JP3779926B2 - Sgp28関連分子を使用する、癌の診断および治療 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許仮出願第60/162,610号(1999年10月28日出願)(本明細書においてその全体の内容が参考として援用される)の利益を主張する。
【0002】
(発明の分野)
本明細書に記載される本発明は、癌(前立腺癌を含む)の診断および治療のための方法および組成物に関し、ヒトSGP28/CRISP−3に対応するかまたはヒトSGP28/CRISP−3と反応性である、単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および関連分子を利用する。
【0003】
(発明の背景)
癌は、冠状動脈の疾患に次ぐ、ヒトの第2の死亡原因である。世界中で、数百万人が、毎年癌で死亡している。米国のみで、癌は、毎年50万をゆうに越えるヒトの死亡原因であり、140万人が毎年新たに診断されている。心臓疾患による死亡は有意に減少しているが、一般的には癌による死亡は増大している。21世紀の始めには、癌は第1の死亡原因になると予想される。
【0004】
世界中で、いくつかの癌は、主だった死亡原因として突出している。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による死亡の主な原因を代表する。これらおよび実質的に全ての他の癌腫は、共通する致死的な特徴を共有する。ごくわずかな例外をともなうが、癌腫による転移性の疾患は致命的である。さらに、当初は生存している初期の癌腫を有するこのような癌の患者についてもなお、共通する経験は、彼らの生存性が劇的に変更されることを示した。多くの癌患者は、再発の可能性または処置の失敗の自覚による強烈な不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の身体の衰弱を経験する。多くの癌患者は、再発を経験する。
【0005】
世界中で、前立腺癌は、男性における4番目の最も一般的な癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、これは、最も一般的な男性の癌であり、そして男性の癌による死亡の第2の原因である。米国のみで、40,000人をゆうに超える男性が、唯一肺癌に次いで、毎年この疾患によって死亡する。これらの数の多さにもかかわらず、転移性の前立腺癌についての有効な処置はなお存在していない。外科手術による前立腺切除、放射線治療、ホルモン離解治療、および化学療法が、主な処置の形態でありつづけている。残念なことに、これらの処置は多くについては不十分であり、そしてしばしば、所望されない結果を付随する。
【0006】
診断の最前線においては、初期段階の局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺の腫瘍マーカーが存在していないことが、この疾患の管理における有意な限界を残している。血清のPSAアッセイが非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的な有用性は、いくつかの重要な点を欠いていると広範に認識されている。
【0007】
前立腺癌のさらなる特異的なマーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の種々の段階を要約し得る前立腺癌の異種移植片の作成によって改善されている。LAPC(Los Angeles Prostate Cancer)異種移植片は、重篤な複合免疫不全(SCID)マウス中の生存した継代を有する前立腺癌の異種移植片であり、そしてアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行および転移性の病巣の発達を含む、疾患の進行を模倣する能力を示した(Kleinら、1997、Nat.Med.3:402)。より最近同定された前立腺癌のマーカーとしては、PCTA−1(Suら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7252)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)(Reiterら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1735)、およびSTEAP(Hubertら、1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:14523)が挙げられる。
【0008】
PSA、PSM、PCTA、およびPSCAのような以前に同定されたマーカーが前立腺癌の診断および処置についての努力を促進したが、診断および治療をさらに改善するための、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的の同定が必要とされている。
【0009】
(発明の要旨)
本発明は、前立腺癌の診断および治療のための方法および組成物に関する。本発明の方法は、ヒトSGP28に対応する単離されたポリヌクレオチド、SGP28遺伝子によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、ならびにSGP28タンパク質を特異的に認識しかつ特異的に結合し得る抗体を利用する。本発明の方法は、部分的に、SGP28に同一でありかつヒト前立腺癌において高度に過剰発現される遺伝子の分子クローニングに基づく。本発明はさらに、免疫組織化学により決定される場合に、非常に高レベルのSGP28タンパク質が、癌性前立腺の管腔ならびにPIN、非浸潤的前癌性前立腺病変、および骨転移およびリンパ節転移において発現されてそして分泌されるという発見に基づく。本明細書中に開示されるSGP28の発現プロファイルは、SGP28が前立腺癌についての有用な診断マーカーおよび/または治療標的を提供するということを示す。さらに、SGP28のPINにおける発現は、それが前立腺癌の初期診断のためのマーカーであり得る(現在PSAを使用して利用可能なマーカーを超える改善が多く必要とされる)ことを示唆する。個々の臨床切片におけるSGP28の発現パターンは、SGP28を使用して、別の処置様式に対してある処置様式により応答性である個々の患者を同定し得るということを示唆する。さらに、SGP28は、前立腺癌治療レジメンの有効性をモニタリングするための代理マーカーとして作用し得る。SGP28分子は、そのリンパ節および骨転移における発現に起因して、インビボ画像化方法における使用のための特に魅力的なマーカーを提供する。
【0010】
SGP28mRNA発現は、前立腺および卵巣に限られ、そして前立腺腫瘍において顕著に上方調節される。mRNA検出方法およびタンパク質検出方法の両方を使用して、対応する正常前立腺/進行した前立腺癌の患者由来の腫瘍サンプルにおけるSGP28の発現は、腫瘍組織における高度に上方調節された発現を示し、このことは、SGP28sが、前立腺癌検出のための有用なマーカーであることを示唆する。
【0011】
SGP28は、細胞外可溶タンパク質であり、29kDaの推定分子量および8.08のpIを有する。SGP28は、アミノ酸残基32と33との間で切断されるシグナルペプチドを有し、そして2つの細胞外タンパク質SCPモチーフ(プロサイト(prosite)ドメインPDOC00772)を含み、これら2つのうちの1つは、アミノ酸150〜160、もう1つはアミノ酸170〜182(両方とも配列番号3)にある。このタンパク質は、ディフェンシンタンパク質(特に、β−ディフェンシン)に強い相同性を有し、これらは、主に上皮細胞により産生される分泌産物である(O−Neilら,1999,J.Immunol.163: 6718−24;Schroderら,1999,Int.J.Biochem.Cell Biol.,31:645−51)。ディフェンシンとして、SGP28タンパク質は、腫瘍細胞死を誘導する能力を有し得、そして/または化学誘導物質として作用し得る。SGP28はまた、細胞結合および/または細胞成長の誘導において役割を有し得る。
【0012】
SGP28を発現する前立腺癌および他の癌の処置への多数の有効なアプローチが本明細書中に記載される。このタンパク質の細胞外および可溶性の性質は、SGP28およびその機能を標的にする分子、ならびにSGP28と相互作用する他のタンパク質、因子およびリガンドを標的とする分子を使用する多数の治療的アプローチを提示する。これらの治療的アプローチとしては、抗SGP28抗体を用いる抗体治療、低分子治療、およびワクチン治療が挙げられる。さらに、前立腺癌において上方調節発現されるとすると、SGP28は、前立腺癌についての診断マーカー、病期判定(staging)マーカーおよび/または予後判定マーカーとして有用であり、そして同様に、このタンパク質を発現するほかの癌についてのマーカーであり得る。
【0013】
本発明は、本明細書中に記載されるようなSGP28遺伝子の全てまたは一部に対応するかまたは相補的なポリヌクレオチド、mRNA、および/またはコード配列を、好ましくは単離された形態で提供し、これらとしては、SGP28タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、および関連分子、SGP28遺伝子またはmRNA配列もしくはその部分に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ならびにSGP28遺伝子、mRNAにかもしくはSGP28コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドが挙げられる。cDNAおよびSGP28をコードする遺伝子を単離するための手段もまた提供される。SGP28ポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、およびSGP28遺伝子産物の発現のための宿主ベクター系もまた提供される。
【0014】
本発明はさらに、SGP28タンパク質およびそのポリペプチドフラグメント、ならびにSGP28タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウス抗体および他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、検出可能なマーカーで標識される抗体、放射性核種に結合体化される抗体、トキシン、または他の治療的組成物が含まれる。
【0015】
本発明はさらに、種々の生物学的サンプル中のSGP28ポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在を検出するための方法、ならびにSGP28を発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明はさらに、種々の治療的組成物および治療ストラテジーを提供し、これらとしては、具体的には前立腺の癌を処置するための、抗体、ワクチンおよび低分子治療が含まれる。
【0016】
(発明の詳細な説明)
本発明は、前立腺癌の診断および治療のための方法および組成物に関し、これらは、ヒトSGP28遺伝子に対応する単離されたポリヌクレオチド、SGP28遺伝子によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、ならびにSGP28タンパク質を特異的に認識し得るかまたは特異的に結合し得る抗体を利用する。本発明は、部分的に、抑制サブトラクティブ(suppression subtraction)ハイブリダイゼーションクローニングによるSGP28遺伝子に対応するcDNAフラグメントの単離に基づく。このcDNA(36P1G3と称する)を配列決定し、そして主要な公共のデータベースで公知の遺伝子およびESTに対する相同性について分析した。36P1G3cDNAは、ヒSGP28遺伝子の報告された配列の一部に同一性を示した。次いで36P1G3に対応する遺伝子を特異的に増幅するように設計されたプライマーを使用して、前立腺癌異種移植片、正常前立腺、および種々の他の正常組織におけるSGP28の発現を特徴付けた。SGP28のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、報告されていた(Kjeldsenら,1996,FEBS Lett.380:246−250;Kratzschmarら,1996,EurJ Biochem 236(3):827−36)。
【0017】
SGP28の発現プロフィールは、これが前立腺癌の理想的な診断マーカーおよび治療マーカーを表し得ることを示唆する。ノーザンブロット発現分析によって決定される場合、正常組織におけるSGP28mRNAの発現は、前立腺、精巣および卵巣に高度に制限される(図1A〜B)。非常に低いレベルの発現が膵臓において検出可能であった(図1A)。興味深いことに、前立腺および卵巣は、2.4kbの転写物を示すが、一方精巣は、1.6kbのメッセージを発現する(この1.6kbのメッセージは、別のSGP28ファミリーメンバーを示し得る)。さらに、SGP28mRNA発現は、進行した転移期疾患由来の前立腺癌異種移植片において高度に上方調節される(図1C)。さらに、SGP28タンパク質は、高レベルでこれらの同じ前立腺癌異種移植片ならびに前立腺癌臨床切片において発現される(図2)。対応する正常/癌性前立腺癌臨床切片において、正常に比較してSGP28タンパク質の高レベルの過剰発現が検出され、これは、SGP28が前立腺癌についての優秀な診断マーカーおよび/または治療標的を提供するということを示す。免疫組織化学的分析は、SGP28タンパク質が、癌性前立腺および前癌前立腺の管腔内ならびに転移性疾患において高レベルで発現および分泌されることを確立した。PSAと同様に、SGP28は、管腔内に分泌され、そして正常な構造が妨害される組織における血清に浸入する。
【0018】
そうでないと規定されない限り、本明細書に使用される当該分野の全ての用語、表記法、およびその他の科学的用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さおよび/または容易な参照のために本明細書において定義され、そしてそのような定義を本明細書に含ませることは、当該分野で一般に理解されるものに対する実質的な差異を表すものと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書において記載されそして参照される技術および手順は、一般に、十分に理解されており、そして当業者によって従来の方法(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.に記載される広汎に利用される分子クローニング法)を使用して一般に利用される。適切であれば、市販されるキットおよび試薬の使用を含む手順は、そうでないと注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロトコルおよび/またはパラメータに従って行われる。
【0019】
本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺嚢(prostate capsule)を通して拡張した前立腺癌を意味し、そしてアメリカ泌尿器科協会(AUA)システムにおけるC段階の疾患、Whitmore−JewettシステムにおいてC1−C2段階の疾患、およびTNM(腫瘍、結節、転移)システムにおいてT3−T4段階およびN+の疾患を含むことを意味する。一般に、外科は、局所的に進行した疾患を有する患者にとって推奨されておらず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した(器官に限定された)前立腺癌を有する患者と比較して実質的により有利でない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えての硬化または前立腺の基底部を超えての非対称もしくは効果の触診可能な証拠によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺嚢を侵襲または貫通し、外科的余地に拡張するか、または精嚢を侵襲した場合、現在、過激な前立腺削除後に病理学的に診断される。
【0020】
本発明において使用される場合、用語「転移性前立腺癌」および「転移性疾患」は、領域性のリンパ節または離れた部位に広がっている前立腺癌を意味し、そしてAUAシステム下でのD段階の疾患およびTNMシステム下でのTxNxM+段階を含むことを意味する。局所的に進行した前立腺癌の場合と同様に、外科手術は、一般的に、転移性疾患を有する患者のために指示されておらず、そして体液性(アンドロゲン切除)治療は、好ましい処置態様である。転移性の前立腺癌を有する患者は、最終的には、処置の開始後12〜18ヶ月内にアンドロゲン抵抗性の状態を発症し、そしてこれらの患者の約半分がその後6ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移についての最も一般的な部位は、骨である。前立腺癌の骨転移は、全てを考慮して、特徴的には、溶骨性であるというよりむしろ造骨細胞的である(正味の骨形成を生じる)。骨転移は、脊椎において最も頻繁に見出され、続いて大腿、骨盤、胸郭、頭蓋骨、および上腕骨である。転移についての他の一般的な部位には、リンパ節、肺、肝臓、および脳が含まれる。転移性前立腺癌は、代表的には、オープンまたは腹腔鏡検査胎盤リンパ節切除、全身放射核種スキャン、骨格ラジオグラフィー、および/または骨病変生検によって診断される。
【0021】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変された形態の、少なくとも10塩基または塩基対長のヌクレオチドのポリマー形態を意味し、そしてDNAの一本鎖および二本鎖の形態を含むことを意味する。
【0022】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド」は、少なくとも10個のアミノ酸のポリマーを意味する。明細書を通じて、アミノ酸についての標準的な3文字または1文字の表記が、使用される。
【0023】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの状況で使用される用語「ハイブリダイズ(hybridize)」、「ハイブリダイズする(hybridizing)」、「ハイブリダイズする(hybridizes)」などは、従来のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、例えば、50%ホルミルアミド/6×SSC/0.1%SDS/100μg/ml ssDNA中でのハイブリダイゼーション(ここで、ハイブリダイゼーションの温度は、37℃を超え、そして0.1×SSC/0.1%SSC/0.1%SDSにおける洗浄についての温度は55℃を超える)、そして最も好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をいうことを意味する。
【0024】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性させられたDNAが再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにし、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience Publishers(1995)を参照のこと。
【0025】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得る:(1)洗浄のために低いイオン強度および高温(例えば、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウム、50℃)を使用すること;(2)変性剤(例えば、ホルムアミド)をハイブリダイゼーションの間に使用する(例えば、0.1%のウシの血清アルブミンを有する50%(v/v)のホルムアミド/0.1%のFicoll/0.1%のポリビニルピロリドン/750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを有するpH6.5の50mMの燐酸ナトリウム緩衝液、42℃)を使用すること;または(3)50%のホルムアミド、5×SSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のDNA(50μg/ml)、0.1%のSDS、および10%のデキストラン硫酸を42℃で使用し、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中で42℃で、そして50%のホルムアミド中で55℃で洗浄し、続いて55℃でEDTAを含有している0.1×SSCから構成される高ストリンジェンシーの洗浄をすること。
【0026】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989によって記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度、および%SDS)の使用を含む。これは、上記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下を含む溶液中での37℃、一晩のインキュベーションである:20%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20mg/ml変性剪断サケ精子DNA、続いて約37℃〜50℃で1×SSC中でフィルターを洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子(例えば、プローブ長など)を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
【0027】
アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況においてはまた、用語「相同性」は、BLAST分析の保存性アミノ酸の判断基準を使用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。例えば、同一性%の値は、WU−BLAST−2(Altschulら、Methods in Enzymology,266:460−480(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html)によって生成され得る。アミノ酸置換(これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる)に関するさらなる詳細は以下に提供される。
【0028】
さらなる定義は、以下のサブセクションを通じて提供される。
【0029】
(SGP28ポリヌクレオチド)
本発明の一つの局面は、SGP28遺伝子、mRNAおよび/またはコード配列(好ましくは、SGP28タンパク質およびそのフラグメント、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、SGP28遺伝子もしくはmRNA配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにSGP28遺伝子、mRNAもしくはSGP28をコードするポリヌクレオチド(集合的に、「SGP28ポリヌクレオチド」)にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における)のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、SGP28遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載されるSGP28遺伝子およびタンパク質、ならびに他のSGP28タンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他のSGP28タンパク質および改変体は、一般的に、SGP28コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約50%のアミノ酸同一性、そして少なくとも約60%のアミノ酸相同性を共有し(BLAST標準を使用して)、より好ましくは、70%以上の相同性を共有する(BLAST標準を使用して)。
【0030】
SGP28ポリヌクレオチドの1つの実施形態は、表1(配列番号2)に示される配列を有しているSGP28ポリヌクレオチドである。SGP28ポリヌクレオチドは、表1(配列番号2)に示されるヒトのSGP28のヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド(ここで、TはまたUでもあり得る);SGP28タンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチド;上記の配列に相補的である配列;または上記の任意の配列のポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、ヌクレオチド残基数3〜ヌクレオチド残基数776の、表1(配列番号2)に示される配列を有するポリヌクレオチド(ここで、TはまたUであり得る)を含む。
【0031】
本明細書中で開示される本発明の典型的な実施形態は、タンパク質およびそのフラグメントをコードする配列のような、SGP28 mRNA配列の特異的な部分をコードするSGP28ポリヌクレオチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は以下を含む:表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸1からおよそアミノ酸10をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸20からおよそアミノ酸30をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸30からおよそアミノ酸40をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸40からおよそアミノ酸50をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸50からおよそアミノ酸60をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸60からおよそアミノ酸70をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸70からおよそアミノ酸80をコードするポリヌクレオチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸80からおよそアミノ酸90をコードするポリヌクレオチド、および表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸90からおよそアミノ酸100をコードするポリヌクレオチドなど。この概要に従って、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のアミノ酸100〜258のアミノ酸配列の一部をコードするポリヌクレオチド(少なくとも10個のアミノ酸)が、本発明の典型的な実施形態である。SGP28タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドもまた、意図される。例えば、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸1(または20、または30、または40など)からおよそアミノ酸20(または30、または40、または50など)までをコードするポリヌクレオチドが、当該分野で周知の種々の技術によって作製され得る。
【0032】
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態として、SGP28タンパク質配列中に含まれる1つ以上の生物学的なモチーフをコードするSGP28のポリヌクレオチドフラグメントが挙げられる。1つの実施形態においては、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、β−ディフェンシンに対して相同性を示す、SGP28の1つ以上の領域をコードし得る。本発明の1つの実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、1つ以上の細胞外タンパク質SCP/Tpx−1/Ag5/PR−1/Sc7サイン(signature)配列をコードし得る。本発明のなお別の実施形態においては、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、1つ以上のSGP28選択的スプライシング改変体について特有である配列をコードし得る。
【0033】
上記の段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の使用を有する。SGP28が前立腺癌において過剰発現されることが示されているので、これらのポリヌクレオチドは、正常な組織対癌性組織中でのSGP28遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代表的には、SGP28タンパク質の特異的な領域をコードするポリヌクレオチドは、SGP28遺伝子産物の特異的な領域中の混乱状態(例えば、欠失、挿入、点変異など)の存在を評価するために使用され得る。例示的なアッセイとして、RT−PCRアッセイおよび一本鎖の立体構造多型性(SSCP)分析(例えば、Marrogiら、J.Cutan.Pathol.26(8):369−378(1999)を参照のこと)の両方が挙げられる。これらの両方ともが、タンパク質中のこれらの領域を試験するために、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。単一ヌクレオチドの多型性を検出するために配列を分析するためのアッセイおよび方法もまた、利用可能である(Irizarryら、2000、Nature Genetics 26(2):223−236)。
【0034】
本明細書中に開示される本発明の他の特に意図される実施形態は、ゲノムDNA、cDNA、リボザイム、およびアンチセンス分子(モルホリノアンチセンス分子を含む)、ならびに別の骨格に基づくかもしくは別の塩基を含有している核酸分子である。これらは、天然の供給源に由来するかまたは合成されるかには関係しない。例えば、アンチセンス分子は、RNAまたは他の分子であり得る。これらは、ホスホロチオエート誘導体のようなペプチド核酸(PNA)または非核酸分子を含み、塩基対依存性の様式でDNAまたはRNAに対して特異的に結合する。当業者は、SGP28ポリヌクレオチドおよび本明細書中に開示されているポリヌクレオチド配列を使用して核酸分子のこれらのクラスを容易に得ることができる。
【0035】
アンチセンス技術は、細胞内に配置された標的のポリヌクレオチドに結合する外因性のオリゴヌクレオチドの投与を必要とする。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドがそれらの細胞内標的(例えば、SGP28)に対して相補的であるという事実をいう。例えば、JackCohen,OLIGODEOXYNUCLEOTIDES,Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press、1989;およびSynthesis 1:1〜5(1998)を参照のこと。本発明のSGP28アンチセンスオリゴヌクレオチドは、S−オリゴヌクレオチド(ホスホロチオエート誘導体またはS−オリゴ、Jack Cohen、前出を参照のこと)のような誘導体を含む。これは、増強された癌細胞の増殖阻害作用を示す。S−オリゴ(ヌクレオシドホスホロチオエート)は、オリゴヌクレオチド(O−オリゴ)の等電アナログであり、ここでは、リン酸基の非架橋酸素原子が、イオウ原子で置き換えられている。本発明のS−オリゴは、イオウ輸送試薬である、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−1,1−ジオキサイドでの対応するO−オリゴの処理によって調製され得る。Iyer,R.P.ら、J.Org.Chem.55:4693−4698(1990);およびIyer,R.P.ら、J.Am.Chem.Soc.112:1253−1254(1990)を参照のこと。その開示は本明細書中で参考として完全に引用されている。本発明のさらなるSGP28アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる(例えば、Partridgeら、1996、Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6:169−175を参照のこと)。
【0036】
本発明のSGP28アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、最初の100個のN末端のコドンまたは最後の100個のC末端のコドンに対して相補的でありそしてそれに対して安定にハイブリダイズするか、あるいはSGP28ゲノムまたは対応するmRNAのATG開始部位と重複している、RNAまたはDNAであり得る。完全な相補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に対して相補的であるオリゴヌクレオチドの使用は、SGP28 mRNAに対する選択的なハイブリダイゼーションを可能にし、そしてプロテインキナーゼの他の調節サブユニットを特定するmRNAに対してはそうではない。好ましくは、本発明のSGP28アンチセンスオリゴヌクレオチドは、SGP28 mRNAに対してハイブリダイズする配列を有しているアンチセンスDNA分子の15〜30マーのフラグメントである。必要に応じて、SGP28アンチセンスオリゴヌクレオチドは、SGP28の最初の10個のN末端のコドンおよび最後の10個のC末端のコドン中の領域に対して相補的である30マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、SGP28の発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される。L.A.Couture & D.T.Stinchcomb;Trends Genet 12:510−515(1996)。
【0037】
本発明のこの局面のさらに特定の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的な増幅を可能にするプライマーおよびプライマーの対、ならびに本発明の核酸分子またはその任意の部分に対して選択的または特異的にハイブリダイズするプローブを含む。プローブは、検出可能なマーカー(例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素のような)で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中のSGP28ポリヌクレオチドの存在を検出するため、およびSGP28タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用され得る。このようなブローブの例として、表1(配列番号2)に示されるヒトのSGP28 cDNA配列の全てまたは一部を含有しているポリペプチドが挙げられる。SGP28 mRNAを特異的に増幅し得るプライマーの対の例はまた、以下の実施例に記載される。SGP28 mRNAを特異的に増幅し得るプライマーの対の例はまた、以下である:
5’−AGTTGCCTTTCCTAGCTCCACTCT−3’(配列番号4)
5’−TCCCTTTCCATACTCCACTCTTTG−3’(配列番号5)。
当業者によって理解されるように、多数の種々のプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そしてSGP28 mRNAを増幅および/または検出するために有効に使用され得る。
【0038】
本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドは、それが、SGP28遺伝子以外の遺伝子に対応するかもしくはそれら対して相補的である混入しているポリヌクレオチド、またはSGP28遺伝子産物もしくはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入しているポリヌクレオチドから、実質的に分離されている場合に、「単離されている」といわれる。当業者は、単離されたSGP28ポリヌクレオチドを得るための核酸の単離手順を容易に使用し得る。
【0039】
本発明のSGP28ポリヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない種々の目的のために有用である:SGP28遺伝子(単数または複数)、mRNA(単数または複数)、もしくはそれらのフラグメントの、増幅および/または検出のための、プローブおよびプライマーとしてのそれらの使用;前立腺癌および他の癌の診断および/または予後のための試薬としてのそれらの使用;特異的な前立腺細胞中へのカルシウムの侵入を阻害する分子を同定するためのツールとしてのそれらの使用;SGP28ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としてのそれらの使用;SGP28遺伝子(単数または複数)の発現および/またはSGP28の転写物(単数または複数)の翻訳を調節または阻害するためのツールとしてのそれらの使用;ならびに治療薬としてのそれらの使用。
【0040】
(SGP28の分子的特徴および生物学的特徴)
特異顆粒タンパク質28(SGP28)は、ヒト好中球の特殊顆粒から同定され、ヒト好中球の特異顆粒において発現される分泌分子である(Kjeldsenら、1996、FEBS Lett.380:246−250)。SGP28は、システインリッチ分泌タンパク質3(CRISP−3)として公知のタンパク質と同一である(Kratzschmarら、1996、Eur.J.Biochem.236:827−36)。SGP28/CRISP−3(本明細書中以後、SGP28と呼ぶ)は、いくつかのCRISPファミリーメンバータンパク質の間で保存される16システイン残基を含むC末端システインリッチ配列を含む258アミノ酸の29kDタンパク質である。SGP28は、ヒト、ゲッ歯類動物、およびウマに存在するシステインリッチ分泌タンパク質のファミリーに属し、このファミリーは、CRISP−1(Brooksら、1986、Eur.J.Biochem.161:13−18;Haendlerら、1993、Endocrinology 133:192−198;Kratzschmarら、1996、Eur.J.Biochem.236:827−36)、CRISP−2/TPX−1(Kasaharaら、1989、Genomics 5:527−534;Mizukiら、1992、Mamm.Genome 3:274−280)およびCRISP−3/SGP28(Haendlerら、1993、Endocrinology 133:192−198;Schambonyら、1998.Biochimica et Biophysica Acta 1387:206−216;Schwidetzky、1995、Biochem.J.309:831−836)を含む。
【0041】
ヒトSGP28は、好中球の顆粒において同定されており、そしてSGP28の発現は、唾液腺、膵臓、前立腺、精巣上体、卵巣および結腸において検出されている(Kratzschmarら、1996、Eur.J.Biochem.236:827−36)。マウスCRISPファミリータンパク質の発現は、B細胞、唾液腺、涙腺、精巣上体、精巣、および粘膜細胞において検出され(Pfistererら、1996、Mol.Cell.Biol.16:6160−6168;Haendlerら、1999 J.Cell.Physiology 178:371−378、Haendlerら、1997、Eur.J.Biochem.250:440−446)、そしてマウスCRISP−2およびCRISP−3は、アンドロゲン調節される(Haendlerら、1999 J.Cell.Physiology 178:371−378、Haendlerら、1997、Eur.J.Biochem.250:440−446)。SGP28および他のCRISPファミリーメンバーは、非特異的な先天免疫においてある役割を有し得ることが示唆されている(Kjeldsenら、1996、FEBS Lett.380:246−250;Pfistererら、1996、Mol.Cell.Biol.16:6160−6168、Haendlerら、1999 J.Cell Physiology 178:371−378)。
【0042】
以下の実施例にさらに記載されるように、SGP28遺伝子およびSGP28タンパク質は、種々の方法で特徴付けられている。例えば、ヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列の分析が、SGP28配列中の保存された構造エレメント、トポロジーの特徴、翻訳後修飾、および関連する可能性のある分子を同定するために行われた。SGP28 mRNAの発現のノーザンブロット分析が、種々のSGP28メッセージを発現している正常な組織および癌性の組織の範囲を確立するために行われた。実験によってトランスフェクトされた細胞および組織ならびに癌細胞および癌組織におけるSGP28タンパク質の発現のウェスタンブロットおよび免疫組織化学分析が、発現および分泌パターンを決定するために行われた。SGP28は、8.08のpIおよび29.0kDaの計算された分子量を有する。
【0043】
いくつかの分泌タンパク質が、前立腺癌において記載されており、これらのうちの多くが、腫瘍形成および進行のプロセスに関与することが示された(Inoue K.、2000;Clin.Cancer Res.6:2104−19;Dow JKら、2000、Urology 55:800−6)。SGP28が、分泌タンパク質であり、その潜在的な機能の1つは、前立腺癌および転移性の疾患の微小環境を調節することである。この可能性を試験するために、SGP28は、組換えGST−SGP28またはSGP28−Myc/His形態として発現され得、そして精製され得る。次いで、精製された組換えSGP28(例えば、GST−SGP28またはSGP28−Myc/His)は、前立腺の環境を再利用する種々の細胞型(前立腺上皮細胞、前立腺腫瘍細胞株、前立腺間質細胞、前立腺内皮細胞および前立腺神経内分泌細胞を含む)とともにインキュベートされる。さらに、組換えSGP28はまた、転移性部位(例えば、骨髄細胞および免疫系の細胞)において見出される細胞とともにインキュベートされる。SGP28のインタクトな細胞への結合は、FACS分析によって、そして熱量アッセイによって検出される。この分析は、SGP28に結合し、そしてSGP28に応答し得る細胞集団を同定するので、価値がある。さらに、標的細胞集団の同定は、SGP28レセプターを単離および同定する手段を提供し得る。
【0044】
SGP28は、ディフェンシンタンパク質(特に、β−ディフェンシン)に強い相同性を有する。β−ディフェンシンは、上皮細胞によって主に産生される分泌産物である(O’Neil DAら、1999、J.Immunol.163:6718−24;Schroder JM、Harder J.、1999、Int.J.Biochem.Cell Biol.31:645−51)。ディフェンシンは、感染を予防する際、および上皮組織の免疫を保護する際に重要な役割を果たす。さらに、ヒトHNP1ディフェンシンは、インビトロでの腫瘍の死を誘導することが示されている。細胞死におけるSGP28の役割を研究する場合、精製された組換えSGP28は、上に列挙された種々の細胞型とともにインキュベートされ、そしてAnnexin V染色細胞のFACS分析を使用してアポトーシス活性について分析される。SGP28はまた、化学誘因物質として機能し得、これは、他のディフェンシン分子について示されている(Yang Dら、Leukoc Biol.2000;68:9−14、Yang Dら、Science.1999、286(5439):525−8)。化学走性アッセイを使用して、種々の型の細胞(上皮細胞、間質細胞、内皮細胞、ならびに単球、リンパ球および樹状細胞を含む)の移動に対するSGP28の効果を評価し得る。
【0045】
(SGP28をコードする核酸分子の単離)
本明細書中に記載されているSGP28 cDNA配列は、SGP28遺伝子産物(単数または複数)をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにSGP28遺伝子産物のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離、SGP28遺伝子産物の選択的スプライシングされたイソ型、対立遺伝子改変体、および変異形態の単離を可能にする。SGP28遺伝子をコードする全長のcDNAを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である(例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、New York、1989;Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、Wiley and Sons,995)。例えば、λファージクローニング方法論が、商業的に利用可能なクローニング系(例えば、Lambda ZAP Express、Stratagene)を使用して便利に使用され得る。SGP28遺伝子のcDNAを含有しているファージクローンが、標識されたSGP28 cDNAまたはそのフラグメントでプローブすることによって同定され得る。例えば、1つの実施形態においては、SGP28 cDNA(表1;配列番号2)またはその一部が合成され得、そしてSGP28遺伝子と重複しかつそれに対応する全長のcDNAを回収するためのプローブとして使用され得る。SGP28遺伝子自体が、ゲノムDNAライブラリー、細菌の人工染色体ライブラリー(BAC)、酵母の人工染色体ライブラリー(YAC)などを、SGP28 DNAプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって単離され得る。
【0046】
(組換えDNA分子および宿主−ベクター系)
本発明はまた、SGP28ポリヌクレオチドを含有している組換えDNA分子またはRNA分子(ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、BAC、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない)、ならびにそのような組換えDNA分子またはRNA分子で形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合は、組換えDNA分子またはRNA分子は、インビトロで分子操作に供されたDNA分子またはRNA分子である。このような分子を作製するための方法は周知である(例えば、Sambrookら、1989(前出)を参照のこと)。
【0047】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中に、SGP28ポリヌクレオチドを含有している組換えDNA分子を含有している、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例として、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)、または昆虫細胞(例えば、バキュロウイルスに感染可能な細胞(例えば、Sf9細胞))が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例として、種々の前立腺癌細胞株(例えば、LNCaP、PC−3、DU145、LAPC−4、TsuPr1、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株)、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多数の哺乳動物細胞(例えば、COS細胞、CHO細胞、293細胞、293T細胞)が挙げられる。より詳細には、SGP28のコード配列を含有しているポリヌクレオチドが、日常的に使用されそして当該分野で広範に公知の任意の多数の宿主−ベクター系を使用して、SGP28タンパク質またはそのフラグメントを作製するために使用され得る。
【0048】
SGP28タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な宿主−ベクター系が、利用可能である。例えば、Sambrookら、1989(前出);Current Protocols in Molecular Biology、1995(前出)を参照のこと。哺乳動物での発現に好ましいベクターとして以下が挙げられるが、これらに限定されない:pcDNA 3.1 myc−His−tag(Invitrogen)およびレトロウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら、1991、MCB 11:1785)。これらの発現ベクターを使用して、SGP28は好ましくは、いくつかの前立腺癌および非前立腺細胞株(例えば、293、293T、rat−1、3T3、PC−3、LNCaP、およびTsuPr1を含む)中で発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、SGP28タンパク質またはそのフラグメントの産生に有用である。このような宿主−ベクター系は、SGP28およびSGP28変異の機能的な特性を研究するために使用され得る。
【0049】
SGP28遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそのフラグメントは、以下を含むがこれらに限定されない、種々の用途を有する:抗体を生成すること、ならびにSGP28遺伝子産物に結合するリガンドおよび他の試薬および細胞構成成分を同定するための方法における使用。SGP28タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断アッセイおよび予想アッセイ、画像化方法論(特に、癌の画像化を含む)、およびSGP28タンパク質の発現によって特徴付けられるヒトの癌(前立腺癌を含むがこれに限定されない)の管理における治療方法において有用であり得る。SGP28タンパク質の検出に有用な種々の免疫学的アッセイが、意図される。これは、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫測定法(ELISA)、酵素結合免疫蛍光アッセイ(ELIFA)、免疫細胞化学的方法などを含むが、これらに限定されない。このような抗体は標識され得、そして前立腺細胞を検出し得る免疫学的な画像化試薬として使用され得る(例えば、放射性シンチグラフィー画像化方法において)。SGP28タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌のワクチンを作製することにおいても特に有用であり得る。
【0050】
(SGP28タンパク質)
本発明の別の局面は、SGP28タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のSGP28タンパク質は、本明細書中で特に同定されるもの、ならびに、以下に概説される方法に従って過度の実験を行うことなく単離/生成されそして特徴付けられ得る程度の、対立遺伝子改変体、保存的置換改変体、およびホモログを含む。種々のSGP28タンパク質またはそのフラグメントの一部を組合せた融合タンパク質、ならびにSGP28タンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質もまた、含まれる。このようなSGP28タンパク質は、まとめて、SGP28タンパク質、本発明のタンパク質、またはSGP28と呼ばれる。本明細書中で使用される場合は、用語「SGP28ポリペプチド」は、少なくとも10アミノ酸の、好ましくは少なくとも15アミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたはSGP28タンパク質をいう。
【0051】
SGP28タンパク質の特定の実施形態は、表2(配列番号3)に示されるヒトのSGP28のアミノ酸配列(その中に示されているアミノ酸残基番号1からおよそアミノ酸残基番号258まで)を有しているポリペプチドを含む。SGP28タンパク質の別の特定の実施形態は、表2(配列番号3)に示されるヒトのSGP28のアミノ酸配列(その中に示されているおよそアミノ酸残基番号33からおよそアミノ酸残基番号258まで)を有しているポリペプチドを含む。SGP28フラグメントの特定の実施形態は、表2(配列番号3)に示されるSGP28のタンパク質配列のアミノ酸1〜32、またはアミノ酸残基150〜160(VVGHYTQVVWY;配列番号6)およびアミノ酸残基170〜182(YYVCQYCPAGNW;配列番号7)の細胞外タンパク質SCPモチーフの一方もしくは両方を含む群より選択されるペプチドを含む。
【0052】
一般的には、ヒトSGP28の天然に存在している対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的な同一性および相同性を共有する(例えば、90%以上の同一性)。代表的には、SGP28タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるSGP28配列中に保存的なアミノ酸置換を含むか、またはSGP28ホモログ中の対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。SGP28対立遺伝子改変体の1つのクラスは、特定のSGP28アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、その配列からの極端な逸脱(例えば、非保存的置換、短縮挿入、またはフレームシフト)をさらに含む、タンパク質である。
【0053】
保存的なアミノ酸の置換は、しばしば、そのタンパク質の立体構造または機能のいずれをも変更することなく、タンパク質中で行われ得る。このような変化は、イソロイシン(I)、バリン(V)、およびロイシン(L)のいずれかをこれらの疎水性アミノ酸の他の任意の代わりに用いること;グルタミン酸(E)に代えてのアスパラギン酸(D)での置換およびその逆;アスパラギン(N)に代えてのグルタミン(Q)での置換およびその逆;ならびにスレオニン(T)に代えてのセリン(S)での置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えられ得る。例えば、グリシン(G)およびアラニン(A)は、アラニン(A)とバリン(V)がそうであり得るように、しばしば、互換可能であり得る。メチオニン(M)(これは、比較的疎水性である)は、頻繁にロイシンおよびイソロイシンと互換可能であり得、そして時にバリンと互換可能であり得る。リジン(K)およびアルギニン(R)は頻繁に、アミノ酸残基の重要な特性がその変化でありそしてこれらの2つのアミノ酸残基の異なるpKが重要ではない位置において、互換可能である。なお他の変化が、特定の環境下では「保存的である」と考えられ得る。
【0054】
SGP28タンパク質(改変体を含む)は、表2(配列番号3)のアミノ酸配列を有しているSGP28タンパク質と共通している少なくとも1つのエピトープを含む。その結果、SGP28タンパク質または改変体に対して特異的に結合する抗体もまた、表2(配列番号3)のアミノ酸配列を有しているSGP28タンパク質に対して特異的に結合する。1つのクラスのSGP28タンパク質改変体は、表2(配列番号3)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を共有する。SGP28タンパク質改変体のより特定のクラスは、上記の細胞外タンパク質SCPモチーフを含む。好ましいSGP28タンパク質改変体は、本明細書中に記載されるデフェンシン機能の1つ以上を示し得る。これは例えば、腫瘍死を誘導するか、または化学誘引および/もしくは細胞の移動を誘導する能力を含む。
【0055】
SGP28タンパク質は、多くの形態(好ましくは、単離された形態)で具体化され得る。本明細書中で使用される場合は、タンパク質は、物理的、機械的、または化学的方法が、通常はそのタンパク質と会合している細胞構成成分からSGP28タンパク質を取り出すために使用される場合に、「単離される」といわれる。当業者は、単離されたSGP28タンパク質を得るための標準的な精製方法を容易に使用し得る。精製されたSGP28タンパク質分子は、抗体または他のリガンドに対するSGP28の結合を損なう他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される使用に依存する。SGP28タンパク質の実施形態は、精製されたSGP28タンパク質および機能的であり可溶性であるSGP28タンパク質を含む。1つの形態においては、このような機能的であり可溶性であるSGP28タンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドに結合する能力を保持している。
【0056】
本発明はまた、SGP28アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含有しているSGP28ポリペプチド(例えば、表2(配列番号3)に示されるSGP28のアミノ酸配列の一部に対応するポリペプチド)を提供する。本発明のこのようなポリペプチドは、SGP28タンパク質の特性(例えば、SGP28タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の生成を誘発する能力)を示す。
【0057】
本明細書中に開示される本発明の実施形態として、アミノ酸の挿入、欠失、および置換を有しているポリペプチドのような、広範な種々の当該分野で受容されるSGP28の改変体を含む。SGP28改変体は、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング、およびPCR変異誘発のような、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発[Carterら、Nucl.Acids Res.,13:4331(1986);Zollerら、Nucl.Acids Res.,10:6487(1987)]、カセット変異誘発[Wellsら、Gene、34:315(1985)]、制限選択変異誘発[Wellsら、Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986)]または他の公知の技術が、SGP28改変体DNAを産生するためにクローン化されたDNAに対して行われ得る。スキャニングアミノ酸分析もまた、連続している配列にそって1つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。中でも、好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミン酸として、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的には、この群の中で好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素の後の側鎖を排除し、そして改変体の主鎖の立体構造を変更する可能性が少ないからである。アラニンはまた、それが最も一般的なアミノ酸であるので、典型的に好ましい。さらに、アラニンは、埋没した部位および露出した部位の両方において頻繁に見出される[Creighton、The Proteins、(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。アラニン置換が十分な量の改変体を生じない場合には、等配電子のアミノ酸が使用され得る。
【0058】
上記に議論されるように、請求される発明の実施形態として、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質の258個未満のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態として、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸1からおよそアミノ酸10からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸20からおよそアミノ酸30からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸30からおよそアミノ酸40からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸40からおよそアミノ酸50からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸50からおよそアミノ酸60からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸60からおよそアミノ酸70からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸70からおよそアミノ酸80からなるポリペプチド、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸80からおよそアミノ酸90からなるポリペプチド、および表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸90からおよそアミノ酸100からなるポリペプチドなどが挙げられる。この概要に従って、SGP28タンパク質のアミノ酸100〜258のアミノ酸配列の一部をからなるポリペプチドが、本発明の典型的な実施形態である。SGP28タンパク質のより大きな部分をからなるポリペプチドもまた、意図される。例えば、表2(配列番号3)に示されるSGP28タンパク質のおよそアミノ酸1(または20、または30、または40など)からおよそアミノ酸20(または30、または40、または50など)からなるポリペプチドが、当該分野で周知の種々の技術によって作製され得る。
【0059】
本明細書中で開示される発明のさらなる例示的な実施形態として、表2(配列番号3)に示されるSGP28ポリペプチド配列中に含まれる生物学的なモチーフの1つ以上のアミノ酸残基を含有しているSGP28ポリペプチドが挙げられる。これらのモチーフまたは本明細書中に記載の目的の他の選択領域の1つ以上を含むSGP28ポリペプチドは、代表的には、選択されたモチーフの一方または両方の側に隣接SGP28タンパク質配列のさらなる5〜25またはそれより多くのアミノ酸残基を含む。1つの実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、デフェンシンに対して相同性を示す、SGP28の領域の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、SGP28 N−グリコシル化部位(例えば、NCSN(配列番号8)(残基252〜255(配列番号3に示される最初のアミノ酸残基からの番号))の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、SGP28プロテインキナーゼCリン酸化部位(例えば、SLK(残基106〜108および/または231〜233))の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、SGP28カゼインキナーゼIIリン酸化部位(例えば、SWFD(残基128〜131)(配列番号9)および/またはSCPD(残基206〜209)(配列番号10))の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、チロシンキナーゼリン酸化部位(例えば、KCGENLY(残基108〜114)(配列番号11))の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、N−ミリストイル化部位(例えば、GLLPSF(残基26〜31)(配列番号12)、GCCNAY(残基164〜169)(配列番号13)、GNWANR(残基188〜193)(配列番号14)、GAPCAS(残基201〜206)(配列番号15)、および/またはGLCTNG(残基214〜219(配列番号16))の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、細胞外タンパク質SCP記号配列(例えば、配列番号3のアミノ酸残基150〜160および/または配列番号3のアミノ酸残基179〜190)の1つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、SGP28の1つ以上の推定HLA−A2結合ペプチド(例えば、アミノ酸2〜10(TLFPVLLFL;配列番号17)、アミノ酸6〜14(VLLFLVAGL;配列番号18)、アミノ酸30〜38(ALLTTQTQV;配列番号19)、アミノ酸142〜150(VVWYSSYLV;配列番号20)、アミノ酸222〜230(TLTCKHQLV;配列番号21)、アミノ酸175〜183(GNWANRLYV;配列番号22)、アミノ酸7〜15(LLFLVAGLL;配列番号23)、アミノ酸141〜149(QVVWYSSYL;配列番号24)、アミノ酸134〜142(AVVGHYTQV;配列番号25)、およびアミノ酸211〜219(DLYSNCKSL;配列番号26)を含み得る。これらの発明の関連する実施形態は、上記に議論される種々のモチーフの組合せを含有しているポリペプチドを含み、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフ内または介在している配列内のいずれかに挿入、欠失、または置換を含まない。
【0060】
SGP28ポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒトのSGP28タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、標準的なペプチド合成技術を使用して、または当該分野で周知の化学的な切断方法を使用して、生成され得る。あるいは、組換え方法が、SGP28タンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を作製するために使用され得る。これに関して、本明細書中に記載されるSGP28をコードする核酸分子は、SGP28タンパク質の定義されるフラグメントを作製するための手段を提供する。SGP28ポリペプチドは、ドメイン特異的抗体(例えば、SGP28タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体)を作製しそして特徴付けることにおいて、SGP28またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞性因子を同定することにおいて、そして癌のワクチンを含むがこれに限定されない種々の治療の状況において、特に有用である。特に興味深い構造を含有しているSGP28ポリペプチドが、以下を含む当該分野で周知の種々の分析技術:例えば、Chou−Fasman、Garnier−Robson,Kyte−Doolittle、Eisenberg、Karplus−Schultz、もしくはJameson−Wolf分析の方法を使用して、または免疫原性に基づいて、推定され得、そして/または同定され得る。このような構造を含有しているフラグメントは、サブユニット特異的抗SGP28抗体を作製すること、またはSGP28に結合する細胞性因子を同定することにおいて、特に有用である。
【0061】
以下の実施例に記載されている特定の実施形態においては、SGP28の分泌された形態は、C末端の6×HisおよびMYCタグを有しているSGP28をコードするCMVによって駆動される発現ベクター(pcDNA3.1/mycHIS,Invitrogen)でトランスフェクトされた293T細胞中で簡便に発現され得る。培養培地中に分泌されたHISタグ化SGP28は、ニッケルカラムおよび標準的な技術を使用して精製され得る。あるいは、APタグ系が使用され得る。SGP28の発現のための種々の構築物が、以下の実施例に記載される。
【0062】
共有結合改変のようなSGP28の改変が、本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の1つの型として、SGP28の選択された側鎖またはN末端もしくはC末端の残基と反応し得る有機誘導試薬との、SGP28ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内に含まれるSGP28ポリペプチドの共有結合改変の別の型は、ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを変更することを含む。「ネイティブなグリコシル化パターンを変更する」とは、ネイティブの配列のSGP28中に見出される1つ以上の炭水化物部分を欠失させること(根本的なグリコシル化部位を除去することか、または化学的および/もしくは酵素的な手段によってグリコシル化を欠失させることのいずれかによる)、ならびに/あるいは、ネイティブの配列のSGP28中には存在しない1つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味するように、本明細書中の目的のために意図される。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および比率を変化させることを含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化における質的変化を含む。SGP28の共有結合改変の別の型は、種々の非タンパク質性のポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン)の1つに対して、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号;同第4,301,144号、同第4,670,417号;同第4,791,192号;または同第4,179,337号に記載される様式で、SGP28ポリペプチドを連結することを含む。
【0063】
本発明のSGP28はまた、別の、異種のポリペプチドまたはアミノ酸の配列に対して融合されたSGP28を含む、キメラ分子を形成するように改変され得る。1つの実施形態においては、このようなキメラ分子は、ポリヒスチジンエピトープタグとのSGP28の融合体を含む。これは、固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。エピトープタグは、一般的には、SGP28のアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。別の実施形態においては、キメラ分子は、イムノグロブリンまたはイムノグロブリンの特定の領域との、SGP28の融合体を含み得る。2価の形態のキメラ分子(「免疫付着因子(immunoadhesin)」とも呼ばれる)については、このような融合は、IgG分子のFc領域に対してであり得る。Ig融合体は、好ましくは、Ig分子内の少なくとも1つの可変領域の代わりに、SGP28ポリペプチドの可溶性の(膜貫通ドメインを欠失させられたかまたは不活化された)形態の置換を含む。特に好ましい実施形態においては、イムノグロブリン融合体は、IgG1分子の、ヒンジ、CH2およびCH3領域、またはヒンジ、CH1、CH2、およびCH3領域を含む。イムノグロブリン融合体の産生については、1995年6月27日に発行された、米国特許第5,428,130号をもまた参照のこと。
【0064】
(SGP28抗体)
本発明の別の局面は、SGP28タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、SGP28タンパク質に対して選択的に結合し、そして非SGP28タンパク質およびポリペプチドに対しては結合しない(または弱く結合する)。特に意図される抗SGP28抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび/または1つ以上の相補性決定領域を含有しているフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合は、抗体フラグメントは、その標的(すなわち、抗原結合領域)に対して結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。
【0065】
いくつかの適用については、特定のSGP28タンパク質および/または特定の構造ドメイン中のエピトープと特異的に反応する抗体を作製することが所望され得る。例えば、癌の治療および診断用の画像化の目的に有用である好ましい抗体は、癌細胞中で発現されるSGP28タンパク質の細胞外領域中のエピトープと反応する抗体である。このような抗体は、本明細書中に記載されているSGP28タンパク質を使用して作製され得るか、または免疫原としてその推定される細胞外ドメインに由来するペプチドを使用して作製され得る。これに関して、図1に示されるSGP28タンパク質配列を参照して、膜貫通ドメインに対してアミノ末端の配列の領域が選択され得、そして細胞外特異的SGP28抗体を惹起および選択するための適切な免疫原およびスクリーニング試薬を設計するために使用され得る。
【0066】
本発明のSGP28抗体は、特に、前立腺癌の治療ストラテジー、診断および予後アッセイ、ならびに画像化方法論において有用であり得る。同様に、このような抗体は、他の癌の処置、診断、および/または予後において、SGP28がまた他の型の癌において発現されるかまたは過剰発現される範囲で、有用であり得る。本発明は、SGP28、ならびに変異体SGP28タンパク質およびポリペプチドの検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、一般的には、SGP28または変異体SGP28タンパク質を認識し得そして結合し得る1つ以上のSGP28抗体を含み、そして適切である場合には、以下を含むがこれらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイの形式で行われ得る:種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素結合免疫蛍光アッセイ(ELIFA)など。さらに、以下を含むがこれらに限定されない、前立腺癌を検出し得る免疫学的な画像化方法が本発明によって提供される:標識されたSGP28抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化方法。このようなアッセイは、前立腺癌(特に、進行した前立腺癌)の検出、モニタリング、および予後において臨床的に使用され得る。
【0067】
SGP28抗体はまた、SGP28および変異体SGP28タンパク質およびポリペプチドを精製するため、ならびにSGP28ホモログおよび関連する分子を単離するための方法においても使用され得る。例えば、1つの実施形態においては、SGP28タンパク質を精製する方法は、固体のマトリックスに対して結合されているSGP28抗体を、SGP28を含有している溶解物または他の溶液とともに、SGP28抗体がSGP28に結合することを可能とする条件下でインキュベートする工程;固体のマトリックスを不純物を排除するために洗浄する工程;および結合した抗体からSGP28を溶出させる工程を包含する。本発明のSGP28抗体の他の用途として、SGP28タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
【0068】
SGP28抗体はまた、例えば、SGP28タンパク質の生物学的活性を調節もしくは阻害すること、またはSGP28タンパク質を発現する癌細胞を標的化しそして崩壊させることによって、治療的にも使用され得る。前立腺癌および他の癌の抗体治療は、以下の別の章により詳細に記載される。
【0069】
抗体の調製のための種々の方法は、当該分野で周知である。例えば、抗体は、SGP28タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを、単離された形態または免疫結合形態で使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る(Antibodies:A Laboratory Manual、CSH Press、HarlowおよびLane編(1988);Harlow、Antibodies、Cold Spring Harbor Press、NY(1989))。タンパク質免疫原の例として、組換えSGP28(バキュロウイルス系、哺乳動物系などにおいて発現される)、SGP28細胞外ドメイン、AP−タグ化SGP28などが挙げられる。さらに、SGP28の融合タンパク質(例えば、SGP28と、GST、マルトース結合タンパク質(MBP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HisMax−TOPO、またはMycHisとの融合物(下記の実施例を参照のこと))もまた、使用され得る。
【0070】
特定の実施形態においては、表2(配列番号3)のアミノ酸配列のオープンリーディングフレームの全てまたはほとんどを含有しているGST融合タンパク質が産生され得、そして適切な抗体を作製するための免疫原として使用され得る。SGP28を発現するかまたは過剰発現する細胞もまた、免疫のために使用され得る。同様に、SGP28を発現するように操作された任意の細胞が、使用され得る。このようなストラテジーは、内因性のSGP28を認識する、増強された能力を有するモノクローナル抗体の産生を生じ得る。別の有用な免疫原は、ヒツジの赤血球の原形質膜に連結されたSGP28ペプチドを含む。
【0071】
表2(配列番号3)に示されるSGP28のアミノ酸配列は、抗体を作製するためのSGP28タンパク質の特定の領域を選択するために使用され得る。例えば、SGP28アミノ酸配列の疎水性および親水性分析が、SGP28構造中の親水性領域を同定するために使用され得る。免疫原性の構造を示すSGP28タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインが、当該分野で公知の種々の他の方法(例えば、Chou−Fasman、Garnier−Robson,Kyte−Doolittle、Eisenberg、Karplus−Schultz、またはJameson−Wolf分析)を使用して容易に同定され得る。HLA−A2に結合すると推定されるSGP28のペプチドが、抗体の生成のために選択され得る。このような推定HLA−A2結合ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:SGP28のアミノ酸2〜10(TLFPVLLFL;配列番号17),アミノ酸6〜14(VLLFLVAGL;配列番号18),アミノ酸30〜38(ALLTTQTQV;配列番号19),アミノ酸142〜150(VVWYSSYLV;配列番号20),アミノ酸222〜230(TLTCKHQLV;配列番号21),アミノ酸175〜183(GNWANRLYV;配列番号22),アミノ酸7〜15(LLFLVAGLL;配列番号23),アミノ酸141〜149(QVVWYSSYL;配列番号24),アミノ酸134〜142(AVVGHYTQV;配列番号25),およびアミノ酸211〜219(DLYSNCKSL;配列番号26)。以下の実施例で議論されるように、免疫原性は、SGP28を用いて、実証されている。これらは、それぞれ、ウサギおよびマウスを使用してポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するために使用された。このB細胞の応答(抗体の産生)は、SGP28の免疫原性部分によって惹起される最初のT細胞応答の結果である。
【0072】
免疫原としての使用のため、およびBSA、KLH、または他のキャリアタンパク質のようなキャリアを有するタンパク質の免疫原性結合体を調製するために、タンパク質またはポリペプチドを調製する方法が、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体が、使用され得る;他の例においては、Pierce Chemical Co.,Rockfold,ILによって供給されるような架橋剤が有効であり得る。SGP28免疫原の投与は、一般的には、適切な期間にわたる注射によって、そして一般的に当該分野で理解されている適切なアジュバントの使用を伴って行われる。免疫スケジュールの間に、抗体の力価が、抗体の形成の適切性を決定するために行われ得る。
【0073】
SGP28モノクローナル抗体が好ましく、そして当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望されるモノクローナル抗体を分泌する不死化された細胞株が、KohlerおよびMilsteinの標準的なハイブリドーマ技術、または一般的に公知であるB細胞を産生するように不死化する改変を使用して、調製され得る。所望された抗体を分泌する不死化された細胞株は、抗原がSGP28タンパク質またはSGP28フラグメントであるイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望される抗体を分泌する適切な不死化された細胞培養物が同定された場合には、その細胞を増殖し得、そしてインビトロの培養物または腹水液のいずれかから抗体が産生され得る。
【0074】
抗体またはフラグメントはまた、組換え手段による現在の技術を使用しても産生され得る。SGP28タンパク質の所望される領域に対して特異的に結合する領域もまた、複数の種起源のキメラまたはCDRグラフト(grafted)抗体の状況において産生され得る。ヒト化またはヒトSGP28抗体もまた産生され得、そして治療の状況における使用に好ましい。1つ以上の非ヒト抗体のCDRを、対応するヒト抗体の配列で置きかえることによる、マウスおよび他のヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である(例えば、Jonesら、1986、Nature 321:522−525;Riechmanら、1988,Nature 332:323−327;Verhoeyenら、1988,Science 239:1534−1536を参照のこと)。Carterら、1993、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89:4285およびSimsら、1993、J.Immunol.151:2296をもまた参照のこと。完全なヒトのモノクローナル抗体を産生するための方法として、ファージディスプレイおよびトランスジェニック動物技術が挙げられる(概要については、Vaughanら、1998、Nature Biotechnology 16:535−539を参照のこと)。
【0075】
完全なヒトのSGP28モノクローナル抗体は、大きなヒトIg遺伝子コンビナトリアルライブラリーを使用するクローニング技術(すなわち、ファージディスプレイ)を使用して作製され得る(GriffithsおよびHoogenboom,Building an in vitro immune system:human antibodies from pharge display libraries:Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man.Clark,M.(編)、Nottingham Academic、45〜64頁(1993);BurtonおよびBarbas、Human Antibodies from combinatorial libraries.同上、65〜82頁)。完全ヒトSGP28モノクローナル抗体はまた、以下に記載されているように、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る:1997年12月3日に公開された、PCT特許出願第WO98/24893号、KucherlapatiおよびJakobovitsら(Jakobovits、1998、Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4):607−614をもまた参照のこと)。この方法は、ファージディスプレイ技術を用いて必要とされるインビトロでの操作を回避し、そして高い親和性の確実なヒト抗体を効率よく産生する。
【0076】
SGP28抗体とSGP28タンパク質との反応性は、ウェスタンブロット、免疫沈降、ELISA、およびFACS分析を含む多数の周知の手段によって、適切なように、SGP28タンパク質、ペプチド、SGP28を発現する細胞またはその抽出物を使用して、確立され得る。
【0077】
本発明のSGP28抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第2の分子(例えば、細胞毒素または他の治療薬)に対して結合させられ得、そしてSGP28ポジティブ細胞に対して第2の分子を標的化するために使用され得る(Vitetta,E.S.ら、1993、Immunotoxin therapy、DeVita、Jr.,V.T.ら編、Cancer:Principles and Plactice of Oncology、第4版、J.B.Lippincott Co.、Philadelphia、2624−2636)。細胞毒性の試薬の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない:リシン、リシンA鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Pseudomonas外毒素(PE)A、PE40、アブリン、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、α−サルシン(sarcin)、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レトストリクトシン(retstrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン(curicin)、クロチン(crotin)、カリヒマイシン(calicheamicin)、sapaonaria officinalisインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素(例えば、212Bi、131I、131In、90Y、および186Re)。適切な検出マーカーとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない:放射性同位元素、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤、または酵素。抗体はまた、プロドラッグをその活性な形態に転換し得る、抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合体化され得る。例えば、米国特許第4,975,287号を参照のこと。
【0078】
さらに、2つ以上のSGP28エピトープについて特異的な二重特異的抗体が、当該分野で一般的に公知の方法を使用して作製され得る。さらに、抗体エフェクター機能が、癌細胞に対するSGP28抗体の治療効果を増強するために改変され得る。例えば、システイン残基が、Fc領域中に操作され得、それによって鎖間ジスルフィド結合の形成およびホモ二量体の生成を可能にし、これはインターナリゼーション、ADCC、および/または補体によって媒介される細胞の殺傷についての能力を増強させ得る(例えば、Caronら、1992、J.Exp.Med.176:1191−1195;Shopes,1992、J.Immunol.148:2918−2922を参照のこと)。ホモ二量体抗体はまた、当該分野で公知の架橋技術によって作製され得る(例えば、Wolffら、Cancer Res.53:2560−2565を参照のこと)。
【0079】
(SGP28トランスジェニック動物)
SGP28またはその改変された形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得る。次いでこれは、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えば、マウスまたはラット)は、トランスジーンを含む細胞を有している動物である。トランスジーンは、動物またはその動物の祖先に、出産前(例えば、胚の段階)に導入された。トランスジーンは、トランスジェニック動物が生じる細胞のゲノム中に組み込まれるDNAである。1つの実施形態においては、SGP28をコードするcDNAは、SGP28をコードするDNAを発現する細胞を含有しているトランスジェニック動物を作製するために使用される確立された技術およびゲノム配列に従って、SGP28をコードするゲノムDNAをクローン化するために使用され得る。
【0080】
トランスジェニック動物(特に、マウスまたはラットのような動物)を作製するための方法は、当該分野で一般的であり、そして例えば、米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号に記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを伴うSGP28トランスジーンの取り込みのために標的化される。胚の段階で動物の生殖系に導入されたSGP28をコードする1コピーのトランスジーンを含むトランスジェニック動物は、SGP28をコードするDNAの増大させられた発現の効果を試験するために使用され得る。このような動物は、保護形態(例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態)を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面に従うと、動物は試薬で処置され、そして、トランスジーンを保有している未処置の動物と比較して病理学的状態の減少した指標は、その病理学的状態についての有望な治療的な介入を示す。
【0081】
あるいは、SGP28の非ヒトホモログが、SGP28「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る。これは、SGP28をコードする内因性の遺伝子と、動物の胚性の細胞中に導入された変更されたSGP28をコードするゲノムDNAとの間での相同組換えの結果としての、欠損しているかまたは変更されたSGP28をコードする遺伝子を有する。例えば、SGP28をコードするcDNAは、確立された技術に従ってSGP28をコードするゲノムDNAをクローン化するために使用され得る。SGP28をコードするゲノムDNAの一部が、欠失させられ得るか、または、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子のような別の遺伝子と置き換えられ得る。
【0082】
代表的には、変更されていない隣接しているDNA(5’および3’末端の両方)の数キロ塩基がベクター中に含まれる(相同組換えベクターの説明については、例えば、ThomasおよびCapecchi、1987、Cell 51:503を参照のこと)。ベクターは、胚性の幹細胞株中に(例えば、エレクトロポレーションによって)導入され、そして導入されたDNAが内因性のDNAと相同組換えされた細胞が選択される(例えば、Liら、1992、Cell 69:915を参照のこと)。次いで、選択された細胞は、動物(例えば、マウスまたはラット)の胚盤胞中に注入されて、凝集キメラを形成する(例えば、Bradley、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson編、IRL、Oxford,1987、113〜152頁を参照のこと)。
【0083】
次いで、キメラ胚が、適切な擬妊娠させた雌性の養母(foster)動物中に移植され得、そして胚は「ノックアウト」動物を作製するための期間に入る。それらの生殖細胞中に相同組換えされたDNAを保有している子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして動物の全ての細胞が相同組換えされたDNAを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御するそれらの能力、およびSGP28ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態のそれらの発症について、特徴付けられ得る。
【0084】
(循環中および排泄されたSGP28についてのアッセイ)
癌性および前癌性前立腺におけるSGP28の高レベル管腔発現に関する出願人の免疫組織化学的証拠に基づいて、前立腺腫瘍は、脈管構造中にSGP28を分泌するか、および/または尿もしくは精液中にSGP28を分泌し、ここでこのタンパク質が、分子診断分野において周知のアッセイおよび技術を使用して検出および定量され得ることが予期される。循環中および排泄されたSGP28のレベルを検出および定量することは、前立腺癌の診断、病期分類、および予後において多数の用途を有することが予期される。血清、尿、および精液中のタンパク質の検出および定量のための多数の異なる技術的アプローチが、当該分野において周知である。SGP28は、前立腺および結腸の癌、そして恐らく他の癌において発現される分泌タンパク質であるので、血液または血清中のSGP28を検出および定量するためのアッセイは、個体におけるSGP28発現腫瘍の検出、診断、予後、および/または病期分類のために有用であることが予期される。例えば、正常組織中のSGP28 mRNA発現は、前立腺および卵巣において優先的に見出される。しかし、高レベルのタンパク質発現は、前立腺癌ならびにPINにおいて検出される。従って、血清SGP28タンパク質の検出は、前立腺腫瘍の存在の指標を提供し得る。癌の診断は、この情報および/または他の情報に基づいてなされ得る。前立腺癌に関して、例えば、このような他の情報としては、血清PSA測定、DREおよび/または超音波検査が挙げられ得る。さらに、血清中において検出されるSGP28のレベルは、病期分類または予後において有用な情報を提供し得る。例えば、血清中の非常に高レベルのSGP28タンパク質は、より大きなおよび/またはより攻撃的な腫瘍を示唆し得る。
【0085】
さらに、末梢血を、SGP28タンパク質および/またはSGP28発現癌細胞(前立腺癌が挙げられるが、これに限定されない)の存在について、SGP28発現を検出するためのRT−PCRを使用して、従来的にアッセイし得る。RT−PCRで増幅可能なSGP28 mRNAの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血における腫瘍細胞についてのRT−PCR検出アッセイは、現在、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理において使用するために評価されている。前立腺癌の分野において、これらには、PSAおよびPSMを発現する細胞の検出のためのRT−PCRアッセイが挙げられる(Verkaikら,1997,Urol.Res.25:373−384;Ghosseinら,1995,J.Clin.Oncol.13:1195−2000;Hestonら,1995,Clin.Chem.41:1687−1688)。RT−PCRアッセイは、当該分野において周知である。
【0086】
1つの実施形態では、捕捉ELISAを使用して、血清、尿または精液中のSGP28を検出および定量する。SGP28についての捕捉ELISAは、一般的に、SGP28タンパク質の別個のエピトープを認識する異なるアイソタイプの少なくとも2つのモノクローナル抗体、または1つの抗SGP28モノクローナル抗体と、異なる種(例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスターなど)に由来する特異的ポリクローナル血清とを含む。このアッセイでは、1つの試薬が捕捉(またはコーティング)抗体として供され、そして他の試薬が検出抗体として供される。
【0087】
以下に詳細に考察するように、SGP28のレベル(SGP28血清レベルを含む)を使用して、SGP28発現腫瘍の存在、程度、および攻撃性の指標を提供し得る。留意されるように、上記のSGP28は、PSA(これは、前立腺における最も重要で、正確で、かつ臨床的に有用な生化学マーカーである)と多数の特徴を共有する。前立腺の正常な構築を破壊する任意のプロセスによって、間質および微小血管中へのPSAの拡散が可能となる。結果として、血清の前立腺特異的抗原レベルにおける臨床的に重要な増加が、前立腺癌で見出される。特に、より多数の悪性細胞、および癌に関連した間質の破壊は、血清の前立腺特異的抗原レベルの増加を説明する。この状況下では、血清の前立腺特異的抗原レベルは、臨床的病期、腫瘍体積、組織学的段階、ならびに莢膜穿孔および精嚢侵襲の存在と、正に相関する。例えば、Bostwick,D.G.,1994,Am.J.Clin.Pathol.102(4 補遺1):S31−S37を参照のこと。
【0088】
最良の類似性分子としてPSAを使用すると、癌で発生する悪性細胞の漸増負荷および間質破壊は、血清SGP28抗原レベルを、1以上の臨床的に関連する因子(例えば、臨床的病期、腫瘍体積、組織学的段階、ならびに莢膜穿孔および精嚢侵襲の存在)と正に相関させるようである。なぜなら、SGP28もまた、組織発現の制限されたパターン(前立腺を含む)を示す分泌分子であるからである。経時的な血清SGP28測定は、さらなる情報を提供することが予期され、ここでSGP28の増加は進行を反映することが予期され、そして増加速度は、攻撃性と相関することが予期される。同様に、血清SGP28の減少は、緩徐に増殖している腫瘍または退行している腫瘍を反映することが予期される。血清中におけるSGP28の同定は、腫瘍の開始および初期の病気を検出するために有用であり得る。外科手術または治療を経験した患者において、血清SGP28レベルは、処置応答および潜在的再発をモニタリングするために有用である。
【0089】
(SGP28およびその産物の状態のモニタリング)
個体におけるSGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍能力に関する情報を提供し得る。例えば、SGP28 mRNAは、正常組織に比べて前立腺癌においてかなり多く発現されるので、生物学的サンプル中のSGP28 mRNA転写物またはタンパク質の相対レベルを評価するアッセイは、SGP28調節不全と関連する疾患(例えば、癌)を診断するために使用され得、そして適切な治療選択肢を規定するに有用である予後情報を提供し得る。同様に、生物学的サンプルにおけるSGP28ヌクレオチドおよびアミノ配列の完全性を評価するアッセイもまた、この状況において使用され得る。
【0090】
SGP28 mRNAが前立腺癌においてかなり多く発現され、そして正常組織においてほとんど発現されないという知見は、この遺伝子が細胞増殖の調節不全に関連するという証拠を提供し、それによってこの遺伝子およびその産物を、当業者がSGP28調節不全に関連する疾患を有することが疑われる個体由来の生物学的サンプルを評価するために使用し得る標的として同定する。別の例において、SGP28の発現が通常、前立腺および卵巣に限定されるので、転移の指標としてSGP28発現を検出するために、他の組織から採取した生物学的サンプルを評価し得る。この状況において、SGP28遺伝子およびその産物の発現状態の評価は、組織サンプルに潜在的な疾患に関する情報を得るために使用され得る。この状況における用語「発現状態」は、遺伝子およびその産物の発現、機能および調節(例えば、mRNA発現レベル、発現された遺伝子産物(例えば、核酸およびアミノ酸配列)の完全性、ならびにこれらの分子に対する転写改変および翻訳改変)に関与する種々の因子を広範にいうために使用される。
【0091】
SGP28の発現状態は、特定の疾患の状態、進行および/または腫瘍攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、SGP28発現状態を決定し、そしてSGP28を発現する癌(例えば、前立腺癌)を診断するための方法およびアッセイを提供する。患者のサンプルにおけるSGP28発現状態は、当該分野で周知の多数の手段(免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉マイクロ精査(micro−dessected)サンプルに対するRT−PCR分析、臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析が挙げられるがこれらに限定されない)によって分析され得る。SGP28遺伝子および遺伝子産物の発現状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Current Protocols In Molecular Biology,Units 2[Northern Blotting],4[Southern Blotting],15[Immunoblotting]および18[PCR Analysis],Frederick M.Ausubulら(編)(1995)に見出され得る。
【0092】
1つの局面において、本発明は、細胞増殖の調節不全と関連する疾患(例えば、過形成または癌)を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現されるSGP28遺伝子産物の状態を決定して、次いでそのように決定された状態を、対応する正常サンプル中のSGP28遺伝子産物の状態に対して比較することによってSGP28遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供し、ここで正常サンプルと比較した試験サンプルにおける異常または改変されたSGP28遺伝子産物の存在は、この個体の細胞において細胞増殖の調節不全の存在を指標を提供する。
【0093】
本発明はさらに、調節不全細胞成長の証拠について生物学的サンプルを試験する方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、生物学的サンプル中のSGP28の状態を、対応する正常サンプル中のSGP28の状態を比較する工程を包含し、ここで生物学的サンプル中のSGP28の状態の変更が、調節不全細胞成長と関連する。生物学的サンプル中のSGP28の状態は、例えば、SGP28mRNA発現またはSGP28タンパク質発現のレベルを試験することにより評価され得る。1つの実施形態において、SGP28の状態の変更は、SGP28発現細胞が通常は存在しない組織由来の生物学的サンプル中のSGP発現細胞の存在により同定される。
【0094】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルと比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおけるSGP28 mRNAまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する。SGP28 mRNAの存在は、例えば、組織サンプル(結腸、肺、前立腺、膵臓、膀胱、乳房、卵巣、頸部、精巣、頭部および首、脳、胃、骨などが挙げられるが、これらに限定されない)において評価され得る。任意のこれらの組織におけるSGP28の有意な発現の存在は、これらの癌の発生、存在および/または重篤度、または別の組織に起源を有する癌の転移を示すために有用であり得る。なぜなら、対応する正常組織は、SGP28 mRNAを発現しないか、またはこれを低レベルで発現するからである。
【0095】
関連する実施形態において、SGP28発現状態は、核酸レベルではなくタンパク質レベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現されるSGP28タンパク質のレベルを決定する工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現されるSGP28のレベルに対して比較する工程を包含する。1つの実施形態において、SGP28タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して評価される。SGP28タンパク質発現を検出し得るSGP28抗体または結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ形式で使用され得る。
【0096】
他の関連する局面において、これらの分子の構造における混乱(perturbation)(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するために、生物学的サンプル中のSGP28ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク質で観察されるからである(例えば、Marrogiら、J.Cutan.Pathol.26(8):369〜378(1999)を参照のこと)。この状況において、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、SGP28遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で議論されるノーザン、サザン、ウエスタン、PCRおよびDNA配列決定プロトコルによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための他の方法(例えば、一本鎖高次構造多型分析)が、当該分野で周知である(例えば、米国特許第5,382,510号および同第5,952,170号を参照のこと)。
【0097】
別の実施形態において、生物学的サンプル中のSGP28遺伝子のメチル化状態を試験し得る。遺伝子の5’調節領域におけるCpG島の異常な脱メチル化および/または過メチル化(hypermethylation)はしばしば、不死化され形質転換された細胞において生じ、そして様々な遺伝子の改変された発現を生じ得る。例えば、パイクラスのグルタチオンS−トランスフェラーゼ(正常な前立腺において発現されるが、前立腺癌の90%より多くでは発現されないタンパク質)のプロモーターの過メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、前立腺癌において最も頻繁に検出されるゲノム変化である(De Marzoら、Am.J.Pathol.155(6):1985〜1992)。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮新形成(PIN)の場合の少なくとも70%の場合に存在する(Brooksら、Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.,1998,7:531〜536)。
【0098】
別の例において、LAGE−I腫瘍特異的遺伝子(これは、正常な前立腺において発現しないが、25〜50%の前立腺癌において発現する)の発現は、リンパ芽球腫細胞中のデオキシアザシチジンによって引き起こされ、このことは腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している(Letheら、1998,Int.J.Cancer 76(6):903〜908)。この状況において、遺伝子のメチル化状態を試験するための様々なアッセイが、当該分野で周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、CpG島の全メチル化状態を評価するために、メチル化CpG部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を使用し得る。
【0099】
さらに、MSP(メチル化特異的PCR)は、所定の遺伝子のCpG島に存在する全てのCpG部位のメチル化状態を迅速にプロフィールし得る。この手順は、重亜硫酸ナトリウムによるDNAの最初の改変(これは、全てのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する)、続いてメチル化されていないDNAに対してメチル化されたDNAに特異的なプライマーを使用する増幅を包含する。メチル化の妨害を包含するプロトコルはまた、Current Protocols In Molecular Biology,Units 12,Frederick M.Ausubelら編、1995の実施例に見出され得る。
【0100】
別の関連する実施形態において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルに対して、試験細胞サンプルまたは組織サンプル中に発現されるSGP28交互スプライシング改変体における有意な変化を検出する工程を包含する。SGP28交互スプライシング改変体のモニタリングは、有用である。なぜなら、タンパク質の交互スプライシングの変化は、癌の進行を引き起こす一連の事象における段階の1つとして示唆されるからである(例えば、Garstensら、Oncogene 15(250:3059〜3065(1997)を参照のこと)。
【0101】
遺伝子増幅は、SGP28の状態を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子増幅は、サンプルにおいて、例えば、本明細書中に提供される配列に基づいて、適切な標識プローブを使用して、従来のサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するノーザンブロッティング[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201〜5205(1980)]、ドットブロッティング(DNA分析)、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって直接的に測定され得る。あるいは、特定の二重鎖(DNA二重鎖、RNA二重鎖、およびDNA−RNAハイブリッド二重鎖またはDNA−タンパク質二重鎖を含む)を認識し得る抗体が、用いられ得る。次いで、この抗体が、標識され得、そしてアッセイ(ここで二重鎖が表面に結合され、その結果、この表面上での二重鎖の形成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る)が、行われ得る。
【0102】
上記で議論される組織に加えて、末梢血が、SGP28発現を検出するためにRT−PCRを使用して、癌細胞(前立腺癌を含むがこれに限定されない)の存在について従来通りにアッセイされ得る。RT−PCRにより増幅可能なSGP28 mRNAの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのRT−PCR検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用について現在評価されている。前立腺癌の分野において、これらは、PSAおよびPSMを発現する細胞の検出のためのRT−PCRアッセイを含む(Verkaikら、1997、Urol.Res.25:373〜384:Ghosseinら,1995,J.Clin.Oncol.13:1195〜2000;Hestonら,1995,Clin.Chem.41:1687〜1688)。RT−PCRアッセイは、当該分野で周知である。
【0103】
本発明の関連する局面は、個体における癌の発症の感受性の推定に関する。1つの実施形態において、癌に対する感受性を推定するための方法は、組織サンプル中のSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質を検出する工程であって、その存在が、癌に対する感受性を示し、ここで存在するSGP28 mRNA発現の程度が感受性の程度に比例する、工程を提供する。特定の実施形態において、前立腺組織中のSGP28の存在が、試験され、ここでこのサンプル中のSGP28の存在は、前立腺癌の感受性(または前立腺腫瘍の発生もしくは存在)の指標を提供する。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するために、生物学的サンプルにおけるSGP28ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここでサンプル中のSGP28遺伝子産物における1以上の混乱の存在が、癌の感受性(または腫瘍の発生もしくは存在)の指標を提供する。
【0104】
本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍攻撃性を測定するための方法に関する。1つの実施形態において、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から採取された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中に発現されるSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで正常サンプルに対する腫瘍サンプルにおけるSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質発現の程度が、攻撃性の程度を示す、工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺腫瘍の攻撃性は、SGP28が腫瘍細胞中に発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するために、生物学的サンプルにおけるSGP28ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで1以上の混乱の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【0105】
本発明のなお別の関連する局面は、個体の悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法に関する。1つの実施形態において、個体における悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から異なる時点に採取された等価な組織サンプル中に発現されるSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍サンプルにおける経時的なSGP28 mRNAまたはSGP28タンパク質発現の程度が、癌の進行に関する情報を提供する、工程を包含する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞におけるSGP28発現が変化する程度を経時的に決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、癌の進行を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するために、生物学的サンプル中のSGP28ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで1以上の混乱の存在は、癌の進行を示す。
【0106】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか1つと組み合わされ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施形態は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定する手段として、SGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物の発現(またはSGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物における混乱)と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況において、悪性疾患に関連する広範な種々の因子(例えば、そうでなければ悪性疾患と関連する遺伝子の発現(PSA、PSCAおよびPSM発現を含む))および細胞学的肉眼観察(例えば、Bockingら,Anal Quant Cytol.6(2):74〜88(1984);Eptsein,Hum Pathol.1995年2月;26(2)223〜9(1995);Thorsonら,Mod Pathol.1998;11(6):543〜51;Baisdenら,Am.J.Surg Pathol.23(8):918〜24(1999)を参照のこと)が、利用され得る。SGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物の発現(またはSGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物における混乱)と、悪性疾患に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法が、有用である。なぜなら、例えば、一致する一連のまたは一群の特定の因子の存在は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定するために重要な情報を提供するからである。
【0107】
代表的な実施形態において、SGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物の発現(またはSGP28遺伝子およびSGP28遺伝子産物における混乱)と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法は、組織サンプルにおいて、SGP28 mRNAまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、組織サンプルにおいてPSA mRNAまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、ならびにSGP28 mRNAまたはタンパク質の過剰発現とPSA mRNAまたはタンパク質の過剰発現との一致を観察する工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺組織におけるSGP28 mRNAおよびPSA mRNAの発現が、試験される。好ましい実施形態において、サンプルにおけるSGP28 mRNA過剰発現とPSA mRNA過剰発現との一致は、前立腺癌、前立腺癌感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在の指標を提供する。
【0108】
SGP28 mRNAまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載され、そして標準的な核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術の使用が、当該分野において周知である。SGP28 mRNAの検出および定量のための標準的な方法としては、標識されたSGP28リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、SGP28ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、SGP28に特異的なプライマーを使用するRT−PCR分析、ならびに他の増幅型検出方法(例えば、分岐DNA、SISBA、TMAなど)が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的RT−PCRが、以下の実施例に記載されるように、SGP28 mRNA発現を検出および定量するために使用され得る。SGP28を増幅し得る任意の数のプライマー(本明細書中に詳細に記載される種々のプライマーセットを含むがこれらに限定されない)が、この目的のために使用され得る。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態において、野生型SGP28タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。SGP28タンパク質に対する抗体はまた、従来の技術(例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)および/またはELISAを使用して、患者検体(例えば血液、尿、精液または他のサンプル)におけるSGP28を検出するために使用され得る。、
(SGP28と相互作用する分子の同定)
本明細書中に開示されるSGP28タンパク質配列により、当業者は、種々の当該分野で受け入れられるプロトコルのいずれか1つを通じて、SGP28と相互作用するタンパク質、低分子およびその他の因子ならびにSGP28により活性化される経路を同定し得る。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系(「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる)のうちの1つを利用し得る。このような系において、相互作用する分子は、転写因子およびレポーター遺伝子の直接的な発現を再構成し、次いで、その発現をアッセイする。代表的な系は、真核生物転写アクチベーターの再構成を通じて、インビボでタンパク質間相互作用を同定し、そして例えば、米国特許第5,955,280号、同第5,925,523号、同第5,846,722号および同第6,004,746号に開示されている。
【0109】
あるいは、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、SGP28タンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法において、選択されたレセプター分子(例えば、SGP28)に結合するペプチドが、アミノ酸の無作為または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。それによって、広範な種々の用途(例えば、治療用試薬または診断用試薬)を有するペプチドが、予期されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関する任意の予備情報を必要することなく同定され得る。SGP28タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第5,723,286号および同第5,773,731号に開示されている。
【0110】
あるいは、SGP28を発現する細胞株が、SGP28によって媒介されるタンパク質間相互作用を同定するために使用され得る。この可能性は、他の研究者によって示されるような免疫沈降技術(Hamilton BJら、Biochem.Biophys.Res.Commun.1999,261:646〜51)を使用して試験され得る。代表的には、SGP28タンパク質は、抗SGP28抗体を使用して、SGP28を発現している前立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Hisタグに対する抗体が、SGP28を発現するように操作された細胞株において使用され得る(上記のベクター)。免疫沈降した複合体は、ウエスタンブロッティング、タンパク質の35S−メチオニン標識、タンパク質微量配列決定、銀染色および2次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の結合に対して試験され得る。
【0111】
SGP28と相互作用する低分子は、このようなスクリーニングアッセイにより同定され得る。例えば、SGP28の機能を増害する低分子(SGP28の細胞に結合する能力ならびに/または腫瘍形成、進行、移動および/もしくはアポトーシスを調節する能力を妨害する分子を含む)が同定され得る。代表的な方法は、例えば、米国特許第5,928,868号に議論されており、そして少なくとも1つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法が挙げられる。例示的な実施形態において、このハイブリッドリガンドは、細胞中に導入され、次いでこの細胞は、第1および第2の発現ベクターを含む。各発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結された標的タンパク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのDNAを含む。細胞は、レポーター遺伝子をさらに含み、その発現は、第1および第2のハイブリッドタンパク質の互いに対する近接性の条件下に置かれており、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合のみに、事象が生じる。レポーター遺伝子を発現するそれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が、同定される。
【0112】
本発明の代表的な実施形態は、表2(配列番号3)に示されるSGP28アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法からなる。この方法は、分子集団とSGP28アミノ酸配列とを接触させる工程、相互作用を促進する条件下で、分子集団とSGP28アミノ酸配列とを相互作用させる工程、SGP28アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いでSGP28アミノ酸配列と相互作用する分子からSGP28アミノ酸配列と相互作用しない分子を分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、SGP28アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態において、SGP28アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触される。SGP28の機能を調節する分子を同定するためのさらなるアッセイは、以下の実施例に記載される。
【0113】
(治療方法および組成物)
SGP28の前立腺癌タンパク質としての同定は、前立腺癌の処置に対する多くの治療アプローチを開放する。上記で議論したように、SGP28は、分泌タンパク質であり、かつ他の細胞および分子とのその相互作用は、前立腺環境の調節および癌の開始、発生および/または進行において役割を果たすようである。SGP28は、SGP28タンパク質の活性の阻害、SGP28タンパク質の他の細胞および分子との結合もしくは会合の阻害、SGP28の転写もしくは翻訳の阻害を目的としたアプローチ、ならびに/またはSGP28に基づく癌ワクチンの使用による治療のために標的化され得る。従って治療ストラテジーは、この分子の機能を阻害するかまたはSGP28分子事態を標的化するように設計され得る。
【0114】
SGP28の発現プロフィールは、MAGE、PSA、およびPMSAを暗示し、MAGE、PSA、およびPMSAは、黒色腫および他の癌にて上方調節される、組織特異的遺伝子である(Van de EyndeおよびBoon、Int J Clin Lab Res.27:81〜86、1997)。癌におけるその組織特異的発現および高レベル発現に起因して、これらの分子は、癌ワクチンについての標的として現在調査されている(Durrant、Anticancer Drugs 8:727〜733、1997;Reynoldsら、Int J Cancer 72:972〜976、1997)。SGP28の発現パターンは、SGP28が同様に、前立腺癌に対する癌ワクチンアプローチのための潜在的標的であるという証拠を提供する。なぜなら、その発現が大部分の正常な組織で検出されないからである。潜在的レセプターとしてのその構造的特徴もまた、SGP28が、低分子標的であり得ること、ならびに抗体に基づく治療ストラテジーのための標的であり得ることの証拠を提供する。この治療ストラテジーは、分子のカルシウム輸送機能を阻害するかまたはSGP28分子自体を標的化するように設計され得る。
【0115】
従って、SGP28の特定のモチーフを標的とする治療アプローチまたはSGP28タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチが、前立腺癌、およびSGP28を発現する他の癌に罹患する患者に有用であることが予期される。SGP28タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチは、一般的に、2つの種類に分類される。1つの種類は、その結合パートナーまたは他のタンパク質との、SGP28タンパク質の結合または会合を阻害するための、種々の方法を包含する。別の種類は、SGP28遺伝子の転写またはSGP28 mRNAの翻訳を阻害するための、種々の方法を包含する。
【0116】
(抗体に基づく治療のための標的としてのSGP28)
SGP28分子は、抗体に基づく治療ストラテジーのための魅力的な標的である。SGP28は大部分の正常な細胞では発現されず、癌細胞にて発現されるので、SGP28免疫反応性組成物の全身投与は、非標的器官および非標的組織へのその免疫治療分子の結合により引き起こされる、毒性効果、非特異的効果および/または非標的効果のない、良好な感受性を示すことが予期される。SGP28と特異的に反応性である抗体は、毒素または治療薬剤との結合体、あるいは結合パートナーとのSGP28の相互作用を阻害し得る裸の抗体のいずれかとして、SGP28を発現する癌を全身的に処置するために有用であり得る。
【0117】
SGP28抗体は、この抗体が循環性微小転移、および/または樹立された転移において、原発腫瘍においてSGP28に結合し、かつSGP28機能を排除するように、患者に導入され得る。腫瘍血管化の程度は、送達アプローチが推奨される誘導を提供し得る。同様に、疾患の悪性度分類および/または病期は、この点において有用な情報を提供すると期待される。例えば、より高い悪性度分類、より進行した腫瘍は、より多く転移の因子を供給するようであり得、転移の発生を処置または予防するために、全身投与を示唆する。
【0118】
抗SGP28抗体を使用する癌の免疫治療は、以下を含むがこれらに限定されない他の型の癌の処置において良好に使用されている種々のアプローチから生成される教示に従い得る:結腸癌(Arlenら、1998、Crit.Rev.Immunol.18:133−138)、多発性骨髄腫(Ozakiら、1997、Blood 90:3179−3186;Tsunenariら、1997、Blood 90:2437−2444)、胃癌(Kasprzykら、1992、Cancer Res.52:2771−2776)、B細胞リンパ腫(Funakoshiら、1996、J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19:93−101)、白血病(Zhongら、1996、Leuk.Res.20:581−589)、結腸直腸癌(Mounら、1994、Cancer Res.54:6160−6166);Veldersら、1995、Cancer Res.55:4398−4403)、および乳癌(Shepardら、1991、J.Clin.Immunol.11:117−127)。いくつかの治療アプローチは、毒素に対する裸の抗体の結合化(例えば、抗CD20抗体に対する131Iの結合化(例えば、Bexxar、Coulter Pharmaceutical)が挙げられるが、一方、他のアプローチは、抗体および他の治療薬の同時の投与(例えば、Herceptin TM(Trastuzumab)とパクリタキセル(Genentech,Inc.))を含む。前立腺癌の処置については、例えば、SGP28抗体は、照射、化学療法、またはホルモンの除去と組合せて、投与され得る。
【0119】
SGP28抗体治療は、全てのステージの癌について有用であり得るが、抗体治療は、進行したかまたは転移性の癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いる処置は、以前に1回以上の化学療法を受けた患者について示され得、一方、本発明の抗体治療と化学療法または照射のレジメンとの組合せが、化学療法による処置を受けていない患者について好ましくあり得る。さらに、抗体治療は、付随する化学療法の減少した投与量の使用を可能にし得、特に、化学療法薬の毒性に寛容ではない患者について、非常に良好である。
【0120】
何人かの癌患者については、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的な評価、定量的なSGP28の画像化、またはSGP28の発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、SGP28の発現の存在およびその発現のレベルを評価することが所望され得る。腫瘍の生検または外科的な標本の免疫組織化学的な分析が、この目的のために好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【0121】
前立腺および他の癌を処置することにおいて有用である抗SGP28モノクローナル抗体として、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得るもの、および直接細胞傷害性であり得るものが挙げられる。これに関して抗SGP28モノクローナル抗体(mAb)は、補体によって媒介される細胞の細胞傷害性または抗体依存性の細胞の細胞傷害性(ADCC)の機能(これらの両方ともが、エフェクター細胞のFcレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、イムノグロブリン分子のインタクトなFc部分を必要とする)のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗SGP28 mAbが、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性のmAbが作用し得る可能性のある機構として、細胞の増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗SGP28 mAbが抗腫瘍効果を発揮する機構は、ADCC、ADMMC、補体によって媒介される細胞の溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロでのアッセイを使用して、当該分野で一般的に公知であるように評価され得る。
【0122】
マウスもしくは他の非ヒトモノクローナル抗体、またはヒト/マウスのキメラmAbの使用は、いくつかの患者において、中程度〜強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの例においては、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効率を生じる。最も重篤な例においては、このような免疫応答は、腎不全を生じ得る可能性のある免疫複合体の多量の形成を導き得る、従って、本発明の治療方法の実施において使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトまたはヒト化されたもののいずれかであり、そして高い親和性で標的のSGP28抗原に対して特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは抗原性を示さないものである。
【0123】
本発明の治療方法は、単一の抗SGP28 mAbの、ならびに種々のmAbの組合せまたは混合物の投与を意図する。このようなmAbの混合物は、それらが種々のエピトープを標的化し、種々のエフェクター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能に依存するmAbと細胞傷害性のmAbとを直接結合するmAbを含む限りにおいて、特定の利点を有し得る。組合せ中のこのようなmAbは、相乗的治療効果を示し得る。さらに抗SGP28 mAbの投与は、以下を含むがこれらに限定されない他の治療薬と組合せられ得る:種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫調節因子(例えば、IL−2、GM−CSF)抗SGP28 mAbは、それらの「裸の」形態または結合していない形態で投与され得るか、あるいはそれらに対して結合体化した治療薬を有し得る。
【0124】
抗SGP28抗体処方物は、腫瘍部位へ抗体を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的には、静脈内注射(IV)(代表的には、約0.1から約10mg/kg体重の範囲の用量)のような受容可能な投与経路を通じる、抗SGP28抗体調製物の繰り返しの投与を含む。1週間あたりで10〜500mgの範囲のmAbの用量が、有効であり得、そして十分に寛容化され得る。
【0125】
転移性の乳癌の処置におけるHerceptin mAbでの臨床試験に基づいて、約4mg/kg患者体重のIVの最初の負荷用量、続く約2mg/kgIVの抗SGP28 mAb調製物の毎週の用量が、受容可能な用量レジメンを示し得る。好ましくは、最初の負荷用量は、90分以上の注入として投与される。期間維持用量は、最初の用量が十分に寛容化される場合は、30分以上の注入として投与され得る。しかし、当業者によって理解されるように、種々の因子が、特定の症例における理想的な投与レジメンに影響を与える。このような因子として、例えば、結合親和性および使用されるAbまたはmAbの半減期、患者におけるSGP28の発現の程度、循環している破棄された(shed)SGP28抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組合せて使用される化学療法剤の影響が挙げられ得る。
【0126】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために、血清中の循環している破棄されたSGP28抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され得、そして他のパラメーター(例えば、前立腺癌治療における血清PSAレベル)を評価することと組合せて良好である計測治療に有用であり得る。
【0127】
(SGP28タンパク質機能の阻害)
本発明は、SGP28のその結合パートナーまたはリガンドに対する結合を阻害する種々の方法および組成物、またはSGP28機能を阻害するための他のタンパク質(単数または複数)および方法とのその組合せを含む。
【0128】
(組換えタンパク質でのSGP28の阻害)
1つのアプローチにおいては、SGP28に結合し得、それによってSGP28がその結合パートナー(単数または複数)に対して会合/結合すること、または他のタンパク質(単数または複数)と会合することを妨げ得る、組換え分子が、SGP28機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、SGP28特異的抗体分子の反応性の部分(単数または複数)を含み得る。特定の実施形態においては、SGP28結合パートナーのSGP28結合ドメインが、ヒトのIgG(例えば、ヒトのIgG1)のFc部分に対して連結された2つのSGP28リガンド結合ドメインを含有している二量体の融合タンパク質中に操作され得る。このようなIgG部分は、例えば、CH2およびCH3ドメイン、ならびにヒンジ領域を含み得るが、CH1ドメインは含まない。このような二量体の融合タンパク質は、可溶性の形態で、SGP28の発現に関連している癌(前立腺癌を含むがこれらに限定されない)を罹患している患者に対して投与され得る。ここでは、二量体の融合タンパク質はSGP28に特異的に結合し、それによって結合パートナーとのSGP28の相互作用をブロックする。このような二量体の融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して多量体のタンパク質へと結合させられ得る。
【0129】
(細胞内抗体を用いるSGP28の阻害)
別のアプローチにおいては、SGP28に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、遺伝子導入技術を通じてSGP28を発現する細胞中に導入され得る。ここでは、コードされる単鎖の抗SGP28抗体は、細胞内で発現され、SGP28タンパク質に結合し、そしてそれによってその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体はまた、「イントラボディー(intrabodies)」としても公知であり、細胞内の特定の部分に対して特異的に標的化され得、それによって処置の阻害活性が集められる場所にわたって制御を提供する。この技術は、当該分野で良好に適用されている(概要については、RichardsonおよびMarasco、1995、TIBTECH、第13巻)。イントラボディーは、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている。例えば、Richardsonら、1995、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:3137−3141;Beerliら、1994、J.Biol.Chem.289:23931−23936;Deshaneら、1994、Gene Ther.1:332−337を参照のこと。
【0130】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドによって連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体が、軽鎖の定常領域に対して連結された単鎖の可変領域フラグメントとして発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、所望される細胞内部分に対して発現されたイントラボディーを正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えのポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体(ER)に対して標的化されたイントラボディーは、リーダーペプチドを、そして必要に応じて、KDELアミノ酸モチーフのようなC末端のER保持シグナルを取り込むように操作され得る。核内で活性を発揮するように意図されたイントラボディーは、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分は、形質膜の細胞質ゾル側にイントラボディーを鎖でつなぐように、イントラボディーに対して連結され得る。イントラボディーはまた、細胞質ゾル中で機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾルのイントラボディーは、細胞質ゾル中の因子を隔離するために使用され得、それによってそれらを、それらの天然の細胞性の目的地に対して輸送されることから妨げる。
【0131】
1つの実施形態においては、SGP28イントラボディーは、特定のSGP28ドメインに対して特異的に結合するように設計される。例えば、SGP28タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾルのイントラボディーは、SGP28に関連する分子が核に対する接近を得ることを防止するために使用され得、それによって、それが核内で任意の生物学的活性を発揮することを防止する。
【0132】
このような特定の腫瘍細胞について特異的なイントラボディーの発現を指向するために、イントラボディーの転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび/またはエンハンサーの調節制御下に配置され得る。前立腺について特異的なイントラボディーの発現を標的化するために、例えば、PSAプロモーターおよび/またはプロモーター/エンハンサーが利用され得る(例えば、米国特許第5,919,652号を参照のこと)。
【0133】
(SGP28の転写または翻訳の阻害)
別のクラスの治療アプローチにおいては、本発明は、SGP28遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、タンパク質へのSGP28 mRNAの翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【0134】
1つのアプローチにおいては、SGP28遺伝子の転写を阻害する方法は、SGP28遺伝子をSGP28アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。別のアプローチにおいては、SGP28 mRNAの翻訳を阻害する方法は、アンチセンスポリヌクレオチドとSGP28 mRNAを接触させることを含む。別のアプローチにおいては、SGP28特異的リボザイムが、SGP28メッセージを切断するために使用され得、それによって翻訳が阻害される。このようなアンチセンスおよびリボザイムに基づく方法はまた、SGP28遺伝子の調節領域(例えば、SGP28プロモーターおよび/またはエンハンサーエレメント)に対して指向され得る。同様に、SGP28遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質が、SGP28 mRNAの転写を阻害するために使用され得る。上記の方法において有用である種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンスおよびリボザイム分子の使用は当該分野で周知である。
【0135】
SGP28転写活性を妨害することを通じてSGP28の転写を阻害する他の因子もまた、SGP28を発現する癌の処置のために有用であり得る。同様に、SGP28のプロセシングを妨害し得る因子が、SGP28を発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【0136】
(治療ストラテジーについての一般的な考察)
遺伝子導入および遺伝子治療技術が、SGP28を合成する腫瘍細胞に対して治療用のポリヌクレオチド分子(すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディーをコードするポリヌクレオチド、および他のSGP28阻害分子)を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが当該分野で公知である。SGP28アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、SGP28の転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して腫瘍細胞を標的化するために送達させられ得る。
【0137】
上記の治療アプローチは、広範の種々の化学療法または放射線治療レジメンの任意の1つと組合せられ得る。これらの治療アプローチもまた、化学療法の減少した投与量および/またはより少ない頻度の投与の使用を、特に、化学療法剤の毒性を十分に寛容化しない患者において可能にし得る。
【0138】
特定の組成物(例えば、アンチセンス、リボザイム、イントラボディー)の抗腫瘍活性、またはこのような組成物の組合せが、種々のインビトロおよびインビボでのアッセイシステムを使用して評価され得る。治療能力を評価するためのインビトロでのアッセイとして、細胞増殖アッセイ、軟らかい寒天アッセイ、および腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療組成物が結合パートナーに対するSGP28の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【0139】
インビボでは、SGP28治療組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種の前立腺癌のモデル(ここでは、ヒトの前立腺癌細胞の移植片または継代された異種移植片組織が、免疫和解された動物(例えば、ヌードマウスまたはSCIDマウス)中に導入される)が、前立腺癌に対する関係において適切であり、そして記載されている(Kleinら、1997、Nature Medicine 3:402−408)。例えば、1998年4月23日に公開された、PCT特許出願第WO98/16628号、Sawyersらは、初代の腫瘍の発達、微小な転移、および後期の疾患の特徴である骨芽細胞の転移の形成を要約し得るヒトの前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載している。効率は、腫瘍形成、腫瘍の退行、または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例をもまた参照のこと。
【0140】
インビボでのアッセイにおいては、アポトーシスの促進のクオリファイもまた、可能性のある治療組成物を評価することにおいて有用であり得る。1つの実施形態においては、治療組成物で処置された生存しているマウスに由来する異種移植片が、アポトーシス性の病巣の存在について試験され得、そして処置されていないコントロールの異種移植片を保有しているマウスに対して比較され得る。アポトーシス性の病巣が処置されたマウスの腫瘍中で見出される程度は、組成物の治療効率の指標を提供する。
【0141】
上記の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望される送達方法のための適切なキャリアを含有している薬学的組成物(ワクチン組成物を含む)中に処方され得る。適切なキャリアとして、治療組成物とともに混合された場合に、治療組成物の抗腫瘍機能を保持し、そして患者の免疫システムと反応しない任意の材料が挙げられる。例として、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水、静菌水などのような、任意の多数の標準的な薬学的キャリアなどが挙げられるがこれらに限定されない(一般的には、Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版、A.Osal.編、1980を参照のこと)。
【0142】
治療用処方物は可溶化され得、そして、腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正常位などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物として、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水、および/または0.9%の注射のための滅菌の塩化ナトリウム(USP)を含有しているポリビニルクロライドもしくはポリエチレンバッグ中に稀釈された溶液中の治療用組成物が挙げられる。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥させられ得、そして滅菌の散剤として、好ましくは、減圧下で保存され、次いで、注射の前に、例えば、ベンジルアルコール保存料を含有している静菌水中でまたは滅菌水中で再構成され得る。
【0143】
以下の方法を使用する癌の処置のための投与量および投与プロトコールは、方法および標的の癌によって変化し、そして、当該分野で示されている多数の他の因子に一般に依存する。
【0144】
(癌のワクチン)
本発明はさらに、SGP28タンパク質またはそのフラグメントからなる癌のワクチン、ならびにDNAに基づくワクチンを提供する。前立腺および腫瘍に制限されたSGP28の発現に関して、SGP28の癌ワクチンは、標的以外の組織に対して非特異的な影響を生じることなく、SGP28を発現する癌を特異的に予防しそして/または処置することにおいて有効であると予想される。抗癌治療における使用のための体液によっておよび細胞によって媒介される免疫性を作成するためのワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトのPSMAおよびげっ歯類のPAP免疫原を使用して、前立腺癌において使用されている(Hodgeら、1995、Int.J.Cancer 63:231−237;Fongら、1997、J.Immunol.159:3113−3117)。このような方法は、SGP28タンパク質もしくはそのフラグメント、またはSGP28をコードする核酸分子、およびSGP28免疫原を発現し得そしてSGP28免疫原を適切に提示し得る組換えベクターを使用することによって、容易に行われ得る。
【0145】
例えば、ウイルス遺伝子送達システムは、SGP28をコードする核酸分子を送達するために使用され得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達システムとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス(Restifo、1996,Curr.Opin.Immunol.8:658−663)。非ウイルス送達システムもまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に(例えば、筋肉内で)導入されるSGP28タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のNDAを使用することによって使用され得る。1つの実施形態においては、全長のヒトのSGP28 cDNAが使用され得る。
【0146】
1つの実施形態においては、SGP28癌ワクチンは、表2(配列番号3)に示されるSGP28のアミノ酸配列内の免疫原性ペプチドの同定に基づく。以下の実施例においてさらに議論されるように、SGP28は、TおよびB細胞応答を誘導することが示されている。SGP28(表2;配列番号3)ORFを含有している組換えHISタグ化タンパク質は、モノクローナル抗体の産生のためにマウス中で免疫応答を生じさせるために使用されている。SGP28のアミノ酸93〜107(CNYRHSNPKDRMTSL;配列番号27)は、ポリクローナル抗体の産生のためにウサギ中で免疫応答を生じさせるために使用されている。従って、SGP28のこれらの特異的部分、およびこれらの部分をコードするポリヌクレオチドが、癌ワクチンの産生のために選択され得る。
【0147】
別の実施形態においては、特異的細胞毒性のTリンパ球(CTL)エピトープをコードするSGP28核酸分子が使用され得る、CTLエピトープは、特定されたHLA対立遺伝子に最適に結合し得るSGP28タンパク質中のペプチドを同定するための、特異的なアルゴリズム(例えば、Epimer、Brown University)を使用して決定され得る。1つの適切なアルゴリズムは、Bioinformatics and Molecular Analysis Section(BIMAS)ウェブサイト(http://bimas.dcrt.nih.gov/)で利用可能な、HLA Peptide Motif Searchアルゴリズムである。このアルゴリズムは、HLAクラスI分子の溝、および特に、HLA−A2中の特異的なペプチド配列の結合に基づく(Falkら、1991、Nature 351:290−6;Huntら、1992、Science 255:1261−3;Parkerら、1992、J.Immunol.149:3580−7;Parkerら、1994,J.Immunol.152:163−75)。HLA Peptide Motif Searchアルゴリズムは、HLA−A2ならびに他のクラスI分子に対する推定される結合のための完全なタンパク質配列に由来する、8マー、9マー、および10マーのペプチドの位置決定およびランキングを可能にする。ほとんどのHLA−A2結合ペプチドが9マーであり、好ましくは、2位にロイシン、そして9位にバリンまたはロイシンを含有する(Parkerら、1992、J.Immunol.149:3580−7)。HLA−A2へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株T2上でのHLA−A2の発現の安定化によって評価され得る(Xueら、1997、Prostate 30:73−8;Peshwaら、1998、Prostate 36:129−38)。特異的なペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのCD8+ CTLの刺激によってインビトロで評価され得る(Xueら;Peshwaら、前出)。
【0148】
HLA−A2に結合すると予想され、そして癌ワクチンでの使用に好ましい特定のSGP28ペプチドは、以下に対応するペプチドを含む:アミノ酸配2−10(TLFPVLLFL;配列番号17)、アミノ酸6−14(VLLFLVAGL;配列番号18)、アミノ酸30−38(ALLTTQTQV;配列番号19)、アミノ酸142−150(VVWYSSYLV;配列番号20)、アミノ酸222−230(TLTCKHQLV;配列番号21)、アミノ酸175−183(GNWANRLYV;配列番号22)、アミノ酸7−15(LLFLVAGLL;配列番号23)、アミノ酸141−149(QVVWYSSYL;配列番号24),アミノ酸134−142(AVVGHYTQV;配列番号25)、およびアミノ酸211−219(DLYSNCKSL;配列番号26)(表2に示されるSGP28タンパク質配列)。
【0149】
種々のエキソビボストラテジーがまた、用いられ得る。1つのアプローチは、患者の免疫系にSGP28抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する。樹状細胞は、MHCクラスIおよびII、B7副刺激因子(co−stimulator)、およびIL−12を発現し、そして従って高度に特化された抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原(PSMA)のペプチドでパルスされた自己樹状細胞が、第I相臨床試験において、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために使用されている(Tjoaら、1996、Prostate 28:65−69;Murphyら、1996、Prostate 29:371−380)。樹状細胞は、MHCクラスI分子およびクラスII分子の関連においてT細胞に対してSGP28ペプチドを提示するために使用され得る。1つの実施形態では、自己樹状細胞は、MHC分子に結合し得るSGP28ペプチドでパルスされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全SGP28タンパク質でパルスされる。さらに別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター(例えば、アデノウイルス(Arthurら、1997、Cancer Gene Ther.4:17−25)、レトロウイルス(Hendersonら、1996、Cancer Res.56:3763−3770)、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、DNAトランスフェクション(Ribasら、1997、Cancer Res.57:2865−2869)、および腫瘍由来RNAトランスフェクション(Ashleyら、1997、J.Exp.Med.186:1177−1182))を用いて樹状細胞におけるSGP28遺伝子の過剰発現を操作することを含む。SGP28を発現する細胞はまた、免疫調節因子(例えば、GM−CSF)を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
【0150】
抗イディオタイプ抗SGP28抗体もまた、抗癌療法において、SGP28タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり、そしてSGP28タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗SGP28抗体を生成するように容易に適合され得る(例えば、Wagnerら、1997、Hybridoma 16:33−40;Foonら、1995、J Clin Invest 96:334−342;Herlynら、1996、Cancer Immunol Immunother 43:65−76を参照のこと)。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【0151】
遺伝子免疫法は、SGP28を発現する癌細胞に対する予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。SGP28タンパク質/免疫原をコードするDNAおよび適切な調節配列を含む構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、筋肉または皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされたSGP28タンパク質/免疫原を発現する。SGP28タンパク質免疫原の発現は、前立腺癌および他のSGP28発現癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫技術が使用され得る(検討のために、インターネットアドレスwww.genweb.comで公開されている情報および参考文献を参照のこと)。
【0152】
(診断組成物およびキット)
上記で記載または示唆された診断適用および治療適用における使用のために、本発明によって、キットもまた提供される。このようなキットは、1つ以上のコンテナ手段(例えば、バイアル、チューブなど)を厳重に閉じ込めて受容するように区画化されるキャリア手段を備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法において、使用されるべき別々の要素の1つを含む。例えば、コンテナ手段の1つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれSGP28タンパク質もしくはSGP28遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが、標的核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含むコンテナ、および/またはレポーター分子(例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識)に結合されるレポーター手段(例えば、ビオチン結合タンパク質(例えば、アビジンまたはストレプトアビジン)を含むコンテナを有し得る。
【0153】
本発明のキットは、代表的には、上記コンテナ、および使用説明書と共に、市販および使用者の観点で所望の材料(緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む)を含む1つ以上の他のコンテナを含む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用(例えば、上記の使用)についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
【0154】
従って、本発明はまた、SGP28−関連分子を含む診断組成物を提供する。このような分子としては、本明細書中に記載される、種々のSGP28ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、タンパク質、フラグメント、抗体が挙げられる。診断組成物に含まれる分子は、検出可能なマーカーで必要に応じて標識され得る。SGP28の診断組成物は、適切な緩衝液、希釈液、および所望される他の成分をさらに含み得る。
【0155】
(実施例)
本発明の種々の局面を、以下に続くいくつかの例によってさらに記載および例示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【0156】
(実施例1:SGP28遺伝子のcDNAフラグメントのSSH生成単離)
(材料および方法)
(LAPC異種移植片)
LAPC異種移植片を、Charles Sawyers博士(UCLA)から入手し、記載のように生成した(Kleinら、1997、Nature Med.3:402−408;Craftら、1999、Cancer Res.59:5030−5036)。アンドロゲン依存性LAPC−4異種移植片およびアンドロゲン非依存性LAPC−4異種移植片(それぞれLAPC−4 ADおよびAI)ならびにアンドロゲン依存性LAPC−9異種移植片およびアンドロゲン非依存性LACP−9異種移植片(それぞれLACP−9 ADおよびAI)をそれぞれインタクトな雄SCIDマウスまたは雄去勢マウスにおいて増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。LAPC−4 AI異種移植片を、LAPC−4 AD腫瘍から誘導し、LAPC−9 AI異種移植片は、LAPC−9 AD腫瘍から誘導した。AI異種移植片を生成するために、LAPC AD腫瘍を有する雄マウスを去勢し、そして2〜3ヶ月間飼育した。LAPC腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄SCIDマウスにおいてまたは雌SCIDマウスにおいて継代させた。
【0157】
LAPC−4 AD異種移植片を、以下のように脛骨内で増殖させた。皮下で増殖させたLAPC−4 AD異種移植片腫瘍組織を、1〜2mm3切片に細かく切り、一方で、この組織を、1×Iscove培地中に入れ、次いで、細かく切った組織を1.3K rpmで4分間遠心分離し、この上清を10mlの氷冷1×Iscove培地中に再懸濁させ、そして1.3Krpmで4分間遠心分離した。次いで、このペレットを、1%のプロナーゼEを含む1×Iscove中で再懸濁させ、そして温和な揺り攪拌で室温で20分間インキュベートし、続いて2〜4分間氷上でインキュベートした。濾液を1.3K rmpで4分間遠心分離し、そしてプロナーゼを10mlのIscove中で再懸濁し、そして再遠心分離することで吸引したペレットから除去した。次いで、細胞のクランプをPrEGM培地中でプレート化し、そして一晩かけて増殖させた。次いで、この細胞を採取し、濾過し、2×RPMIで洗浄し、そして計数した。約50,000個の細胞を、氷上の等容量の氷冷Matrigelとともに混合し、そして27ゲージ針を介してSCIDマウスのほぼ脛骨骨幹端に外科的に注射した。10〜12週間後に、骨髄中で増殖したLAPC−4腫瘍を回収した。
【0158】
(細胞株)
ヒト細胞株(例えば、HeLa)を、ATCCから入手し、そして5%ウシ胎児血清を含むDMEM中で維持した。
【0159】
(RNA単離)
腫瘍組織および細胞株を、10ml/g組織または10ml/108細胞を用いてTrizol試薬(Life Technologies、Gibco BRL)においてホモジナイズし、総RNAを単離した。ポリA RNAを、Qiagen’s Oligotex mRNA MiniキットおよびMidiキットを用いて総RNAから精製した。総RNAおよびmRNAを、分光光度計分析(O.D. 260/280nm)によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【0160】
(オリゴヌクレオチド)
以下のHPLC精製オリゴヌクレオチドを使用した。
【0161】
【化1】
(抑制サブトラクティブ(suppression subtractive)ハイブリダイゼーション)
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション(SSH)を使用して、前立腺癌において示差的に発現され得る遺伝子に対応するcDNAを同定した。このSSH反応は、異なる2種の環境(すなわち、皮下(「LAPC−4 AD SQ」)および脛骨内(「LAPC−4 AD IT」)増殖環境)下で増殖するLAPC−AD異種移植片由来のcDNAを使用し(ここで、LAPC−4 AD SQ異種移植片は、「ドライバー(diriver)」cDNAの供給源として使用した)、一方ここで、LAPC−4 AD SQ異種移植片を、「テスター(tester)」cDNAの供給源として使用し、「ドライバー」cDNAの供給源として使用した。
【0162】
テスターおよびドライバーcDNAに対応する二本鎖cDNAを、CLONTECHのPCR−Select cDNA Subtraction Kitおよびプライマーとして1ngのオリゴヌクレオチドDPNCDNを使用して、上記のように、異種移植片組織から単離された2μgのポリ(A)+RNAから合成した。第一鎖および第二鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル(CLONTECHプロトコール番号PT1117−1、カタログ番号K1804−1)に記載のように実施した。得られたcDNAをDpnIIで37℃で3時間消化した。消化したcDNAをフェノール/クロロホルム(1:1)で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【0163】
ドライバーcDNAを、1:1比で、関連異種移植片供給源(上記)由来のDpnII消化cDNAを、ヒト良性前立腺肥大(BPH)、およびヒト細胞株HeLa、293、A431、Colo 205、およびマウス肝臓由来の消化cDNAの混合物と組み合わせることにより生成した。
【0164】
テスターcDNAを、5μlの水中に1μlの関連異種移植片供給源(上記)由来のDpnII消化cDNA(400ng)を希釈することにより生成した。次いで、希釈したcDNA(2μl、160ng)を、総容量10μlで16℃で一晩、400uのT4 DNAリガーゼ(CLONTECH)を用いて、別の連結反応中で、2μlのアダプター1およびアダプター2(10μM)に連結した。連結を、1μlの0.2M EDTAで、そして72℃で5分間加熱して終結させた。
【0165】
第一のハイブリダイゼーションは、1.5μl(600ng)のドライバーcDNAを、1.5μl(20ng)のアダプター1連結のおよびアダプター2連結のテスターcDNAを含む2つの各チューブに添加することにより実施した。4μlの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、MJ Research サーマルサイクラー中で、98℃で1.5分間変性し、次いで、68℃で8時間ハイブリダイズさせた。次いで、2つのハイブリダイゼーションを、さらなる1μlの新鮮な変性ドライバーcDNAと一緒に混合し、そして68℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第二のハイブリダイゼーションを、200μlの20mM Hepes、pH8.3、50mM NaCl、0.2mM EDTA中で希釈し、70℃で7分間加熱し、そして−20℃で貯蔵した。
【0166】
(SSHから生成した遺伝子フラグメントのPCR増幅、クローニング、および配列決定)
SSH反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、2つのPCR増幅を行った。第一のPCR反応において、1μlの希釈最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量25μlの1μlのPCRプライマー1(10μM)、0.5μl dNTP混合物(10μM)、2.5μlの10×反応緩衝液(CLONTECH)、および0.5μlの50×Advantage cDNA polymerase Mix(CLONTECH)に添加した。PCR1を、以下の条件を用いて実施した:75℃で5分、94℃で25秒、次いで27サイクルの94℃で10秒、66℃で30秒、72℃で1.5分。5つの別の第一のPCR反応を各実験について行った。産物をプールし、そして水で1:10に希釈した。第二のPCR反応については、プールし、そして希釈した第一のPCR反応物からの1μlを、プライマーNP1およびNP2(10μM)をPCRプライマー1の代わりに使用したことを除き、PCR1について用いたものと同じ反応混合物に添加した。PCR2を、10〜12サイクルの94℃で10秒、68℃で30秒、72℃で1.5分を用いて実施した。PCR産物を、2%アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【0167】
PCR産物を、T/Aベクタークローニングキット(Invitrogen)を用いてpCR2.1に挿入した。形質転換E.coliを青/白およびアンピシリン選択に供した。白色コロニーを釣り上げ、96ウェルプレート中に並べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、PCR増幅をPCR1の条件ならびにプライマーとしてNP1およびNP2を用いて1mlの細菌培養物において実施した。PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【0168】
96ウェルフォーマットで20%グリセロール中に細菌クローンを貯蔵した。プラスミドDNAを調製し、配列決定し、そしてGenBank、dBest、およびNCI−CGAPデータベースの核酸相同性検索に供した。
【0169】
(結果)
前出の材料および方法において記載したSSH実験により、そして多数の候補遺伝子フラグメントクローン(SSH クローン)の単離がもたらされた。すべての候補クローンを配列決定し、そして主要な公の遺伝子およびESTのデータベースにおけるすべての配列に対して相同性分析を行って、対応する遺伝子の同一性についての情報を提供し、そして示差的発現のための特定の遺伝子を分析するための決定をガイドすることを支援した。一般に、検索した任意のデータベースにおける任意の公知配列に何ら相同性を有せず、従って新規遺伝子をあらわすと考えられる遺伝子フラグメント、およびこれまでに配列決定された発現配列タグ(EST)に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、RT−PCRおよび/またはノーザン分析による示差的発現分析にかけた。
【0170】
SSHクローンの一つは、特定の顆粒タンパク質28(SGP28)(Kjeldsenら(1996)FEBS Lett.380,246−250)またはシステイン富化分泌タンパク質(CRISP−3)(Kratzschemaら(1996)Eur J Biochem236(3):827−36)として公知の分泌分子の対応する配列と同定した。このクローンの配列(36P1G3)は、以下の通りである:
【0171】
【化2】
(配列番号1)。
【0172】
(実施例2:全長SGP28 SGP28コードcDNAの単離)
774bpの全長cDNA(クローン1;表1)を、258アミノ酸のORFを露出する、前立腺ライブラリーから単離した(表2)。本明細書において同定された配列は、2本の核酸(コード配列の核酸および5’UTRの核酸)における開示されたSGP28配列(Kjeldsenら(1996)FEBS Lett.380(3):246−50)と異なる。これらの差異は、タンパク質配列を変化させない。
【0173】
(表1:全長36P1G3/SGP28 cDNA(配列番号2))
【0174】
【表1】
(表2:36P1G3/SGP28オープンリーディングフレーム(配列番号3))
【0175】
【表2】
(実施例3:SGP28遺伝子発現分析)
正常ヒト組織(プローブとして標識した36P1G3 cDNA(実施例1におけるような配列)を使用する、全部で16個の異なる正常ヒト組織を含む)におけるSGP28 mRNA発現は、Clontech(Palo Alto, California)から得られた2つの多重組織ブロットをノーザンブロットすることによってまず実施した。RNAサンプルを、β−アクチンプローブを用いて定量的に標準化した。この結果を図1A〜Bに示し、そして試験した16種の組織内のSGP28が、前立腺、精巣および卵巣で排他的に発現されることを示す。興味深いことに、この前立腺および卵巣は、2.4kbの転写を示すが、精巣は、1.6kbメッセージ(この1.6メッセージは、別のSGP28ファミリーメンバーを示す)を発現する。正常の精巣における低分子量は、おそらく、CRISP2メッセージに対するプローブ(SSHフラグメント)のクロスハイブリダイゼーションに起因する。同一の転写を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用する正常パネル上のCRISP2で確認した(Kratzschmar,J.ら(1996)Eur.J.Biochem.236:827−836)。
【0176】
さらに、ヒト癌組織および細胞株におけるSGP28発現を分析するために、LAPC−4ヒト前立腺癌異種移植片から誘導されたRNAを、36P1G3プローブを使用するノーザンブロットによって分析した。全RNAサンプルを、エチジウムブロミド染色および標識したβ−アクチンプローブを用いた配列分析によって定量的に標準化した。この分析の結果を、図1Cに示し、そしてLAPC異種移植片の全てにおける2.4kb SGP28転写物の非常に高いレベルの発現を示す。
【0177】
前立腺癌組織におけるSGP28を分析するために、ノーザンブロットを、一致した正常隣接前立腺組織を用いた、3種の前立腺腫瘍サンプルから誘導されたRNA上で実施した。この結果は、SGP28mRNA発現は、試験された3種の腫瘍検体のうち全3つにおいて、そして3種のうち2つにおいて非常に高いレベルの発現を検出されることを示す。
【0178】
(実施例4:SGP28に対するポリクローナル抗体の産生)
SGP28に対するポリクローナル血清を産生するために、SGP28タンパク質のアミノ酸93−107(CNYRHSNPKDRMTSL;配列番号27)に対応するペプチドを、合成した。ペプチド配列を、Keyhole吸着ヘモシアニン(limpet hemacyanin)(KLH)に連結し、そして以下のようにウサギを免疫するために使用した。このウサギを、フロイント完全アジュバント中で混合した200μgのペプチド−KLHを用いて最初に免疫した。次いで、このウサギに、フロイント不完全アジュバンド中の200μgのペプチド−KLHを2週間置きに注射した。血液を、各免疫の約7〜10日後に採血した。ELISAおよびウエスタンブロット分析を使用して、免疫ペプチドおよびSGP28タンパク質それぞれに対するウサギ血清の特異性および力価を決定した。Affigel10(BioRad)に対して共有結合させたSGP28ペプチド(CNYRHSNPKDRMTSL;配列番号27)から構成したアフィニティーカラム内を免疫ウサギ由来の粗血清を通過させることによって、アフィニティー精製したSGP28ポリクローナル抗体を調製した。PBSを用いたこの基質の大規模な洗浄後に、SGP28ペプチドに特異的な抗体を低pHのグリシン緩衝液(0.1M、pH2.5)を用いて溶出し、迅速に中和し、そしてPBSに対して大規模に透析した。
【0179】
SGP28タンパク質との反応性についてウサギ血清を試験するために、全長SGP28 cDNAを、カルボキシル末端(pCDNA 3.1 myc−his,In Virtogen)で6His tagを提供する発現ベクターにクローニングした。得られたMYC/HIS SGP28構築物を、293T細胞にトランスフェクトした。LAPC4細胞およびMYC/HIS SGP28で一過的にトランスフェクトされた293T細胞の全細胞溶解物および上清ならびにLAPC4およびLAPC9異種移植片溶解物を、アフィニティー精製したウサギ抗−SGP28pAb(1μg/ml)を使用するウエスタンブロッティングに供した。SGP28の免疫反応性結合を、HRP結合抗ウサギ第2抗体を用いたブロットのインキュベーションによって視覚化し、次いで増加した化学ルミネセンス検出によって視覚化した。この結果を図3に示し、そしてこの抗−SPG28ポリクローナル抗体が、LAPC4およびLAPC9異種移植片溶解物中のSGP28タンパク質ならびにLAPC4およびトランスフェクトされた293Tの細胞株上清中のSGP28タンパク質と同一であることを示す。
【0180】
(実施例5:哺乳動物細胞における組換えSGP28タンパク質の発現)
(pcDNA3.1/MycHis構築物)
哺乳動物細胞中で36P1G3を発現するために、774bp(258アミノ酸)の36P1G3 ORFをpcDNA3.1/MycHis Version A(Invitrogen,Carlsbad,CA)へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、C末端に融合したmycおよび6つのヒスチジンを有する。このpcDNA3.1/MycHisベクターはまた、ラージT抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純ベクターレスキューのためのSV40起源に加えて、mRNAの安定性を増大するためのウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびColE1起源は、E.coliにおけるこのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【0181】
(pAPtag構築物)
シグナル配列(アミノ酸33〜258)を有さない36P1G3/SGP28タンパク質を、pAPtag−5(GenHunter Corp.Nashville,TN)中にクローニングした。この構築物は、36P1G3タンパク質のC末端でのアルカリホスファターゼ融合を生じ、その上IgGKシグナル配列をN末端に融合する。得られた組換え36P1G3タンパク質を、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培養物中に分泌するために最適化し、そして36P1G3タンパク質と相互作用するタンパク質(例えば、リガンドまたはレセプター)を同定するために使用し得る。タンパク質発現は、CMVプロモーターから駆動され、そして組換えタンパク質はまた、アルカリホスファターゼのC末端に融合したmycおよび6つのヒスチジンを含む。ゼオシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、E.coliにおけるこのプラスミドの選択を可能にする。
【0182】
(ptag5構築物)
シグナル配列(アミノ酸33〜258)を有さない36P1G3タンパク質をまた、pTag−5中にクローニングした。このベクターは、pAPTagと同様であるが、アルカリホスファターゼ融合を伴わない。
【0183】
(pSRa構築物)
構成的に36P1G3を発現する哺乳動物細胞株を作製するために、774bp(258アミノ酸)ORFをpSRa構築物にクローニングした。アンホトロピックおよびエコトロピックなレトロウイルスを、pSRa構築物の293T−10A1パッケージング株へのトランスフェクション、またはpSRaとヘルパープラスミド(j−)の293細胞中への同時トランスフェクションによって、それぞれ作製する。レトロウイルスは、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために使用し得、それによってクローン化した遺伝子である36P1G3の宿主細胞株中への組込みを生じる。タンパク質の発現は、長末端反復(LTR)から駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてColE1起点は、E.coli中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。抗FLAG抗体を使用する検出を可能にするためにC末端にFLAGタグを融合させたさらなるpSRa構築物を作製した。FLAG配列(5’gat tac aag gat gac gac gat aag 3’)(配列番号36)をORFの3’末端のクローニングプライマーに付加した。
【0184】
N末端およびC末端の両方のGFP、ならびに全長の36P1G3タンパク質のmyc/6 HIS融合タンパク質を生じるために、さらなるpSRa構築物を構築し得る。
【0185】
(実施例6:昆虫細胞における組換えSGP28タンパク質の発現)
(pMelBac a)
シグナル配列(アミノ酸33〜258)を有さない36P1G3タンパク質をまた、Sf9昆虫細胞においてこのタンパク質を発現および分泌するために、pMelBac(カタログ番号V1950−20,Invitrogen,CA)にクローニングした。このpMelBAC Aベクターは、細胞外培地への分泌経路を介して組換えタンパク質を直接発現するために設計されたバキュロウイルス移入ベクターである。ミツバチメリチン(高度に発現され、そして高効率で分泌されるタンパク質)についてのシグナル配列を、組換え36P1G3タンパク質の直接分泌のために使用する。タンパク質の発現は、ポリヘドリンプロモーター下で駆動される。C末端myc−hisタグ化構築物をまた、組換え36P1G3タンパク質の検出および精製を可能にするためにpMelBac A中に作製した。
【0186】
(pIZT/V5His)
36P1G3タンパク質を、Sf9昆虫細胞中にこのタンパク質を発現するために、pIZT/V5His(カタログ番号v8010−01,Invitrogen,CA)中にクローニングした。この発現ベクターは、一過性であり、そして安定な組換えタンパク質の発現を可能にする。タンパク質の発現は、高レベルの構成的な発現について、OpIE2プロモーターによって駆動される。ゼオシン耐性遺伝子は、OpIElプロモーターの制御下である。
【0187】
(実施例7:SGP28に対するモノクローナル抗体の作製)
SGP28に対するmABを作製するために、293T組織培養物の上清から精製した組換えHISタグ化SGP28タンパク質を、5匹の雌性のBalb Cマウスを免疫するために使用した。最初の免疫化を、フロイント完全アジュバント中に混合した50μgの精製SGP28タンパク質を用いて行った。次いで、ブーストを、フロイント不完全アジュバント中に混合した50μgのSGP28タンパク質を用いて、2週間の間隔で投与した。各免疫化の7〜10日後に採取した試験採血の反応性および特異性を、ELISAおよびウエスタンブロッティング手順によって決定した。免疫原に対する試験採血の特異性の力価は、少なくとも2×106であった。3匹のマウスを引き続いて屠殺し、そして標準的手順(HarlowおよびLane,1988)使用して融合およびハイブリドーマ作製を行うために、脾臓を使用した。次いで、11の陽性ウェルを、SGP28特異的モノクローナルハイブリドーマを作製するためにサブクローニングに供した。サブクローニングが完了したハイブリドーマの1つ(4G6(IgGlアイソタイプ)と名付けた)は、前立腺癌細胞溶解物および上清中に存在するSGP28タンパク質を特異的に認識し、そして臨床的前立腺癌組織におけるSGP28タンパク質と著しく反応したが、同じ患者の正常な隣接組織には反応しなかった(図4)。
【0188】
図4は、抗SGP28モノクローナル抗体が、前立腺癌細胞株および上清、前立腺癌異種移植片、ならびに臨床的前立腺癌組織中のSGP28タンパク質を特異的に検出することを示す。LAPC4前立腺癌細胞株由来の細胞溶解物および馴化培地、ならびにLAPC4およびLAPC9前立腺癌異種移植片由来の溶解物、ならびに一致した正常および癌性前立腺の臨床試料由来の溶解物を、SDS−PAGEによって分離し、そしてニトロセルロースへと移した。次いでこのブロットを、4G6抗SGP28モノクローナル抗体上清の1:2希釈を用いてウエスタン分析に供した。次いで、特異的なSGP28免疫反応性バンドを、抗マウスIgG−HRP結合体第二抗体と共にインキュベートし、そして増大した化学発光を用いる発生およびオートラジオグラフィーのフィルムへの暴露によって可視化した。SGP28免疫反応性タンパク質の二重線が矢印で示される。
【0189】
(実施例9:SGP28タンパク質発現のウエスタン分析)
前立腺癌および正常な隣接組織の一致した臨床的組織溶解物、ならびにLAPC4細胞株およびLAPC−4異種移植片の正常な組織溶解物を、1μg/mlの親和性精製したウサギ抗SGP28ポリクローナル抗血清を用いるウエスタンブロッティングに供した。HRP結合体化抗ウサギ第二抗体を用いるこのブロットのインキュベーション、続いて増大した化学発光の検出によって、SGP28免疫反応性バンドを可視化する。この結果(図5A〜B)は、SGP28の、前立腺癌サンプルにおける高レベルの発現(隣接する正常な組織では発現しない)、およびLAPC異種移植片における高レベルの発現を示す。低レベルの発現を、正常な精巣および肺において検出した。
【0190】
(実施例10:前立腺癌、PINおよび前立腺癌転移部におけるSGP28の免疫組織化学的検出)
Gleasonスコア7の前立腺癌試料、ならびに高グレードのPIN試料におけるSGP28の発現を、以下のようにSGP28発現の免疫組織化学的分析に供した。組織切片をこのサンプルから調製し、10%ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、そして標準的プロトコルに従って切片化した。切片を、抗SGP28ポリクローナル抗体で染色した(上記のように)。この結果を、図6A〜Bに示す。強い染色を、前立腺の上皮細胞(特に、管腔の境界)において観察した。染色をまた、この管腔内で観察し、これは、前立腺癌およびPINにおけるSGP28の高レベルの発現および分泌を示す。
【0191】
同様に、ポリクローナル抗SGP28を、前立腺癌転移部におけるSGP28発現を検出する能力を評価するために使用した。図7A〜Bは、骨(図7A)およびリンパ節(図7B)への前立腺癌転移におけるSGP28タンパク質の発現を示す免疫組織化学的分析の結果を示す。
【0192】
前立腺癌およびPINにおけるSGP28の高い発現を、免疫組織化学を使用してさらに実証し、そしてこの結果を図8A〜Dに示す。図8Aは、200×の倍率での前立腺癌におけるSGP28の免疫組織化学的検出を示し;図8Bは、800×での検出を示す。PINにおけるSGP28の発現を、200×で図8Cに示し、そして800×で図8Dに示す。前立腺癌およびPINについての免疫組織化学的分析の結果の要旨を表3に示し、そして組織の広範囲について表4に示す。試験した広範囲の組織(正常な前立腺を含む)中での免疫組織化学的に検出可能な発現の欠如は、前立腺癌およびPINにおける強い染色と組み合わせて、SGP28が、抗体ベースの診断(生検試料の評価およびインビボ画像化を含む)についての特に適切な標的であることを示す。
【0193】
【表3】
【0194】
【表4】
(実施例11:可能性のあるシグナル伝達経路の同定)
SGP28が細胞中の公知のシグナル伝達経路を直接または間接的に活性化するか否かを決定するために、ルシフェラーゼ(luc)に基づく転写レポーターアッセイを、SGP28を発現する細胞中で行う。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する公知の転写因子についてのコンセンサスな結合部位を含む。レポーターおよびそれらの会合する転写因子の例、シグナル伝達経路、および活性化の刺激を以下に列挙する。
【0195】
1.NFkB−luc、NFkB/Rel;Ik−キナーゼ/SAPK;増殖/アポトーシス/ストレス
2.SRE−luc、SRF/TCF/ELK1;MAPK/SAPK;増殖/分化
3.AP−1−luc、FOS/JUN;MAPK/SAPK/PKC;増殖/アポトーシス/ストレス
4.ARE−luc、アンドロゲンレセプター;ステロイド/MAPK;増殖/分化/アポトーシス
5.p53−luc、p53;SAPK;増殖/分化/アポトーシス
6.CRE−luc、CREB/ATF2;PKA/p38;増殖/アポトーシス/ストレス
SGP28によって媒介される効果を、mRNAの発現を示す細胞中でアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質によって媒介されるトランスフェクション(TFX−50、Promega)によって導入し得る。ルシフェラーゼ活性(相対的な転写活性の指標)を、ルシフェリン基質との細胞の抽出物のインキュベーションによって測定し、そして反応物の発光を、ルミノメーターでモニターする。
【0196】
(実施例12:SGP28機能のインビトロアッセイ)
前立腺癌中でのSGP28の発現プロフィールは、腫瘍の開始、進行および/または維持における機能的な役割を示唆する。SGP28の機能を、インビトロでのアプローチを使用して哺乳動物細胞中で評価し得る。哺乳動物での発現のために、SGP28を多数の適切なベクター(pcDNA 3.1 myc−His−tagおよびレトロウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら、1991、MCB 11:1785)を含む)中にクローン化し得る。このような発現ベクターを使用して、SGP28を、いくつかの癌細胞株(例えば、PC−3、NIH 3T3、LNCaP、および293Tを含む)中で発現させ得る。SGP28の発現を、抗SGP28抗体を使用してモニターし得る。
【0197】
SGP28を発現する哺乳動物細胞株を、いくつかのインビトロおよびインビボのアッセイ(組織培養物中での細胞の増殖、アポトーシスシグナルの活性化、SCIDマウス中での原発性および転移性の腫瘍の形成、および膜侵襲培養系(MICS)(Welchら、Int.J.Cancer 43:449−457)を使用するインビトロでの侵襲を含む)において試験し得る。SGP28細胞表現型を、SGP28の発現を欠く細胞の表現型と比較する。さらに、外因的に添加されたSGP28タンパク質ありおよびなしで処置された細胞を、改変された増殖パラメーターについて分析し得る。
【0198】
SGP28を発現する細胞株をまた、マトリゲルでコーティングした多孔質膜チャンバー(Becton Dickinson)を通じる細胞の通過を測定することによって、侵襲性および移動の特性の変化についてアッセイし得る。膜を通じる反対側への細胞の通過を、蛍光アッセイ(Becton Dickinson Technical Bulletin #428)を使用して、指示細胞を充填したcalcein−Am(Molecular Probes)を使用して、モニターする。分析した細胞株は、親、およびSGP28を過剰発現するPC3細胞、3T3細胞、およびLNCaP細胞を含む。SGP28が化学誘引特性を有するか否かをアッセイするために、親の指示細胞を、コントロール培地に対して比較して、SGP28の馴化培地の勾配に対する多孔質膜を通した通過をモニターする。このアッセイをまた、候補の癌治療組成物によるSGP28によって誘導される影響の特異的な中和の定性および定量のために使用し得る。
【0199】
SGP28が、前立腺癌細胞および他の癌細胞または正常細胞中で発現される細胞タンパク質に結合するか否かを確証するために、2つのアプローチを用い得る。最初のアプローチにおいて、種々の細胞株に結合する組換えHISタグ化SGP28につていのインビトロアッセイを使用する。別のアプローチにおいて、GenHunter Corporation(Nashville,TN,カタログ#Q202)からのAP−TAG系、および記載されるような(ChengおよびFlanagan,1994,Cell 79:157−168)種々の前立腺癌細胞株へのSPG28の結合を試験するために使用されるAP−TAG融合物を使用して、組換えアルカリホスファターゼSGP28融合タンパク質を作製する。この細胞の洗浄およびAP基質BCIPの添加後(これは、脱リン酸化の際に不溶性青色沈殿を形成する)、SGP28の結合を、光学顕微鏡下で青色に染色する細胞を同定することによって決定する。種々の癌細胞株(種々の前立腺癌細胞株(例えば、LNCaP、PC−3、DU145、TSUPR、LAPC4)が挙げられるがこれらに限定されない)を試験し得る。他の細胞株(例えば、PREC前立腺細胞株、293T、PIN細胞、およびNIH 3T3など)をまた、試験し得る。さらに、LAPCおよび他の前立腺癌異種移植片を試験し得る。平衡解離速度定数を、結合相互作用の強度を評価するために算出し得る。さらに、細胞当たりの細胞表面レセプターの数を決定し得る。SGP28に対する最も高い結合能力を有する細胞株または組織は、SGP28レセプターまたは他の結合パートナーのクローニングのために好ましい。
【0200】
別の機能的アッセイにおいて、SGP28を安定に発現するNIH−3T3細胞を、軟寒天においてコロニーを形成するその能力について分析し得る。これらの実験において、このような手順で使用された細胞(例えば、NIH−3T3細胞)を、SGP28の形質転換能力を評価するために、SGP28またはneoまたは活性化されたRas(それぞれ試験遺伝子、ネガティブコントロール、およびポジティブコントロールとして)を安定に発現するようにトランスフェクトし得る。代表的に実験を二連で行い、そしてこのアッセイを、細胞のプレーティングの約4週間後に評価した。SGP28が、ネガティブコントロール(例えば、neo)と比較してコロニー形成における増加を誘導するということを実験的観察が実証する場合、このような結果は、SGP28が有意な形質転換能力を有することを示す。
【0201】
(実施例13:SGP28腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ)
SGP28タンパク質の腫瘍細胞増殖に対する影響は、腫瘍保有マウスにおける遺伝子過剰発現によりインビボで評価され得る。例えば、SCIDマウスは、それぞれの側腹部上に、tkNeo空ベクターまたはSGP28を含む1×106の前立腺細胞株をSQで注射され得る。少なくとも2つのストラテジーが使用され得る:(1)LTRプロモーターの調節下での構成性SGP28発現、および(2)誘導性ベクター系(例えば、ecdysone、tetなど)の制御下での調節された発現。次いで、腫瘍容積を触知可能な腫瘍の外観でモニターし、次いでSGP28発現細胞がより早い速度で成長するか否かを経時的に測定する。さらに、マウスに1×105の同じ細胞を同所移植して、SGP28が標的組織(すなわち前立腺)における局所成長または細胞の(特に肺、リンパ節、肝臓、骨髄などに)転移する能力に対する効果を有するか否かを決定し得る。SGP28の骨腫瘍形成および成長に対する効果を、実施例1に記載されるように、前立腺腫瘍細胞を、脛骨内に注射することにより評価し得る。
【0202】
これらのアッセイはまた、候補治療組成物(例えば、SGP28抗体、SGP28アンチセンス分子およびリボザイム)のSGP28抑制効果を決定するために有用である。
【0203】
(実施例14:SGP28の細胞への結合についての機能的アッセイ)
いくつかの分泌タンパク質が前立腺癌において記載されており、これらの多くは、腫瘍形成および進行のプロセスに関与することが示された(Inoue K.,2000,Clin.Cancer Res.6:2104−19,Dow JK,deVere White RW,2000,Urology 55:800−6)。SGP28は分泌タンパク質であるので、その潜在的な機能の1つは、前立腺癌および転移性疾患の微小環境を調節することである。この可能性を試験するために、SGP28を、組換えタンパク質(例えば、GST−SGP28またはSGP28−Myc/His)として発現および精製し得る。次いで精製された組換えSGP28(GST−SGP28またはSGP28−Myc/Hisのいずれか)を、前立腺の環境を反復する種々の細胞型(前立腺上皮細胞、前立腺腫瘍細胞株、前立腺間質細胞、前立腺内皮細胞および前立腺神経内分泌細胞を含む)と共にインキュベートする。さらに、組換えSGP28をまた、転移部位において見出される細胞(例えば、骨髄細胞および免疫系の細胞)と共にインキュベートする。SGP28のインタクトな細胞への結合を、FACS分析および熱量計アッセイにより検出する。この分析は、SGP28に結合して応答し得る細胞集団を用いて同定するので価値がある。さらに、標的細胞集団の同定は、SGP28レセプターの単離および同定の手段を提供し、それによりSGP28媒介事象を調節するさらなる手段を提供する。
【0204】
(実施例15:SGP28のディフェンシン様活性についてのアッセイ)
SGP28は、ディフェンシンタンパク質、特にβ−ディフェンシンに対して強い相同性を有する。β−ディフェンシンは、主に上皮細胞により産生される分泌産物である(O’Neil DAら,1999,J.Immunol.163: 6718−24;Schroder JM,Harder J.,1999,Int.J.Biochem.Cell.Biol.31: 645−51)。ディフェンシンは、感染の予防および上皮組織の免疫の保護において重要な役割を果たし得る。さらに、ヒトHNP1ディフェンシンは、インビトロで腫瘍細胞死を誘導することが示された。SGP28の細胞死における役割を調べて、精製された組換えSGP28を、上記に列挙された種々の細胞型と共にインキュベートし、そしてアネキシンV染色細胞のFACS分析を使用してアポトーシス活性について分析する。SGP28はまた、他のディフェンシン分子について示されたように、化学誘引物質として機能し得る(Yang Dら,2000,Leukoc.Biol.68:9−14;Yang Dら,1999,Science 286(5439):525−8)。走化性アッセイを使用して、種々の型の細胞(上皮細胞、間質細胞、内皮細胞ならびに単球、リンパ球、および樹状細胞を含む)の移動に対するSGP28の影響を評価し得る。
【0205】
(実施例16:SGP28ペプチドのHLA−A2への推定結合)
ヒトMHCクラスI分子HLA−A2に結合することが推測されるSGP28ペプチドを同定するために、SGP28タンパク質の完全アミノ酸配列を、Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS)ウェブサイト(http://bimas.dcrt.nih.gov/)に見出されるHLAペプチドモチーフ検索アルゴリズムに入力した。SGP28推定結合ペプチドの結果を表5に示す。上位10にランクする候補を、その位置、各特定ペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアと共に示す。結合スコアは、そのペプチドを含む複合体の37℃pH6.5における解離の推定半減期に対応する。最も高い結合スコア有するペプチド(すなわちSGP28ペプチド2について999.9)を、細胞表面上のHLAクラスIに最も密接に結合し、従ってT細胞認識についての最も良好な面原性標的を表わすと推定する。ペプチドのHLA−A2への実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株T2条でのHLA−A2発現の安定化により評価され得る(Xueら,1997,Prostate 30:73−8;Peshwaら,1998,Prostate 36:129−38)。特定のペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の刺激によりインビトロで評価され得る(Xueら,1997,Prostate 30:73−8;Peshwaら,1998,Prostate 36:129−38)。
【0206】
【表5】
本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書によりその全体が本明細書中に参考として援用される。
【0207】
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によりその範囲を限定されず、これらの実施形態は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図され、かつ機能的等価物のいずれも本発明の範囲内である。本明細書中に記載されるモデルおよび方法に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変は、上述の説明および教示から当業者に明らかとなり、そして同様に本発明の範囲内であることが意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1A〜Cは、正常組織におけるSGP28mRNA発現(図1Aおよび1B)および前立腺癌異種移植片高レベル上方調節された発現(パネルC)のノーザンブロット分析を示す。正常精巣における低分子量のシグナルは、おそらくプローブ(SSHフラグメント)のCRISP2/TRX−1メッセージに対する交差ハイブリダイゼーションに起因する。同一転写物は、Kratzschmarら,1996,EurJ Biochem 236(3):827−36に記載されるような遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して、この正常パネルでCRISP2について見られた。図1Aにおいて、レーン1は、心臓であり、レーン2は、脳であり、レーン3は、胎盤であり、レーン4は、肺であり、レーン5は、肝臓であり、レーン6は、骨格筋であり、レーン7は、腎臓であり、そしてレーン8は、膵臓である。図1Bにおいて、レーン1は、脾臓であり、レーン2は、胸腺であり、レーン3は、前立腺であり、レーン4は、精巣であり、レーン5は、卵巣であり、レーン6は、小腸であり、レーン7は、結腸であり、そしてレーン8は、リンパ球である。図1Cにおいて、レーン1は、前立腺であり、レーン2は、LAPC−4 ADであり、レーン3は、LAPC−4 AIであり、レーン4は、LAPC−9 ADであり、そしてレーン5は、LAPC−9 AIである。
【図2】 図2は、前立腺腫瘍(レーン2、4、6)と正常隣接組織(レーン1、3、5)との3つの対のパネルにおけるSGP28/36P1G3mRNAのノーザンブロット分析であり、3つの腫瘍切片のうち3つにおける上方調節を示す。
【図3】 図3は、抗SGP28ポリクローナル抗体が、LAPC4およびLAPC9異種移植片溶解産物中のSGP28タンパク質、ならびにLAPC4細胞株およびトランスフェクトされた293T細胞株の上清中のSGP28タンパク質を同定することを実証するウェスタンブロットである。全細胞溶解産物(WCL)ならびにLAPC4細胞およびMYC/HIS SGP28で一時的にトランスフェクトされた293T細胞の上清、ならびにLAPC4およびLAPC9の異種移植片溶解産物を、アフィニティ精製されたウサギ抗SGP28pAb(1μg/ml)を使用するウエスタンブロットにかけた。SGP28免疫反応性バンドを、これらのブロットをHRP結合体化抗ウサギ二次抗体とのインキュベーション、次いで増強化学発光検出により可視化した。
【図4】 図4は、抗SGP28/CRISP−3モノクローナル抗体が、前立腺癌細胞株および上清、前立腺癌異種移植片、ならびに臨床的前立腺癌組織においてSGP28/CRISP−3タンパク質を特異的に検出するということを示すウエスタンブロット分析である。LAPC4前立腺癌細胞株由来の細胞溶解産物および馴化培地、ならびにLAPC4およびLAPC9前立腺癌異種移植減由来の溶解産物および対応する正常前立腺および癌性前立腺の臨床切片由来の溶解産物を、SD−PAGEにより分離し、そしてニトロセルロースに移した。次いでブロットを4G6抗SGP28/CRISP−3モノクローナル抗体上清の1:2希釈を用いてウエスタン分析にかけた。次いで特異的SGP28/CRISP−3免疫反応性バンドを、抗マウスIgG−HRP結合体化二次抗体とのインキュベーションおよび増強化学発光およびオートラジオグラフフィルムへの露光による現像により可視化した。
【図5A】 図5Aは、前立腺癌臨床サンプルおよびLAPC異種移植片におけるSGP28の高レベルの発現を示すウエスタンブロット分析である。前立腺癌(PCa)および正常隣接組織(NAT)の対応する臨床組織溶解産物ならびにLAPC4異種移植片の対応する臨床組織溶解産物を、1μg/mlのアフィニティ精製されたウサギ抗SGP28pAbを用いるウエスタンブロットにかけた。SGP28免疫反応性バンドを、これらのブロットをHRP−結合体化抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートし、次いで増強化学発光検出することにより可視化した。SGP28/CRISP−3免疫反応性タンパク質の二本のバンド(doublet)が矢印で示される。
【図5B】 図5Bは、LAPC異種移植片におけるSGP28の高レベルの発現、ならびに正常精巣および正常肺における低レベルの発現を示すウエスタンブロット分析である。脾臓、精巣、腎臓、肝臓および肺の正常組織溶解産物、ならびにLAPC4細胞株および異種移植片を、図5Aについて記載されるようにウエスタンブロットにかけた。SGP28/CRISP−3免疫反応性タンパク質の二本のバンドが矢印で示される。
【図6A】 図6Aは、Gleasonスコア7の前立腺癌(図6A)におけるSGP28タンパク質の免疫組織化学的分析であり、アフィニティ精製されたポリクローナル抗体を使用して、前立腺の管腔内へのSGP28の高レベルの発現および分泌を示す。強い染色が、前立腺の上皮細胞、特に管腔縁において上皮細胞で観察された。染色はまた管腔内で観察され、前立腺癌およびPINにおけるSGP28の高レベルの発現および分泌を示す。
【図6B】 図6Bは、高異型度(grade)PIN(図6B)におけるSGP28タンパク質の免疫組織化学的分析であり、アフィニティ精製されたポリクローナル抗体を使用して、前立腺の管腔内へのSGP28の高レベルの発現および分泌を示す。強い染色が、前立腺の上皮細胞、特に管腔縁において上皮細胞で観察された。染色はまた管腔内で観察され、前立腺癌およびPINにおけるSGP28の高レベルの発現および分泌を示す。
【図7A】 図7Aは、骨への前立腺癌転移におけるSGP28タンパク質の発現を実証する免疫組織化学的分析である。
【図7B】 図7Bは、リンパ節への前立腺癌転移におけるSGP28タンパク質の発現を実証する免疫組織化学的分析である。
【図8A】 図8は、前立腺癌およびPINにおけるSGP28タンパク質の免疫組織化学的分析である。図8Aは、200倍の倍率での前立腺癌におけるSGP28の免疫組織化学的検出を示す。
【図8B】 図8は、前立腺癌およびPINにおけるSGP28タンパク質の免疫組織化学的分析である。図8Bは、800倍の倍率における図8Aと同じものを示す。
【図8C】 図8は、前立腺癌およびPINにおけるSGP28タンパク質の免疫組織化学的分析である。図8Cは、200倍でのPINにおけるSGP28発現を示す。
【図8D】 図8は、前立腺癌およびPINにおけるSGP28タンパク質の免疫組織化学的分析である。図8Dは、800倍でのPINにおけるSGP28発現を示す。
【配列表】
Claims (14)
- 癌発現SGP28タンパク質の存在を検出する方法であって、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現されるSGP28タンパク質のレベルを決定する工程、およびこのように決定された該レベルを、対応する正常サンプル中の発現されるSGP28のレベルと比較する工程を包含し、該正常サンプルに対して増加した該試験サンプル中のSGP28タンパク質の存在が、該個体におけるこのような癌の存在を示す、方法。
- 前記細胞により発現されるSGP28タンパク質のレベルを決定する工程が、該細胞を、SGP28タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることを包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項2に記載の方法。
- SGP28遺伝子産物をモニタリングする方法であって、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現されるSGP28遺伝子産物の状態を決定する工程、およびこのように決定された該状態を、対応する正常サンプル中のSGP28遺伝子産物の状態と比較する工程を包含し、該正常サンプルに対して該試験サンプル中のSGP28遺伝子産物の変更された状態の存在が、該個体内の細胞成長の調節不全を示す、方法。
- 調節不全細胞成長の形跡について生物学的サンプルを試験する方法であって、該生物学的サンプル中のSGP28の状態を、対応する正常サンプル中のSGP28の状態と比較する工程を包含し、ここで該生物学的サンプルにおけるSGP28の状態の変更が、調節不全細胞成長と関連する、方法。
- 前記生物学的サンプル中のSGP28の状態が、SGP28mRNA発現のレベルまたはSGP28タンパク質発現のレベルを試験することにより評価される、請求項6に記載の方法。
- 前記SGP28の状態における変更が、SGP28発現細胞が通常存在しない組織由来の生物学的サンプル中の該SGP28発現細胞の存在により同定される、請求項6に記載の方法。
- 個体における癌の存在を診断するためのキットであって、該個体から得られた試験サンプル中で発現されたSGP28mRNAのレベルを決定するための手段を備え、ここで、このように決定された該レベルは、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現されたSGP28mRNAのレベルと比較され、該正常組織サンプルに対して該試験サンプル中の増加したSGP28mRNA発現の存在が、該癌の存在を示す、キット。
- 個体における癌の存在を診断するためのキットであって、該個体から得られた試験サンプル中で発現されたSGP28タンパク質のレベルを決定するための手段を備え、ここで、このように決定された該レベルは、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現されたSGP28タンパク質のレベルと比較され、該正常組織サンプルに対して該試験サンプル中の増加したSGP28タンパク質の存在が、該癌の存在を示す、キット。
- 前記癌が、前立腺癌または結腸癌であり、そして前記試験組織サンプルおよび前記正常組織サンプルが、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織、血清、血液または精液からなる群から選択される、請求項10に記載のキット。
- 前記試験サンプル中で発現されたSGP28タンパク質のレベルを決定するための手段が、該サンプルを、SGP28タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項10に記載のキット。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項12に記載のキット。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項12に記載のキット。
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