etwa von dem dort dargestellten Aminosäure-Rest Nr. 33 bis etwa zu dem Aminosäure-Rest Nr. 258 enthält. Eine spezielle Ausführungsform eines SGP28 Fragmentes enthält ein Peptid, welches aus einer Gruppe ausgewählt ist, welche die Aminosäuren 1–32 der in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenen SGP28 Proteinsequenz oder eine oder beide der extrazellulären Protein SCP-Motive an den Aminosäure-Resten 150–160 (WGHYTQWWY; SEQ ID Nr. 6) und 170–182 (YYVCQYCPAGNW; SEQ ID Nr. 7) umfaßt.
Im allgemeinen weisen natürlich vorkommende allelische Varianten von menschlichem SGP28 einen hohen Grad an struktureller Identität und Homologie (z.B. 90% Identität oder mehr) auf. Typischerweise enthalten allelische Varianten der SGP28 Proteine konservative Aminosäuresubstitutionen innerhalb der vorliegend beschriebenen SGP28 Sequenzen, oder sie enthalten eine Substitution einer Aminosäure aus einer entsprechenden Position in einer SGP28 Homologen. Eine Klasse von SGP28 allelischen Varianten stellen Proteine dar, welche einen hohen Grad an Homologie mit wenigstens einer kleinen Region einer bestimmten SGP28 Aminosäuresequenz, aber überdies eine radikale Abweichung von dieser Sequenz, wie eine nicht konservative Substitution, eine Verkürzung (Truncation), Einfügung (Insertion) oder einen Frame-Shift, aufweisen.
Konservative Aminosäuresubstitutionen können in einem Protein häufig vorgenommen werden, ohne die Konformation oder die Funktion des Proteins zu verändern. Solche Austausche umfassen die Substitution eines beliebigen Vertreter aus der Gruppe Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) gegen einen beliebigen anderen Vertreter dieser hydrophoben Aminosäuren; Asparginsäure (D) gegen Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) gegen Aspargin (N) und umgekehrt; und Serin (S) gegen Threonin (T) und umgekehrt. Weiterhin können andere Substitutionen je nach Umgebung der bestimmten Aminosäuren und je nach ihrer Rolle bei der dreidimensionalen Struktur des Proteins als konservativ erachtet werden. So sind beispielsweise Glycin (G) und Alanin (A) wie auch Alanin (A) und Valin (V) häufig austauschbar, Methionin (M), welches relativ hydrophob ist, ist häufig gegen Leucin und Isoleucin und manchmal gegen Valin austauschbar. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig an Stellen austauschbar, an welchen das signifikante Merkmal der Aminosäure-Reste ihre Ladung ist und die verschiedenen pK-Werte dieser beiden Aminosäure-Reste nicht signifikant sind. Schließlich können auch andere Austausche in bestimmten Umgebungen als "konservativ" erachtet werden.
SGP28 Proteine einschließlich der Varianten enthalten wenigstens ein gemeinsames Epitop mit einem SGP28 Protein, welches die in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebene Aminosäuresequenz aufweist, so daß ein Antikörper, wel cher spezifisch an ein SGP28 Protein bindet, oder eine Variante ebenfalls spezifisch an das SGP28 Protein bindet, welches die in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. Eine Klasse von SGP28 Proteinvarianten weist 90% Identität oder mehr mit der in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenen Aminosäuresequenz auf. Eine spezifischere Klasse von SGP28 Proteinvarianten weist ein oben beschriebenes extrazelluläres Protein SCP-Motiv auf. Bevorzugte SGP28 Proteinvarianten sind in der Lage, eine oder mehrere der vorliegend beschriebenen Defensin-Funktionen zu zeigen, z.B. einschließlich der Fähigkeit, Tumortod zu induzieren oder als Chemoattraktant für die Zellmigration zu wirken und/oder diese zu induzieren.
SGP28 Proteine können in vielen Formen, vorzugsweise in isolierter Form, ausgebildet sein. Sofern hierin von einem "isolierten" Protein die Rede ist, so ist damit gemeint, daß physikalische, mechanische oder chemische Methoden angewandt werden, um das SGP28 Protein von Zellbestandteilen zu trennen, welche normalerweise mit dem Protein verbunden sind. Der Fachmann kann sich auf einfache Weise Standard-Reinigungsverfahren bedienen, um ein isoliertes SGP28 Protein zu erhalten. Ein gereinigtes SGP28 Proteinmolekül ist im wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Molekülen, welche die Bindung von SGP28 an Antikörper oder andere Liganden beeinträchtigen. Die Art und der Grad an Isolierung und Reinigung hängt von der beabsichtigten Verwendung ab. Ausführungsformen eines SGP28 Proteins umfassen ein gereinigtes SGP28 Protein und ein funktionelles, lösliches SGP28 Protein. Gemäß einer Ausführungsform behalten solche funktionellen, löslichen SGP28 Proteine oder Fragmente hiervon ihre Fähigkeit bei, Antikörper oder andere Liganden zu binden.
Die Erfindung betrifft auch SGP28 Polypeptide, welche biologisch aktive Fragmente der SGP28 Aminosäuresequenz enthalten, wie ein Polypeptid, welches mit einem Teil der in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten Aminosäuresequenz für SGP28 korrespondiert. Solche erfindungsgemäßen Polypeptide zeigen Eigenschaften des SGP28 Proteins, wie die Fähigkeit, die Bildung von Antikörpern auszulösen, welche spezifisch ein mit dem SGP28 Protein verbundenes Epitop binden.
Ausführungsformen der vorliegend beschriebenen Erfindung umfassen eine breite Vielfalt an akzeptierten Varianten (Accepted Variants) von SGP28 Proteinen, wie Polypeptide, welche Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren aufweisen. SGP28 Varianten lassen sich mittels aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren erzeugen, wie punktgerichtete Mutagenese (Site-directed Mutagenesis), Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Punktgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1987)), Kassetten-Mutagenese (Cassette Mutagenesis) (Wells et al., Gene 34: 315 (1985)), Restriction-Selection-Mutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A, 317: 415 (1986)) oder andere bekannte Verfahren können auf die klonierte DNA angewandt werden, um die SGP28 variante DNA zu erzeugen. Ebenfalls können Scan-Analysen der Aminosäuren angewandt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scan-Aminosäuren befinden sich verhältnismäßig kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist üblicherweise eine bevorzugte Scan-Aminosäure in dieser Gruppe, weil sie die Seitenkette jenseits des Beta-Kohlenstoffes entfernt und mit geringerer Wahrscheinlichkeit die Konformation der Hauptketten der Variante ändert. Alanin ist weiterhin deshalb üblicherweise bevorzugt, weil es die häufigste Aminosäure darstellt. Ferner findet es sich häufig sowohl an verdeckten als auch an exponierten Positionen (Creighton, The Proteins (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150: 1 (1976). Falls die Alaninsubstitution nicht zu hinreichenden Mengen an Varianten führt, so kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
Wie vorstehend erläutert, umfassen Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung Polypeptide, welche weniger als die 258 Aminosäuresequenz des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenen SGP28 Proteins enthalten. So umfassen beispielsweise typische Ausführungsformen der vorliegend beschriebenen Erfindung Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 1 bis zu der Aminosäure von etwa 10 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 20 bis zu der Aminosäure von etwa 30 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 30 bis zu der Aminosäure von etwa 40 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 40 bis zu der Aminosäure von etwa 50 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 50 bis zu der Aminosäure von etwa 60 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 60 bis zu der Aminosäure von etwa 70 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 70 bis zu der Aminosäure von etwa 80 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 80 bis zu der Aminosäure von etwa 90 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 90 bis zu der Aminosäure von etwa 100 des in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellten SGP28 Proteins zusammengesetzt sind; etc. Gemäß diesem Schema stellen Polypeptide, welche aus Teilen der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 100–258 des SGP28 Proteins zusammengesetzt sind, typische Ausführungsformen der Erfindung dar. Ferner sind Polypeptide, welche aus größeren Teilen des SGP28 Proteins zusammengesetzt sind, ebenfalls angedacht. So lassen sich z.B. Polypeptide, welche aus der Aminosäure von etwa 1 (oder 20 oder 30 oder 40 etc.) bis zu der Aminosäure von etwa 20 (oder 30 oder 40 oder 50 etc.) des in Tabelle 2 wiedergegebenen SGP28 Proteins (SEQ ID Nr. 3) zusammengesetzt sind, mittels einer Vielzahl an aus dem Stand der Technik bekannten Methoden erzeugen.
Weitere, der Veranschaulichung dienende Ausführungsformen der vorliegend beschriebenen Erfindung umfassen SGP28 Polypeptide, welche die Aminosäure-Reste eines oder mehrerer der in der in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) gezeigten SGP28 Proteinsequenz enthaltenen biologischen Motive aufweisen. SGP28 Polypeptide, welche eines oder mehrere dieser Motive oder andere ausgewählte, vorliegend beschriebene Regionen von Interesse enthalten, weisen typischerweise zusätzliche 5 bis 25 oder mehr Aminosäure-Reste benachbarter SGP28 Proteinsequenzen an einer oder beiden Seiten des/der ausgewählten Motivs/Motive auf. Gemäß einer Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere Regionen von SGP28 enthalten, welche Homologie mit Defensinen aufweisen. Gemäß einer anderen Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere der SGP28 N-Glykolysierungsstellen, wie NCSN (SEQ ID Nr. 8) an den Resten 252–255 (Numerierung von dem in SEQ ID Nr. 3 dargestellten ersten Aminosäure-Rest), enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere der SGP28 Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen, wie SLK an den Resten 106–108 und/oder 231–233, enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere der SGP28 Caseinkinase II Phosphorylierungsstellen, wie SWFD an den Resten 128–131 (SEQ ID Nr. 9) und/oder SCPD an den Resten 206–209 (SEQ ID Nr. 10), enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere der Tyrosinkinase Phosphorylierungsstellen, wie KCGENLY an den Resten 108–114 (SEQ ID Nr. 11), enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere der N-Myristoylierungsstellen, wie GLLPSF an den Resten 26–31 (SEQ ID Nr. 12), GCGNAY an den Resten 164–169 (SEQ ID Nr. 13), GNWANR an den Resten 188–193 (SEQ ID Nr. 14), GAPCAS an den Resten 201–206 (SEQ ID Nr. 15) und/oder GLCTNG an den Resten 214–219 (SEQ ID Nr. 16), enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eine oder mehrere der extrazellulären Protein SCP-Signatursequenzen, wie die Aminosäure-Reste 150–160 der SEQ ID Nr. 3 und/oder die Aminosäure-Reste 179–190 der SEQ ID Nr. 3, enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können typische Polypeptide gemäß der Erfindung eines oder mehrere der vorhergesagten HLA-A2 Bindungspeptide, wie die Aminosäuren 2–10 (TLFPVLLFL; SEQ ID Nr. 17), die Aminosäuren 6–14 (VLLFLVAGL; SEQ ID Nr. 18), die Aminosäuren 30–38 (ALLTTQTQV; SEQ ID Nr. 19), die Aminosäuren 142–150 (VVWYSSYLV; SEQ ID Nr. 20), die Aminosäuren 222–230 (TLTCKHQLV; SEQ ID Nr. 21), die Aminosäuren 175–183 (GNWANRLYV; SEQ ID Nr. 22), die Aminosäuren 7–15 (LLFLVAGLL; SEQ ID Nr. 23), die Aminosäuren 141–149 (QWWYSSYL; SEQ ID Nr. 24), die Aminosäuren 134–142 (AWGHYTQV; SEQ ID Nr. 25) und die Aminosäuren 211–219 (DLYSNCKSL; SEQ ID Nr. 26), von SGP28 enthalten. Zugehörige Ausführungsformen dieser Erfindungen umfassen Polypeptide, welche Kombinationen der verschiedenen, vorstehend erwähnten Motive aufweisen, wobei bevorzugte Ausführungsformen solche sind, welche keine Insertionen, Deletionen oder Substitutionen entweder innerhalb des Motivs oder des Introns dieser Polypeptide enthalten.
SGP28 Polypeptide lassen sich unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Standard-Peptidsyntheseverfahren oder unter Verwendung chemischer Teilungsmethoden erzeugen, welche auf den Aminosäuresequenzen des vorliegend beschriebenen menschlichen SGP28 Proteins basieren. Alternativ können rekombinante Verfahren verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen, welche ein Polypeptid-Fragment eines SGP28 Proteins kodieren. In dieser Hinsicht stellen die vorliegend beschriebenen SGP28 kodierenden Nukleinsäuremoleküle ein Mittel zur Herstellung von definierten Fragmenten von SGP28 Proteinen dar. SGP28 Polypeptide sind insbesondere nützlich für die Erzeugung und Charakterisierung von Domänen-spezifischen Antikörpern (z.B. Antikörpern, welche ein extrazelluläres oder intrazelluläres Epitop eines SGP28 Proteins erkennen), für die Identifizierung von Verbindungen oder Zellfaktoren, welche an SGP28 oder an eine bestimmte strukturelle Domäne desselben binden, sowie für verschiedene therapeutische Zusammenhänge, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – im Hinblick auf Impfstoffe gegen Krebs. SGP28 Polypepide, welche Strukturen von besonderem Interesse enthalten, können unter Verwendung von. verschiedenen, aus dem Stand der Technik bekannten Analysetechniken, welche z.B. die Analysemethoden gemäß Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson-Wolf umfassen, oder auf der Basis von Immunogenität vorhergesagt und/oder identifi ziert werden. Fragmente, welche solche Strukturen enthalten, sind insbesondere nützlich für die Erzeugung von Untereinheit-spezifischen anti-SGP28 Antikörpern oder für die Identifizierung von Zellfaktoren, welche an SGP28 binden.
Gemäß einer speziellen, in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Ausführungsform kann eine sekretierte Form von SGP28 auf einfache Weise in 293T Zellen exprimiert werden, welche mit einem CMV-gesteuerten Expressionsvektor transfiziert sind, welcher SGP28 mit einem C-terminalen 6 × His und MYC tag kodiert (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen). Das sektretierte HIS-tagged SGP28 im Nährboden kann unter Verwendung einer Nickel-Säule und Standard-Verfahren gereinigt werden. Alternativ kann ein AP-tag System verwendet werden. Verschiedenen Konstrukte für die Expression von SGP28 sind in den nachfolgenden Beispielen erläutert.
Modifikationen von SGP28, wie kovalente Modifikationen, sind vom Schutzbereich der Erfindung umfaßt. Ein Typ einer kovalenten Modifikation umfaßt die Reaktion getargeter Aminosäure-Reste eines SGP28 Polypeptides mit einem organischen Derivatisierungsmittel, welches in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten der N- oder C-terminalen Reste von SGP28 zu reagieren. Ein anderer Typ einer kovalenten Modifikation des SGP28 Polypeptides, welche in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen ist, umfaßt die Veränderung des natürlichen Glykosylierungsmusters des Polypeptides. Mit "Veränderung des natürlichen Glykosylierungsmusters" ist in diesem Zusammenhang gemeint, daß einer oder mehrere Kohlenhydrat-Reste, welche in der natürlichen Sequenz von SGP28 vorhanden sind, beseitigt (entweder durch Entfernen der zugrunde liegenden Glykosylierungsstelle oder durch Beseitigen der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel) und/oder daß eine oder mehrere Glykosylierungsstellen, welche in der natürlichen Sequenz von SGP28 nicht vorhanden sind, eingefügt wird/werden. Ferner umfaßt der genannte Ausdruck qualitative Änderungen in der Glykosylierung der natürlichen Proteine, welche eine Änderung in der Natur und in den Verhältnissen der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydrat-Reste bedingen. Ein weiterer Typ einer kovalenten Modifikation von SGP28 umfaßt die Bindung des SGP28 Polypeptides an eines oder eine Mehrzahl an nicht proteinösen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf eine Weise, wie es in den US-Patenten Nr. 4 640 835, 4 496 689, 4 310 144, 4 670 417, 4 791 192 oder 4 179 337 beschrieben ist.
Das SGP28 gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert werden, daß es ein chimäres Molekül bildet, welches miteinander verschmolzenes (fused) SGP28, heterologe Polypeptide oder Aminosäuresequenzen aufweist. Gemäß einer Ausführungsform weist ein solches chimäres Molekül eine Verschmelzung (Fusion) des SGP28 mit einem Polyhistidin-Epitop-tag auf, was für ein Epitop sorgt, an welches immobilisierter Nickel selektiv bindet. Das Epitoptag ist im allgemeinen an dem Amino- oder Carboxyl-Terminus des SGP28 angeordnet. Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Verschmelzung (Fusion) des SGP28 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglubulins aufweisen. Bei einer bivalenten Form des chimären Moleküls (auch als "Immunadhäsin" bezeichnet) kann eine solche Verschmelzung (Fusion) an der Fc-Region eines IgG-Moleküls angeordnet sein. Die Ig Verschmelzungen (Fusionen) beinhalten vorzugsweise die Substitution einer löslichen (Transmembran-Domäne deletiert oder inaktiviert) Form eines SGP28 Polypeptides an Stelle von wenigstens einer variablen Region in einem Ig-Molekül. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Immunglobulin-Verschmelzung (-Fusion) die Scharnier-Region (Hinge-Region) CH1 und CH3 oder die Scharnier-Regionen (Hinge-Regionen) CH1, CH2 und CH3 eines IgG1-Moleküls. Zur Herstellung von Immunglobulin-Verschmelzungen(-Fusionen) sie auch auf das US-Patent Nr. 5 428 130 verwiesen, welches am 27. Juni 1995 veröffentlicht worden ist.
SGP28 Antikörper
dEin weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Antikörper, welche an SGP28 Proteine und Polypeptide binden. Die bevorzugtesten Antikörper binden selektiv an ein SGP28 Protein, während sie an andere als SGP28 Proteine und Polypeptide nicht (oder nur schwach) binden. Im besonderen angedachte anti-SGP28 Antikörper umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente, welche die Antigen-Bindungsdomäne und/oder eine oder mehrere komplementaritätsbestimmende Regionen (Complementarity Determining Regions) solcher Antikörper enthalten. Der hierin verwendete Begriff eines Antikörper-Fragmentes ist als wenigstens ein Teil der variablen Region des Immunglobulinmoleküls definiert, welcher an sein Target, d.h. die Antigen-Bindungsregion, bindet.
Für einige Anwendungsfälle kann es wünschenswert sein, Antikörper zu erzeugen, welche spezifisch mit einem bestimmten SGP28 Protein und/oder einem Epitop in einer bestimmten strukturellen Domäne reagieren. So sind beispielsweise bevorzugte Antikörper, welche für die Krebsbehandlung und die diagnostische Bildgebung (Imaging) nützlich sind, solche, welche mit einem Epitop in einer extrazellulären Region des SGP28 Proteins reagieren, wie es in Krebszellen exprimiert wird. Solche Antikörper lassen sich unter Verwendung der vorliegend beschriebenen SGP28 Proteine oder unter Verwendung von Peptiden, welche aus vorhergesagten extrazellulären Domänen derselben erhalten worden sind, wie ein Immunogen, herstellen. In dieser Hinsicht können unter Bezugnahme auf die in 1 dargestellte SGP28 Proteinsequenz Regionen in der Amino-terminalen Sequenz zu der Transmembran-Domäne ausgewählt und genutzt werden, um geeignete Immunogene und Screening-Verbindungen für die Erhebung und Auswahl extrazellulär-spezifischer SGP28 Antikörper zu konstruieren.
Die erfindungsgemäßen SGP28 Antikörper können insbesondere nützlich sein für Behandlungsstrategien für Prostatakrebs, diagnostische und prognostische Untersuchungen und bildgebende Verfahren (Imaging-Verfahren). Auf ähnliche Weise können solche Antikörper für die Behandlung, die Diagnose und/oder die Prognose anderer Krebsarten in dem Umfang nützlich sein, wie SGP28 auch in anderen Krebsarten exprimiert oder über-exprimiert wird. Die Erfindung stellt verschiedene immunologische Untersuchungen bzw. Assays zur Verfügung, welche für die Feststellung und Quantifizierung von SGP28 und mutanten SGP28 Proteinen und Polypeptiden nützlich sind. Solche Untersuchungen umfassen im allgemeinen einen oder mehrere SGP28 Antikörper, welche in der Lage sind, soweit erforderlich ein SGP28 oder mutantes SGP28 Protein zu erkennen und an dieses zu binden, wobei sie auf verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte immunologische Untersuchungsweisen durchgeführt werden können, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – verschiedene Arten von Radioimmunoassays, Enzyme-linked-Immunosorbent-Assays (ELISA), Enzyme-linked-Immunofluorescent-Assays (ELIFA) und dergleichen. Darüber hinaus stellt die Erfindung immunologische bildgebende Verfahren (immunologische Imaging-Verfahren) zur Verfügung, welche in der Lage sind, Prostatakrebs festzustellen. Solche Untersuchungen können im klinischen Bereich bei der Feststellung, der Überwachung und der Prognose von Prostatakrebs, insbesondere bei fortgeschrittenem Prostatakrebs, verwendet werden.
SGP28 Antikörper können auch in Verfahren zur Reinigung von SGP28 und mutanten SGP28 Proteinen und Polypeptiden sowie zur Isolierung von SGP28 Homologen und zugehörigen Molekülen verwendet werden. So umfaßt z.B. ein Verfahren zur Reinigung eines SGP28 Proteins gemäß einer Ausführungsform die Inkubation eines SGP28 Antikörpers, welcher an eine feste Matrix gebunden worden ist, mit einem Lysat oder einer anderen SGP28 enthaltenden Lösung unter solchen Bedingungen, welche es dem SGP28 Antikörper ermöglichen, an das SGP28 zu binden; das Waschen der festen Matrix zum Entfernen von Verunreinigungen; und die Elution des SGP28 von dem gebundenen Antikörper. Andere Anwendungen der erfindungsgemäßen SGP28 Antikörper umfassen die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern, welche das SGP28 Protein imitieren.
SGP28 können auch therapeutisch verwendet werden, z.B. zum Modulieren oder Inhibieren der biologischen Aktivität eines SGP28 Proteins oder als Target und zum Zerstören von Krebszellen, welche ein SGP28 Protein exprimieren. Die Antikörperbehandlung von Prostatakrebs und anderen Krebsarten ist in einem eigenen Unterabschnitt weiter unten näher erläutert.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bekannt. So lassen sich Antikörper beispielsweise durch Immunisierung eines geeigneten säugetierischen Wirtes unter Verwendung eines SGP28 Proteins, Peptides oder Fragmentes in isolierter oder immunkonjugierter Form erzeugen (Antibodies: A Labaratory Manual, CSH Press, Hrsg., Harlow and Lane (1988); Harlow, An tibodies, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989)). Beispiele für Protein-Immunogene umfassen rekombinates SGP28 (in einem Baculovirus-System, einem Säuger-System etc. exprimiert), SGP28 extrazelluläre Domänen, AP-tagged SGP28 etc. Ferner können auch Fusionsproteine von SGP28 verwendet werden, wie ein Fusionsprotein aus SGP28 mit GST, Maltose-Bindungsprotein (MBP), grün fluoreszierendes Protein (GFP), HisMax-TOPO oder MycHis (siehe auch die Beispiele weiter unten).
Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann ein GST Fusionsprotein, welches die gesamte oder einen Teil der in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenen Aminosäuresequenz des offenen Leserasters (Open Reading Frame) enthält, hergestellt und als ein Immunogen zur Erzeugung geeigneter Antikörper verwendet werden. Ebenfalls können Zellen, welche SGP28 exprimieren oder über-exprimieren, für Immunisierungen verwendet werden. Auf ähnliche Weise kann eine beliebige Zelle, welche zur Expression von SGP28 konstruiert worden ist, verwendet werden. Solche Strategien können zur Produktion von monoklonalen Antikörpern mit verstärkter Funktion zur Erkennung von endogenem SGP28 führen. Ein anderes nützliches Immunogen enthält SGP28 Peptide, welche an die Zellmembran von Schaferythrozyten gebunden sind.
Die Aminosäuresequenz von SGP28, wie sie in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) dargestellt ist, kann zur Auswahl von spezifischen Regionen des SGP28 Proteins zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. So können beispielsweise Hydrophobie- und Hydrophilie-Analysen der SGP28 Aminosäuresequenz zur Identifizierung von hydrophilen Regionen in der SGP28 Struktur eingesetzt werden. Regionen des SGP28 Proteins, welche immonogene Strukturen aufweisen, sowie andere Regionen und Domänen können auf einfache Weise unter Ver wendung von verschiedenen anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie die Analyse gemäß Chou-Fasman, Garnier-Robson, Hyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson-Wolf, identifiziert werden. Peptide von SGP28, von welchen vorhergesagt wird, daß sie an HLA-A2 binden, können zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Solche vorhergesagten HLA-A2 Bindungspeptide umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – die Aminosäuren 2–10 (TLFPVLLFL; SEQ ID Nr. 17); die Aminosäuren 6–14 (VLLFLVAGL; SEQ ID Nr. 18); die Aminosäuren 30–38 (ALLTTQTQV; SEQ ID Nr. 19); die Aminosäuren 142–150 (VVWYSSYLV; SEQ ID Nr. 20); die Aminosäuren 222–230 (TLTCKHQLV; SEQ ID Nr. 21); die Aminosäuren 175–183 (GNWANRLYV; SEQ ID Nr. 22); die Aminosäuren 7–15 (LLFLVAGLL; SEQ ID Nr. 23); die Aminosäuren 141–149 (QVVWYSSYL; SEQ ID Nr. 24); die Aminosäuren 134–142 (AVVGHYTQV; SEQ ID Nr. 25); und die Aminosäuren 211–219 (DLYSBCKSL; SEQ ID Nr. 26) von SGP28. Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, wurde mit SGP28 Immunität nachgewiesen, welche jeweils unter Verwendung von Kaninchen und Mäusen zur Erzeugung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern verwendet wurde. Diese Reaktion der B-Zellen (B-Zellen Response) bzw. die Antikörperproduktion ist das Ergebnis einer anfänglichen Reaktion der B-Zellen, welche durch die immunogenen Teile von SGP28 ausgelöst worden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptides zur Verwendung als Immunogen und zur Herstellung von immunogenen Konjugaten eines Proteins mit einem Träger, wie BSA, KLH oder anderen Trägerproteinen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. In bestimmten Fällen kann eine direkte Konjugation, z.B. unter Verwendung von Carbodiimid-Reagenzien, angewandt werden; in anderen Fällen können Bindungsreagenzien, wie solche, welche von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA, bereitgestellt werden, wirksam sein. Die Verabreichung eines SGP28 Immunogens wird im allgemeinen durch Spritzen über einen geeigneten Zeitraum und unter Verwendung eines geeigneten Adjuvans durchgeführt, wie es allgemein bekannt ist. Während des Immunisierungsplans können Titer von Antikörpern herangezogen werden, um eine hinreichende Bildung von Antikörpern festzustellen.
Vorzugsweise sind SGP28 monoklonale Antikörper vorgesehen, welche durch verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden können. So können z.B. immortalisierte Zellinien, welche einen gewünschten monoklonalen Antikörper sekretieren, durch die Standard-Hybridommethode gemäß Kohler und Milstein, oder Modifikationen, welche produzierende B-Zellen immortalisieren, wie es allgemein bekannt ist, erzeugt werden. Die immortalisierten Zellinien, welche die gewünschten Antikörper sekretieren, werden durch immunologische Verfahren (Immunassays), bei welchen das Antigen das SGP28 Protein oder das SGP28 Fragment ist, gescreent. Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur, welche den gewünschten Antikörper sekretiert, identifiziert worden ist, können die Zellen expandiert und Antikörper entweder aus in vitro Kulturen oder aus asziten Fluiden produziert werden.
Die Antikörper oder Fragmente können auch unter Verwendung von gegenwärtigen Techniken durch rekombinante Mittel erzeugt werden. Regionen, welche spezifisch an die gewünschten Regionen des SGP28 Proteins binden, können auch im Rahmen von chimären oder CDR-transplantierten (CDR-grafted) Antikörpern aus verschiedenen Spezies erzeugt werden. Humanisierte oder menschliche SGP28 Antikörper können ebenfalls produziert werden und werden im Rahmen von therapeutischen Behandlungen bevorzugt eingesetzt. Verfahren zur Humanisierung von murinen (Maus) und anderen, nicht mensch lichen Antikörpern durch Substitution einer oder mehrerer der nicht menschlichen Antikörper-CDRs durch entsprechende menschliche Antikörpersequenzen sind bekannt (vgl. z.B. Jones et al., 1986, Nature 321: 522–525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323–327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534–1536). Ebenfalls sei auf Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989: 4285 und Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296 verwiesen. Verfahren zur Herstellung gänzlich menschlicher monoklonaler Antikörper umfassen das Phage-Display und die Technologie transgener Tiere (vgl. Vaughan et al., 1993, Nature Biotechnology 16: 535–539).
Gänzlich menschliche SGP28 monoklonale Antikörper können durch Klonierungsverfahren unter Einsatz von umfangreichen menschlichen Ig Gen-kombinatorischen Datenbanken (d.h. Phage-Display) erzeugt werden (Griffith und Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries; in: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Clark, M. (Hrsg.), Nottingham Academic, Seiten 45–64 (1993); Burton und Barbas, Human Antibodies form combinatorial libraries; Id., Seiten 65–82). Gänzlich menschliche SGP28 monoklonale Antikörper können des weiteren unter Verwendung von transgenen Mäusen erzeugt werden, welche so konstruiert worden sind, daß sie menschliche Immunglobulin-Genloci aufweisen, wie es in der am 3. Dezember 1997 veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 98/24893 A1 von Kucherlapati und Jakobovits et al. (vgl. auch Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4): 607–614)) beschrieben ist. Dieses Verfahren vermeidet die in vitro Manipulation, wie sie beim Verfahren des Phage-Displays erforderlich ist, und führt zur wirksamen Erzeugung von Affinitäts-authentischen menschlichen Antikörpern.
Die Reaktivität von SGP28 Antikörpern mit einem SGP28 Protein kann auf eine Vielzahl an bekannten Mitteln bestimmt werden, einschließlich Western-Blotting, Gelpräzipitation, ELISA- und FRCS-Ananlysen, bei welchen – soweit erforderlich – SGP28 Proteine, Pepetide, SGP28 exprimierende Zellen oder Extrakte derselben verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßer SGP28 Antikörper oder ein Fragment desselben kann mit einem detektierbaren Marker gelabelt oder zu einem zweiten Molekül, wie einem Zytotoxin oder einem anderen therapeutischen Mittel, konjugiert und als Target für das zweite Molekül an eine SGP28-positive Zelle verwendet werden (Vitetta E. S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, in DeVita, Jr., V. T. et al., Hrsg., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624–2636). Beispiele für zytotoxische Mittel umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – Ricin, Ricin A-Kette, Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Binblastin, Colchicin, Dihydroxyanthracin-dion, Actinomycin, Diphtherie-Toxin, Pseudomonas-Exotoxin (PE) A, PE40, Abrin Abrin A-Kette, Modeccin A-Kette, Alpha-Sarcin, Gelonin, Mitogellin, Retstrictocin, Phenomycin, Enomycin, Curicin, Crotin, Calicheamicin, Sapaonaria Officinalis-Inhibitor und Glukokortikoide sowie andere chemotherapeutischen Mittel und Radioisotope wie ²¹²Bi, ¹³¹J, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re. Geeignete detektierbare Marker umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung, einen Metall-Chelatbildner oder ein Enzym. Die Antikörper können auch zu einem eine Prodrug gegen Krebs aktivierenden Enzym konjugiert sein, welches in der Lage ist, die Prodrug in ihre aktive Form zu konvertieren (vgl. z.B. das US-Patent Nr. 4 975 287).
Ferner können bispezifische Antikörper, welche für zwei oder mehrere SGP28 Epitope spezifisch sind, durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Überdies können Antikörper-Effektorfunktionen modifiziert werden, um die therapeutische Wirkung der SGP28 Antikörper auf Krebszellen zu verstärken. So können beispielsweise Cystein-Reste in die Fc-Region konstruiert werden, was eine Bildung von inter-kettigen (Interchain-)Disulfidbindungen und eine Erzeugung von Homodimeren ermöglicht, welche eine erhöhte Kapazität hinsichtlich Internalisation, ADCC und/oder Komplement-mediierter Zelltötung aufweisen können (vgl. z.B. Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1191–1195; Shopes, 1992, J. Immunol. 148: 2918–2922). Homodimere Antikörper können weiterhin durch aus dem Stand der Technik bekannte Vernetzungsverfahren erzeugt werden (z.B. Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560–2565).
SGP28 transgene Tiere
Nukleinsäuren, welche SGP28 oder dessen modifizierte Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder "Knock-Out"-Tiere zu erzeugen, welche wiederum für die Entwickung und das Screening von therapeutisch wirksamen Reagenzien nützlich sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier, welches Zellen besitzt, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tieres in einem vorgeburtlichen Zustand, z.B. im embryonalen Zustand, eingeführt worden ist. Ein Transgen ist eine DNA, welche in das Genom einer Zelle integriert worden ist, aus welcher sich ein transgenes Tier entwickelt. Gemäß einer Ausführungsform kann cDNA, welche SGP28 kodiert, verwendet wer den, um durch bekannte Verfahren und unter Verwendung der genomischen Sequenzen, welche zur Erzeugung von transgenen Tieren, welche Zellen aufweisen, die SGP28 kodierende DNA enthalten, verwendet werden, genomische DNA, welche SGP28 kodiert, zu klonieren.
Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren, insbesondere Tieren, wie Mäusen oder Ratten, sind im Stand der Technik gebräuchlich worden und beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4 736 866 und 4 870 009 beschrieben. Typischerweise werden bestimmte Zellen zum Einführen von SGP28 Transgenen mit gewebespezifischen Verstärkern (Enhancern) targetiert. Transgene Tiere, welche eine Kopie eines SGP28 kodierenden Transgens besitzen, das in die Keimbahn des Tieres in seinem embryonalen Zustand eingeführt worden ist, können verwendet werden, um die Wirkung einer erhöhten Expression von SGP28 kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Versuchstiere für Reagenzien verwendet werden, von welchen vermutet wird, daß sie einen Schutz bieten z.B. vor pathologischen Zuständen in Verbindung mit Über-Expression. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagenz behandelt, wobei ein vermindertes Auftreten von pathologischen Zuständen im Vergleich mit unbehandelten Tieren, welche das Transgen besitzen, auf eine potentielle therapeutische Behandlungsmethode zur Verhinderung von pathologischen Zuständen hindeutet.
Alternativ können nicht menschliche Homologe von SGP28 verwendet werden, um ein SGP28 "Knock-Out"-Tier zu konstruieren, welches ein defektes oder verändertes, SGP28 kodierendes Gen als Folge einer homologen Rekombination zwischen dem endogenen, SGP28 kodierenden Gen und der veränderten genomischen, SGP28 kodierenden DNA, welche in eine embryonale Zelle des Tieres eingeführt worden ist, besitzt. So kann beispielsweise SGP28 kodierende cDNA verwendet werden, um durch bekannte Verfahren SGP28 kodierende, genomische DNA zu klonieren. Ein Teil der SGP28 kodierenden, genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie ein Gen, welches einen selektierbaren Marker kodiert, der zur Überwachung der Integration verwendet werden kann.
Typischerweise können mehrere Kilobasen an unveränderter flankierender DNA (sowohl an dem 5'- als auch an dem 3'-Ende) in den Vektor eingeschlossen sein (vgl. z.B. Thomas und Capecchi, 1987 Cell 51: 503 zur Erläuterung homologer rekombinanter Vektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellinie eingeführt (z.B. durch Elektroporation), wonach Zellen, in welchen die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert worden ist, ausgewählt werden (vgl. z.B. Li et al., 1992, Cell 69: 915). Die ausgewählten Zellen werden anschließend in eine Blastozyste eines Tieres (z.B. einer Maus oder einer Ratte) injiziert, um Aggregations-Chimäre zu bilden (vgl. z.B. Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg., IRL, Oxford, 1987, Seiten 113–152).
Ein chimärer Embryo kann anschließend einem geeigneten scheinschwangeren weiblichen Zuchttier implantiert werden, wonach der Embryo zur Erzeugung eines "Knock-Out"-Tieres herangezogen wird. Der Abkömmling, welcher die homolog rekombinierte DNA in seinen Keimzellen trägt, kann durch Standard-Verfahren identifiziert und verwendet werden, um Tiere hervorzubringen, bei welchen sämtliche Zellen des Tieres die homolg rekombinierte DNA enthalten. Knock-Out-Tiere lassen sich z.B. durch ihre Fähigkeit, sich gegen bestimmte pathologische Zustände zur Wehr zu setzen, und durch ihre Entwicklung von pathologischen Zuständen aufgrund des Nichtvorhandenseins des SGP28 Polypeptides charakterisieren.
Untersuchungen zur Zirkulation und Exkretion von SGP28
Auf der Grundlage des seitens der Anmelderin gezeigten immunhistochemischen Nachweises einer hochgradigen lumenalen Expression von SGP28 in kanzerösen und präkanzerösen Prostatazellen wird erwartet, daß Prostatatumore SGP28 in die Vaskulatur sekretieren und/oder in den Urin oder das Sperma exkretieren, wobei das Protein unter Verwendung von auf dem Gebiet der Molekulardiagnostik bekannten Untersuchungen und Verfahren festgestellt und quantifiziert werden kann. Von der Feststellung und Quantifizierung der Niveaus an zirkulierendem oder exkretierten SGP28 wird erwartet, daß sie eine Vielzahl von Anwendungen in der Diagnose, Bestimmung und Prognose von Prostatakrebs erschließen. Eine Vielzahl an verschiedenen technischen Ansätzen zur Feststellung und Quantifizierung von Proteinen in Serum, Urin oder Sperma sind aus dem Stand der Technik bekannt. Weil SGP28 ein sekretiertes Protein ist, welches in Krebsen der Prostata und des Dickdarms sowie möglicherweise in anderen Krebsen exprimiert wird, wird von Untersuchungen zur Feststellung und Quantifizierung von SGP28 in Blut oder Serum erwartet, daß sie für die Feststellung, Diagnose, Prognose und/oder Bestimmung eines SGP28 exprimierenden Tumors in einem Individuum nützlich sind. So findet sich beispielsweise eine SGP28 mRNA Expression in normalen Geweben vornehmlich in der Prostata und in den Eierstöcken. Eine hochgradige Proteinexpression wird jedoch sowohl in Prostatakrebs als auch in PIN festgestellt. Folglich stellt die Feststellung von SGP28 Protein in Serum einen Hinweis auf das Vorhandensein eines Prostatatumors dar. Auf der Grundlage dieser Information und/oder anderer Informationen kann eine Krebsdiagnose gestellt werden. Im Hinblick auf z.B. Prostatakrebs können solche anderen Informationen Messungen von Serum-PSA, DRE und/oder Ultraschalluntersuchungen umfassen. Ferner kann das Niveau an SGP28, welche im Serum festgestellt worden ist, eine bei der Bestimmung und Prognose nützliche Information darstellen. So können z.B. sehr hohe Niveaus an SGP28 Protein im Serum auf einen größeren und/oder aggressiveren Tumor hinweisen.
Ferner kann periphäres Blut auf einfache Weise auf ein Vorhandensein von SGP28 Protein und/oder SGP28 exprimierenden Krebszellen untersucht werden, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – von Prostatakrebs, wobei RT-PCR eingesetzt werden kann, um eine Expression von SGP28 festzustellen. Ein Vorhandensein von mittels RT-PCR amplifizierbarer SGP28 mRNA stellt einen Hinweis auf das Vorhandensein von Krebs dar. RT-PCR Nachweisuntersuchungen für Tumorzellen in periphärem Blut werden gegenwärtig für die Verwendung in der Diagnose und Handhabung einer Mehrzahl an menschlichen Solid-Tumoren evaluiert. Auf dem Gebiet von Prostatakrebs umfassen diese RT-PCR Untersuchungen zur Feststellung von PSA und PSM exprimierenden Zellen (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 273–384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195–2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687–1688). RT-PCR Untersuchungen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Capture-ELISA verwendet, um SGP28 im Serum, Urin oder Sperma festzustellen und zu quantifizieren. Ein Capture-ELISA für SGP28 umfaßt im allgemeinen wenigstens zwei monoklonale Antikörper verschiedener Isotypen, welche verschiedene Epitope des SGP28 Proteins erkennen, oder einen anti-SGP28 monoklonalen Antikörper und ein spezifisches polyklonales Serum aus ver schiedenen Spezies (z.B. Kaninchen, Ziege, Schaf, Hamster etc.). Bei dieser Untersuchung dient das eine Reagenz als Capture-(oder Coating-)Antikörper und das andere als Nachweis-Antikörper.
Wie nachfolgend noch im einzelnen erläutert, können Niveaus an SGP28 einschließlich Serumniveaus an SGP28 verwendet werden, um ein Anzeichen für das Vorhandensein, das Ausmaß und die Aggressivität eines SGP28 exprimierenden Tumors zu liefern. Wie weiter oben bereits erwähnt, teilt SGP28 eine Reihe von Merkmalen mit PSA, welches den wichtigsten, genauesten und klinisch bedeutsamsten biochemischen Marker hinsichtlich der Prostata darstellt. Jeglicher Vorgang, welcher die normale Architektur der Prostata stört, ermöglicht eine Diffusion von PSA in das Stroma und in die Mikrovaskulatur. Folglich lassen sich klinisch bedeutsame Erhöhungen der Serumniveaus an Prostata-spezifischem Antigen mit Prostatakrebsen in Verbindung bringen. Insbesondere die mit Krebs verbundene größere Anzahl an malignen Zellen und die stromale Störung sind für das erhöhte Serumniveau an Protata-spezifischem Antigen verantwortlich. In diesem Zusammenhang korreliert das Serumniveau an Prostata-spezifischem Antigen zwangsläufig mit dem klinischen Zustand, dem Tumorvolumen, dem histologischen Grad und dem Vorhandensein einer Kapselperforation und Invasion in die Samenbläschen; vgl. z.B. Bostwick, D. G., 1994, Am. J. Clin. Pathol. 102 (4 Suppl. 1): S31–S37.
Unter Verwendung von PSA als das beste analoge Molekül ist es aufgrund dessen, daß SGP28 ebenfalls ein sekretiertes Molekül ist, welches ein begrenztes Muster an Gewebeexpression (einschließlich Prostata) aufweist, wahrscheinlich, daß die ansteigende Menge an malignen Zellen und stromaler Störung, welche in Verbindung mit Krebs auf treten, dazu führen, daß die Serumniveaus an SGP28 Antigen zwangsläufig mit einem oder mehreren klinisch relevanten Faktoren, wie dem klinischen Zustand, dem Tumorvolumen, dem histologischen Grad und dem Vorhandensein einer Kapselperforation und Invasion in die Samenbläschen, korrelieren. Von Messungen von Serum SGP28 im Zeitablauf wird erwartet, daß sie weitere Informationen liefern, wobei von einem Anstieg an SGP28 erwartet wird, daß er ein Fortschreiten widerspiegelt, während von der Anstiegsrate erwartet wird, daß sie mit der Aggressivität korreliert. In ähnlicher Weise wird von einer Verringerung an Serum SGP28 erwartet, daß sie ein langsameres Wachstum oder einen zurückgehenden Tumor widerspiegelt. Die Identifizierung von SGP28 im Serum kann nützlich sein, um den Anfang eines Tumors und ein frühes Krankheitsstadium festzustellen. Bei Patienten, die bereits einer Operation oder Behandlung unterzogen worden sind, können Serumniveaus an SGP28 nützlich sein für die Überwachung des Behandlungserfolgs und potentieller Rückschläge.
Überwachung des Zustandes von SGP28 und dessen Produktes
Untersuchungen, welche den Zustand des SGP28 Gens und der SGP28 Genprodukte in einem Individuum evaluieren, können Informationen über das Wachstum oder das onkogene Potential einer biologischen Probe aus diesem Individuum liefern. So können beispielsweise aufgrund dessen, daß SGP28 mRNA in solch hohem Maß in Prostatakrebsen exprimiert wird, in den meisten normalen Geweben jedoch nicht, Untersuchungen, welche die relativen Niveaus an SGP28 mRNA Transkripten oder Proteinen in einer biologischen Probe evaluieren, zur Diagnose einer mit SGP28 Dysregulierung verbundenen Krankheit, wie Krebs, verwendet werden und ferner prognostische Informationen liefern, welche bei der Auswahl von geeigneten Behandlungsmethoden nützlich sind. Auf ähnliche Weise können in diesem Zusammenhang auch Untersuchungen verwendet werden, welche die Gesamtheit an SGP28 Nukleotiden und Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe evaluieren.
Der Befund, daß SGP28 mRNA in solch hohem Maß in Prostatakrebsen exprimiert wird, in den meisten normalen Geweben jedoch nicht, liefert einen Beweis, daß dieses Gen mit dysreguliertem Zellwachstum in Verbindung gebracht werden kann, weshalb dieses Gen und seine Produkte als Target identifiziert werden können, welche der Fachmann verwenden kann, um biologische Proben aus Individuen, die im Verdacht stehen, unter einer mit SGP28 Dysregulierung im Zusammenhang stehenden Krankheit zu leiden, zu evaluieren. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel können aufgrund dessen, daß die Expression von SGP28 normalerweise auf die Prostata und auf die Eierstöcke beschränkt ist, auch biologische Proben, welche aus anderen Geweben genommen worden sind, evaluiert werden, um eine SGP28 Expression als ein Anzeichen für Metastasen festzustellen. In diesem Zusammenhang kann die Evaluierung des Expressionszustandes des SGP28 Gens und seiner Produkte verwendet werden, um Informationen über das Krankheitspotential einer Gewebeprobe zu gewinnen. Der in diesem Zusammenhang verwendete Begriff "Expressionszustand" bezieht sich allgemein auf eine Reihe von an der Expression beteiligten Faktoren, Funktionen und Regulationen eines Gens und seiner Produkte, wie die Rate an mRNA Expression, die Gesamtheit an exprimierten Genprodukten (wie die Nuklein- und Aminosäuresequenzen) und die transkriptorischen und translationalen Modifikationen dieser Moleküle.
Der Expressionszustand von SGP28 kann Informationen liefern, welche für die Vorhersage der Sensibilität bzw. Prädisposition für bestimmte Krankheitsstadien, der Progression und/oder der Aggressivität von Tumoren nützlich sind. Die Erfindung stellt Verfahren und Untersuchungen zur Feststellung des SGP28 Expressionszustandes und zur Diagnostizierung von SGP28 exprimierenden Krebsen, wie Krebsen der Prostata, zur Verfügung. Der SGP28 Expressionszustand in Patientenproben kann mittels einer Mehrzahl an aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren analysiert werden, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – immunhistochemische Analyse, in situ Hybridisierung, RT-PCR Analyse von Laser-Capture mikro-dissektionierten Proben, Western-Blotting Analyse von klinischen Proben und Zellinien sowie Tissue-Array Analyse. Typische Protokolle für die Evaluierung des Expressionszustandes des SGP28 Gens und seiner Genprodukte finden sich beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, Unit 2 [Northern-Blotting], 4 [Southern-Blotting], 15 [Immunoblotting] und 18 [PCR Analyse], Frederick M. Ausubel et al., Hrsg., 1995.
Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Überwachung von SGP28 Genprodukten durch Ermittlung des Zustandes von SGP28 Genprodukten, welche von Zellen in einer Gewebe-Testprobe eines Individuums, von welchem vermutet wird, daß es unter einer mit dyreguliertem Zellwachstum in Verbindung stehenden Krankheit (wie Hyperplasie oder Krebs) leidet, exprimiert werden, und den anschließenden Vergleich des derart ermittelten Zustandes mit dem Zustand von SGP28 Genprodukten in einer entsprechenden normalen Probe, wobei das Vorhandensein eines abweichenden oder modifizierten Zustandes der SGP28 Genprodukte in der Testprobe gegenüber der normalen Probe eine Indikation für das Vorhandensein von dysreguliertem Zellwachstum in den Zellen des Individuums gibt.
Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe auf Anzeichen an einem dysregulierten Zellwachstum. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren den Vergleich des Zustandes von SGP28 in der biologischen Probe mit dem Zustand von SGP28 in einer entsprechenden normalen Probe, wobei Modifikationen des Zustandes von SGP28 in der biologischen Probe mit einem dysregulierten Zellwachstum in Verbindung gebracht werden. Der Zustand von SGP28 in der biologischen Probe kann beispielsweise durch Untersuchung der Rate an SGP28 mRNA Expression oder der Rate an SGP28 Proteinexpression evaluiert werden. Gemäß einer Ausführungsform kann eine Veränderung des Zustandes von SGP28 durch das Vorhandensein von SGP28 exprimierenden Zellen in einer biologischen Probe von einem Gewebe, in welchem SGP28 exprimierenden Zellen gewöhnlich nicht vorhanden sind, identifiziert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Untersuchungen, welche zur Ermittlung des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum nützlich sind und welche die Feststellung eines signifikanten Anstieges an SGP28 mRNA oder Proteinexpression in einer Testzelle oder in einem Testgewebe gegenüber den Expressionsraten in entsprechenden normalen Zellen oder Geweben umfaßt. Ein Vorhandensein von SGP28 mRNA kann z.B. in Gewebeproben aus – wenn auch nicht ausschließlich – dem Dickdarm, der Lunge, der Prostata, der Bauchspeicheldrüse, der Blase, der Brust, den Eierstöcken, der Zervix, den Hoden, dem Kopf, dem Hals, dem Gehirn, dem Magen, den Knochen etc. evaluiert werden. Das Vorhandensein einer signifikanten SGP28 Expression in einem beliebigen dieser Gewebe kann nützlich sein für einen Hinweis auf die Entstehung, das Vorhandensein und/oder das Ausmaß eines solchen Krebses oder einer Metastase eines aus einem anderen Gewebe stammenden Krebses, da die entsprechenden norma len Gewebe keine SGP28 mRNA exprimieren oder sie in geringerem Ausmaß exprimieren.
Gemäß einer zugehörigen Ausführungsform kann der Zustand der SGP28 Expression auf der Basis des Proteins anstatt auf der Basis der Nukleinsäure festgestellt werden. Ein solches Verfahren bzw. eine solche Untersuchung kann z.B. die Ermittlung des Niveaus an SGP28 Protein, welches von Zellen in einer Gewebe-Testprobe exprimiert wird, und den Vergleich des derart ermittelten Niveaus mit dem Niveau an SGP28, welches in einer entsprechenden normalen Probe exprimiert wird, umfassen. Gemäß einer Ausführungsform wird das Vorhandensein von SGP28 Protein beispielsweise unter Verwendung von immunhistochemischen Verfahren evaluiert. SGP28 Antikörper oder Bindungspartner, welche in der Lage sind, eine Expression von SGP28 Protein festzustellen, können bei einer Vielzahl an zu diesem Zweck wohlbekannten Untersuchungsmethoden verwendet werden.
Gemäß weiteren zugehörigen Ausführungsformen kann die Gesamtheit an SGP28 Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe evaluiert werden, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle, wie Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen, zu identifizieren. Solche Ausführungsformen sind nützlich, weil Störungen in der Nukleotid- und Aminosäuresequenz bei einer großen Anzahl an Proteinen beobachtet werden können, welche mit einem Wachstums-dysregulierten Phänotyp im Zusammenhang stehen (vgl. z.B. Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26 (8): 369–378 (1999)). In diesem Zusammenhang ist eine breite Vielfalt an Untersuchungen zur Feststellung von Störungen in Nukleotid- und Aminosäuresequenzen aus dem Stand der Technik bekannt. So kann beispielsweise die Größe und die Struktur der Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen von SGP28 Genprodukten durch Northern-, Southern-, Western-. PCR- und DNA-Sequenzierungsprotokolle festgestellt werden, wie sie vorliegend beschrieben sind. Des weiteren sind andere Verfahren zur Feststellung von Störungen in Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, wie Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism), aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. z.B. die US-Patente Nr. 5 381 510 und 5 952 170).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Methylierungszustand des SGP28 Gens in einer biologischen Probe untersucht werden. Eine abweichende Demethylierung und/oder Hypermethylierung von CpG Inseln in Gen 5' regulatorischen Regionen tritt häufig in immortalisierten und transformierten Zellen auf und kann zu einer veränderten Expression von verschiedenen Genen führen. So scheint beispielsweise die Promoter-Hypermethylierung von Glutathion-S-Transferase der pi-Klasse (einem Protein, welches in der normalen Prostata exprimiert wird, aber in > 90% von Prostatakarzinomen nicht exprimiert wird) die Transkription dieses Gens permanent zu unterbinden und stellt die am häufigsten festgestellte genomische Veränderung in Prostatakarzinomen dar (De Marzo et al., 1999, Am. J. Pathol. 155 (6): 1985–1992). Überdies tritt diese Veränderung in wenigstens 70% der Fälle einer hochgradigen Prostata Intraepithelialen Neoplasie (PIN) auf (Brooks et al., 1998, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 7: 531–536).
Gemäß einem weiteren Beispiel wird die Expression des LAGE-1 Tumor-spezifischen Gens (welches in der normalen Prostata nicht exprimiert wird, aber in 25 bis 50% von Prostatakrebsen exprimiert wird) durch Deoxy-Azacytidin in lymphoblastischen Zellen induziert, wobei behauptet wurde, daß die tumorale Expression eine Folge der Demethylierung ist (Lethe et al., 1998, Int. J. Cancer 76 (6): 903–908). In diesem Zusammenhang ist eine Vielzahl an Untersuchungen zur Feststellung des Methylierungszustandes eines Gens aus dem Stand der Technik bekannt. So können z.B. bei der Southern-Hybridisierung Methylierungs-sensitive Restriktionsenzyme verwendet werden, welche keine Sequenzen spalten können, die methylierte CpG Stellen enthalten, um den allgemeinen Methylierungszustand der CpG Inseln zu bewerten.
Des weiteren vermag die MSP (Methylierungs-spezifische PCR) den Methylierungszustand aller CpG Stellen, welche in einer CpG Insel eines bestimmten Gens vorhanden sind, schnell zu profilieren. Dieses Verfahren umfaßt die anfängliche Modifizierung von DNA durch Natriumbisulfit (welches sämtliche unmethylierten Cytosine zu Uracil umsetzt) und die anschließende Amplifikation unter Verwendung von Primern, welche für methylierte gegenüber unmethylierter DNA spezifische sind. Protokolle, welche die Methylierungs-Interferenz umfassen, finden sich z.B. auch in Current Protocols in Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al., Hrsg., 1995.
Gemäß einer weiteren zugehörigen Ausführungsform betrifft die Erfindung Untersuchungen, welche zur Feststellung des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum nützlich sind und welche die Feststellung einer signifikanten Änderung in den SGP28 alternativen Spleißvarianten, welche in einer Testzelle oder Gewebeprobe exprimiert werden, gegenüber den Expressionsraten in entsprechenden normalen Zellen oder Geweben umfassen. Die Überwachung von alternativen Spleißvarianten von SGP28 ist nützlich, weil von Veränderungen in dem alternativen Spleißen von Proteinen behauptet wird, daß sie einen Schritt einer Reihe an Vorgängen darstellen, welche zu einer Progression von Krebsen führen (vgl. z.B. Carstens et al., Oncogene 15 (250): 3059–3065 (1997)).
Die Amplifikation von Genen stellt ein weiteres Verfahren zur Überwachung des Zustandes von SGP28 dar. Die Gen-Amplifikation kann in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantität der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA Analyse), oder in situ Hybridisierung unter Verwendung einer in geeigneter Weise gelabelten Probe auf der Basis von hierin vorhandenen Sequenzen. Alternativ können Antikörper eingesetzt werden, welche spezifische Duplexe zu erkennen vermögen, einschließlich DNA Duplexe, RNA Duplexe und DNA-RNA Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein Duplexe. Die Antikörper können wiederum gelabelt werden und kann die Untersuchung durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so daß bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart eines Antikörpers festgestellt werden kann, welcher an den Duplex gebunden ist.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Geweben kann peripheres Blut unter Verwendung von RT-PCR auf einfache Weise auf das Vorhandensein von Krebszellen, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – Prostatakrebs, untersucht werden, um eine SGP28 Expression festzustellen. Das Vorhandensein von mittels RT-PCR amplifizierbarer SGP28 mRNA liefert einen Hinweis auf das Vorhandensein von Krebs. RT-PCR Untersuchungsverfahren für Tumorzellen in peripherem Blut werden gegenwärtig für die Verwendung in der Diagnose und Handhabung einer Mehrzahl an menschlichen Solid-Tumoren evaluiert. Auf dem Gebiet von Prostatakrebs umfassen diese RT-PCR Untersuchungen zur Feststellung von PSA und PSM exprimierenden Zellen (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 273–384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195–2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687–1688). RT-PCR Untersuchungen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Ein zugehöriger Aspekt der Erfindung ist darauf gerichtet, die Sensibilität bzw. Prädisposition hinsichtlich einer Entwicklung von Krebs in einem Individuum vorherzusagen. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zum Vorhersagen der Prädisposition für Krebs die Feststellung von SGP28 mRNA oder SGP28 Protein in einer Gewebeprobe, wobei dessen Vorhandensein einen Hinweis auf die Prädisposition für Krebs gibt, wobei die vorhandene Rate an SGP28 mRNA Expression proportional zu dem Grad an Prädisposition ist. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird das Vorhandensein von SGP28 in Prostatagewebe untersucht, wobei ein Vorhandensein von SGP28 in der Probe einen Hinweis auf die Prädisposition für Prostatakrebs (oder auf die Entstehung oder Existenz eines Prostatatumors) liefert. Gemäß einer eng zugehörigen Ausführungsform kann die Gesamtheit an SGP28 Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe evaluiert werden, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle, wie Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen, zu identifizieren, wobei das Vorhandensein einer oder mehrerer Störungen in den SGP28 Genprodukten der Probe einen Hinweis auf die Prädisposition für Prostatakrebs (oder auf die Entstehung oder Existenz eines Prostatatumors) liefert.
Ein weiterer zugehöriger Aspekt der Erfindung ist auf Verfahren zur Beurteilung der Tumoraggressivität gerichtet. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Beurteilung der Tumoraggressivität die Ermittlung des Niveaus an SGP28 mRNA oder SGP28 Protein, welche von Zellen in einer Probe des Tumors exprimiert werden, und den Vergleich des derart ermittelten Niveaus mit dem Niveau an SGP28 mRNA oder SGP28 Protein, welche in einem entsprechenden normalen Gewebe desselben Individuums oder in einer normalen Referenz-Gewebeprobe exprimiert werden, wobei das Niveau an SGP28 mRNA oder SGP28 Protein in der Tumorprobe im Vergleich mit der normalen Gewebeprobe einen Hinweis auf den Grad an Aggressivität gibt. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird die Aggressivität von Prostatatumoren durch Ermittlung des Ausmaßes, in welchem SGP28 in den Tumorzellen exprimiert wird, evaluiert, wobei höhere Expressionsraten auf aggressivere Tumore schließen lassen. Gemäß einer eng zugehörigen Ausführungsform kann die Gesamtheit an SGP28 Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe evaluiert werden, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle, wie Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen, zu identifizieren, wobei das Vorhandensein einer oder mehrerer Störungen einen Hinweis auf aggressivere Tumoren liefert.
Ein weiterer zugehöriger Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Feststellung der Progression einer Malignität in einem Individuum im Zeitablauf. Gemäß einer Ausführungsform umfassen Verfahren zur Feststellung der Progression einer Malignität in einem Individuum im Zeitablauf die Ermittlung des Niveaus an SGP28 mRNA oder SGP28 Protein, welche von Zellen in einer Probe des Tumors exprimiert werden, und den Vergleich des derart ermittelten Niveaus mit dem Niveau an SGP28 mRNA oder SGP28 Protein, welche in einer äquivalenten Gewebeprobe desselben Individuums, welche an einem anderen Zeitpunkt genommen worden ist, exprimiert werden, wobei das Niveau an SGP28 mRNA oder SGP28 Protein in der Tumorprobe im Zeitablauf Informationen über die Progression des Krebses liefert. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird die Progression eines Krebses durch Ermittlung des Ausmaßes, in welchem sich die SGP28 Expression in den Tumorzellen im Zeitablauf verändert, evaluiert, wobei höhere Expressionsraten auf eine Progression des Krebses schließen lassen. Gemäß einer eng zugehörigen Ausführungsform kann die Gesamtheit an SGP28 Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe evaluiert werden, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle, wie Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen, zu identifizieren, wobei das Vorhandensein einer oder mehrerer Störungen einen Hinweis auf eine Progression des Krebses liefert.
Die oben genannten diagnostischen Ansätze können mit einem beliebigen einer großen Vielfalt an aus dem Stand der Technik bekannten prognostischen und diagnostischen Protokollen kombiniert werden. So ist z.B. eine weitere Ausführungsform der vorliegend beschriebenen Erfindung auf Verfahren zur Feststellung einer Koinzidenz zwischen der Expression des SGP28 Gens und SGP28 Genprodukten (oder Störungen in dem SGP28 Gen oder in den SGP28 Genprodukten) und einem Faktor, welcher mit Malignität in Verbindung steht, als Mittel zur Diagnose und Prognose des Zustandes einer Gewebeprobe gerichtet. In diesem Zusammenhang kann eine breite Vielfalt an Faktoren, welche mit Malignität in Verbindung stehen, verwendet werden, wie die Expression von Genen, welche ansonsten mit Malignität in Verbindung stehen (einschließlich PSA, PSCA und PSM Expression), sowie grob zytologische Beobachtungen (vgl. z.B. Backing et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6 (2): 74–88; Epstein, 1995, Hum. Pathol., 1995 Feb., 26 (2): 223–9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11 (6): 543–51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol: 23 (8): 918–24). Verfahren zur Feststellung einer Koinzidenz zwischen der Expression des SGP28 Gens und SGP28 Genprodukten (oder Störungen in dem SGP28 Gen oder in den SGP28 Genprodukten) und einem zusätzlichen Faktor, welcher mit Malignität in Verbindung steht, sind z.B. nützlich, weil das Vorhandensein einer Gruppe oder einer Konstellation von zusammentreffenden spezifischen Faktoren Informationen liefern, welche für die Diagnose und die Prognose des Zustandes einer Gewebeprobe entscheidend sind.
Gemäß einer typischen Ausführungsform umfassen Verfahren zur Feststellung einer Koinzidenz zwischen der Expression des SGP28 Gens und SGP28 Genprodukten (oder Störungen in dem SGP28 Gen oder in den SGP28 Genprodukten) und einem Faktor, welcher mit Malignität in Verbindung steht, die Feststellung einer Über-Expression von SGP28 mRNA oder Protein in einer Gewebeprobe, die Feststellung einer Über-Expression von PSA mRNA oder Protein in einer Gewebeprobe sowie die Ermittlung einer Koinzidenz von SGP28 mRNA oder Protein Über-Expression und PSA mRNA oder Protein Über-Expression. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird die Expression von SGP28 und PSA mRNA in Prostatagewebe untersucht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Koinzidenz von SGP28 und PSA mRNA Über-Expression in der Probe einen Hinweis auf Prostatakrebs, auf die Prädisposition für Prostatakrebs oder auf die Entstehung oder die Existenz eines Prostatatumors liefert.
Verfahren zur Feststellung und Quantifizierung der Expression von SGP28 mRNA oder Protein sind vorliegend beschrieben und verwenden aus dem Stand der Technik bekannte Standard-Techniken zur Feststellung und Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen. Standard-Verfahren zur Feststellung und Quantifizierung von SGP28 mRNA umfassen die in situ Hybridisierung unter Verwendung von gelabelten SGP28 Riboproben, Northern-Blotting und zugehörige Techniken unter Verwendung von SGP28 Polynukleotid-Proben, RT-PCR Analyse unter Verwendung von SGP28-spezifischen Primern und andere Nachweisverfahren auf der Basis einer Amplifikation, wie z.B. verzweigte DNA (branched DNA), SISBA, TMA und dergleichen. Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann semiquantitative RT-PCR verwendet werden, um die SGP28 mRNA Expression festzustellen und zu quantifizieren, wie es in den nachfolgenden Beispielen beschrieben ist. Zu diesem Zweck kann eine beliebige Anzahl an Primern verwendet werden, welche zur Amplifikation von SGP28 in der Lage sind, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – die verschiedenen, vorliegend speziell erwähnten Primergruppen. Standard-Verfahren für die Feststellung und Quantifizierung von Proteinen können zu diesem Zweck eingesetzt werden. Gemäß einer speziellen Ausführungsform können polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche mit dem Wildtyp SGP28 Protein spezifisch reaktiv sind, in einer immunhistochemischen Untersuchung von biopsiertem Gewebe verwendet werden. Antikörper gegen das SGP28 Protein können ebenfalls verwendet werden, um SGP28 in einer Patientenprobe (z.B. Blut, Urin, Sperma oder andere Proben) unter Verwendung von herkömmlichen Techniken, wie Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (Fluorescence-activated Cell Sorting; FACS) und/oder ELISA, festzustellen.
Identifizierung von Molekülen, welche mit SGP28 wechselwirken
Die vorliegend beschriebene SGP28 Proteinsequenz ermöglicht dem Fachmann die Identifizierung von Proteinen, kleinen Molekülen (Small Molecules) und andere Verbindungen, welche mit SGP28 wechselwirken, sowie von Pfaden, welche von SGP28 über eine Vielzahl an anerkannten Protokollen aktiviert werden. So kann beispielsweise eines einer Mehrzahl an sogenannten Interaction-Trap Systemen (auch als "Two-Hybrid Assay" bezeichnet) verwendet werden. In solchen Systeme rekonstituieren wechselwirkende Moleküle einen Transkriptionsfaktor und direkte Expression eines Reporter-Gens, dessen Expression sodann untersucht wird. Typische Systeme identifizieren Protein-Protein Wechselwirkungen in vivo durch Rekonstitution eines eukaryontischen Transkriptionsaktivators und sind z.B. in den US-Patenten Nr. 5 955 280, 5 925 523, 5 846 722 und 6 004 746 beschrieben.
Alternativ können Moleküle, welche mit SGP28 Proteinsequenzen wechselwirken, durch Screening von Peptid-Datenbanken identifiziert werden. Bei solchen Verfahren werden Peptide, welche an ausgewählte Rezeptor-Moleküle, wie SGP28, binden, durch Screening von Datenbanken identifiziert, welche ein zufälliges oder geregeltes Sammelsystem (Random – oder Controlled Collection) kodieren. Peptide, welche von den Datenbanken kodiert werden, werden als Fusionsproteine von Bakteriophagen-Hüllproteinen exprimiert, wonach die Bakteriophagen-Partikel im Hinblick auf die interessierenden Rezeptoren gescreent werden. Peptide, welche ein vielfältiges Anwendungsgebiet, wie als therapeutische oder diagnostische Reagenzien, besitzen, können folglich ohne jegliche vorherige Informationen über die Struktur der erwarteten Liganden oder Rezeptor-Moleküle identifiziert werden. Typische Peptid-Datenbanken und Screeningverfahren, welche zur Identifizierung von Molekülen verwendet werden können, welche mit SGP28 Proteinsequenzen wechselwirken, sind z.B. in den US-Patenten Nr. 5 723 286 und 5 733 731 beschrieben.
Alternativ können SGP28 exprimierende Zellinien verwendet werden, um SGP28-vermittelte Protein-Protein Wechselwirkungen zu identifizieren. Diese Möglichkeit kann unter Verwendung von Verfahren der Immunpräzipitation untersucht werden, wie es bereits gezeigt wurde (Hamilton B. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646–51). Typischerweise kann SGP28 unter Verwendung von anti-SGP28 Antikörpern aus SGP28 exprimierenden Prostatakrebs-Zellinien immunpräzipiert werden. Alternativ können Antikörper gegen His-tag in einer zur Expression von SGP28 konstruierten Zelline verwendet werden (oben genannte Vektoren). Der immunpräzipierte Komplex kann durch Verfahren, wie Western-Blotting, ³⁵S-Methionin Labeling von Proteinen, Protein Mikrosequenzierung, Silber-Färbung und zweidimensionale Gelelektrophorese, auf Proteinassoziierung untersucht werden.
Kleine Moleküle (Small Molecules), welche mit SGP28 wechselwirken, können mittels zugehöriger Ausführungsformen solcher Screeningverfahren identifiziert werden. So können beispielsweise kleine Moleküle identifiziert werden, welche mit der SGP28 Funktion interferieren, einschließlich Moleküle, welche mit der Fähigkeit von SGP28 interferieren, an Zellen zu binden und/oder die Tumorbildung, Progression, Migration und/oder Apoptose zu modulieren. Typische Verfahren sind z.B. in dem US-Patent Nr. 5 928 868 beschrieben und umfassen Verfahren zur Bildung von Hybrid-Liganden, bei welchen wenigstens ein Ligand ein kleines Molekül ist. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform wird der Hybrid-Ligand in Zellen eingeführt, welche wiederum einen ersten und einen zweiten Expressionsvektor enthalten. Jeder Expressionsvektor enthält DNA zum Exprimieren eines Hybrid-Proteins, welches ein Target-Protein kodiert, das an eine kodierende Sequenz für ein transkriptionales Modul gebunden ist. Die Zellen enthalten ferner ein Reporter-Gen, dessen Expression abhängig ist von der Nachbarschaft des ersten und des zweiten Hybrid-Proteins zueinander – einem Ereignis, welches nur auftritt, wenn der Hybrid-Ligand an Target-Stellen beider Hybrid-Proteine bindet. Diese Zellen, welche das Reporter-Gen exprimieren, werden ausgewählt, während das unbekannte kleine Molekül oder das unbekannte Hybrid-Protein identifiziert wird.
Eine typische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Screening-Verfahren für ein Molekül, welches mit einer in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenen SGP28 Aminosäuresequenz wechselwirkt, welches die Schritte des Inkontaktbringens einer Population von Molekülen mit der SGP28 Aminosäuresequenz, der Gewährleistung eines Wechselwirkens der Population von Molekülen mit der SGP28 Aminosäuresequenz unter Bedingungen, welche eine Wechselwirkung begünstigen, der Ermittlung des Vorhandenseins eines Moleküls, welches mit der SGP28 Aminosäuresequenz wechselwirkt, und der anschließenden Abtrennung der nicht mit der SGP28 Aminosäuresequenz wechselwirkenden Moleküle von den mit der SGP28 Aminosäuresequenz wechselwirkenden Molekülen umfaßt. Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Verfahren ferner die Reinigung eines Moleküls, welches mit der SGP28 Aminosäuresequenz wechselwirkt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die SGP28 Aminosäuresequenz mit einer Peptid-Datenbank in Kontakt gebracht. Weitere Untersuchungen zur Identifizierung von Molekülen, welche die SGP28 Funktion modulieren, sind in den nachfolgenden Beispielen erläutert.
Behandlungsverfahren und Zusammensetzungen
Die Identifizierung von SGP28 als ein Prostatakrebs-Protein eröffnet eine Mehrzahl an therapeutischen Ansätzen für die Behandlung von Prostatakrebsen. Wie vorstehend erörtert, stellt SGP28 ein sekretiertes Protein dar und spielt seine Wechselwirkung mit anderen Zellen und Molekülen wahrscheinlich eine Rolle bei der Regulierung der Umgebung der Prostata und bei der Initiierung, Entwicklung und/oder Progression von Krebs. SGP28 kann für die Therapie mittels Ansätzen, welche darauf abzielen, die Aktivität des SGP28 Proteins zu inhibieren, die Bindung oder Assoziierung von SGP28 Protein an bzw. mit andere(n) Zellen und Moleküle(n) zu inhibieren, die Transkription oder Translation von SGP28 zu inhibieren, und/oder über die Verwendung von Impstoffen gegen Krebs auf der Basis von SGP28 targetiert werden, Die Behandlungsstrategie kann folglich dahingehend ausgerichtet werden, daß eine Funktion des Moleküls inhibiert oder das SGP28 Molekül selbst targetiert wird.
Das Expressionsprofil von SGP28 erinnert an MAGEs, PSA und PMSA, welche Gewebe-spezifische Gene sind, die in Melanomen und anderen Krebsen überreguliert sind (Van den Eynde und Boon, Int. J. Clin. Lab. Res. 27: 81–86, 1997). Aufgrund ihrer Gewebe-spezifischen Expression und ihrer hohen Expressionsraten in Krebs werden diese Moleküle gegenwärtig als Targets für Impfstoffe gegen Krebs untersucht (Durrant, Anticancer Drugs 8: 727–733, 1997; Reynolds et al., Int. J. Cancer 72: 972–976, 1997). Das Expressionsmuster von SGP28 liefert den Beweis, daß es gleichermaßen ein ideales Target für einen Krebsimpfstoff gegen Prostatakrebs darstellt, da seine Expression in den meisten normalen Geweben nicht festgestellt wird.
Folglich wird von therapeutischen Ansätzen unter Targetierung bestimmter Motive von SGP28, oder welche darauf abzielen, die Aktivität des SGP28 Protein zu inhibieren, erwartet, daß sie für Patienten nützlich sind, die unter Prostatakrebs und anderen SGP28 exprimierenden Krebsen leiden. Die therapeutischen Ansätze, welche darauf abzielen, die Aktivität des SGP28 Proteins zu inhibieren, lassen sich allgemein in zwei Klassen einteilen. Die eine Klasse umfaßt verschiedene Verfahren zur Inhibierung der Bindung oder Assoziierung des SGP28 Proteins an bzw. mit seinen/seinem Bindungspartner oder an bzw. mit andere(n) Proteine(n). Die andere Klasse umfaßt eine Vielfalt an Verfahren zur Inhibierung der Transkription des SGP28 Gens oder der Translation der SGP28 mRNA.
SGP28 als Target für die Behandlung auf der Basis von Antikörpern
Das SGP28 Molekül stellt ein attraktives Target für therapeutische Strategien auf der Basis von Antikörpern dar. Da SGP28 in Krebszellen exprimiert wird, in den meisten normalen Geweben jedoch nicht, wird von einer systemischen Verabreichung von SGP28 immunreaktiven Verbindungen erwartet, daß sie eine exzellente Sensitivität ohne toxische, nicht spezifische und/oder nicht Target-gerichtete Effekte infolge einer Bindung des immuntherapeutischen Moleküls an nicht als Target vorgesehene Organe und Gewebe aufweisen. Spezifisch mit SGP28 reaktive Antikörper können nützlich sein zur systemischen Behandlung von SGP28 exprimierenden Krebsen, entweder als Konjugate mit einer Toxin oder einem therapeutischen Mittel oder als nackte Antikörper, welche in der Lage sind, die Wechselwirkung von SGP28 mit seinem Bindungspartner zu inhibieren.
SGP28 Antikörper können in einen Patienten eingeführt werden, so daß der Antikörper an SGP28 bindet und die SGP28 Funktion in dem Primärtumor, in zirkulierenden Mikrometastasen und/oder in gebildeten Metastasen unterbindet. Der Grad an Vaskularisation des Tumors kann als Richtlinie dienen, welche Verabreichung empfohlen wird. Auf ähnliche Weise wird von dem Grad und/oder dem Stadium der Krankheit erwartet, in dieser Hinsicht nützliche Informationen zu liefern. So kann es z.B. bei einem hochgradigeren, fortgeschritteneren Tumor wahrscheinlicher sein, daß er Metastasen verbreitet, so daß eine systemische Verabreichung empfohlen wird, um den Ausbruch von Metastasen zu behandeln oder zu verhindern.
Eine Immuntherapie gegen Krebs unter Verwendung von anti-SGP28 Antikörpern kann gemäß der Anleitung einer Vielzahl von Ansätzen geschehen, welche bei der Behandlung von anderen Krebsarten erfolgreich eingesetzt werden, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – Darmkrebs (Arten et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133–138), multiples Myelom (Kahler-Krankheit) (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179–3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437–2444), Magenkrebs (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771–2776), B-Zell-Lymphom (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93–101), Leukämie (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581–589), kolorektales Karzinom (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54: 6160–6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55: 4398–4403) und Brustkrebs (Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11: 117–127). Einige therapeutischen Ansätze umfassen die Konjugation von nackten Antikörpern mit einem Toxin, wie die Konjugation von ¹³¹J mit anti-CD20 Antikörpern (z.B. Bexxar, Coulter Pharmaceutical), während andere die gleichzeitige Verabreichung von Antikörpern mit anderen therapeutischen Verbindungen umfassen, wie Herceptin^TM (Trastuzumab) mit Paclitaxel (Genentech, Inc.). Für die Behandlung von Prostatakrebs können beispielsweise SGP28 Antikörper in Verbindung mit Bestrahlung, Chemotherapie oder Hormonablation verabreicht werden.
Obgleich die SGP28 Antikörpertherapie für alle Stadien von Krebs nützlich sein kann, kann die Antikörpertherapie in besonderem Maße bei fortgeschrittenen oder metastatisierten Krebsen angezeigt sein. Eine Behandlung auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Antikörpertherapie kann insbesondere für Patienten angezeigt sein, die bereits ein- oder mehrfach eine Chemotherapie erhalten haben, während eine Kombination der erfindungsgemäßen Antikörpertherapie mit einer Chemotherapie oder Bestrahlung bei Patienten bevorzugt sein kann, die noch keine chemotherapeutische Behandlung erhalten haben. Ferner kann die Antikörpertherapie eine geringere Dosierung der begleitenden Chemotherapie ermöglichen, insbesondere bei Patienten, welche die Toxizität des chemotherapeutischen Mittels nicht gut vertragen.
Bei manchen Krebspatienten kann es erwünscht sein, daß sie auf das Vorhandensein und die Rate an SGP28 Expression evaluiert werden, was vorzugsweise unter Verwendung von immunhistochemischen Bewertungen von Tumorgewebe, quantitativem SGP28 Imaging oder anderen Techniken geschehen kann, welche in der Lage sind, das Vorhandensein und die Rate an SGP28 Expression zuverlässig anzuzeigen. Immunhistochemische Analysen von Tumorbiopsien können zu diesem Zweck bevorzugt sein. Verfahren zur immunhistochemischen Analyse von Tumorgewebe sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Anti-SGP28 monoklonale Antikörper, welche bei der Behandlung von Prostatakrebs und anderen Krebsen nützlich sind, umfassen solche, welche in der Lage sind, eine wirksame Immunantwort gegen den Tumor zu initiieren, und solche, welche in der Lage sind, direkt zytotoxisch zu wirken. In diesem Zusammenhang können anti-SGP28 monoklonale Antikörper (mAbs) eine Tumorzellyse entweder durch den Mechanismus der lokalen Initiierung der Komplementkaskade (Complement-mediated Cell Cytotoxicity) oder der Rekrutierung von Effektorzellen (Antibody-dependent Cell Cytotoxicity, ADCC) auslösen, welche beide einen intakten Fc-Teil des Immunglobulinmoleküls für die Wechselwirkung mit Effektorzellen Fc-Rezeptorstellen oder komplementären Proteinen erfordern. Ferner sind anti-SGP28 mAbs, welche einen direkten biologischen Effekt auf das Tumorwachstum ausüben, in der Ausführung der Erfindung nützlich. Potentielle Mechanismen, in welchen solche direkt zytotoxischen mAbs wirken können, können die Inhibierung von Zellwachstum, die Modulation von zellulärer Differenzierung, die Modulation von Profilen von Tumorangionese-Faktoren und die Induzierung von Apoptose umfassen. Die Mechanismen, durch welche ein bestimmter anti-SGP28 mAb einen anti-tumoralen Effekt ausübt, können unter Verwendung einer beliebigen Anzahl an in vitro Untersuchungen, welche zur Ermittlung von ADCC, ADMMC, lokaler Initiierung der Komplementkaskade (Complement-mediated Cell Cytotoxicity) usw. geeignet sind, evaluiert werden, wie es aus dem Stand der Technik allgemein bekannt ist.
Die Verwendung von murinen (Maus) oder nicht menschlichen monoklonalen Antikörpern oder menschlich/murinen chimären mAbs können bei einigen Patienten mäßige bis starke Immunantworten hervorrufen. In einigen Fällen kann dies zu einer Verhinderung der Zirkulation des Antikörpers und zu einer verminderten Wirksamkeit führen. In den meisten schweren Fällen kann eine solche Immunantwort zu einer extensiven Bildung von Immunkomplexen führen, welche gegebenenfalls ein Nierenversagen verursachen können. Folglich sind bevorzugte monoklonale Antikörper zur Verwendung in der Praxis der erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren solche, welche entweder gänzlich menschlich oder humanisiert sind und welche spezifisch an das Target SGP28 Antigen mit hoher Affinität binden, jedoch eine geringe oder gar keine Antigenität in dem Patienten zeigen.
Erfindungsgemäße Behandlungsverfahren ziehen sowohl die Verabreichung eines einzigen anti-SGP28 mAbs als auch von Kombinationen oder Cocktails verschiedener mAbs in Erwägung. Solche mAb Cocktails können insofern bestimmte Vor teile besitzen, als sie mAbs enthalten, welche verschiedene Epitope targetieren, verschiedene Effektormechanismen ausnutzen oder direkt zytotoxische mAbs mit mAbs, welche auf die Funktionalität von Immuneffektoren angewiesen sind, kombinieren. Solche mAbs in Kombination können synergistische therapeutische Wirkungen entfalten. Ferner kann die Verabreichung von anti-SGP28 mAbs mit anderen therapeutischen Mitteln kombiniert werden, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – verschiedene chemotherapeutische Mittel, Androgen-Blocker und Immunmodulatoren (z.B. IL-2, GM-CSF). Die anti-SGP28 mAbs können in ihre "nackten" oder unkonjugierten Form verabreicht werden oder können therapeutische Mittel aufweisen, welche zu ihnen konjugiert sind.
Die anti-SGP28 Antikörper-Formulierungen können auf einem beliebigen Weg verabreicht werden, welcher in der Lage ist, die Antikörper an die Stelle des Tumors zu bringen. Potentiell wirksame Wege umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – die intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intratumorale, intradermale Verabreichung und dergleichen. Die Behandlung umfaßt im allgemeinen eine wiederholte Verabreichung der SGP28 Antikörper-Zusammensetzung auf einem akzeptablen Verabreichungsweg, wie intravenöse Injektion (IV), wobei typischerweise eine Dosierung im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht eingestellt wird. Dosen im Bereich von 10 bis 500 mg mAb pro Woche können wirksam und gut verträglich sein.
Auf der Grundlage der klinischen Erfahrung mit dem Herceptin mAb bei der Behandlung von metastatischem Brustkrebs kann eine anfängliche Initialdosis von etwa 4 mg/kg Körpergewicht des Patienten IV und anschließende wöchentliche Dosen von etwa 2 mg/kg IV der anti-SGP28 mAb-Zusammen setzung einen akzeptablen Dosisplan darstellen. Vorzugsweise wird die anfängliche Initialdosis als 90 minütige oder längere Infusion verabreicht. Die periodische Erhaltungsdosis kann als 30 minütige oder längere Infusion verabreicht werden, vorausgesetzt, die Initialdosis war gut verträglich. Indes ist dem Fachmann bewußt, daß verschiedene Faktoren den idealen Dosisplan im Einzelfall beeinflussen. Solche Faktoren können beispielsweise die Bindungsaffinität und die Halbwertzeit der eingesetzten Ab oder mAbs, die Rate an SGP28 Expression in dem Patient, die Menge an zirkulierendem Shed-SGP28 Antigen, das gewünschte Fließgleichgewicht (Steady State) des Konzentrationsniveaus der Antikörper, die Behandlungshäufigkeit und der Einfluß von chemotherapeutischen Mitteln, welche in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren eingesetzt werden, darstellen.
Optimalerweise sollten Patienten auf das Niveau an zirkulierendem Shed-SGP28 Antigen im Serum untersucht werden, um bei der Ermittlung des wirksamsten Dosisplans und zugehöriger Faktoren zu helfen. Solche Untersuchungen können auch zu Überwachungszwecken während der gesamten Behandlung verwendet werden und nützlich sein, um den Behandlungserfolg in Verbindung mit der Evaluierung weiterer Parameter (wie Serumniveaus an PSA bei der Behandlung von Prostatakrebs) zu beurteilen.
Inhibierung der SGP28 Proteinfunktion
Die Erfindung betrifft verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung der Bindung von SGP28 an seinen Bindungspartner oder Liganden oder der Assoziation mit einem anderen Protein/mit anderen Proteinen sowie Verfahren zur Inhibierung der SGP28 Funktion.
Inhibierung von SGP28 mit rekombinanten Proteinen
Gemäß einem Ansatz werden rekombinante Moleküle, welche in der Lage sind, an SGP28 zu binden und dabei zu verhindern, daß SGP28 an seine(n) Bindungspartner angreift/bindet oder mit (einem) anderen Protein(en) assoziiert, zur Inhibierung der SGP28 Funktion verwendet. Solche rekombinanten Moleküle können beispielsweise den/die reaktiven Teil (e) eines SGP28-spezifischen Antikörpermoleküls enthalten. Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann die SGP28 Bindungsdomäne eines SGP28 Bindungspartners in ein dimäres Fusionsprotein konstruiert werden, welches zwei SGP28 Liganden-Bindungsdomänen enthält, welche an den Fc-Abschnitt von menschlichem IgG, wie menschlichem IgG1, gebunden sind. Solche IgG-Abschnitte können z.B. die C_H2 und C_H3 Domänen sowie die Scharnier-Region, jedoch nicht die C_H1 Domäne enthalten. Solche dimären Fusionsproteine können Patienten, die an einem mit der Expression von SGP28 in Verbindung stehenden Krebs leiden, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – Prostatakrebs, in löslicher Form verabreicht werden, wobei das dimäre Fusionsprotein spezifisch an SGP28 bindet und dabei die Wechselwirkung von SGP28 mit einem Bindungspartner abblockt. Solche dimären Fusionsproteine können des weiteren unter Verwendung von bekannten Techniken zur Verbindung von Antikörpern zu multimeren Proteinen kombiniert werden.
Inhibierung von SGP28 mit intrazellulären Antikörpern
Gemäß einem weiteren Ansatz können rekombinante Vektoren, welche einkettige Antikörper kodieren, die spezifisch an SGP28 binden, mittels Gentransfertechniken in SGP28 exprimierende Zellen eingeführt werden, wobei der kodierte einkettige anti-SGP28 Antikörper intrazellulär exprimiert wird, an SGP28 Protein bindet und dabei dessen Funktion inhibiert. Verfahren zur Konstruktion solcher in trazellulärer einkettiger Antikörper sind wohlbekannt. Solche auch als "Intrakörper" bezeichneten intrazellulären Antikörper können spezifisch auf ein bestimmtes Kompartiment im Innern der Zelle targetiert werden, so daß sie dort für eine Kontrolle sorgen, wo die inhibitorische Aktivität der Behandlung fokussiert wird. Diese Technik wurde im Stand der Technik erfolgreich eingesetzt (vgl. Richardson und Marasco, 1995, TIBTECH Vol. 13). Es wurde bei Intrakörpern gezeigt, daß sie die Expression von anderweitig vorhandenen Zell-Oberflächenfaktoren virtuell eliminieren (vgl. z.B. Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137–3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931–23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332–337).
Einkettige Antikörper enthalten die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten, welche über ein flexibles Linker-Polypeptid verbunden sind, und werden als ein einziges Polypeptid exprimiert. Optional können einkettige Antikörper als ein einkettiges Fragment der variablen Region, welches mit der konstanten Region der leichten Kette verbunden ist, exprimiert werden. Wohlbekannte intrazelluläre Trafficking-Signale können in rekombinante Polynukleotid-Vektoren, welche solche einkettigen Antikörper kodieren, konstruiert werden, um den exprimierten Intrakörper präzise an das gewünschte intrazelluläre Kompartiment zu targetieren. So können z.B. Intrakörper konstruiert werden, welche an das endoplasmatische Retikulum (ER) targetiert sind, um ein Leader-Peptid und gegebenenfalls ein C-terminales ER Retentionssignal, wie das KDEL Aminosäuremotiv, zu enthalten. Zur Ausübung von Aktivität im Zellkern (Nukleus) vorgesehene Intrakörper können so konstruiert werden, daß sie ein Kern-Lokalisierungssignal enthalten. Flüssige Anteile können den Intrakörpern angefügt werden, um den Intrakörper an die zytosolische Seite der Plasmamembran anzubinden. Ferner können Intrakörper zur Ausübung einer Funk tion im Zytosol targetiert werden. So können beispielsweise zytosolische Antikörper verwendet werden, um Faktoren im Innern des Zytosols abzusondern und dabei zu verhindern, daß sie an ihren natürlichen Ort in der Zelle transportiert werden.
Gemäß einer Ausführungsform werden SGP28 Intrakörper so konstruiert, daß sie spezifisch an eine bestimmte SGP28 Domäne binden. So können beispielsweise zytosolische Antikörper, welche spezifisch an das SGP28 Protein binden, verwendet werden, um SGP28-zugehörige Moleküle vor einem Zutritt in den Zellkern zu bewahren und diesen dabei vor der Ausübung jeglicher biologischer Aktivität im Innern des Zellkerns zu bewahren.
Um die Expression solcher Intrakörper spezifisch auf bestimmte Tumorzellen zu richten, kann die Transkription des Intrakörpers unter die regulatorische Kontrolle (Regulatory Control) eines geeignete Tumor-spezifischen Promotors oder Enhancers gestellt werden. Um die Expression von Intrakörpern spezifisch auf die Prostata zu targetieren, kann z.B. der PSA Promotor und/oder Promotor/Enhancer verwendet werden (vgl. z.B. das US-Patent Nr. 5 919 652).
Inhibierung der SGP28 Transkription oder Translation
Gemäß einer weiteren Gruppe von therapeutischen Ansätzen stellt die Erfindung verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung der Transkription des SGP28 Gens zur Verfügung. Auf ähnliche Weise liefert die Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung der Translation von SGP28 mRNA in das Protein.
Gemäß einem Ansatz umfaßt ein Verfahren zur Inhibierung der Transkription des SGP28 Gens das Inkontaktbringen des SGP28 Gens mit einem SGP28 Antisense-Polynukleotid. Gemäß einem weiteren Ansatz umfaßt ein Verfahren zum Inhibieren der SGP28 mRNA Translation das Inkontaktbringen der SGP28 mRNA mit einem Antisense-Polynukleotid. Gemäß einem anderen Ansatz wird ein SGP28-spezifisches Ribozym verwendet, um die SGP28 Message zu spalten und somit die Translation zu inhiieren. Solche Verfahren auf der Basis von Antisense-Molekülen und Ribozymen können auch auf regulatorische Regionen des SGP28 Gens, wie die SGP28 Promotor- und/oder Enhancerelemente, gerichtet werden. Auf ähnliche Weise können Proteine, welche zur Inhibierung eines SGP28 Gen-Transkriptionsfaktors in der Lage sind, zur Inhibierung der SGP28 mRNA Transkription verwendet werden. Die für die vorgenannten Verfahren nützlichen verschiedenen Polynukleotide und Zusammensetzungen sind weiter oben beschrieben. Die Verwendung von Antisense- und Ribozym-Molekülen zur Inhibierung der Transkription und Translation sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Weitere Faktoren, welche die Transkription von SGP28 durch Wechselwirkung mit einer SGP28 transkriptorischen Aktivierung inhibieren, können ebenfalls für die Behandlung von SGP28 exprimierenden Krebsen nützlich sein. Auf ähnliche Weise können Faktoren, welche in der Lage sind, mit dem SGP28 Prozeß zu interferieren, für die Behandlung von SGP28 exprimierenden Krebsen nützlich sein. Behandlungsverfahren für Krebs, welche sich solcher Faktoren bedienen, fallen ebenfalls in den Schutzbereich der Erfindung.
Allgemeine Betrachtungen für Behandlungsstrategien
Die Techniken des Gentransfers und der Gentherapie können verwendet werden, um therapeutische Polynukleotidmoleküle an Tumorzellen zu überliefern, welche SGP28 synthetisieren (z.B. Antisense-Moleküle, Ribozyme, Polynukleoti de, welche Intrakörper und andere SGP28 inhibierende Moleküle kodieren). Eine Mehrzahl an Ansätzen zur Gentherapie ist aus dem Stand der Technik bekannt. Rekombinante Vektoren, welche SGP28 Antisense-Polynukleotide, Ribozyme, zum Interferieren mit der SGP28 Transkription fähige Faktoren usw. kodieren, können unter Verwendung solcher gentherapeutischen Ansätze an die Target-Tumorzellen überliefert werden.
Die vorgenannten therapeutischen Ansätze können mit einem beliebigen aus einer breiten Vielfalt an chemotherapeutischen Behandlungsverfahren oder Bestrahlungsverfahren kombiniert werden. Diese therapeutischen Verfahren können ferner den Einsatz von verminderten Dosen chemotherapeutischer Mittel und/oder eine weniger häufige Verabreichung ermöglichen, insbesondere bei Patienten, welche die Toxizität der chemotherapeutischen Mittel nicht gut vertragen.
Die anti-tumorale Aktivität einer bestimmten Zusammensetzung (z.B. Antisense-Moleküle, Ribozyme, Intrakörper) oder einer Kombination solcher Zusammensetzungen kann unter Verwendung verschiedener in vitro und in vivo Untersuchungsverfahren evaluiert werden. In vitro Untersuchungen zur Evaluierung des therapeutischen Leistungsvermögens umfassen Zellwachstumsuntersuchungen, Soft-Agar-Untersuchungen und andere Untersuchungen, welche hinsichtlich Tumor-fördernder Aktivität indikativ sind, Bindungsuntersuchungen, welche in der Lage sind, das Ausmaß festzustellen, in welchem eine therapeutische Zusammensetzung die Bindung von SGP28 an einen Bindungspartner inhibiert, etc.
In vivo läßt sich die Wirkung einer SGP28 therapeutischen Zusammensetzung in einem geeignete Tiermodell evaluieren. So sind beispielsweise xenogene Prostatakrebs-Mo delle, bei welchen menschliche Prostatakrebs-Explantate oder passagierte Heterotransplantat-Gewebe in immunsupprimierte Tiere, wie Nackt- oder SCID-Mäuse, eingeführt werden, in Bezug auf Prostatakrebs geeignet und bereits beschrieben (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402–408). Die am 23. April 1998 veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 98/16628 von Sawyers et al. beschreibt verschiedene Heterotransplantat-Modelle von menschlichem Prostatakrebs, welche in der Lage sind, die Entwicklung von Primärtumoren, Mikrometastasen und die Bildung von osteoblastischen Metastasen, wie sie für ein spätes Stadium der Krankheit charakteristisch sind, zu rekapitulieren. Die Wirksamkeit kann unter Verwendung von Untersuchungen vorhergesagt werden, welche die Inhibierung der Tumorbildung, Tumorrückbildung oder Metastatisierung und dergleichen messen (vgl. auch die Beispiele weiter unten).
In vivo Untersuchungen zur Bestimmung der Promotion von Apoptose können bei der Evaluierung von potentiell therapeutischen Zusammensetzungen ebenfalls nützlich sein. Gemäß einer Ausführungsform können Heterotransplantate von Träger-Mausen, welche mit der therapeutischen Zusammensetzung behandelt worden sind, auf ein Vorhandensein von apoptotischen Fukussen untersucht und mit unbehandelten, Heterotransplantat tragenden Mäusen zur Kontrolle verglichen werden. Das Ausmaß, in welchem apoptotische Fokusse in den Tumoren der behandelten Mäusen aufgefunden werden, liefert einen Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit der Zusammensetzung.
Die in der Praxis verwendeten therapeutischen Zusammensetzungen der vorgenannten Verfahren können in pharmazeutischen Zusammensetzungen einschließlich Impfstoff-Zusammensetzungen formuliert werden, welche einen für die ge wünschte Zuführung geeigneten Träger aufweisen. Geeignete Träger umfassen beliebige Materialien, welche bei Kombination mit der therapeutischen Zusammensetzung die anti-tumorale Funktion der therapeutischen Zusammensetzung erhalten und mit dem Immunsystem des Patienten nicht reaktiv sind. Beispiele umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – beliebige aus einer Mehrzahl an pharmazeutischen Standard-Trägern, wie sterile Phosphat-gepufferte Salzlösungen, bakteriostatisches Wasser und dergleichen (vgl. allgemein Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th Edition, A. Osal, Hrsg., 1980).
Therapeutische Formulierungen können gelöst und auf einem beliebigen Weg verabreicht werden, welcher in der Lage ist, die therapeutische Zusammensetzung an die Stelle des Tumors zu überliefern. Potentiell wirksame Verabreichungswege umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – intravenöse, parenterale, intraperitoneale, intramuskuläre, intratumorale, intradermale, intraorganische, orthotope Verabreichung und dergleichen. Eine bevorzugte Formulierung zur intravenösen Injektion enthält die therapeutische Zusammensetzung in einer Lösung aus konserviertem bakteriostatischem Wasser, sterilem unkonserviertem Wasser und/oder verdünnt in Polyvinylchlorid- oder Polyethylen-Beutel mit 0,9% sterilem Natriumchlorid für die Injektion, USP. Therapeutische Protein-Zusammensetzungen können lyophilisiert und als sterile Pulver, vorzugsweise unter Valuum, auf Vorrat gehalten und sodann vor der Injektion in bakteriostatischem Wasser, welches z.B. Konservierungsmittel in Form von Benzylalkohol enthält, oder in sterilem Wasser wieder hergestellt werden.
Die Dosierungen und Verabreichungsprotokolle für die Behandlung von Krebs unter Verwendung der vorgenannten Ver fahren variieren mit dem jeweiligen Verfahren und dem anvisierten Krebs und hängen allgemein von einer Mehrzahl an anderen Faktoren ab, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Impfstoffe gegen Krebs
Die Erfindung betrifft ferner Impfstoffe gegen Krebs, welche sowohl ein SGP28 Protein oder Fragment desselben als auch DNA basierte Impfstoffe enthalten. Hinsichtlich einer auf die Prostata und auf Tumoren beschränkten Expression von SGP28 wird von SGP28 Impfstoffen gegen Krebs erwartet, daß sie bei der spezifischen Prävention und/oder Behandlung von SGP28 exprimierenden Krebsen wirksam sind, ohne unspezifische Wirkungen auf nicht targetierte Gewebe zu entfalten. Die Verwendung eines Tumor-Antigens in einem Impfstoff zur Erzeugung von humoraler und Zellvermittelter Immunität zum Einsatz in der Anti-Krebstherapie ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt und bereits unter Verwendung von menschlichem PSMA und rodenten (Nager) Immunogenen auf Prostatakrebs angewandt worden (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231–237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113–3117). Solche Verfahren können auf einfache Weise unter Einsatz eines SGP28 Proteins oder Fragmentes desselben oder eines SGP28 kodierenden Nukleinsäuremoleküls und rekombinanter Vektoren, welche in der Lage sind, das SGP28 Immunogen zu exprimieren und in geeigneter Weise zur Verfügung zu stellen, praktiziert werden.
So können beispielsweise virale Gentransfersysteme verwendet werden, um ein SGP28 kodierendes Nukleinsäuremolekül zu überliefern. Verschiedene virale Gentransfersysteme, welche in der Anwendung dieses Aspektes der Erfindung verwendet werden können, umfassen – wenn auch nicht ausschließlich – Vaccinia, Fowlpox, Canarypox, Adenovirus, In fluenza, Poliovirus, Adeno-assoziierte Viren, Lentivirus und Sindbus Virus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658–663). Nicht vitale Transfersysteme können ebenfalls eingesetzt werden, indem nackte DNA, welche ein SGP28 Protein oder Fragment desselben kodiert, verwendet und in den Patient (z.B. intramuskulär) eingeführt wird, um eine antitumorale Antwort hervorzurufen. Gemäß einer Ausführungsform wird die menschliche SGP28 cDNA in voller Länge eingesetzt.
Gemäß einer Ausführungsform basiert ein SGP28 Impfstoff gegen Krebs auf der Identifizierung von immunogenen Peptiden in der in Tabelle 2 (SEQ ID Nr. 3) wiedergegebenen SGP28 Aminosäuresequenz. Wie in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert, wurde von SGP28 gezeigt, daß es eine T- und B-Zellantwort induziert. Ein rekombinantes HIS-tagged Protein, welches das offene Leseraster (ORF) von SGP28 (Tabelle 2, SEQ ID Nr. 3) enthält, wurde bereits verwendet, um eine Immunantwort in Mäusen für die Produktion monoklonaler Antikörper hervorzurufen. Die Aminosäuren 93–107 von SGP28 (CNYRHSNPKDRMTSL; SEQ ID Nr. 27) wurden bereits verwendet, um eine Immunantwort in Kaninchen für die Produktion polyklonaler Antikörper hervorzurufen. Folglich können spezifische Teile von SGP28 sowie von Polynukleotiden, welche diese Teile kodieren, zur Produktion eines Impfstoffes gegen Krebs ausgewählt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können SGP28 Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden, welche spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Epitope kodieren. CTL Epitope können unter Verwendung von spezifischen Algorithmen (z.B. Epimer, Brown University) ermittelt werden, um Peptide innerhalb eines SGP28 Proteins zu identifizieren, welche in der Lage sind, optimal an vorgegebene HLA Allele zu binden. Einen geeigneten Algorithmus stellt der HLA Peptidmo tiv-Suchalgorithmus (HLA Peptide Motif Search Algorithm) dar, welcher auf der Internetseite (http://bimas.dcrt.nih.gov/) der Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) verfügbar ist. Der Algorithmus basiert auf der Bindung von spezifischen Peptidsequenzen in der Bindungsgrube von HLA Klasse I-Molekülen und insbesondere von HLA-A2 (Falk et al., 1991, Nature 351: 290–6; Hunt et al., 1992, Science 255: 1261–3; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149: 3580–7; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152: 163–75). Der HLA Peptidmotiv-Suchalgorithmus ermöglicht die Identifizierung und Rangfolge von 8-mer, 9-mer und 10-mer Peptiden aus einer vollständigen Proteinsequenz für eine vorhergesagte Bindung an HLA-A2 sowie an andere Klasse 1-Moleküle. Die meisten HLA-A2 Bindungspeptide sind 9-mere, welche vorteilhafterweise ein Leucin an Position 2 und ein Valin oder ein Leucin an Position 9 enthalten (Parker et al., 1992, J. Immunol. 149: 3580–7). Eine tatsächliche Bindung von Peptiden an HLA-A2 kann durch Stabilisierung der HLA-A2 Expression an der Antigenprozessierungs-defekten Zellinie T2 evaluiert werden (Xue et al., 1997, Prostate 30: 73–8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36: 129–38). Eine Immunogenität von spezifischen Pepiden kann durch in vitro Stimulation von CD8+ CTL in Gegenwart von dendritischen Zellen evaluiert werden (Xue et al., Peshwa et al., s.o.).
Spezifische SGP28 Peptide, von welchen vorhergesagt wird, daß sie HLA-A2 binden, und welche vorzugsweise in Impfstoffen gegen Krebs verwendet werden, umfassen Peptide, welche mit den Aminosäuren 2–10 (TLFPVLLFL; SEQ ID Nr. 17) korrespondieren, die Aminosäuren 6–14 (VLLFLVAGL; SEQ ID Nr. 18), die Aminosäuren 30–38 (ALLTTQTQV; SEQ ID Nr. 19), die Aminosäuren 142–150 (VVXWSSYLN; SEQ ID Nr. 20), die Aminosäuren 222–230 (TLTCKHQLV; SEQ ID Nr. 21), die Aminosäuren 175–183 (GNWANRLYV; SEQ ID Nr. 22), die Aminosäuren 7–15 (LLFLVAGLL; SEQ ID Nr. 23), die Aminosäuren 141– 149 (QWWYSSYL; SEQ ID Nr. 24), die Aminosäuren 134–142 (AWGHYTQV; SEQ ID Nr. 25) und die Aminosäuren 211–219 (DLYSNCKSL; SEQ ID Nr. 26) der in Tabelle 2 dargestellten SGP28 Proteinsequenz.
Desgleichen können verschiedene ex vivo Strategien eingesetzt werden. Ein Ansatz umfaßt die Verwendung von dendritischen Zellen, um ein SGP28 Antigen dem Immunsystem eines Patienten zu präsentieren. Dendritische Zellen exprimieren MHC Klasse I und II, B7 Co-Stimulator und IL-12 und stellen folglich hoch spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen dar. Auf dem Gebiet von Prostatakrebs werden autologe dendritische Zellen, welche mit Peptiden des Prostata-spezifischen Membran-Antigens (PSMA) gepulst sind, in einem klinischen Phase I-Test verwendet, um das Immunsystem von unter Prostatakrebs leidenden Patienten zu stimulieren (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65–69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371–380). Dendritische Zellen können verwendet werden, um SGP28 Pepetide T-Zellen im Zusammenhang mit MHC Klasse I- und Klasse II-Molekülen zu präsentieren. Gemäß einer Ausführungsform werden autologe dendritische Zellen mit SGP28 Peptiden gepulst, welche in der Lage sind, an MHC-Moleküle zu binden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden autologe dendritische Zellen mit dem vollständigen SGP28 Protein gepulst. Eine weitere Ausführungsform umfaßt eine Konstruktion der Über-Expression des SGP28 Gens in dendritische Zellen unter Verwendung von verschiedenen aus dem Stand der Technik bekannten implementierenden Vektoren, wie Adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17–25), Retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763–3770), Lentivirus, Adeno-assoziierte Viren, DNA Transfektion (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865–2869) und Tumor-abgeleitete RNA Transfektion (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177–1182). SGP28 exprimierende Zellen können ferner zur Expression von Im munmodulatoren, wie GM-CSF, konstruiert und als Immunisierungsmittel verwendet werden.
Anti-idiotypische anti-SGP28 Antikörper können auch in der Anti-Krebstherapie als ein Impfstoff zum Induzieren einer Immunantwort an SGP28 exprimierende Zellen verwendet werden. Insbesondere die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt und kann auf einfache Weise an die Erzeugung von anti-idiotypischen anti-SGP28 Antikörpern angepaßt werden, welche ein Epitop an einem SGP28 Protein imitieren (vgl. z.B. Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33–40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 334–342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother 43: 65–76). Ein solcher anti-idiotypischer Antikörper kann in Impfstoffstrategien gegen Krebs verwendet werden.
Es können genetische Immunsierungsverfahren eingesetzt werden, um prophylaktische oder therapeutische, humorale und zelluläre Immunantworten zu erzeugen, welche gegen SGP28 exprimierende Krebszellen gerichtet sind. Konstrukte umfassen DNA, welche ein SGP28 Protein/Immunogen kodiert, wobei geeignete regulatorische Sequenzen direkt in den Muskel oder die Haut eines Individuums injiziert werden können, so daß die Zellen des Muskels oder der Haut das Konstrukt aufnehmen und das kodierte SGP28 Protein/Immunogen exprimieren. Die Expression des SGP28 Proteins/Immunogens führt zur Erzeugung von prophylaktischer oder therapeutischer, humoraler und zellulärer Immunität gegenüber Prostatakrebs und anderen SGP28 exprimierenden Krebsen. Es können verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte prophylaktische und therapeutische Immunsierungstechniken verwendet werden (vgl. die Informationen und Fundstellen, welche un ter der Internetadresse www.genweb.com veröffentlicht sind).
Diagnostische Zusammensetzungen und Packungen
Im Hinblick auf eine Verwendung in den oben beschriebenen oder vorgeschlagenen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen stellt die Erfindung Packungen (Kits) zur Verfügung. Solche Packungen (Kits) können ein unterteiltes Tragmittel umfassen, um unter dichtem Halt ein oder mehrere Behältermittel, wie Fläschchen bzw. Vials, Röhrchen und dergleichen, aufzunehmen, wobei jedes der Behältermittel eines der in dem Verfahren verwendeten, separaten Elemente aufweist. So kann beispielsweise eines der Behältermittel eine Probe aufweisen, welche detektierbar gelabelt ist oder werden kann. Eine solche Probe kann ein für ein SGP28 Protein bzw. ein SGP28 Gen oder eine Message spezifischer/spezifisches Antikörper oder Polynukleotid sein. Sofern die Packung (Kit) von einer Nukleinsäurehybridisierung Gebrauch macht, um die Target-Nukleinsäure festzustellen, kann die Packung (Kit) auch Behälter, welche (ein) Nukleotid(e) zur Amplifikation der Target-Nukleinsäuresequenz enthalten, und/oder einen Behälter umfassen, welcher ein Reporter-Mittel, wie ein Biotin-Bindungsprotein, wie Avidin oder Streptavidin, enthält, welches an ein Reporter-Molekül, wie ein enzymatisches, fluoreszentes oder radioisotopisches Label, gebunden ist.
Die erfindungsgemäße Packung (Kit) umfaßt typischerweise den vorgenannten Behälter sowie einen oder mehrere weitere Behälter, welche von kommerzieller Seite und seitens des Benutzers erwünschte Materialien enthalten, einschließlich Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anweisungen zum Gebrauch. Der Behälter kann mit einem Etikett versehen sein, um anzu zeigen, daß die Zusammensetzung für eine spezielle Therapie oder eine nicht therapeutische Anwendung verwendet wird, wobei es ferner auf eine Verwendung in vivo oder in vitro hinweisen kann, wie es weiter oben beschrieben ist.
Die Erfindung betrifft folglich auch diagnostische Zusammensetzungen, welche SGP28-zugehörige Moleküle enthalten. Solche Moleküle umfassen die verschiedenen vorliegend beschriebenen SGP28 Polynukleotide, Primer, Proben, Proteine, Fragmente und Antikörper. Die in der diagnostischen Zusammensetzung enthaltenen Moleküle können gegebenenfalls mit einem detektierbaren Marker gelabelt sein. Die SGP28 diagnostischen Zusammensetzungen können ferner je nach Wunsch geeignete Puffer, Verdünnungsmittel und andere Inhaltsstoffe umfassen.
BEISPIELE
Nachstehend sind verschiedene Aspekte der Erfindung anhand von mehreren Ausführungsbeispielen, von welchen keines als die Erfindung beschränkend aufgefaßt werden darf, näher erläutert und veranschaulicht.
Beispiel 1: SSH-generierte Isolierung des cDNA-Fragmentes des SGP28 Gens
Material und Methoden
LAPC Heterotransplantate
LAPC Heterotransplantate (Xenotransplantate) wurden von Dr. Charles Sawyers (UCLA) bezogen und wie beschrieben (Klein et al., 1997, Nature Med. 3: 402–408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030–5036) erhalten. Androgen-abhängige und -unabhängige LAPC-4 Heterotransplantate (LAPC-4 AD bzw. AI) und LAPC-9 Heterotransplantate (LAPC-9 AD bzw. AI) wurden jeweils in intakten männlichen SCID-Mäusen und in kastrierten Männchen gezüchtet und als kleine Gewebestücke in Empfänger-Männchen passagiert. Die LAPC-4 AI Heterotransplantate wurden aus LAPC-4 AD Tumoren erhalten, während die LAPC-9 AI Heterotransplantate aus LAPC-9 AD Tumoren erhalten wurden. Um die AI Heterotransplantate zu erzeugen, wurden LAPC AD Tumore aufweisende männliche Mäuse kastriert und über zwei bis drei Monate hinweg gehalten. Nachdem die LAPC Tumoren wieder gewachsen waren, wurden die Tumore entnommen und in kastrierte männliche oder in weibliche SCID-Mäuse passagiert.
Die LAPC-4 AD Heterotransplantate wurden wie folgt intratibial gezüchtet. Das subkutan gewachsene LAPC-4 AD Heterotransplantat-Tumorgewebe wurde in 1–2 mm³ Segmente zerteilt, während das Gewebe in 1 × Isocove'sches Medium getaucht wurde, das zerteilte Gewebe wurde anschließend mit 1,3 K U/min 4 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wurde in 10 ml eiskaltem Isocove'schem Medium resuspendiert und mit 1,3 K U/min 4 Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wurde sodann in 1 × Isocove mit 1% Pronase E resuspendiert und 20 min lang unter sanften Schwenkbewegungen bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Inkubation auf Eis über 2 bis 4 Minuten. Das Filtrat wurde mit 1,3 K U/min 4 Minuten lang zentrifugiert und die Pronase wurde von dem abgesaugten Niederschlag durch Resuspendieren in 10 ml Isocove und erneutem Zentrifugieren abgetrennt. Anschließend wurden Zellklumpen in PrEGM Medium ausplattiert und über Nacht gezüchtet. Die Zellen wurden sodann entnommen, gefiltert, 2 × in RPMI gewaschen und gezählt. Etwa 50.000 Zellen wurden mit einem entsprechenden Volumen an eiskaltem Matrigel auf Eis gemischt und chirurgisch mittels einer Kanüle Nr. 14 in die proximale Tibia-Metaphyse von SCID-Mäusen injiziert. Nach 10 bis 12 Wochen wurden die im Knochenmark gewachsenen LAPC-4 Tumore entnommen.
Zellinien
Menschliche Zellinien (z.B. HeLa) wurden aus ATCC gewonnen und in DMEM mit 5% fetalem Kalbserum erhalten.
RNA Isolierung
Tumorgewebe und Zellinien wurden in Trizol-Reagenz (Life Technologies, Gibco BRL) unter Verwendung von 10 ml/g Gewebe oder 10 ml/10⁸ Zellen homogenisiert, um die gesamte RNA zu isolieren. Die Poly-A RNA wurde unter Verwendung von Oligotex mRNA Mini- und Midi Kits (Quiagen) von der gesamten RNA gereinigt. Die gesamte und mRNA wurden durch spektrophotometrische Analyse (O.D. 260/180 nm) quantifiziert und durch Gelelektrophorese analysiert.
Oligonukleotide
Die nachfolgend genannten, HPLC aufgereinigten Oligonukleotide wurden verwendet.
DPNCDN (cDNA Synthese-Primer):
Adaptor 1:
Adaptor 2:
PCR-Primer 1:
Nested-Primer (NP) 1:
Nested-Primer (NP) 2:
Suppression Subtractive Hybridization (Differenzielle Analyse)
Es wurde die Suppression Subtractive Hybridization (SSH) eingesetzt, um die cDNAs zu identifizieren, welche mit Genen korrespondieren, die in Prostatakrebs differenziert exprimiert werden können. Die SSH-Reaktion verwendete cDNA aus LAPC-4 AD Heterotransplantaten, welche in zwei verschiedenen Umgebungen gewachsen waren, nämlich in der subkutanen ("LAPC-4 AD SQ") und der intrabialen ("LAPC-4 AD IT") Wachtumsumgebung, wobei die LAPC-4 AD IT Heterotransplantate als Quelle der "Tester"-DNA verwendet wurden, während die LAPC-4 AD SQ Heterotransplantate als Quelle für die "Driver"-DNA verwendet wurden.
Doppelsträngige cDNAs, welche mit den Tester- und Driver-DNAs korrespondieren, wurden unter Verwendung des PCR-Select cDNA Subtraction Kits (CLONTECH) und 1 ng des Oligonukleotides DPNCDN als Primer aus 2 μg der aus dem relevanten Heterotransplantat-Gewebe isolierten Poly(A)⁺ RNA synthetisiert, wie es weiter oben beschrieben ist. Die Synthese des ersten und zweiten Strangs wurde gemäß der Anleitung im Benutzerprotokoll des Kits (CLONTECH Protocol No. PT1117-1, Catalog No. K1804-1) durchgeführt. Die erhaltene cDNA wurde in Dpn II drei Stunden lang bei 37°C aufgeschlossen. Die aufgeschlossene DNA wurde mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und in Ethanol präzipitiert.
Die Driver-cDNA wurde durch Kombination der Dpn II aufgeschlossenen cDNA aus der relevanten Heterotransplantat-Quelle (siehe oben) mit einer Mischung aus aufgeschlossenen cDNAs aus menschlicher benigner Prostata-Hyperplasie (BPH), aus den menschlichen Zellinien HeLa, 293, A431 Colo205 und aus Mausleber in einem Verhältnis von 1:1 erzeugt.
Die Tester-cDNA wurde durch Verdünnen von 1 μl der Dpn II aufgeschlossenen cDNA aus der relevanten Heterotransplantat-Quelle (siehe oben) (400 ng) in 5 μl Wasser erzeugt. Die verdünnte cDNA (2 μl, 160 ng) wurde sodann in getrennten Bindungsreaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 μl bei 16°C über Nacht unter Verwendung von 400 u T4 DNA Ligase (CLONTECH) an 2 μl von Adaptor 1 und Adaptor 2 (10 μM) ligiert. Die Ligierung wurde mit 1 μl 0,2 M EDTA und Erwärmen auf 72°C über fünf Minuten beendet.
Die erste Hybridisierung wurde durch Zusetzen von 1,5 μl (600 ng) der Driver-cDNA in jedes der beiden Röhrchen mit 1,5 μl (20 ng) Adaptor 1- und Adaptor 2-ligierter Tester-cDNA durchgeführt. Die Proben wurden bis zu einem Endvolumen von 4 μl mit Mineralöl überdeckt, in einem Thermal-Cycler (MJ Research) 1,5 Minuten lang bei 98°C denaturiert und anschließend 8 Stunden lang bei 68°C hybridisiert. Die beiden Hybridisierungen wurden sodann gemeinsam mit 1 μl zusätzlicher, frisch denaturierter Driver-cDNA gemischt und über Nacht bei 68°C hybridisiert. Die zweite Hybridisierung wurde anschließend in 200 μl 20 mM Hepes, pH 8,3, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA verdünnt, 7 Minuten lang auf 70°C erwärmt und bei –20°C gelagert.
PCR-Amplifikation. Klonierung und Sequenzierung von mittels SSH erzeugten Gen-Fragmenten
Um die aus den SSH-Rekationen erhaltenen Genfragmente zu amplifizieren, wurden zwei PCR-Amplifikationen durchgeführt. Bei der ersten PCR-Reaktion wurde 1 μl der verdünnten End-Hybridisierungsmischung zu 1 μl des PCR-Primers 1 (10 μM), 0,5 μl dNTP-Mischung (10 μM), 2,5 μl 10 × Reaktionspuffer (reaction buffer, CLONTECH) und 0,5 μl 50 × Advantage cDNA Polymerase Mix (CLONTECH) bis zu einem Endvolumen von 25 μl zugesetzt. Die PCR 1 wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 75°C über 5 min; 94°C über 25 s, dann 27 Zyklen bei 94°C über 10 s, 66°C über 30 s, 72°C über 1,5 min. Für jedes Experiment wurden fünf erste PCR-Reaktionen getrennt voneinander durchgeführt. Bei der zweiten PCR-Reaktion wurde 1 μl aus der vereinigten und verdünnten ersten PCR-Reaktion zu derselben Reaktionsmischung zugesetzt, wie sie bei der PCR 1 verwendet wurde, außer daß anstelle des PCR-Primers 1 die Primer NP 1 und NP 2 (10 μM) verwendet wurden. Die PCR 2 wurde unter Einsatz von 10 bis 12 Zyklen bei 94°C über 10 s, 68°C über 30 s, 72°C über 1,5 Minuten durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des T/A Vector Cloning Kits (Invitrogen) in pCR 2.1 eingeführt. Transformierte E. coli wurden einer Blau/Weiß- und Ampicillin-Selektion unterzogen. Weiße Kolonien wurden gesammelt und in 96 Well-Platten angeordnet und in Flüssigkultur über Nacht gezüchtet. Um Inserts zu identifizieren, wurde eine PCR-Amplifikation mit 1 ml der Bakterienkultur unter den Bedingungen wie bei der PCR 1 und unter Verwendung von NP 1 und NP 2 als Primer durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Die bakteriellen Klone wurden in 20% Glycerol in einem 96 Well-Format gelagert. Die Plasmid-DNA wurde präpariert, sequenziert und einer Nukleinsäure-Homologierecher che auf GenBank, dBest und NCI-CGAP Datenbanken unterworfen.
Ergebnisse
Das oben unter "Material und Methoden" beschriebene SSH-Experiment führte zur Isolierung einer Vielzahl an Kandidatengenfragment-Klonen (SSH-Klone). Alle Kandidatenklone wurden sequenziert und einer Homologieanalyse gegenüber sämtlichen Sequenzen in den wichtigen öffentlichen Genbanken und EST Datenbanken unterzogen, um Informationen über die Identität mit dem entsprechenden Gen zu erhalten und die Entscheidung, ein bestimmtes Gen auf differenzierte Expression zu analysieren, zu leiten. Im allgemeinen wurden Genfragmente, welche keine Homologie mit irgend einer bekannten Sequenz in den recherchierten Datenbanken aufwiesen und somit als neue Gene darstellend erachtet wurden, sowie Genfragmente, welche Homologie mit vorherig sequenzierten exprimierten Sequenz-tags (ESTs) aufwiesen, einer differenzierten Expressionsanalyse mittels RT-PCR oder Northern-Analyse unterzogen.
Einer der SSH-Klone war identisch mit der entsprechenden Sequenz eines sekretierten Moleküls, welches als Spezifisches Granula-Protein 28 (Specific Granule Protein 28, SGP28) (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246–250) oder Cystein-reiches Sekret-Protein 3 (Cysteine-rich Secretory Protein 3, CRISP-3) (Krätzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236 (3): 827–36) bekannt ist. Die Sequenz dieses Klons (3GP1G3) lautet wie folgt:
Beispiel 2: Isolierung von SGP28 kodierender cDNA in voller Länge
Die cDNA in voller Länge (Klon 1; Tabelle 1) von 774 bp wurde aus einer Prostata-Datenbank isoliert, welche ein offenes Leseraster (Open Reading Frame, ORF) von 258 Aminosäuren erkennen läßt. Die hierin identifizierte Sequenz unterscheidet sich von der veröffentlichten SGP28-Sequenz (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380 (3): 246–50) in zwei Nukleinsäuren, nämlich einer in der kodierenden Sequenz und einer in der 5'UTR. Diese Unterschiede verändern die Proteinsequenz nicht.
Tabelle 1: 36P1G3/SGP28 cDNA in voller Länge (SEQ ID Nr. 2)
Tabelle 2: 36P1G3/SGP28 Offenes Leseraster (SEQ ID Nr. 3)
Beispiel 3: SGP28 Genexpressionsanalyse
Die SGP28 mRNA Expression in normalem menschlichem Gewebe wurde zunächst durch Northern-Blotting von zwei multiplen Gewebe-Blots von Clontech (Palo Alto, Kalifornien), welche eine Gesamtheit an 16 verschiedenen menschlichen Geweben enthalten, unter Verwendung einer gelabelten 36P1G3 cDNA als Probe (Sequenz wie in Beispiel 1) analysiert. Die RNA-Proben wurden mit einer β-Actin-Probe quantitativ normalisiert. Die Ergebnisse sind in den 1A–B wiedergegeben und zeigen, daß das SGP28 Gen ausschließlich in der Prostata, den Hoden und den Eierstöcken exprimiert wird. Interessanterweise zeigen die Prostata und die Eierstöcke ein 2,4 kb Transkript, während die Hoden eine 1,6 kb Message exprimieren (die 1,6 kb Message könnte eine andere SGP28 Familie darstellen). Das geringere Molekulargewichtssignal in normalen Hoden ist wahrscheinlich bedingt durch Kreuzhybridisierung der Probe (SSH Fragment) zu CRISP2 Message. Ein identisches Transkript ist für CRISP2 auf diesem normalen Feld erkennbar unter Verwendung einer genspezifischen Oligonukleotid-Probe, wie sie von Krätzschmar, J. et al., 1996, Eur. J. Biochem 236: 827–836, beschrieben ist.
Um die SGP28 Expression in menschlichen Krebsgeweben und Zellinien zu analysieren, wurden des weiteren RNAs aus den LAPC-4 menschlichen Prostatakrebs-Heterotransplantaten durch Northern-Blotting unter Verwendung der 36P1G3-Probe analysiert. Sämtliche RNA-Proben wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid und anschließende Analyse mit einer gelabelten β-Actin-Probe quantitativ normalisiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 1C dargestellt und zeigen eine sehr hohe Expressionsrate des 2,4 kb SGP28 Transkriptes in sämtlichen LAPC Heterotransplantaten.
Um die SGP28 Expression in Prostatakrebsgeweben zu analysieren, wurde Northern-Blotting für die RNA aus drei Prostatatumor-Proben mit ihrem entsprechenden normalen, umgebenden Prostatagewebe durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß eine SGP28 mRNA Expression in allen drei der drei getesteten Tumorproben festgestellt wurde, wobei in zwei der drei Proben eine sehr hohe Expressionsrate festgestellt wurde (2).
Beispiel 4: Erzeugung polyklonaler Antikörper zu SGP28
Um polyklonale Sera zu SGP28 zu erzeugen, wurde ein Peptid synthetisiert, welches mit den Aminosäuren 93–107 (CNYRHSNPKDRMTSL; SEQ ID Nr. 27) des SGP28 Proteins korrespondiert. Die Peptidsequenz wurde an Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) gebunden und verwendet, um Kaninchen wie folgt zu immunisieren. Das Kaninchen wurde anfänglich mit 200 μg Peptid-KLH in komplettem Freund's Adjuvans immunisiert. Dem Kaninchen wurden anschließend alle zwei Wochen 200 μg Peptid-KLH in nicht-komplettem Freund's Adjuvans injiziert. Etwa 7 bis 10 Tage nach jeder Immunisierung wurde Blut abgenommen. ELISA und Western-Blotting Analyse wurden eingesetzt, um die Spezifität und den Titer des Kaninchenserums gegenüber dem immunisierenden Peptid bzw. dem SGP28 Protein zu ermitteln. Affinitätsgereinigte SGP28 polyklonale Antikörper wurden durch Passage des Rohserums aus dem immunisierten Kaninchen über eine Affinitätsmatrix aus SGP28 Peptid (CNYRHSNPKDRMTSL; SEQ ID Nr. 27), kovalent an Affigel 10 (BioRad) gebunden, präpariert. Nach intensivem Waschen der Matrix mit PBS wurden die für SGP28 Peptid spezifischen Antikörper mit Glycin-Puffer mit niedrigem pH (0,1 M, PH 2,5) eluiert, sofort neutralisiert und intensiv gegen PBS dialysiert.
Um das Kaninchenserum auf Reaktivität mit SGP28 Protein zu testen, wurde die SGP28 cDNR in voller Länge in einen Expressionsvektor kloniert, welcher einen 6His tag am Carboxyl-Terminus aufweist (pcDNA3.1 myc-his, Invitrogen). Das erhaltene MYC/HIS SGP28 Konstrukt wurde in 293T Zellen transfiziert. Die gesamten Zellysate und Überstände der LAPC4 Zellen und MYC/HIS SGP28 transient transfizierten 293T Zellen und LAPC4 und LAPC9 Heterotransplantat-Lysaten wurden dem Western-Blotting unter Verwendung von affinitätsgereinigtem anti-SGP28 pAb von Kaninchen (1 μg/ml) unterworfen. Die SGP28 immunreaktiven Bereiche wurden durch Inkubation der Blots mit HRP-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper (HRP-conjugated anti-rabbit secondary antibody), gefolgt von verstärktem Chemilumineszenznachweis, visualisiert. Die Ergebnisse sind in 3 wiedergegeben und zeigen, daß der anti-SGP28 polyklonale Antikörper SGP28 Protein in LAPC4 und LAPC9 Heterotransplantat-Lysaten und in Überständen von LAPC4 und transfizierter 293T Zelllinie zu identifizieren vermag.
Beispiel 5: Expression von rekombinantem SGP28 Protein in Säugetierzellen
pcDNA3.1/MycHis Konstrukt
Um 36P1G3 in Zellen von Säugetieren zu exprimieren, wurde das 774 bp (258 Aminosäuren) 36P1G3 offene Leseraster (ORF) in pcDNA3.1/MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die Proteinexpression ist von einem Cytome galovirus (CMV)-Promotor getrieben. Das rekombinante Protein weist das Myc und sechs Histidine an den C-Terminus verschmolzen auf. Der pcDNA3.1/MycHis Vektor enthält ferner das/die bovine Wachstumshormon (Bovine Growth Hormone, BGH) Polyadenylierungs-Signal und Transkriptionsterminierungssequenz, um die mRNA Stabilität gemeinsam mit dem SV40 Ursprung zur episomalen Replikation und einfachem Vektor-Rescue in Zellinien, welche das große T-Antigen exprimieren, zu verbessern. Das Neomycin-Resistenz-Gen ermöglicht die Auswahl von Zellen aus Säugetieren, welche das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenz-Gen und der ColE1 Ursprung ermöglichen die Auswahl und Erhaltung des Plasmides in E. coli.
pAPtag Konstrukt
Das 3GP1G3/SGP28 Protein ohne die Signalsequenz (Aminosäuren 33 bis 258) wurde in pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN) kloniert. Dieses Konstrukt erzeugt eine Alkalinphosphatase-Fusion an den C-Terminus des 36P1G3 Proteins und eine Fusion der IgGK Signalsequenz an den N-Terminus. Das resultierende rekombinante 3GP1G3 Protein ist für eine Sekretion in das Medium tranfizierter Zellen von Säugetieren optimiert und kann verwendet werden, um Proteine, wie Liganden oder Rezeptoren, welche mit dem 36P1G3 Protein Wechselwirken, zu identifizieren. Die Proteinexpression ist von dem CMV-Promotor getrieben und das rekombinante Protein weist ebenfalls das Myc und sechs Histidine an den C-Terminus der Alkalinphosphatase verschmolzen auf. Das Zeosin-Resistenz-Gen ermöglicht die Auswahl von Zellen aus Säugetieren, welche das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenz-Gen ermöglicht die Auswahl des Plasmides in E. coli.
ptag5 Konstrukt
Das 3GP1G3 Protein ohne die Signalsequenz (Aminosäuren 33 bis 258) wurde in pTag-5 kloniert. Dieser Vektor ist pAPtag ähnlich, weist aber keine Alkalinphosphatase-Fusion auf.
pSRa Konstrukte
Um Zellinien von Säugetieren zu erzeugen, welche 36P1G3 konstitutiv exprimieren, wurde das 774 bp (258 Aminosäuren) offene Leseraster (PRF) in pSRa Konstrukte kloniert. Amphotrope und ecotrope Retroviren werden jeweils durch Transfektion der pSRa Konstrukte in die 293T-10A1 Verpackungszellinie bzw. Kotransfektion von pSRa und einem Helfer-Plasmid (φ–) in 293 Zellen erzeugt. Das Retrovirus kann verwendet werden, um eine Mehrzahl an Zellinien von Säugetieren zu infizieren, was zu einer Integration des klonierten Gens, 36P1G3, in Wirts-Zellinien (host cell lines) führt. Die Proteinexpression ist von einer langen terminalen Wiederholung (long terminal repeat, LTR) getrieben. Das Neomycin-Resistenz-Gen ermöglicht die Auswahl von Zellen aus Säugetieren, welche das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenz-Gen und der ColE1 Ursprung ermöglichen die Auswahl und Erhaltung des Plasmides in E. coli. Ein weiteres pSRa Konstrukt wurde erzeugt, welches den FLAG mit dem C-Terminus fusioniert, um eine Detektion unter Verwendung von anti-FLAG Antikörpern zu ermöglichen. Die FLAG Sequenz 5'gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEQ ID Nr. 36) wurde dem Klonierungsprimer an dem 3'-Ende des offenen Leseraster (ORF) zugesetzt.
Es können zusätzliche pSRa Konstrukte erzeugt werden, um sowohl N-terminale als auch C-terminale GFP und myc/6 HIS Fusions mit dem 36P1G3 Protein in voller Länge zu produzieren.
Beispiel 6: Expression von rekombinantem SGP28 Protein in Insektenzellen
pMelBac A
Das 36P1G3 Protein ohne die Signalsequenz (Aminosäuren 33 bis 258) wurde auch in pMelBac (Cat. No. V1950-20, Invitrogen, CA) kloniert, um das Protein in Sf9 Insektenzellen zu exprimieren und sekretieren. Der pMelBac A Vektor ist ein Baculovirus-Transfervektor, welcher zur direkten Expression von rekombinanten Proteinen auf sekretorischem Weg an das extrazelluläre Medium konstruiert ist. Die Signalsequenz für Melittin von Honigbienen, einem hochgradig exprimierten und wirksam sekretierten Protein, wird verwendet, um die Sekretion des rekombinanten 3GP1G3 Proteins zu regeln. Die Proteinexpression ist unter dem Polyhedrin-Promotor getrieben. Ferner wurde ein C-terminales myc-his tagged Konstrukt in pMelBac A erzeugt, um eine Feststellung und Reinigung des rekombinanten 36P1G3 Proteins zu ermöglichen.
pIZT/V5His
Das 3GP1G3 Protein wurde in PIZT/V5His (Cat. No. V8010-01, Invitrogen, CA) kloniert, um das Protein in Sf9 Insektenzellen zu exprimieren. Der Expressionsvektor ermöglicht eine transiente und stabile Expression des rekombinanten Proteins. Die Proteinexpression ist von dem OpIE2-Promotor zur hochgradigen konstitutiven Expression getrieben. Das Zeocin-Resistenz-Gen steht unter Kontrolle des OpIE1-Promotors.
Beispiel 7: Produktion monoklonaler Antikörper zu SGP28
Um mAbs zu SGP28 zu erzeugen, wurde von Überständen von 293T Gewebekulturen gereinigtes, rekombinantes HIS- tagged SGP28 Protein verwendet, um fünf weibliche Balb/C-Mäuse zu immunisieren. Die anfängliche Immunisierung wurde mit 50 μg gereinigtem SGP28 Protein in komplettem Freund's Adjuvans durchgeführt. Anschließend wurden in zweiwöchigen Intervallen Boosts mit 50 μg SGP28 Protein in unkomplettem Freund's Adjuvans verabreicht. Die Reaktivität und Spezifität von alle 7 bis 10 Tage nach jeder Immunisierung genommenen Blutproben wurden mittels ELISA- und Western-Blotting-Verfahren ermittelt. Der spezifische Titer der Blutproben für das Immunogen betrug wenigstens 2 × 10⁶. Anschließend wurden drei Mäuse geopfert und wurde deren Milz verwendet, um die Fusion und Hybridom-Erzeugung unter Verwendung von Standard-Methoden (Harlow und Lane, 1988) durchzuführen. Sodann wurden elf positive Wells einer Subklonierung unterzogen, um SGP28-spezifische monoklonale Hybridomen zu erzeugen. Einer der Hybridomen, welcher vollständig subkloniert war und als 4G6 (IgG1 Isotyp) bezeichnet wird, erkennt spezifisch in Prostatakrebs-Zellysaten und Überständen vorhandenes SGP28 Protein und reagiert deutlich mit SGP28 Protein in klinischem Prostatakrebsgewebe, jedoch nicht in normalem umgebendem Gewebe desselben Patienten (4).
Die 4 zeigt, daß der anti-SGP28 monoklonale Antikörper SGP28 Protein in Prostatakrebs-Zellinien und Überständen, Prostatakrebs-Heterotransplantaten und klinischem Prostatakrebsgewebe spezifisch feststellt. Zellinien und konditionierte Medien von der LAPC4 Prostatakrebs-Zellinie und Lysate von LAPC4 und LAPC9 Prostatakrebs-Heterotransplantaten und von einer zugehörigen normalen bzw. kanzerösen klinischen Probe wurden mittels SDS-PAGE separiert und in Nitrocellulose überführt. Der Blot wurde anschließend der Western-Analyse mit einer Verdünnung des Überstandes des 4G6 anti-SGP28 monoklonalen Antikörpers von 1:2 unterworfen. Spezifische SGP28 immunreaktive Bereiche wurden so dann durch Inkubation mit IgG-HRP-konjugiertem anti-Maus Sekundär-Antikörper (IgG-HRP conjugated anti-mouse secondary antibody) und Entwicklung mittels verstärkter Chemilumineszenz sowie Aussetzen eines autoradiografischen Films visualisiert.
Beispiel 9: Western-Analyse der SGP28 Proteinexpression
Die zugehörigen klinischen Gewebelysate von Prostatakrebs und normalem umgebendem Gewebe sowie die normalen Gewebelysate einer LAPC4 Zellinie und LAPC4 Heterotransplantaten wurden dem Western-Blotting mit 1 μg/ml affinitätsgereinigten anti-SGP28 polyklonalen Antisera von Kaninchen unterzogen. Die SGP28 immunreaktiven Bereiche wurden durch Inkubation der Blots mit HRP-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper (HRP-conjugated anti-rabbit secondary antibody), gefolgt von verstärktem Chemilumineszenznachweis, visualisiert. Die Ergebnisse (5A–B) zeigen eine hochgradige Expression von SGP28 in den Prostatakrebs-Proben, jedoch nicht in dem umgebenden normalen Gewebe, sowie eine hochgradige Expression in den LAPC Heterotransplantaten. Eine geringe Expression wurde in den normalen Hoden und in der Lunge festgestellt.
Beispiel 10: Immunhistochemischer Nachweis von SGP28 in Prostatakrebs, PIN und Metastasen von Prostatakrebs
Die SGP28 Expression in einer Prostatakrebs-Probe mit einer Gleason-Summe (Gleason Score) von 7 und in einer hochgradiger PIN-Probe wurde wie folgt einer immunhistochmischen Analyse der SGP28 Expression unterzogen. Es wurden Gewebesegmente aus den Proben präpariert, diese wurden in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und gemäß einem Standard-Protokoll sektioniert. Die Segmente wurden mit einem anti-SGP28 polyklonalen Antikörper gefärbt (wie oben beschrieben). Die Ergebnisse sind in den 6A–B wiedergegeben. In den Epithelzellen der Prostatadrüsen, insbesondere an den lumenalen Grenzen, wurde eine starke Färbung beobachtet. Eine Färbung wurde ferner im Innern des Lumens beobachtet, was auf eine hochgradige Expression und Sekretion von SGP28 in Prostatakrebs und PIN schließen läßt.
Auf ähnliche Weise wurde ein polyklonaler Antikörper verwendet, um die Fähigkeit einer Feststellung von SGP28 Expression in Metastasen von Prostatakrebs zu überprüfen. In 7A–B sind die Ergebnisse von immunhistochemischen Analysen wiedergegeben, welche die Expression von SGP28 Protein in Prostatakrebsmetastasen in Knochen (7A) und Lymphknoten (7B) zeigen.
Die hohe Expression von SGP28 in Prostatakrebs und in PIN wurde des weiteren unter Verwendung von immunhistochemischen Analysen nachgewiesen, deren Ergebnisse in den 8A–D dargestellt sind. 8A zeigt einen immunhistochemischen Nachweis von SGP28 in Prostatakrebs in einer Vergrößerung von 200 ×; 8B zeigt denselben Nachweis in einer Vergrößerung von 800 ×. Die SGP28 Expression in PIN ist in 8C in einer Vergrößerung von 200 × und in 8D in einer Vergrößerung von 800 × gezeigt. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistochemischen Analysen ist in Tabelle 3 für Prostatakrebs und PIN sowie in Tabelle 4 für eine breitere Auswahl an Geweben wiedergegeben. Das Fehlen einer immunhistochemisch nachweisbaren Expression innerhalb der breiten Auswahl an untersuchten Geweben einschließlich normalem Prostatagewebe in Verbindung mit der starken Färbung in Prostatakrebs und in PIN weist darauf hin, daß SGP28 ein besonders geeignetes Target für eine auf Antikörper gestützte Diagnose einschließlich einer Evaluie rung von Biopsie-Proben und in vivo bildgebenden Verfahren (in vivo Imaging) darstellt.
Tabelle 3:
Tabelle 4:
Beispiel 11: Identifizierung potentieller Signalübertragungswege
Um festzustellen, ob SGP28 bekannte Signalübertragungswege in Zellen direkt oder indirekt aktiviert, wurden transkriptorische Reporter-Assays auf der Basis von Luciferase in SGP28 exprimierenden Zellen durchgeführt. Diese transkriptorischen Reporter enthalten übereinstimmende Bindungsstellen für bekannte Transkriptionsfaktoren, welche stromab von genau gekennzeichneten Signalübertragungswegen angeordnet sind. Die Reporter sowie Beispiele ihrer zugehörigen Transkriptionsfaktoren, Signalübertragungswege und Aktivierungsstimuli sind nachfolgend aufgeführt:

1) NFkB-luc, NFkB/Rel; Ikkinasc/SAPK; Wachstum/Apoptose/Streß;
2) SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; Wachstum/Differenzierung;
3) AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; Wachstum/Apoptose/Streß;
4) ARE-luc, Androgen-Rezeptor; Steroide/MAPK; Wachstum/Differenzierung/Apoptose;
5) p53-luc, p53; SAPK; Wachstum/Differenzierung/Apoptose;
6) CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; Wachstum/Apoptose/Streß.

SGP28-vermittelte Effekte können in Zellen, welche eine mRNA Expression zeigen, untersucht werden. Luciferase-Reporter-Plasmide können durch Lipid-Reagenzien vermittelte Transfektion (TFX-50, Promega) eingeführt werden. Die Luciferase-Aktivität, ein Indikator für die relative transkriptorische Aktivität, wird durch Inkubation der Zellextrakte mit Luciferin-Substrat gemessen und die Lumineszenz der Reaktion wird mittels eines Luminometers überwacht.
Beispiel 12: In Vitro Untersuchungen der SGP28 Funktion
Das Expressionsprofil von SGP28 in Prostatakrebs weist auf eine funktionelle Rolle bei der Initiierung, Progression und/oder Erhaltung von Tumoren hin. Die SGP28 Funktion kann in Zellen von Säugetieren unter Verwendung von in vitro Ansätzen bewertet werden. Im Hinblick auf eine Expression in Säugetieren kann SGP28 in eine Mehrzahl an geeigneten Vektoren kloniert werden, einschließlich pcDNA 3.1 myx-His-tag und dem retroviralen Vektor pSRαtkneo (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785). Unter Verwendung solcher Expressionsvektoren kann SGP28 in einigen Krebszellinien exprimiert werden, einschließlich z.B. PC-3, NIH 3T3, LNCaP und 293T. Die Expression von SGP28 kann unter Verwendung von anti-SGP28 Antikörpern überwacht werden.
SGP28 exprimierende Zellinien aus Säugetieren können mittels verschiedenen in vitro und in vivo Untersuchungen getestet werden, einschließlich Zellproliferation in Gewebekulturen, Aktivierung apoptotischer Signale, primäre und metastatische Tumorbildung in SCID-Mäusen sowie in vitro Invasion unter Verwendung eines Membran-Invasion-Kultursystems (Membrane Invasion Culture System, MICS) (Welch et al., Int. J. Cancer 43: 449–457). Der SGP28 Zell-Phänotyp wird mit dem Phänotyp von Zellen verglichen, welche keine Expression von SGP28 zeigen. Zusätzlich können Zellen, welche mit und ohne exogen zugesetztem SGP28 Protein behandelt worden sind, auf ihre veränderten Wachstumsparameter untersucht werden.
SGP28 exprimierende Zellinien können ebenfalls auf eine Veränderung der invasiven oder migratorischen Eigenschaften untersucht werden, indem die Passage der Zellen durch eine Matrigel beschichtete, poröse Membrankammer gemessen wird (Becton Dickinson). Die Passage der Zellen durch die Membran auf die entgegengesetzte Seite wird unter Einsatz einer Fluoreszenzuntersuchung (Becton Dickinson Technical Bulletin #428) unter Verwendung von Calcein-Am (molekulare Proben) angereicherten Indikator-Zellen überwacht. Die analysierten Zellinien umfassen parentale Zellen und SGP28 über-exprimierende PC3-, 3T3- und LNCaP-Zellen. Um festzustellen, ob SGP28 chemoattraktive Eigenschaften aufweist, werden parentale Indikator-Zellen auf eine Passage durch die poröse Membran in Richtung eines Gradienten von SGP28-konditioniertem Medium gegenüber Kontrollmedium überwacht. Diese Untersuchung kann auch verwendet werden, um die spezifische Neutralisierung des SGP28-induzierten Effektes bei vorgeschlagenen therapeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs zu qualifizieren und zu quantifizieren.
Um festzustellen, ob SGP28 an zelluläre Proteine bindet, welche in Prostatakrebszellen und anderen Krebszellen oder in normalen Zellen exprimiert werden, können zwei Ansätze herangezogen werden. Gemäß dem ersten Ansatz werden in vitro Untersuchungen hinsichtlich rekombinanter HIS-tagged SGP28 Bindung an verschiedene Zellinien verwendet. Gemäß dem anderen Ansatz wird unter Verwendung des AP-TAG Systems der GenHunter Corporation (Nashville, TN, Cat # Q202) ein rekombinantes Alkalinphosphatase-Fusionsprotein erzeugt und wird die AP-TAG Fusion verwendet, um die Bindung von SGP28 an eine Mehrzahl an Prostatakrebs-Zellinien zu testen, wie es bereits beschrieben ist (Cheng und Flanagan, 1994, Cell 79: 157–168). Nach Waschen der Zellen und Zugabe des AP-Substrates BCIP, welches einen unlöslichen blauen Niederschlag bei der Dephosphorylierung bildet, wird die Bindung von SGP28 durch Identifizierung von unter dem Lichtmikroskop blau gefärbten Zellen ermittelt. Verschiedene Krebszellinien lassen sich so untersuchen, einschließlich – wenn auch nicht ausschließlich – verschiedene Prostatakrebs-Zellinien (z.B. LNCaP, PC-3, DU 145, TSUPR, LAPC4). Andere Zellinien, wie die PREC Prostata-Zellinie, 193T, PIN Zellen und NIH 3T3 etc., können ebenfalls untersucht werden. Ferner können LAPC und andere Prostatakrebs-Heterotransplantate getestet werden. Um die Stärke der Bindungswechselwirkung zu evaluieren, können die Konstanten der Gleichgewichtsdissoziationsraten errechnet werden. Fer ner kann die Anzahl an Zell-Oberflächenrezeptoren pro Zelle bestimmt werden. Zellinien oder Gewebe mit dem größten Bindungsvermögen für SGP28 wären dann bevorzugt für die Klonierung des SGP28 Rezeptors oder anderen Bindungspartners.
Gemäß einem weiteren Funktionstest können SGP28 dauerhaft exprimierende NIH-3T3 Zellen auf ihre Fähigkeit zur Bildung von Kolonien in Soft-Agar analysiert werden. Bei diesen Experimenten können in solchen Verfahren verwendete Zellen (z.B. NIH-3T3 Zellen) transfiziert werden, um SGP28 oder neo oder aktiviertes Ras (als Test-Gen, jeweils negative und positive Kontrolle) dauerhaft zu exprimieren, um die transformatorischen Fähigkeiten von SGP28 zu beurteilen. Die Experimente werden typischerweise zweifach durchgeführt und die Untersuchungen werden etwa vier Wochen nach der Plattierung der Zellen evaluiert. Sofern die experimentellen Beobachtungen zeigen, daß SGP28 eine erhöhte Koloniebildung gegenüber der negativen Kontrolle (z.B. neo) induziert, weisen die Ergebnisse darauf hin, daß SGP28 signifikante transformatorische Fähigkeiten besitzt.
Beispiel 13: In Vivo Untersuchungen der Promotion des Wachstums von Tumoren durch SGP28
Die Wirkung des SGP28 Proteins auf das Wachstum von Tumorzellen kann in vivo durch Gen-Über-Expression in Tumoren aufweisenden Mäusen evaluiert werden. So kann beispielsweise SCID-Mäusen an jeder Flanke SQ mit 1 × 10⁶ einer Prostata-Zellinie, welche den tkNeo Leervektor oder SGP28 enthält, injiziert werden. Wenigstens zwei Strategien kommen zum Einsatz: (1) Konstitutive SGP28 Expression unter Regulierung eines LTR Promotors; und (2) Regulierte Expression unter der Kontrolle eines induzierbaren Vektorsystems, wie Ecdyson, Tet etc. Das Tumorvolumen wird sodann bei Auftreten von ertastbaren Tumoren überwacht und über die Zeit verfolgt, um festzustellen, ob SGP28 exprimierende Zellen mit einer höheren Wachstumsrate wachsen. Zusätzlich kann Mäusen 1 × 10⁵ derselben Zellen orthotop implantiert werden, um festzustellen, ob SGP28 eine Wirkung auf das lokale Wachstum im Target-Gewebe (z.B. in der Prostata) oder auf die Fähigkeit der Zellen zu metastatisieren, insbesondere in den Lungen, den Lymphknoten, der Leber, dem Knochenmark etc., besitzt. Die Wirkung von SGP28 auf die Bildung und das Wachstum von Knochentumoren kann durch intratibiale Injektion von Prostatatumorzellen beurteilt werden, wie es in Beispiel 1 erläutert ist.
Diese Untersuchungen sind des weiteren nützlich zur Ermittlung der SGP28 inhibitorischen Wirkung von vorgeschlagenen therapeutischen Zusammensetzungen, wie beispielsweise SGP28 Antikörpern, SGP28 Antisense-Molekülen und Ribozymen.
Beispiel 14: Funktionstests zur Bindung von SGP28 an Zellen
In Prostatakrebs wurden bereits verschiedene sekretierte Proteine beschrieben, bei welchen von einer Mehrzahl derselben gezeigt wurde, daß sie am Vorgang der Tumorbildung und -progression teilnehmen (Inoue K., 2000, Clin. Cancer Res. 6: 2104–19; Dow J. K., deVere White R. W., 2000, Urology 55: 800–6). Da SGP28 ein sekretiertes Protein ist, besteht eine seiner potentiellen Funktionen darin, die Mikroumgebung des Prostatakrebses und der Metastasierung zu regulieren. Um diese Möglichkeit zu testen, kann SGP28 als rekombinantes Protein, wie GST-SGP28 oder SGP28-Myc/His, exprimiert und gereinigt werden. Das gereinigte rekombinante SGP28 (ob GST-SGP28 oder SGP28-Myc/His) wird dann mit einer Mehrzahl an verschiedenen Zelltypen inkubiert, welche die Umgebung der Prostata rekapitulieren, einschließlich Epithelzellen der Prostata, Prostatatumor-Zellinien, Stro mazellen der Prostata, Endothelzellen der Prostata und Endokrinzellen der Prostata. Zusätzlich wird rekombinantes SGP28 auch mit Zellen inkubiert, welche an metastatischen Stellen aufgefunden worden sind, wie Knochenmarkszellen und Zellen des Immunsystems. Die Bindung von SGP28 an intakte Zellen wird mittels FACS Analyse und durch kalorimetrische Untersuchung ermittelt. Eine solche Analyse ist nützlich, weil sie eine Zellpopulation identifiziert, welche an SGP28 bindet und auf dieses reagiert. Ferner kann die Identifizierung einer Target-Zellpopulation ein Mittel zum Isolieren und Identifizieren von SGP28 Rezeptoren darstellen, wodurch ein zusätzliches Mittel zur Modulation von SGP28-vermittelten Vorgängen zur Verfügung gestellt wird.
Beispiel 15: Untersuchungen der Defensin-ähnlichen Aktivität von SGP28
SGP28 weist starke Homologie mit Defensin-Proteinen, insbesondere mit Beta-Defensinen, auf, Beta-Defensine sind sekretierte Produkte, welche vornehmlich von Epithelzellen produziert werden (O'Neil D. A. et al., 1999, J. Immunol. 163: 6718–24; Schröder J. M., Harder J., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 645–51). Defensine spielen eine wichtige Rolle bei der Vorbeugung vor Infektionen und Überwachung der Immunität von Epithelgeweben. Ferner wurde von menschlichem HNP-1 Defensin gezeigt, daß es in vitro den Tod von Tumorzellen induziert. Um die Rolle von SGP28 beim Zellod zu untersuchen, wird gereinigtes rekombinantes SGP28 mit einer Mehrzahl an verschiedenen Zelltypen der vorgenannten Art inkubiert, wonach die apoptotische Aktivität unter Verwendung der FACS Analyse von Annexin V-gefärbten Zellen analysiert wird. SGP28 kann auch die Funktion als Chemoattraktant besitzen, wie es für andere Defensinmoleküle gezeigt wurde (Yang D. et al., 2000, Leukoc. Biol. 68: 9–14; Yang D. et al., 1999, Science 286 (5439): 525–8). Durch chemotaktische Untersuchung kann der Effekt von SGP28 auf die Migration von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Stromazellen, Endothelzellen, sowie auf Monozyten, Lymphozyten und dendritische Zellen beurteilt werden.
Beispiel 16: Vorhergesagte Bindung von SGP28 Peptiden an HLA-A2
Um SGP28 Peptide zu identifizieren, von welchen vorhergesagt wird, daß sie an das menschliche MHC Klasse I-Molekül HLA-A2 binden, wurde die komplette Aminosäuresequenz des SGP28 Proteins in den HLA Peptidmotiv-Suchalgorithmus (HLA Peptide Motif Search Algorithm) der Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) eingegeben (Internetseite: http://bimas.dcrt.nih.gov/). Die Ergebnisse der vorhergesagten SGP28 Bindungspeptide sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Die Top 10-Rangliste der potentiellen Vertreter ist gemeinsam mit ihrer Lage, der Aminosäuresequenz eines jeden spezifischen Peptides und einem geschätzten Bindungswert dargestellt. Der Bindungswert entspricht der geschätzten Halbwertzeit des Zerfalls von Komplexen, welche das Peptid bei 37°C und einem pH-Wert von 6,5 enthalten. von den Peptiden mit dem größten Bindungswert (d.h. 999,9 für SGP28 Peptid 2) wird vorhergesagt, daß sie am festesten an HLA Klasse 1 an der Zelloberfläche binden und folglich die besten immunogenen Targets zur Erkennung von T-Zellen darstellen. Eine tatsächliche Bindung von Peptiden an HLA-A2 kann durch Stabilisierung der HLA-A2 Expression an der Antigenprozessierungs-defekten Zellinie T2 evaluiert werden (Xue et al., 1997, Prostate 30: 73–8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36: 129–38). Eine Immunogenität von spezifischen Pepiden kann durch in vitro Stimulation von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten (cytotoxic T lymphocytes, CTL) in Gegenwart von dendritischen Zellen evaluiert werden (Xue et al., 1997, Prostate 30: 73–8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36: 129–38).
Tabelle 5: SGP28 Peptide mit den höchsten vorhergesagten Bindungswerten
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins eines SGP28 Protein exprimierenden Krebses, umfassend die Ermittlung des Niveaus an SGP28 Protein, welches von Zellen in einer Gewebe-Testprobe eines Individuums exprimiert wird, und den Vergleich des derart ermittelten Niveaus mit dem Niveau an SGP28, welches in einer entsprechenden normalen Probe exprimiert wird, wobei das Vorhandensein erhöhten SGP28 Proteins in der Testprobe gegenüber der normalen Probe eine Indikation für das Vorhandensein eines solchen Krebses in dem Individuum gibt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ermittlung des Niveaus an SGP28 Protein, welches von den Zellen exprimiert wird, das Inkontaktbringen der Zellen mit einem Antikörper umfaßt, welcher spezifisch an SGP28 Protein bindet.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper einen polyklonalen Antikörper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper einen monoklonalen Antikörper aufweist.
Verfahren zur Überwachung von SGP28 Genprodukten, umfassend die Ermittlung des Zustandes von SGP28 Genprodukten, welche von Zellen in einer Gewebe-Testprobe eines Individuums exprimiert werden, und den Vergleich des derart ermittelten Zustandes mit dem Zustand von SGP28 Genprodukten in einer entsprechenden normalen Probe, wobei das Vorhandensein eines modifizierten Zustandes der SGP28 Genprodukte in der Testprobe gegenüber der normalen Probe eine Indikation für dysreguliertes Zellwachstum in dem Individuum gibt.
Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe auf Anzeichen an einem dysregulierten Zellwachstum, umfassend den Vergleich des Zustandes von SGP28 in der biologischen Probe mit dem Zustand von SGP28 in einer entsprechenden normalen Probe, wobei Modifikationen des Zustandes von SGP28 in der biologischen Probe mit einem dysregulierten Zellwachstum in Verbindung gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Zustand von SGP28 in der biologischen Probe durch Untersuchung des Niveaus an SGP28 mRNA Expression oder des Niveaus an SGP28 Proteinexpression evaluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei eine Modifikation des Zustandes von SGP28 durch das Vorhandensein von SGP28 exprimierenden Zellen in einer biologischen Probe von einem Gewebe, in welchem SGP28 exprimierende Zellen gewöhnlich nicht vorhanden sind, bestimmt wird.
Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum, umfassend: (a) Ermittlung des Niveaus an SGP28 mRNA, welches in einer aus dem Individuum erhaltenen Testprobe exprimiert wird; und (b) Vergleich des derart ermittelten Niveaus mit dem Niveau an SGP28 mRNA, welches in einer vergleichbaren, bekannten, normalen Gewebeprobe exprimiert wird, wobei das Vorhandensein einer erhöhten SGP28 mRNA Expression in der Testprobe gegenüber der normalen Gewebeprobe eine Indikation für das Vorhandensein von Krebs gibt.
Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum, umfassend: (a) Ermittlung des Niveaus an SGP28 Protein, welches in einer aus dem Individuum erhaltenen Testprobe exprimiert wird; und (b) Vergleich des derart ermittelten Niveaus mit dem Niveau an SGP28 Protein, welches in einer vergleichbaren, bekannten, normalen Gewebeprobe exprimiert wird, wobei das Vorhandensein erhöhten SGP28 Proteins in der Testprobe gegenüber der normalen Gewebeprobe eine Indikation für das Vorhandensein von Krebs gibt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Krebs Prostata- oder Darmkrebs ist und wobei die Test- sowie die normale Gewebeprobe aus einer Gruppe gewählt sind, welche Prostatagewebe, Darmgewebe, lymphatisches Gewebe, Serum, Blut oder Sperma umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Ermittlung des Niveaus an SGP28 Protein, welches in der Testprobe exprimiert wird, das Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper umfaßt, welcher spezifisch an SGP28 Protein bindet.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper einen polyklonalen Antikörper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper einen monoklonalen Antikörper aufweist.
Verwendung eines Vektors, welcher einen einkettigen monoklonalen Antikörper kodiert, welcher die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers aufweist, der spezifisch an ein SGP28 Protein bindet, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Polynukleotid, welches ein SGP28 Polypeptid kodiert, wobei das Polynukleotid aus einer Gruppe gewählt ist, welche (a) ein Polynukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2, wobei T auch U sein kann; (b) ein Polynukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 von Nukleotid-Rest Nr. 3 bis Nukleotid-Rest Nr. 776, wobei T auch U sein kann; (c) ein Polynukleotid, welches ein SGP28 Protein kodiert, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist; (d) ein Polynukleotid, welches ein Fragment eines Polynukleotides gemäß (a), (b) oder (c) ist und eine Länge von wenigstens 20 Nukleotid-Basen aufweist; (e) ein Polynukleotid, welches zu einem beliebigen Polynukleotid gemäß (a) bis (d) gänzlich komplementär ist; oder (f) ein Polynukleotid, welches unter stringenten Bedingungen selektiv zu einem beliebigen Polynukleotid gemäß (a) bis (d) hybridisiert, umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Polynukleotid, welches ein Polypeptid kodiert, welches zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 über deren gesamte Länge ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Polynukleotid, welches ein SGP28 Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, welche aus einer Gruppe gewählt ist, welche SEQ ID Nr. 8; SEQ ID Nr. 9; SEQ ID Nr. 10; SEQ ID Nr. 11; SEQ ID Nr. 12; SEQ ID Nr. 13; SEQ ID Nr. 14; SEQ ID Nr. 15; SEQ ID Nr. 16; die Aminosäuren 2-10 der SEQ ID Nr. 17; die Aminosäuren 6–14 der SEQ ID Nr. 18; die Aminosäuren 30–38 der SEQ ID Nr. 19; die Aminosäuren 142–150 der SEQ ID Nr. 20; die Aminosäuren 222–230 der SEQ ID Nr. 21; die Aminosäuren 175–183 der SEQ ID Nr. 22; die Aminosäuren 7–15 der SEQ ID Nr. 23; die Aminosäuren 141–149 der SEQ ID Nr. 24; die Aminosäuren 134–142 der SEQ ID Nr. 25 und die Aminosäuren 211–219 der SEQ ID Nr. 26 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Polynukleotid mit einem detektierbaren Marker gelabelt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem SGP28 Polypeptid, welches von einem Polynukleotid nach Anspruch 16 kodiert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Polypeptid, welches wenigstens 15 zusammenhängende Aminosäuren des Polypeptides nach Anspruch 20 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Antikörper oder einem Fragment desselben, welcher/welches spezifisch an das SGP28 Polypeptid nach Anspruch 20 bindet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Antikörper oder das Fragment desselben monoklonal ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem rekombinanten Protein, welches die Antigen-Bindungsregion eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 23 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Antikörper oder das Fragment desselben mit einem detektierbaren Marker gelabelt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der detektierbare Marker aus einer Gruppe gewählt ist, welche ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung, einen Metall-Chelatbildner oder ein Enzym umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das Antikörper-Fragment ein Fab-, F(ab')2-, Fv- oder sFv-Fragment umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Antikörper oder das Fragment desselben einen menschlichen Antikörper umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Antikörper oder das Fragment desselben zu einem Toxin oder einem therapeutischen Mittel konjugiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Antikörper mäusische Antigen-Bindungsregionen-Reste und menschliche Antikörper-Reste aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem einkettigen monoklonalen Antikörper, welcher die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 23 enthält.
Impfstoff-Zusammensetzung für die Behandlung eines SGP28 exprimierenden Krebses, welche einen immunogenen Anteil eines SGP28 Proteins und einen physiologisch verträglichen Träger enthält.
Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei der immunogene Anteil eines SGP28 Proteins aus einer Gruppe gewählt ist, welche die Aminosäuren 2–10 der SEQ ID Nr. 17, die Aminosäuren 6–14 der SEQ ID Nr. 18, die Aminosäuren 30–38 der SEQ ID Nr. 19, die Aminosäuren 142–150 der SEQ ID Nr. 20, die Aminosäuren 222–230 der SEQ ID Nr. 21, die Aminosäuren 175–183 der SEQ ID Nr. 22, die Aminosäuren 7–15 der SEQ ID Nr. 23, die Aminosäuren 141–149 der SEQ ID Nr. 24, die Aminosäuren 134–142 der SEQ ID Nr. 25 und die Aminosäuren 211–219 der SEQ ID Nr. 26 umfaßt.
Impfstoff-Zusammensetzung für die Behandlung eines SGP28 exprimierenden Krebses, welche ein Polynukleotid, welches einen immunogenen Anteil eines SGP28 Proteins kodiert, und einen physiologisch verträglichen Träger enthält.
Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei der immunogene Anteil eines SGP28 Proteins aus einer Gruppe gewählt ist, welche die Aminosäuren 2–10 der SEQ ID Nr. 17, die Aminosäuren 6–14 der SEQ ID Nr. 18, die Aminosäuren 30–38 der SEQ ID Nr. 19, die Aminosäuren 142–150 der SEQ ID Nr. 20, die Aminosäuren 222–230 der SEQ ID Nr. 21, die Aminosäuren 175–183 der SEQ ID Nr. 22, die Aminosäuren 7–15 der SEQ ID Nr. 23, die Aminosäuren 141–149 der SEQ ID Nr. 24, die Aminosäuren 134–142 der SEQ ID Nr. 25 und die Aminosäuren 211–219 der SEQ ID Nr. 26 umfaßt.
Impfstoff-Zusammensetzung für die Behandlung eines SGP28 exprimierenden Krebses mit einem Polynukleotid, welches einen einkettigen monoklonalen Antikörper kodiert, welcher die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers enthält, welcher spezifisch an SGP28 Protein bindet.