DE60130541T2

DE60130541T2 - Gewebespezifisches protein 103p2d6, stark exprimiert in verschiedenen krebsarten

Info

Publication number: DE60130541T2
Application number: DE60130541T
Authority: DE
Inventors: Arthur B. Los Angeles RAITANO; Daniel E. Brisbane AFAR; Gazelle Shiva Beverly Hills RASTEGAR; Steve Chappell Santa Monica MITCHELL; Rene S. Los Angeles HUBERT; Pia M. Encino CHALLITA-EID; Mary Los Angeles FARIS; Aya Beverly Hills JAKOBOVITS
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2021-02-27
Also published as: ATE373711T1; IL151335A; WO2001062925A3; EP1257644A2; EP1257644B1; IL151335A0; DE60130541D1; AU4174201A; AU2001241742B2; WO2001062925A2; AU2001241742B8; CA2400443A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Gen und das von ihm kodierte Protein, das als 103P2D6 bezeichnet wird. Ferner sind diagnostische und therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, die zur Behandlung verschiedener Karzinome geeignet sind, welche 103P2D6 exprimieren.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Krebs ist neben Erkrankungen der Herzkranzgefäße die zweithäufigste Todesursache beim Menschen. Weltweit sterben jedes Jahr Millionen von Menschen an Krebs. Allein in den Vereinigten Staaten von Amerika sind jährlich mehr als eine halbe Million Krebs bedingte Todesfälle zu verzeichnen, wobei jedes Jahr rund 1,4 Millionen neue Fälle diagnostiziert werden. Während Todesfälle infolge von Herzkrankheiten signifikant zurückgegangen sind, nehmen Krebs bedingte Todesfälle generell zu. Prognosen zufolge wird Krebs Anfang des nächsten Jahrhunderts die führende Todesursache sein.
Weltweit stechen mehrere Krebserkrankungen als Todesursache hervor. Insbesondere Karzinome der Lunge, der Prostata, der Brust, des Kolons, der Bauchspeicheldrüse und der Eierstücke repräsentieren die führenden Ursachen von krebsbedingten Todesfällen. Diese und praktisch alle anderen Karzinome haben ein tödliches Merkmal gemein. Mit sehr wenigen Ausnahmen verläuft die Metastasierung eines Karzinoms tödlich. Die gängige Erfahrung hat gezeigt, dass sich darüber hinaus selbst bei solchen Krebspatienten, die ihre primäre Krebserkrankung zunächst überleben, das Leben drastisch ändert. Viele Krebspatienten haben Angst vor einer möglichen Rückkehr bzw. einem möglichen Rezidiv der Krankheit oder vor einem Versagen der Behandlung. Viele Krebspatienten erleiden infolge der Behandlung körperliche Behinderungen. Darüber hinaus treten bei vielen Krebspatienten Rezidive auf.
Prostatakrebs ist weltweit bei Männern die vierthäufigste Krebserkrankung. In Nordamerika und Nordeuropa handelt es sich hierbei um die bei weitem häufigste Krebserkrankung bei Männern und die zweithäufigste Ursache krebsbedingter Todesfälle bei Männern. Allein in den USA sterben jährlich weit über 40.000 Männer an dieser Krankheit, übertroffen allein von Lungenkrebs. Trotz der Größenordnung dieser Zahlen gibt es noch immer keine wirksame Behandlung für metastasierten Prostatakrebs. Chirurgische Prostatektomie, Strahlentherapie, Hormonablationstherapie, chirurgische Kastration und Chemotherapie sind nach wie vor die hauptsächlichen Behandlungsmodalitäten. Leider sind diese Behandlungen bei vielen unwirksam und häufig mit unerwünschten Folgen verbunden.
Was die Diagnostik anbelangt, bleibt das Fehlen eines Prostatatumormarkers, mit dem sich lokalisierte Tumoren im Frühstadium akkurat erkennen lassen, eine signifikante Einschränkung bei der Diagnose und der Behandlung dieser Krankheit. Das prostataspezifische Antigen (PSA) im Serum ist zwar ein sehr nützliches Hilfsmittel, aber seine Spezifität und allgemeine Nützlichkeit werden in mancherlei bedeutender Hinsicht gemeinhin als mangelhaft betrachtet.
Der Fortschritt bei der Identifizierung weiterer spezifischer Marker für Prostatakrebs ist durch die Generierung von Prostatakrebs-Xenografts verbessert worden, die verschiedene Stadien der Krankheit bei Mäusen wiedergeben können. Die LAPC(Los Angeles Prostate Cancer)-Xenografts sind Prostatakrebs-Xenografts, die die Passage in SCID-Mäuse(Mäuse mit schwerer kombinierter Immundefizienz) überlebt und sich als fähig erwiesen haben, den Übergang von der Androgenabhängigkeit zur Androgenunabhängigkeit zu imitieren (Klein et al., 1997, Nat Med. 3: 402). In jüngerer Zeit identifizierte Prostatakrebsmarker umfassen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), das prostataspezifische Membranantigen (PSM-Antigen) (Pinto et at., Clin Cancer Res 1996 Sep; 2(9): 1445-51), STEAP (Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8) und das Prostatastammzellenantigen (PSCA) (Reiter et al., 1998, Prot. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).
Obgleich die bereits identifizierten Marker wie PSA, PSM, PCTA und PSCA die Diagnose und Behandlung von Prostatakrebs erleichtert haben, müssen weitere Marker und therapeutische Ziele für Prostatakrebs und verwandte Krebserkrankungen identifiziert werden, um die Diagnose und die Therapie weiter zu verbessern.
Die WO 01/18022 beschreibt neuartige sezernierte Humanproteine und isolierte Nukleinsäuren, welche die Kodierungsregionen von Genen enthalten, die solche Proteine kodieren. Dieses Dokument stellt außerdem Vektoren, Zellen, Antikörper und Rekombinationsverfahren zur Herstellung sezernierter Humanproteine bereit. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische und therapeutische Verfahren, die für das Diagnostizieren und Behandeln von Krankheiten, Störungen und/oder Leiden in Verbindung mit neuartigen sezernierten Humanproteinen geeignet sind.
Die WO 98/45435 beschreibt sESTs (sezernierte exprimierte Sequenzmarker bzw. Sequenztags), die aus verschiedenen humanen Gewebequellen isoliert worden sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Gen mit der Bezeichnung 103P2D6, das in mehreren in Tabelle I aufgeführten Karzinomen überexprimiert ist. Northern-Blot-Expressionsanalyse der 103P2D6-Genexpression in normalem Gewebe von Erwachsenen zeigt ein restringiertes Expressionsmuster. Die Analyse der 103P2D6-Expression in der normalen Prostata und in Prostatatumor-Xenografts zeigt eine Überexpression in LAPC4- und LAPC-9-Prostatatumor-Xenografts. Die Nukleotid-(2) und Aminosäure-(2 und 3)Sequenzen von 103P2D6 sind angegeben. Anteile der 103P2D6-Aminosäuresequenz zeigen gewisse Homologien zu ESTs in der dbEST-Datenbank. Das gewebebezogene Profil von 103P2D6 in normalem Gewebe von Erwachsenen, kombiniert mit der bei Prostatatumoren und anderen Tumoren beobachteten Überexpression, zeigt, dass 103P2D6 zumindest in einigen Karzinomen irrtümlich überexprimiert ist und daher als geeignetes diagnostisches und/oder therapeutisches Ziel für Karzinome der in Tabelle I aufgeführten Gewebe dient.
Die Erfindung stellt Polynukleotide bereit, die den Genen, mRNAs und/oder Kodierungssequenzen von 103P2D6, ganz oder teilweise entsprechen bzw. dazu ganz oder teilweise komplementär sind, vorzugsweise in isolierter Form, einschließlich Polynukleotide, die 103P2D6-bezogene Proteine und Fragmente aus 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 oder mehr als 25 Aminosäuren kodieren, sowie die Peptide/Proteine selbst, DNA, RNA, DNA/RNA-Hybride und verwandte Moleküle, Polynukleotide oder Oligonukleotide, die zu den 103P2D6-Genen oder -mRNA-Sequenzen oder Teilen davon komplementär sind oder eine Homologie von mindestens 90% dazu aufweisen, und Polynukleotide oder Oligonukleotide, die mit den 103P2D6-Genen, -mRNAs oder mit 103P2D6 kodierenden Polynukleotiden hybridisieren. Es werden außerdem Mittel zum Isolieren von cDNAs und der 103P2D6 kodierenden Gene bereitgestellt. Ferner werden rekombinante DNA-Moleküle, die 103P2D6-Polynukleotide enthalten, Zellen, die mit solchen Molekülen transformiert oder transduziert sind, und Wirt-Vektor-Systeme für die Expression von 103P2D6-Genprodukten bereit gestellt. Die Erfindung stellt ferner Antikörper bereit, die an 103P2D6-Proteine und -Polypeptidfragmente davon binden, einschließlich polyklonale und monoklonale Antikörper, Antikörper von Mäusen und anderen Säugern, chimäre Antikörper, humanisierte und vollständig humane Antikörper und mit einem detektierbaren Marker markierte Antikörper.
Es werden auch Verfahren für das Nachweisen des Vorhandenseins und Zustandes von 103P2D6-Polynukleotiden und -Proteinen in verschiedenen biologischen Proben sowie Verfahren zum Identifizieren von Zellen, die 103P2D6 exprimieren, bereit gestellt. Es werden Verfahren zum Überwachen von 103P2D6-Genprodukten in einer Gewebe- oder Blutprobe bereit gestellt, die eine gewisse Form einer Wachstumsregulationsstörung wie beispielsweise Krebs aufweisen oder bei denen eine gewisse Form einer Wachstumsregulationsstörung wie beispielsweise Krebs vermutet wird.
Die Erfindung stellt ferner verschiedene immunogene oder therapeutische Zusammensetzungen und Strategien zum Behandeln von Karzinomen bereit, die 103P2D6 exprimieren, wie beispielsweise Prostatakarzinome, einschließlich Therapien, die auf die Hemmung der Transkription, Translation, Prozessierung oder Funktion von 103P2D6 abzielen, sowie Krebsimpfstoffe.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die DNA-Sequenz von 103P2D6 nach Suppression Subtractive Hybridization (SSH) (SEQ ID Nr.: 3).
2A–B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von 103P2D6. cDNA und ORF des 103P2D6-Klons B, Kozak- Sequenz und Startmethionin sind fett gedruckt. Siehe Beispiel 2, unten.
3 zeigt die von dem in 2 gezeigten, offenen Leseraster kodierte Aminosäuresequenz und listet die Aminosäurepositionen auf, die für erfindungsgemäße Proteine/Peptide verwendet werden. Die 103P2D6-Signalsequenz ist mit einem Kasten umgeben.
4 zeigt die Ausrichtung der Sequenz von 103P2D6 (ORF von Klon B) mit der Sequenz des env-Proteins des humanen endogenen retroviralen NERV-H (FASTA-Zugangskennung: Q9UNM3). Die 103P2D6-Proteinsequenz weist Homologie zu dem env-Protein von HERV-H auf (24,9% Identität und 32,8% Homologie unter Berücksichtigung etwaiger Lücken).
5A–C zeigen die Northern-Blot-Analyse der 103P2D6-Expression in verschiedenen gesunden Humangeweben (wobei das 103P2D6-SSH-Fragment als Sonde verwendet wurde) und LAPC-Xenografts. Zwei multiple Northern-Gewebeblots (Clontech) und ein Northern-Xenograftblot wurden mit dem 103P2D6-SSH-Fragment als Sonde behandelt. Auf jeder Seite sind die Größenstandards in Kilobasen (kb) angegeben. Jede Spur enthält 2 μg mRNA von Normalgewebe und 10 μg RNA von Xenograftgewebe. Die Ergebnisse zeigen die Expression von 103P2D6 in LAPC-Xenografts bzw. die nicht vorhandene Expression von 103P2D6 in gesunder Prostata und anderen Geweben. Die Spuren in 5A geben Folgendes wieder: (1) Herz; (2) Gehirn; (3) Plazenta; (4) Lunge; (5) Leber; (6) Skelettmuskel; (7) Niere; (8) Bauchspeicheldrüse. Die Spuren in 5B geben wieder: (1) Milz; (2) Thymus; (3) Prostata; (4) Hoden; (5) Eierstock; (6) Dünndarm; (7) Kolon; (8) Leukozyten; Die Spuren in 5C geben wieder: (1) Prostata; (2) LAPC-4 AD; (3) LAPC-4 AI; (4) LAPC-9 AD; (5) LAPC-9 AI.
6 zeigt die Northern-Blot-Analyse der 103P2D6-Expression in verschiedenen Zelllinien. Die Spuren geben wieder: (1) LAPC-4 AD; (2) LAPC-4 AI; (3) LAPC-9 AD; (4) LAPC-9 AI; (5) LNCaP; (6) PC-3; (7) DU145; (8) TsuPrI; (9) LAPC-4 CL; (10) HT1197; (11) SCaBER; (12) UM-UC-3; (13) TCCSUP; (14) J82; (15) 5637; (16) 293T; (17) RD-ES; (18) PANC-1; (19) BxPC-3; (20) HPAC; (21) Capan-1; (22) SK-CO-1; (23) CaCo-2; (24) LoVo; (25) T84; (26) Colo-205; (27) KCL 22; (28) PFSK-1; (29) T98G; (30) SK-ES-1; (31) HOS; (32) U2-OS; (33) RD-ES; (34) CALU-1; (35) A427; (36) NCI-H82; (37) NCI-H146; (38) 769-P; (39) A498; (40) CAKI-1; (41) SW839; (42) BT20; (43) CAMA-1; (44) DU4475; (45) MCF-7; (46) MDA-MB-435s; (47) NTERRA-2; (48) NCCIT; (49) TERA-1; (50) TERA-2; (51) A431; (52) HeLa; (53) OV-1063; (54) PA-1; (55) SW626; (56) CAOV-3.
7 zeigt die Northern-Blot-Analyse der Expression von 103P2D6 in verschiedenen LAPC-4 AD-Xenografts, einschließlich subkutan gewachsener Xenografts (sc), intratibial gewachsener Xenografts (it) und in Humanknochenexplantaten gewachsener Xenografts (LAPC-4 AD²) in SCID-Mäusen. Die Spuren geben Folgendes wieder: (1) LAPC-4 AD sc; (2) LAPC-4 AD sc; (3) LAPC-4 AD Sc; (4) LAPC-4 AD it; (5) LAPC-4 AD it; (6) LAPC-4 AD it; (7) LAPC-4 AD 2.
8 zeigt die Northern-Blot-Analyse der Expression von 103P2D6 in Geweben eines 9 Wochen alten Fetus, einschließlich 6 Organe und des gesamten Embryos. Die Spuren geben Folgendes wieder: (1) Gehirn; (2) Herz; (3) Niere; (4) Leber; (5) Lunge; (6) Muskel; (7) gesamter Embryo.
9 zeigt eine RT-PCR-Expressionsanalyse von 103P2D6. cDNAs, die unter Verwendung von Pools mehrerer normaler Gewebe und Krebsgewebe gewonnen wurden, wurden anhand von Beta-Aktin-Primern normalisiert und zur Untersuchung der Expression von 103P2D6 verwendet. Aliquots des RT-PCR-Gemisches nach 26 Zyklen (oberer Teil dieser Figur) und 30 Zyklen (unterer Teil dieser Figur) wurden auf Agarosegel analysiert, um eine halbquantitative Bestimmung des Grades der Expression der verschiedenen Proben vornehmen zu können. Die First-Strand-cDNAs in den verschiedenen Spuren dieser Figur sind wie folgt: Spur 1 (VP-1) enthält First-Strand-cDNA aus normalem Gewebe aus Leber, Lunge und Niere; Spur 2 (VP-2) aus normalem Gewebe aus Magen, Milz und Bauchspeicheldrüse; Spur 3 (Xenograft-Gewebepool) LAPC4AD, LAPC4AI, LAPC9AD und LAPC9AI; Spur 4 ist normaler Prostatagewebepool; Spur 5 ist Prostatakrebsgewebepool; Spur 6 ist Blasenkarzinomgewebepool; Spur 7 ist Nierenkarzinomgewebepool; Spur 8 ist Kolonkarzinomgewebepool; Spur 9 stammt aus einem Lungenkrebspatienten und Spur 10 ist Wasser als Leerwert.
10 zeigt die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse der Expression von 103P2D6 bei von Patienten stammenden Karzinomen. Spur 1 enthält eine Probe von einer normalen Prostata; Spur 2 von einer normalen Niere; Spur 3 von einem Prostatatumorpool, Spur 4 von einem Nierentumorpool, Spur 5 von einem Blasentumorpool, Spur 6 von HeLa-Zellen und für Spur 7 wurde Wasser verwendet.
11A–C zeigen die Expression von 103P2D6 in Bauchspeicheldrüsen-, Kolon- und Prostatakrebszelllinien. In Tafel A und B wurden Zelllysate (∼25 μg) der angegebenen Zelllinien mit SDS-PAGE aufgetrennt, einer Western-Blot-Analyse unterzogen, wobei ein Anti-103P2D6-pAb verwendet wurde. Der Pfeil deutet auf eine starke Anti-103P2D6-pAb-immunreaktive Bande von etwa 60 kD in den Bauchspeicheldrüsenkarzinomzelllinien HPAC und Bx PC-3, der Kolonkarzinomzelllinie CaCo-2 und auf eine schwächere Bande in LAPC9-Prostatakarzinomzellen hin und ist ein Zeichen für eine endogene Expression von 103P2D6-Protein. Ebenfalls mit einem Pfeil markiert ist die immunreaktive 85-kD-Bande in 293-T-Zellen, die mit V5-His-markierter 103P2D6-cDNA transfiziert wurden. In Tafel C wurden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen Bx PC-3 mit Anti-103P2D6-pAb (10 μg/ml) oder mit Kaninchen- IgG-Kontrollantikörpern gefärbt und nach Inkubation mit FITC-konjugiertem sekundärem Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen. Mit dem Anti-103P2D6-pAb gefärbte Bx PC-3-Zellen zeigten im Vergleich zu den mit dem Kaninchen-IgG-Kontrollantikörper gefärbten Zellen eine Fluoreszenzverschiebung, was darauf hindeutet, dass 103P2D6 auf der Zelloberfläche exprimiert wird.
12A–B zeigen die Expression von 103P2D6-Protein in 293T-Zellen. Für die Daten in Tafel A wurden 293T-Zellen entweder mit pCDNA 3.1 V5-His 103P2D6-Plasmid oder mit einem leeren Kontrollvektor transient transfiziert und 2 Tage später geerntet. Die Zellen wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer lysiert und die Lysate wurden im SDS-PAGE-Gel getrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Western Blotting erfolgte mit einem Anti-103P2D6-Kaninchen-pAb (2 μg/ml), der gegen ein Peptid erzeugt wurde, das Aminosäure 163–176 in der extrazellulären Domäne von 103P2D6 kodiert. Immunreaktive Anti-103P2D6-Banden wurden durch Inkubation mit HRP-konjugiertem sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper erfasst und mit verstärkter Chemilumineszenz und Belichtung auf Autoradiographiefilm entwickelt. Der Pfeil zeigt auf eine spezifische immunreaktive Anti-130P2D6-Bande von etwa 85 kD in 103P2D6-transfizierten Zellen, die aber nicht in Kontrollzellen vorhanden ist. Für die Daten in Tafel B wurden Zellen, die mit 103P2D6 oder Vektor transfiziert wurden, mit 10 μg/ml Anti-103P2D6-pAb gefärbt und nach Inkubation mit FITC-konjugiertem sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper einer Durchflusszytometrie unterzogen. Gezeigt ist eine Fluoreszenzverschiebung in 103P2D6-transfizierten Zellen im Vergleich zu den mit Vektor transfizierten Zellen, was auf eine Expression von 103P2D6-Protein auf der Zelloberfläche hinweist.
13 zeigt die Expression von 103P2D6 nach Untersuchung in einem Panel von Karzinomen des Menschen (T) und ihren jeweils entsprechenden normalen Geweben (N) auf RNA-Dotblots. Eine Expression von 103P2D6 wurde in Karzinomen der Niere, der Brust, der Prostata, der Gebärmutter, des Eierstocks, des Kolons, des Magens und des Rektums beobachtet. 103P2D6 war auch in den beiden menschlichen Karzinomzelllinien, der CML-Linie K562 und Kolorektalkarzinom SW 480, stark exprimiert. Die in normalem benachbartem (aus erkranktem Gewebe isoliertem) Gewebe, aber nicht in normalem, aus gesunden Spendern isoliertem Gewebe festgestellte Expression deutet darauf hin, dass diese Gewebe nicht vollständig normal sind und dass 103P2D6 in Tumorfrühstadien exprimiert und daher als diagnostischer Marker nützlich sein könnte. Bei den Karzinomzelllinien handelte es sich (von links nach rechts) um HeLa (Gebärmutterhalskarzinom); Daudi (Burkitt-Lymphom); K562 (CML); HL-60 (PML); G361 (Melanom); A549 (Lungenkarzinom); MOLT-4 (Lymphoblasten-Leukämie); SW480 (Kolorektalkarzinom); Raji (Burkitt-Lymphom).
14 zeigt Daten, für die RNA aus Prostatatumoren (T) und deren benachbarte Gewebe (N) isoliert wurde, welche von folgenden Prostatakarzinompatienten stammten (Pt); Patient 1, Gleason-Score 4 + 5; Patient 2, Gleason-Score 3 + 4; und Patient 3, Gleason-Score 4 + 3. NP = normale Prostata. Von jeder Probe wurde mit 10 μg Gesamt-RNA eine Northern-Analyse durchgeführt. In allen drei getesteten Tumorproben und deren jeweiligem normalem Gewebe wurde eine Expression von 103P2D6 beobachtet.
15 liefert Daten aus Northern-Experimenten, für die RNA aus von folgenden Nierenkrebspatienten erhaltenen Nierentumoren (T) und deren benachbartem normalem Gewebe (N) isoliert wurde: Patient 1 – Papillärer Typ, Stadium 1, Grad 2/4; Patient 2 – Invasives papilläres Karzinom, Grad 2/4; Patient 3 – Klarzelltyp, Grad 1/3, fokal 2/3; Patient 4 – Klarzelltyp, Stadium III, Grad 2/4; Patient 5 – Klar zelltyp, Stadium III, Grad 3/4; Patient 6 – Klarzelltyp, Stadium III, Grad 3/4; Patient 7 – Klarzelltyp, Grad III. CL = Zelllinien (von links nach rechts): 769-P, A498, SW839; NK = Normale Niere; N = Normales benachbartes Gewebe; T = Tumor. Die Northern-Analyse wurde mit 10 μg Gesamt-DNA jeder Probe durchgeführt. In Nierentumoren und normalem benachbartem Gewebe aus Nierenkrebspatienten wurde im Vergleich zu einer normalen Niere eine erhöhte Expression von 103P2D6 beobachtet.
16 zeigt die Ergebnisse der Northern-Analyse, für die RNA aus von folgenden Blasenkrebspatienten erhaltenen Blasenkarzinomen und benachbartem normalem Gewebe isoliert wurde. Die Northern-Analyse wurde mit 10 μg Gesamt-DNA jeder Probe durchgeführt. Eine Expression von 103P2D6 wurde in Blasentumoren, aber nicht in normalem benachbartem Gewebe beobachtet. N_at = Normales benachbartes Gewebe; T = Tumor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I.) DEFINITIONEN:
Sofern nicht anders definiert, sollen alle hierin verwendeten Begriffe aus dem Stand der Technik, Anmerkungen und sonstige wissenschaftliche Begriffe oder Terminologie diejenigen Bedeutungen haben, die von einem Fachmann, den diese Erfindung betrifft, üblicherweise verstanden werden. In manchen Fällen sind Begriffe mit allgemein verständlicher Bedeutung zur Verdeutlichung und/oder zur schnellen Bezugnahme hierin definiert, wobei das Vorhandensein solcher Definitionen hierin nicht zwingend als wesentlicher Unterschied gegenüber den allgemein im Stand der Technik verstandenen aufzufassen ist. Viele der Techniken und Verfahren, die hierin beschrieben sind oder auf die hierin verwiesen wird, sind einem Fachmann gut verständlich und werden von einem Fachmann gängigerweise mithilfe herkömmli cher Verfahrensweise eingesetzt, beispielsweise die gemeinhin verwendeten molekularen Klonierungsverfahren, wie sie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., beschrieben sind. Je nach Erforderlichkeit werden Verfahren, welche die Verwendung handelsüblicher Kits und Reagenzien beinhalten, generell nach vom Hersteller definierten Protokollen und/oder Parametern ausgeführt, sofern nicht anders angegeben.
Wie hierin verwendet, bedeuten die Begriffe „fortgeschrittenes Prostatakarzinom", „lokal fortgeschrittenes Prostatakarzinom", „fortgeschrittene Krankheit" und „lokal fortgeschrittene Krankheit" Prostatakarzinome, die sich durch die Prostatakapsel hindurch ausgebreitet haben und sollen das Krankheitsstadium C nach dem System der American Urological Association (AUA), das Krankheitsstadium C1–C2 nach dem Whitmore-Jewett-System und das Krankheitsstadium T3–T4 und N+ nach dem System TNM (Tumor, Nodus, Metastasen) umfassen. Bei Patienten mit lokal fortgeschrittener Krankheit wird im Allgemeinen keine Operation angeraten, und diese Patienten haben einen im Wesentlichen weniger günstigen Ausgang im Vergleich zu Patienten mit klinisch lokalisiertem (auf das Organ beschränktem) Prostatakarzinom. Eine lokal fortgeschrittene Krankheit ist klinisch durch tastbare Evidenz einer Härtung jenseits der lateralen Grenze der Prostata oder einer Asymmetrie oder Härtung über der Prostatabasis identifizierbar. Lokal fortgeschrittener Prostatakrebs wird derzeit pathologisch nach Radikalprostatektomie diagnostiziert, wenn der Tumor in die Prostatakapsel eindringt oder diese penetriert, bis in die Resektatränder verläuft oder in die Samenbläschen eindringt.
Eine „Veränderung des nativen Glykosylierungsmusters" soll für die Zwecke hierin das Entfernen mindestens einer Kohlenhydrateinheit bedeuten, die in der nativen Sequenz von 103P2D6 vorhanden ist. (entweder durch Entfernen der zu grunde liegenden Glykosylierungsstelle oder durch Entfernen der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Hinzufügen mindestens einer Glykosylierungsstelle, die in der nativen 103P2D6-Sequenz nicht vorhanden ist. Darüber hinaus umfasst der Begriff qualitative Änderungen der Glykosylierung der nativen Proteine, was eine Änderung der Art und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydrateinheiten beinhaltet.
Der Begriff „Analog" betrifft ein Molekül, das einem anderen Molekül (z.B. einem mit 103P2D6 verwandten Protein) strukturell ähnlich ist oder ähnliche oder korrespondierende Attribute aufweist. Beispielsweise kann ein Analog des Proteins 103P2D6 spezifisch von einem Antikörper oder einer T-Zelle gebunden werden, der bzw. die spezifisch an 103P2D6 bindet.
Der Begriff „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet. Daher kann ein „Antikörper" natürlich vorkommen oder künstlich sein, beispielsweise monoklonale Antikörper, die durch herkömmliche Hybridomtechnologie hergestellt werden. Anti-103P2D6-Antikörper umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente, welche die Antigenbindungsdomäne und/oder mindestens eine Komplementarität bestimmende Region dieser Antikörper enthalten.
Wie hierin verwendet, ist ein „Antikörperfragment" definiert als mindestens ein Anteil der variablen Region des Immunglobulinmoleküls, der an sein Ziel bindet, d. h. die Antigenbindungsregion. In einer Ausführungsform sind dadurch einzelne Anti-103P2D6-Antikörper und deren Klone (einschließlich Agonist, Antagonist und neutralisierende Antikörper) und Anti-103P2D6-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitoper Spezifität abgedeckt.
Der Begriff „codonoptimierte Sequenz" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die für eine bestimmte Art von Wirt optimiert worden sind, indem alle Codons mit einer Gebrauchshäufigkeit von weniger als etwa 20% ausgetauscht worden sind. Nukleotidsequenzen, die außer durch Codonoptimierung durch Eliminierung störender Polyadenylierungssequenzen, Eliminierung von Exon/Intron-Splicing-Signalen, Eliminierung von transposonartigen Wiederholungen (Repeats) und/oder Optimierung des GC-Gehalts für die Expression in einer bestimmten Wirtart optimiert worden sind, werden hierin als „expressionsverstärkte Sequenzen" bezeichnet.
Der Begriff „zytotoxisches Agens", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Vernichtung von Zellen verursacht. Der Begriff soll radioaktive Isotope, Chemotherapeutika und Toxine wie kleinmolekulare Toxine oder enzymatisch aktive Toxine bakterieller, fungaler, pflanzlicher oder tierischer Herkunft umfassen, einschließlich Fragmente und/oder Varianten davon. Beispiele zytotoxischer Substanzen umfassen unter anderem Maytansinoide, Ytrium, Wismut-Rizin, Rizin-A-Kette, Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchizin, Dihydroxyanthracindion, Actinomycin, Diphtherietoxin, Pseudomonas-Exotoxin (PE) A, PE40, Abrin, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin, Curicin, Crotin, Calicheamicin, Saponaria officinalis-Inhibitor und Glukokortikoide und andere Chemotherapeutika sowie Radioisotope wie beispielsweise At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² und radioaktive Isotope von Lu. Antikörper können auch mit einem Propharmakon-aktivierenden Anti-Krebs-Enzym konjugiert sein, welches das Propharmakon in seine aktive Form umwandeln kann.
Der Begriff „Homolog" bezieht sich auf ein Molekül, das Homologie zu einem anderen Molekül aufweist, indem es beispielsweise Sequenzen chemischer Reste aufweist, die an entsprechenden Positionen gleich oder ähnlich sind.
Wie hierin verwendet, sollen sich die Begriffe "hybridisieren", „hybridisierend", „hybridisiert" und dergleichen bei Gebrauch im Zusammenhang mit Polynukleotiden auf herkömmliche Hybridisierungsbedingungen beziehen, vorzugsweise beispielsweise eine Hybridisierung in 50% Formamid/6 × SSC/0,1% SDS/100 μg/ml ssDNA, bei denen die Hybridisierungstemperaturen über 47 Grad Celsius liegen und die Temperaturen zum Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS über 55 Grad Celsius liegen.
Wie hierin verwendet, gilt ein Polynukleotid als "isoliert", wenn es im Wesentlichen von kontaminierenden Polynukleotiden getrennt wurde, welche Genen entsprechen bzw. zu Genen komplementär sind, bei denen es sich nicht um das 103P2D6-Gen handelt, oder die Polypeptide kodieren, bei denen es sich nicht um das Genprodukt von 103P2D6 oder dessen Fragmente handelt. Ein Fachmann kann leicht Nukleinsäureisolierungsverfahren anwenden, um ein isoliertes 103P2D6-Polynukleotid zu erhalten.
Wie hierin verwendet, gilt ein Protein als isoliert, wenn physikalische, mechanische oder chemische Verfahren angewandt werden, um das 103P2D6-Protein von zellulären Bestandteilen, die normalerweise mit dem Protein assoziiert sind, zu entfernen. Ein Fachmann kann leicht Standardreinigungsverfahren anwenden, um ein isoliertes 103P2D6-Protein zu erhalten. Alternativ kann ein isoliertes Protein chemisch hergestellt werden.
Der Begriff „Säuger", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jeden als Säuger klassifizierten Organismus, einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hunde, Katzen, Kühe, Pferde und Menschen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger eine Maus. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger ein Mensch.
Wie hierin verwendet, bedeuten die Begriffe „metastasierter Prostatakrebs" und „metastasierte Krankheit" Prostatakarzinome, die in regionale Lymphknoten oder entfernte Stellen gestreut haben, und sollen das Krankheitsstadium D nach dem AUA-System und das Krankheitsstadium TxNxM+ nach dem TNM-System umfassen. Wie es der Fall bei lokal fortgeschrittenem Prostatakarzinom ist, ist bei Patienten mit metastasierter Krankheit in der Regel eine Operation nicht angezeigt, und eine bevorzugte Behandlungsmodalität ist eine hormonelle (Androgenablations-)Therapie. Patienten mit metastasiertem Prostatakarzinom entwickeln innerhalb von 12 bis 18 Monaten nach Beginn der Behandlung schließlich einen androgenrefraktären Zustand. Rund die Hälfte dieser androgenrefraktären Patienten verstirbt innerhalb von 6 Monaten, nachdem sich dieser Status entwickelt hat. Der häufigste Ort für Prostatakrebsmetastasen sind die Knochen. Prostatakrebs-Knochenmetastasen sind häufig eher osteoblastisch als osteolytisch (d. h. das Nettoergebnis ist eine Knochenbildung). Knochenmetastasen werden am häufigsten in der Wirbelsäule gefunden, gefolgt vom Oberschenkelknochen, Becken, Rippenkäfig, Schädel und Oberarmknochen. Sonstige häufige Metastasierungsorte sind Lymphknoten, Lunge, Leber und Gehirn. Ein metastasiertes Prostatakarzinom wird typischerweise durch offene oder laparoskopische Beckenlymphadenektomie, Ganzkörper-Radionuklid-Scans, Skelettradiographie und/oder Biopsie von Knochenläsionen diagnostiziert.
Der Betriff „monoklonaler Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d. h. die Antikörper, welche die Population umfasst, sind identisch, ausgenommen möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in kleinen Mengen vorhanden sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Motiv", wie beispielsweise „biologisches Motiv in einem mit 103P2D6 verwandten Protein" auf jeden Satz von Aminosäuren, die einen Teil der Primärsequenz eines Proteins bilden und die entweder kontig sind oder zu bestimmten, im Allgemeinen invari anten Positionen ausgerichtet werden können, der mit einer bestimmten Funktion (z.B. Protein-Protein-Interaktion, Protein-DNA-Interaktion, etc.) oder Modifikation (z.B. phosphoryliert, glykosyliert oder amidiert ist) oder Lokalisierung (z.B. sekretorische Sequenz, Kernlokalisierungssequenz, etc.) assoziiert ist, oder auf eine Sequenz, die aufgrund einer humoralen oder zellulären Immunogenität korreliert ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Polynukleotid" eine polymere Form von Nukleotiden mit einer Länge von mindestens 10 Basen oder Basenpaaren, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide, oder eine modifizierte Form einer dieser Arten von Nukleotiden, und soll einzel- und doppelsträngige Formen von DNA und/oder RNA umfassen. Im Stand der Technik wird dieser Begriff häufig im Wechsel mit „Oligonukleotid" verwendet. Ein Polynukleotid kann eine hierin beschriebene Nukleotidsequenz aufweisen, wobei Thymidin (T) (wie beispielsweise in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt) auch Uracil (U) sein kann; diese Definition bezieht sich auf Unterschiede zwischen der chemischen Struktur von DNA und RNA, insbesondere auf die Beobachtung, dass eine der vier Hauptbasen in RNA Uracil (U) anstelle von Thymidin (T) ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Polypeptid" ein Polymer aus mindestens etwa 4, 5, 6, 7 oder 8 Aminosäuren. In dieser Beschreibung werden durchgängig Drei-Buchstaben oder Ein-Buchstaben-Standardbezeichnungen für Aminosäuren verwendet. Im Stand der Technik wird dieser Begriff häufig im Wechsel mit „Peptid" oder „Protein" verwendet.
Wie hierin verwendet, ist ein „rekombinantes" DNA- oder RNA-Molekül ein DNA- oder RNA-Molekül, das in vitro einer molekularen Manipulation unterzogen worden ist.
Die „Stringent" einer Hybridisierungsreaktion kann von einem durchschnittlichen Fachmann leicht bestimmt werden und ist generell eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Längere Sonden erfordern im Allgemeinen höhere Temperaturen, damit ein korrektes Annealing (Anlagern) stattfindet, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Eine Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter Nukleinsäuresequenzen ab, ein Reannealing (eine Wiederanlagerung) einzugehen, wenn in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur komplementäre Stränge vorhanden sind. Je höher der Grad der gewünschten Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die verwendbare relative Temperatur. Daraus folgt, dass höhere relative Temperaturen im Gegensatz zu niedrigeren Temperaturen die Reaktionsbedingungen tendenziell stringenter machen. Für weitere Einzelheiten und eine Erläuterung der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
„Stringente Bedingungen" oder „Bedingungen hoher Stringenz", wie hierin definiert, sind unter anderem wie folgt identifiziert: (1) Verwendung niedriger Innenstärke und hoher Temperatur zum Waschen, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) Verwendung eines Denaturierungsmittels während der Hybridisierung, beispielsweise Formamid, beispielsweise 50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelter Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, während Waschschritte bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C durchgeführt wer den, gefolgt von einem Waschschritt mit hoher Stringenz, bestehend aus 0,1 × SSC mit EDTA bei 55°C. „Mäßig stringente Bedingungen" werden unter anderem in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, beschrieben und umfassen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Innenstärke und % SDS), die weniger stringent sind als die oben beschriebenen. Ein Beispiel mäßig stringenter Bedingungen ist eine Übernachtinkubation bei 37°C in einer Lösung umfassend: 20 Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Der Fachmann weiß, wie Temperatur, Innenstärke etc. erforderlicherweise einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen Rechnung zu tragen.
Ein „transgenes Tier" (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, welche ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder in einen Vorfahr des Tiers in einem pränatalen, z.B. embryonalen Stadium, eingeführt worden ist. Ein „Transgen" ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt, integriert ist.
Der Begriff „Variante" betrifft ein Molekül, das eine Variation von einem beschriebenen Typ oder einer beschriebenen Norm aufweist, beispielsweise ein Protein, das mindestens einen unterschiedlichen Aminosäurerest an der entsprechenden Position bzw. den entsprechenden Positionen eines spezifisch beschriebenen Proteins (z.B. das in 2 und 3 gezeigte Protein 103P2D6) aufweist. Ein Analog ist ein Beispiel eines varianten Proteins.
Wie hierin verwendet, umfassen das mit 103P2D6 verwandte Gen und das mit 103P2D6 verwandte Protein die 103P2D6-Gene und -Proteine, die hierin spezifisch beschrie ben sind, sowie strukturell und/oder funktionell ähnliche Varianten oder Analoge der vorangehenden. 103P2D6-Peptidanaloge teilen im Allgemeinen eine Aminosäurehomologie von mindestens etwa 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr (nach BLAST-Kriterien). 103P2D6-Nukleotidanaloga teilen vorzugsweise eine Nukleinsäurehomologie von 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr (nach BLAST-Kriterien). In manchen Ausführungsformen ist jedoch eine niedrigere Homologie bevorzugt, um in Anbetracht speziesspezifischer Kodonpräferenzen für optimierte Proteinexpression und -produktion und/oder im Hinblick auf ihre Immunogenität modulierter Peptidepitope bevorzugte Reste auszuwählen, die für eine bestimmte Zielpopulation, z.B. den HLA-Typ, maßgeschneidert sind, wie ein Fachmann zu schätzen weiß.
Die erfindungsgemäßen, mit 103P2D6 verwandten Proteine umfassen solche, die hierin spezifisch identifiziert sind, sowie Allelvarianten, konservative Substitutionsvarianten, Analoge und Homologe, die ohne übermäßige Experimentierung nach den hierin ausgeführten Verfahren isoliert/erzeugt und charakterisiert werden können oder leicht aus dem Stand der Technik verfügbar sind. Dazu gehören auch Fusionsproteine, die Teile verschiedener 103P2D6-Proteine oder Fragmente davon kombinieren, sowie Fusionsproteine eines 103P2D6-Proteins und eines heterologen Polypeptids. Solche 103P2D6-Proteine werden kollektiv als die mit 103P2D6 verwandten Proteine, die erfindungsgemäßen Proteine oder als 103P2D6 bezeichnet. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „mit 103P2D6 verwandtes Protein" auf ein Polypeptidfragment oder eine 103P2D6-Proteinsequenz aus 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 oder mehr als 25 Aminosäuren.
II.) Eigenschaften von 103P2D6
Wie hierin beschrieben, weist 103P2D6 spezifische Eigenschaften auf, die analog zu den in einer Molekülfamilie Gefundenen sind, deren Polynukleotide, Polypeptide, reaktive zytotoxische T-Zellen (ZTL), reaktive T-Helferzellen (HTL) und Anti-Polypeptidantikörper in gut bekannten diagnostischen Tests verwendet werden, um Zustände in Verbindung mit fehlreguliertem Zellwachstum wie beispielsweise Krebs, insbesondere Prostatakrebs, zu untersuchen (siehe z.B. sowohl sein hoch spezifisches Gewebeexpressionsmuster sowie seine Überexpression in Prostatakarzinomen, wie beispielsweise in Beispiel 3 beschrieben). Das am besten bekannte Mitglied dieser Klasse ist PSA, der archetypische Marker, der seit Jahren von Ärzten verwendet wird, um das Vorhandensein von Prostatakrebs zu identifizieren und zu überwachen (siehe z.B. Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162(2): 293-306 (1999) und Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640(1999)). In diesem Kontext werden noch verschiedene andere diagnostische Marker verwendet, einschließlich p53 und K-ras (siehe z.B. Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul; 4(1): 99-102 und Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000; 24(1): 1-12). Diese Beschreibung der 103P2D6-Polynukleotide und -Polypeptide (sowie der 103P2D6-Polynukleotidsonden und der Anti-103P2D6-Antikörper, die zur Identifizierung des Vorhandenseins dieser Moleküle verwendet werden) und deren Eigenschaften ermöglicht es daher dem Fachmann, diese Moleküle in Verfahren zu nutzen, die analog zu den beispielsweise in verschiedenen diagnostischen Tests Verwendeten sind, welche auf die Untersuchung von mit Krebs in Zusammenhang stehenden Bedingungen ausgerichtet sind.
Typische Ausführungsformen diagnostischer Verfahren, welche die 103P2D6-Polynukleotide, -Polypeptide, -reaktiven T-Zellen und Antikörper nutzen, sind analog zu solchen Ver fahren von gut etablierten diagnostischen Tests, die beispielsweise PSA-Polynukleotide, -Polypeptide, -reaktive T-Zellen und Antikörper verwenden. So wie beispielsweise PSA-Polynukleotide als Sonden (beispielsweise bei der Northern-Analyse, siehe z.B. Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3): 567-74(1994)) und Primer (beispielsweise bei der PCR-Analyse, siehe z.B. Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) zur Beobachtung des Vorhandenseins und/oder der Menge an PSA-mRNAs in Verfahren zur Überwachung der PSA-Überexpression oder der Metastasierung von Prostatakarzinomen verwendet werden, können die hierin beschriebenen 103P2D6-Polynukleotide auf dieselbe Weise eingesetzt werden, um eine 103P2D6-Überexpression oder die Metastasierung von Prostata- und anderen Karzinomen, die dieses Gen exprimieren, festzustellen. So wie PSA-Polynukleotide verwendet werden, um PSA-spezifische Antikörper herzustellen, die dann in Verfahren zur Überwachung der Überexpression des PSA-Proteins (siehe z.B. Stephan et al., Urology 55(4): 560-3 (2000)) oder der Metastasierung von Prostatazellen (siehe z.B. Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-7 (1996)) zum Beobachten des Vorhandenseins und/oder der Menge an PSA-Proteinen verwendet werden, können die hierin beschriebenen 103P2D6-Polypeptide alternativ verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung bei der Feststellung einer Überexpression von 103P2D6 oder der Metastasierung von Prostatazellen und Zellen anderer Karzinomen, die dieses Gen exprimieren, herzustellen.
Weil Metastasierung die Bewegung von Krebszellen von einem Ursprungsorgan (wie beispielsweise der Lunge oder Prostatadrüse, etc.) zu einem anderen Körperbereich (wie beispielsweise einem Lymphknoten) beinhaltet, können insbesondere Tests, welche eine biologische Probe auf das Vorhandensein von Zellen, die 103P2D6-Polynukleotide und/oder -Polypeptide exprimieren, untersuchen, verwendet werden, um einen Hinweis auf eine Metastasierung zu liefern. Wenn bei spielsweise festgestellt wird, dass eine biologische Probe von Gewebe, das 103P2D6-exprimierende Zellen normalerweise nicht enthält (Lymphknoten), 103P2D6-exprimierende Zellen enthält, wie beispielsweise die Expression von 103P2D6 in LAPC4- und LAPC9-Xenografts aus Lymphknoten bzw. Knochenmetastasen, deutet dieser Befund auf Metastasierung hin.
Alternativ können 103P2D6-Polynukleotide und/oder -Polypeptide verwendet werden, um eine Evidenz für eine Krebserkrankung zu liefern, beispielsweise wenn festgestellt wird, dass Zellen in einer biologischen Probe, die 103P2D6 normalerweise nicht oder in einer anderen Menge exprimieren, 103P2D6 exprimieren oder 103P2D6 verstärkt exprimieren (siehe z.B. die 103P2D6-Expression in Nieren-, Lungen- und Kolonkarzinomzellen und in Patientenproben, etc., die in 4–10 gezeigt ist). Möglicherweise möchte ein Fachmann bei solchen Tests ergänzende Hinweise auf eine Metastasierung erhalten, indem die biologische Probe auf das Vorhandensein eines zweiten geweberestringierten Markers (außer 103P2D6) getestet wird, wie beispielsweise PSA, PSCA etc. (siehe z.B. Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192 (3): 233-237 (1996)).
So wie PSA-Polynukleotidfragmente und -Polynukleotidvarianten vom Fachmann in Verfahren zur Überwachung von PSA eingesetzt werden, werden 103P2D6-Polynukleotidfragmente und -Polynukleotidvarianten auf analoge Weise verwendet. Insbesondere sind typische PSA-Polynukleotide, die in Verfahren zum Überwachen von PSA verwendet werden, Sonden oder Primer, die aus Fragmenten der PSA-cDNA-Sequenz bestehen. Als Veranschaulichung müssen die zur PCR-Amplifizierung eines PSA-Polynukleotids verwendeten Primer weniger als die ganze PSA-Sequenz aufweisen, um in der Polymerasekettenreaktion zu funktionieren. Im Kontext solcher PCR-Reaktionen stellt der Fachmann im Allgemeinen verschiedene Polynukleotidfragmente her, die als Primer verwendet werden können, um verschiedene Anteile eines relevanten Polynukleotids zu amplifizieren oder um Amplifizierungsreaktionen zu optimieren (siehe z.B. Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98: 121-154 (1998)). Eine weitere Veranschaulichung der Verwendung solcher Fragmente liefert Beispiel 3, wo ein 103P2D6-Polynukleotidfragment als Sonde verwendet wird, um die Expression von 103P2D6-RNAs in Krebszellen aufzuzeigen. Darüber hinaus werden Polynukleotidsequenzen typischerweise als Primer und Sonden für die entsprechenden mRNAs in PCR- und Northern-Analysen verwendet (siehe z.B. Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. 1996, Nov-Dez; 11(6): 407-13 und Current Protocols In Molecular Biology, Band 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel et al. Hrsg., 1995)). Polynukleotidfragmente und -varianten sind in diesem Kontext geeignet, wenn sie unter Bedingungen hoher Stringenz an eine Polynukleotidzielsequenz (z.B. das in SEQ ID Nr.: 1 gezeigte 103P2D6-Polynukleotid) binden können
Darüber hinaus werden PSA-Polypeptide, die ein Epitop enthalten, das von einem Antikörper oder einer T-Zelle erkannt werden kann, der bzw. die spezifisch an dieses Epitop bindet, in Verfahren zur Überwachung von PSA verwendet. Auf analoge Weise können auch Analoge und Varianten von 103P2D6-Polypeptidfragmenten und -Polypeptiden verwendet werden. Die Praxis der Verwendung von Polypeptidfragmenten oder Polypeptidvarianten zur Erzeugung von Antikörpern (wie beispielsweise Anti-PSA-Antikörper oder T-Zellen) ist im Stand der Technik typisch, wobei ein breites Spektrum an Systemen, beispielsweise Fusionsproteine, vom Praktiker verwendet wird (siehe z.B. Current Protocols In Molecular Biology, Band 2, Unit 16, Frederick M. Ausubel et al. Hrsg., 1995). In diesem Kontext dient jedes Epitop zur Bereitstellung der Architektur, mit der ein Antikörper oder eine T-Zelle reagiert. Typischerweise stellt der Fachmann unterschiedliche Polypeptidfragmente her, die verwendet werden können, um Immunreaktionen zu erzeugen, welche für verschiedene Anteile eines relevanten Polypeptids spezifisch sind (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.840.501 und US-Patent Nr. 5.939.533 ). Beispielsweise kann es bevorzugt sein, ein Polypeptid zu verwenden, das eines der hierin erörterten oder aus dem Stand der Technik verfügbaren biologischen Motive von 103P2D6 aufweist. Typischerweise sind in diesem Kontext Polypeptidfragmente, -varianten oder -analoge geeignet, so lange sie ein Epitop aufweisen, das einen Antikörper oder eine T-Zelle hervorbringen kann, die für eine Polypeptidzielsequenz (z.B. das in SEQ ID Nr.: 2 gezeigte 103P2D6-Polypeptid) spezifisch sind.
Wie hierin gezeigt, weisen die 103P2D6-Polynukleotide und -Polypeptide (sowie die 103P2D6-Polynukleotidsonden und Anti-103P2D6-Antikörper oder T-Zellen, die zur Identifizierung des Vorhandenseins dieser Moleküle verwendet werden) spezifische Eigenschaften auf, aufgrund derer sie bei der Diagnostizierung von Krebserkrankungen der Prostata geeignet sind. Diagnostische Tests, welche das Vorhandensein von 103P2D6-Genprodukten messen, um das Vorhandensein oder das Einsetzen eines hierin beschriebenen Krankheitszustandes wie beispielsweise Prostatakrebs zu beurteilen, werden verwendet, um Patienten für Präventivmaßnahmen oder weitere Überwachung zu identifizieren, so wie es erfolgreich mit PSA geschah. Darüber hinaus erfüllen diese Materialien einen Bedarf im Stand der Technik nach Molekülen mit ähnlichen oder komplementären Eigenschaften zu PSA in Situationen, in denen beispielsweise eine definitive Diagnose der von der Prostata ausgehenden Metastasierung nicht auf Basis eines PSA-Tests alleine erfolgen kann (siehe z.B. Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), und demnach müssen Materialien wie beispielsweise 103P2D6-Polynukleotide und -Polypeptide (sowie die 103P2D6-Polynukleotidsonden und Anti-103P2D6-Antikörper, die zur Identifizierung des Vorhandenseins dieser Moleküle verwendet werden) eingesetzt werden, um Metastasen aus der Prostata zu bestätigen.
Die hierin beschriebenen 103P2D6-Polynukleotide sind nicht nur für diagnostische Tests geeignet, sondern finden schließlich darüber hinaus einer Reihe weiterer spezifischer Anwendungen, beispielsweise bei der Identifizierung von onkogenetischen assoziierten chromosomalen Anomalien in 2q34, der chromosomalen Region, in welcher das 103P2D6 kartiert wurde (siehe Beispiel 7 unten). Außer ihrer Anwendung in diagnostischen Tests haben die hierin beschriebenen, mit 103P2D6 verwandten Proteine und Polynukleotide noch weitere Anwendungen, wie beispielsweise bei der forensischen Analyse von Geweben unbekannter Herkunft (siehe z.B. Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28; 80(1-2): 63-9).
Darüber hinaus können erfindungsgemäße, mit 103P2D6 verwandte Proteine und Polynukleotide verwendet werden, um einen pathologischen Zustand zu behandeln, der durch die Überexpression von 103P2D6 gekennzeichnet ist. Beispielsweise können die Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz von 2 oder Fragmente davon verwendet werden, um eine Immunreaktion gegenüber dem 103P2D6-Antigen zu erzeugen. Antikörper oder andere Moleküle, die mit 103P2D6 reagieren, können zur Modulierung der Funktion dieses Moleküls verwendet werden und bieten daher therapeutischen Nutzen.
III.) 103P2D6-POLYNUKLEOTIDE
Ein Aspekt der Erfindung stellt Polynukleotide bereit, die dem ganzen oder einem Teil eines 103P2D6-Gens, einer 103P2D6-mRNA und/oder einer 103P2D6-Kodierungssequenz entsprechen oder dazu komplementär sind, vorzugsweise in isolierter Form, einschließlich Polynukleotide, die ein mit 103P2D6 verwandtes Protein und Fragmente davon kodieren, DNA, RNA, DNA/RNA-Hybride und verwandte Moleküle, Polynukleotide oder Oligonukleotide, die zu einem 103P2D6-Gen oder einer mRNA-Sequenz oder einem Teil davon komplementär sind, und Polynukleotide oder Oligonukleotide, die mit ei nem 103P2D6-Gen, mit 103P2D6-mRNA oder einem 103P2D6-kodierenden Polynukleotid (kollektiv „103P2D6-Polynukleotide") hybridisieren. In allen Fällen kann bei Bezugnahme auf diesen Abschnitt in 2 T auch U sein.
Ausführungsformen eines 103P2D6-Polynukleotids umfassen: ein 103P2D6-Polynukleotid mit der in 2 gezeigten Sequenz, die Nukleotidsequenz von 103P2D6, wie in 2 gezeigt, wobei T U ist; mindestens 10 kontige Nukleotide eines Polynukleotids mit der Sequenz, wie in 2 gezeigt; oder mindestens 10 kontige Nukleotide eines Polynukleotids mit der Sequenz, wie in 2 gezeigt, wobei T U ist. Darüber hinaus umfassen 103P2D6-Polynukleotide, wobei T U sein kann:

(a) mindestens 10 kontige Nukleotide eines Polynukleotids mit der Sequenz, wie in 2 gezeigt, von Nukleotidrest, Nummer 1 bis einschließlich Nukleotidrest, Nummer 804; oder
(b) mindestens 10 kontige Nukleotide eines Polynukleotids mit der Sequenz, wie in 2 gezeigt, von Nukleotidrest, Nummer 977 bis einschließlich Nukleotidrest, Nummer 1036; oder
(c) mindestens 10 kontige Nukleotide eines Polynukleotids mit der Sequenz, wie in 2 gezeigt, von Nukleotidrest, Nummer 1414 bis einschließlich Nukleotidrest, Nummer 1815; oder
(d) ein Polynukleotid, dessen Startbase im Bereich von 1–804 von 2 ist und deren Endbase im Bereich von 805–2493 von 2 ist; oder
(e) ein Polynukleotid, dessen Startbase im Bereich von 977–1036 von 2 ist und deren Endbase im Bereich von 1037–2493 von 2 ist; oder
(f) ein Polynukleotid, dessen Startbase im Bereich von 141–1815 von 2 ist und deren Endbase im Bereich von 1816–2493 von 2 ist; oder
(g) ein Polynukleotid, dessen Startbase im Bereich von 805–976 von 2 ist und deren Endbase im Bereich von 977–2493 von 2 ist; oder
(h) ein Polynukleotid, dessen Startbase im Bereich von 805–2493 von 2 ist und deren Endbase im Bereich von 2494–4727 von 2 ist; oder
(i) ein Polynukleotid von (d–g), das eine Länge von mindestens 10 Nukleotidbasen aufweist; oder
(j) ein Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen selektiv mit einem Polynukleotid von (a)–(g) hybridisiert;

Es sind ein Nukleotid sowie jedes von ihm kodierte Peptid beschrieben, das an einer der folgenden Positionen oder in einem der folgenden Bereiche beginnt und an einer höheren Position oder in einem höheren Bereich endet: 1, 804, ein Bereich von 1–804, 805, ein Bereich von 805–976; ein Bereich von 805–2493; ein Bereich von 977–1036; ein Bereich von 1037–1413; ein Bereich von 1414–1815; ein Bereich von 1816–2493; ein Bereich von 2494–4727, wobei ein Bereich, wie in diesem Abschnitt verwendet, so zu verstehen ist, dass er spezifisch alle Positionen ganzer Einheiten davon beschreibt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Polynukleotid, das ein mit 103P2D6 verwandtes Protein kodiert, dessen Sequenz von der in den Plasmiden enthaltenen cDNA kodiert wird, die bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer PTA-1155 oder PTA-1895 hinterlegt sind. Eine weitere Ausführungsform umfasst ein Polynukleotid, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der humanen 103P2D6-cDNA, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, oder mit einem Polynukleotidfragment davon hybridisiert.
Typische Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung umfassen 103P2D6-Polynukleotide, die spezifische Anteile der 103P2D6-mRNA-Sequenz kodieren (und solche, die zu solchen Sequenzen komplementär sind), wie beispielsweise solche, welche das Protein und Fragmente davon kodieren, beispielsweise mit 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr kontige Aminosäuren.
Beispielsweise umfassen hierin beschriebene, repräsentative Ausführungsformen: Polynukleotide und die von ihnen kodierten Peptide selbst, die etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 10 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 10 bis etwa Aminosäure 20 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 20 bis etwa Aminosäure 30 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 30 bis etwa Aminosäure 40 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 40 bis etwa Aminosäure 50 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 50 bis etwa Aminosäure 60 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 60 bis etwa Aminosäure 70 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 70 bis etwa Aminosäure 80 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 90 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, und Polynukleotide, die etwa Aminosäure 90 bis etwa Aminosäure 100 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins kodieren, in Stufen von etwa 10 Aminosäuren, endend bei Aminosäure 532. Entsprechend sind Polynukleotide, die Anteile der Aminosäurese quenz (mit etwa 10 Aminosäuren) von Aminosäure 100–532 des 103P2D6-Proteins kodieren, Ausführungsformen. Dabei versteht sich, dass jede bestimmte Aminosäureposition die jeweilige Position zuzüglich bzw. abzüglich fünf Aminosäurereste beschreibt.
Polynukleotide, die relativ lange Anteile des 103P2D6-Proteins kodieren, sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten. Weitere hierin beschriebene, veranschaulichende Ausführungsformen umfassen 103P2D6-Polynukleotidfragmente, die mindestens eines der in der 103P2D6-Proteinsequenz enthaltenen biologischen Motive kodieren, einschließlich mindestens eine der Motiv tragenden Untersequenzen des 103P2D6-Proteins, ausgeführt in Tabelle XIX. In einer anderen Ausführungsform kodieren typische Polynukleotidfragmente der Erfindung mindestens eine Region von 103P2D6, die Homologie zu einem bekannten Molekül aufweist. In einer anderen Ausführungsform können typische Polynukleotidfragmente mindestens eine der N-Glykosylierungsstellen, Stellen zur Phosphorylierung durch eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase, Caseinkinase-Il-Phosphorylierungsstellen oder N-Myristoylierungsstellen und Amidierungsstellen von 103P2D6 kodieren.
III.A.) Verwendung von 103P2D6-Polynukleotiden
III.A.1.) Überwachung genetischer Anomalien
Die Polynukleotide der vorhergehenden Absätze finden eine Reihe unterschiedlicher spezifischer Verwendungen. Das humane 103P2D6-Gen wurde auf Chromosom 4p12–p14 kartiert, wie mithilfe des Radiation-Hybrid-Panels GeneBridge4 bestimmt wurde (siehe Beispiel 7). Da das 103P2D6-Gen auf Chromosom 4p12–p14 liegt, werden Polynukleotide, die verschiedene Regionen des 103P2D6-Proteins kodieren, beispielsweise verwendet, um zytogenetische Anomalien auf Chromosom 4, Bande p12–p14, zu charakterisieren, die als in Verbindung mit verschiedenen Krebserkrankung stehend identifiziert wurden. Insbesondere wurden verschiedene chromosomale Anomalien in 4p12–p14, einschließlich Translokationen und Deletionen, bei einer Reihe unterschiedlicher Karzinome als häufige zytogenetische Anomalien identifiziert (siehe z.B. Zimonjic, D.B. et al., 1999, Hepatology 29(4): 1208-14; Wu, X. et al., 1995, Cancer Res. 55(3): 557-61; Arribas, R. et al., 1999, Lab. Invest. 79(2): 111-22). Polynukleotide, die spezifische Regionen des 103P2D6-Proteins kodieren, liefern daher neue Hilfsmittel, die verwendet werden können, um mögliche zytogenetische Anomalien in dieser Region von Chromosom 2, die zu dem malignen Phänotyp beitragen könnten, mit größerer Präzision, als zuvor möglich war, zu beschreiben. In diesem Kontext erfüllen diese Polynukleotide einen Bedarf im Stand der Technik zur Steigerung der Empfindlichkeit der chromosomalen Untersuchung, um subtilere und weniger häufige chromosomale Anomalien zu identifizieren (siehe z.B. Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)).
Da sich herausgestellt hat, dass 103P2D6 beim Prostatakarzinom und anderen Karzinomen stark exprimiert ist, werden 103P2D6-Polynukleotide darüber hinaus in Verfahren eingesetzt, in denen der Status von 103P2D6-Genprodukten in normalem im Vergleich zu karzinogenem Gewebe bestimmt wird. Typischerweise werden Polynukleotide, die spezifische Regionen des 103P2D6-Proteins kodieren, verwendet, um das Vorhandensein von Perturbationen (wie beispielsweise Deletionen, Insertionen, Punktmutationen oder Veränderungen, die zu einem Verlust eines Antigens führen, etc.) in spezifischen Regionen des 103P2D6-Gens, wie beispielsweise Regionen, die mindestens ein Motiv enthalten, zu bestimmen. Beispielhafte Tests umfassen RT-PCR-Tests sowie die Analyse von Einzelstrangkonformationspolymorphismen (SSCP) (siehe z.B. Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)), die beide Polynukleotide verwenden, die spezifi sche Regionen eines Proteins kodieren, um diese Regionen in dem Protein zu untersuchen.
III.A.2.) Antisense-Ausführungsformen
Andere, spezifisch in Betracht gezogene, hierin beschriebene Nukleinsäureeinheiten sind genomische DNA, cDNAs, Ribozyme und Antisense-Moleküle, sowie Nukleinsäuremoleküle, die auf einem Alternativgerüst basieren oder alternative Basen aufweisen, ob natürlicher Herkunft oder synthetisiert, und umfassen Moleküle, die die RNA- oder Protein-Expression von 103P2D6 hemmen können. Beispielsweise können Antisense-Moleküle RNAs oder andere Moleküle sein, einschließlich Peptidnukleinsäuren (PNAs) oder Nichtnukleinsäuremoleküle, wie beispielsweise Phosphorthioratderivate, die DNA oder RNA in Basenpaar-abhängiger Weise spezifisch binden. Ein Fachmann kann diese Klassen von Nukleinsäuremolekülen durch Verwendung der hierin beschriebenen 103P2D6-Polynukleotid- und -Polynukleotidsequenzen leicht erhalten.
Die Antisense-Technologie umfasst die Verabreichung exogener Oligonukleotide, die an ein sich in den Zellen befindendes Zielpolynukleotid binden. Der Begriff „Antisense" bezieht sich auf die Tatsache, dass solche Oligonukleotide zu ihren intrazellulären Zielen komplementär sind, z.B. zu 103P2D6. Siehe beispielsweise Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; und Synthesis 1: 1-5 (1988). Die 103P2D6-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Derivate wie beispielsweise S-Oligonukleotide (Phosphorthioatderivate oder S-Oligos, siehe Jack Cohen, oben), die verstärkte Hemmwirkung auf das Wachstum von Krebszellen ausüben. S-Oligos (Nukleosidphosphorthioate) sind isoelektronische Analoge eines Oligonukleotids (O-Oligo), bei denen ein nicht Brücken bildendes Sauerstoffatom der Phosphat gruppe durch ein Schwefelatom ersetzt ist. Die S-Oligos der vorliegenden Erfindung können durch Behandlung der entsprechenden O-Oligos mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid, einem Schwefelübertragungsreagens, hergestellt werden. Siehe Iyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); und Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990). Weitere 103P2D6-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen aus dem Stand der Technik bekannte Morpholino-Antisense-Oligonukleotide (siehe z.B. Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
Die 103P2D6-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können typischerweise RNA oder DNA sein, die zu den ersten 100 5'-Codons oder den letzten 100 3'-Codons der genomischen Sequenz von 103P2D6 oder der entsprechenden mRNA komplementär sind oder damit stabil hybridisieren. Absolute Komplementarität ist keine Voraussetzung, obgleich ein hoher Komplementaritätsgrad bevorzugt ist. Die Verwendung eines Oligonukleotids, das zu dieser Region komplementär ist, ermöglicht die selektive Hybridisierung mit 103P2D6-mRNA und nicht an mRNA, die andere regulatorische Untereinheiten der Proteinkinase spezifiziert. In einer Ausführungsform sind die 103P2D6-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung 15- bis 30-mer-Fragmente des DNA-Antisense-Moleküls, die eine Sequenz aufweisen, die mit 103P2D6-mRNA hybridisiert. Gegebenenfalls ist das 103P2D6-Antisense-Oligonukleotid ein 30-mer-Oligonukleotid, das zu einer Region in den ersten 10 5'-Codons oder den letzten 10 3'-Codons von 103P2D6 komplementär ist. Alternativ sind die Antisense-Moleküle modifiziert, um Ribozyme bei der Hemmung der Expression von 103P2D6 anzuwenden, siehe z.B. L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).
III.A.3.) Primer und Primerpaare
Weitere spezifische Ausführungsformen dieser erfindungsgemäßen Nukleotide umfassen Primer und Primerpaare, welche die spezifische Amplifizierung von erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder spezifischer Teile davon ermöglichen, und Sonden, die selektiv oder spezifisch mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder einem beliebigen Teil davon hybridisieren. Sonden können mit einem detektierbaren Marker, wie beispielsweise einem Radioisotop, einer Fluoreszenzverbindung, einer Biolumineszenzverbindung, einer Chemilumineszenzverbindung, einem Metallchelatbildner oder einem Enzym, gelabelt sein. Solche Sonden und Primer werden verwendet, um das Vorhandensein eines 103P2D6-Polynukleotids in einer Probe festzustellen, sowie als Mittel zum Detektieren einer Zelle, welche das 103P2D6-Protein exprimiert.
Beispiele solcher Sonden umfassen Polypeptide, welche die ganze oder einen Teil der cDNA-Sequenzen von humanem 103P2D6, gezeigt in 2, aufweisen. In den Beispielen sind auch Beispiele von Primer-Paaren beschrieben, die 103P2D6-mRNAs spezifisch amplifizieren können. Wie ein Fachmann weiß, können ausgehend von den hierin bereit gestellten Sequenzen viele verschiedene Primer und Sonden hergestellt und effektiv zur Amplifizierung und/oder zum Feststellen einer 103P2D6-mRNA verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen 103P2D6-Polynukleotide sind für unterschiedliche Zwecke geeignet, einschließlich unter anderem als Sonden und Primer für die Amplifizierung und/oder die Feststellung des 103P2D6-Gens bzw. der 103P2D6-Gene, -mRNAs oder Fragmenten davon; als Reagenzien für die Diagnose und/oder Prognose von Prostatakrebs und anderen Krebserkrankungen; als Kodierungssequenzen, welche die Expression von 103P2D6-Polypeptiden steuern; als Hilfsmittel zum Modulieren oder Hemmen der Expression des 103P2D6-Gens bzw. der 103P2D6-Gene und/oder der Translation des 103P2D6-Transkripts bzw. der 103P2D6-Transkripte; und als therapeutische Mittel.
III.A.4.) Isolierung von 103P2D6 kodierenden Nukleinsäure molekülen
Die hierin beschriebenen 103P2D6-cDNA-Sequenzen ermöglichen die Isolierung anderer Polynukleotide, welche eines oder mehrere 103P2D6-Genprodukte kodieren, sowie die Isolierung von Polynukleotiden, die Homologe von 103P2D6-Genprodukten, alternativ gesplicte Isoformen, Allelvarianten und mutierte Formen des 103P2D6-Genprodukts kodieren, sowie Polynukleotide, welche Analoge von mit 103P2D6 verwandten Proteinen kodieren. Es sind verschiedene molekulare Klonierungsverfahren, die zur Isolierung von ein 103P2D6-Gen kodierenden Volllängen-cDNAs eingesetzt werden können, gut bekannt (siehe beispielsweise Sambrook:, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, New York:, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Hrsg. Wiley and Sons, 1995). Beispielsweise können unter Verwendung von handelsüblichen Klonierungssystemen Lambda-Phage-Klonierungsverfahren geeignet angewandt werden (z.B. Lambda ZAP Express, Stratagene). Phagenklone, die cDNAs des 103P2D6-Gens enthalten, lassen sich mit einer markierten, als Sonde eingesetzten 103P2D6-cDNA oder einem Fragment davon identifizieren. Beispielsweise können in einer Ausführungsform die 103P2D6-cDNA (2) oder ein Anteil davon synthetisiert und als Sonde verwendet werden, um überlappende cDNAs und Volllängen cDNAs zu erhalten, welche einem 103P2D6-Gen entsprechen. Das 103P2D6-Gen selbst kann durch Durchsuchen von Bibliotheken genomischer DNA, Bibliotheken bakterieller artifizieller Chromosomen (BACS), Bibliotheken artifizieller Hefechromosomen (YACs) und dergleichen mit 103P2D6-DNA-Sonden oder -Primern isoliert werden.
III.A.5.) Rekombinante Nukleinsäuremoleküle und Wirt- Vektor-Systeme
Die Erfindung stellt außerdem rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle bereit, welche ein 103P2D6-Polynukleotid, Fragment, Analog oder Homolog davon enthalten, einschließlich unter anderem Phagen, Plasmide, Phagemide, Cosmide, YACs, BACs sowie verschiedene virale und nicht-virale Vektoren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, und Zellen, die mit solchen rekombinanten DNA- oder RNA-Molekülen transformiert oder transfiziert sind. Verfahren zum Herstellen solcher Moleküle sind gut bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, oben).
Die Erfindung stellt des Weiteren ein Wirt-Vektor-System bereit, welches ein rekombinantes DNA-Molekül aufweist, das ein 103P2D6-Polynukleotid, -Fragment, -Analog oder ein Homolog davon in einer geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle enthält. Beispiele geeigneter eukaryotischer Wirtszellen umfassen eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle, wie beispielsweise eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle (z.B. eine Bakulovirus-infizierbare Zelle wie beispielsweise eine SF9- oder HighFive-Zelle). Beispiele geeigneter Säugerzellen umfassen verschiedene Prostatakarzinom-Zelllinien wie beispielsweise DU145 und TsuPr1, andere transfizierbare oder transduzierbare Prostatakarzinom-Zelllinien, primäre Zellen (PrEC) sowie eine Reihe von Säugerzellen, die routinemäßig für die Expression rekombinanter Proteine verwendet werden (z.B. COS, CHO, 293, 293T-Zellen). Spezieller kann ein Polynukleotid, umfassend die Kodierungssequenz von 103P2D6 oder ein Fragment, Analog oder Homolog davon, zur Herstellung von 103P2D6-Proteinen oder Fragmenten davon verwendet wer den, wobei eine beliebige Anzahl von Wirt-Vektor-Systemen eingesetzt wird, die im Stand der Technik routinemäßig eingesetzt und auf breiter Basis bekannt sind.
Es steht ein breites Spektrum an Wirt-Vektor-Systemen zur Verfügung, die für die Expression von 103P2D6-Proteinen oder Fragmenten davon geeignet sind, siehe beispielsweise Sambrook et at, 1989, oben; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, oben). Bevorzugte Vektoren für die Säuger-Expression umfassen unter anderem pcDNA3.1 myc-His-tag (Invitrogen) und der retrovirale Vektor pSRαtkneo (Muller et al., 1991, MOB 11: 1785). Wenn diese Expressionsvektoren verwendet werden, kann 103P2D6 in mehreren Prostatakarzinom-Zelllinien und Nicht-Prostata-Zelllinien exprimiert werden, einschließlich beispielsweise 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 und TsuPr1. Die erfindungsgemäßen Wirt-Vektor-Systeme sind für die Produktion eines 103P2D6-Proteins oder dessen Fragment geeignet. Solche Wirt-Vektor-Systeme können verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von 103P2D6- und 103P2D6-Mutationen oder -Analogen zu untersuchen.
Rekombinantes humanes 103P2D6-Protein oder ein dessen Analog oder Homolog oder Fragment kann von Säugerzellen produziert werden, die mit einem Konstrukt transfiziert sind, welches ein mit 103P2D6 verwandtes Nukleotid kodiert. Beispielsweise können 293T-Zellen mit einem Expressionsplasmid transfiziert werden, das 103P2D6 oder ein Fragment, Analog oder Homolog davon kodiert, das 103P2D6 oder ein verwandtes Protein werden in den 293T-Zellen exprimiert, und das rekombinante 103P2D6-Protein wird mithilfe von Standardreinigungsverfahren (z.B. Affinitätsreinigung mithilfe von Anti-103P2D6-Antikörpern) isoliert. In einer anderen Ausführungsform wird eine 103P2D6-Kodierungssequenz in den retroviralen Vektor pSRαMSVtkneo subkloniert und verwendet, um verschiedene Säuger-Zelllinien zu infizieren, wie beispielsweise NIH 3T3, TsuPr1, 293 und rat-1, um 103P2D6-exprimierende Zelllinien zu erhalten. Es können auch verschiedene andere, aus dem Stand der Technik gut bekannte Expressionssysteme verwendet werden. Für die Herstellung einer sezernierten Form des rekombinanten 103P2D6-Proteins können Expressionskonstrukte verwendet werden, die ein Leader-Peptid kodieren, welches im Leseraster mit der 103P2D6-Kodierungssequenz verbunden ist.
Wie hierin erläutert, ermöglicht die Redundanz des genetischen Codes eine Variation der 103P2D6-Gensequenzen. Insbesondere ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass bestimmte Wirtarten häufig bestimmte Codonpräferenzen aufweisen, und deshalb kann die beschriebene Sequenz so, wie sie für einen gewünschten Wirt bevorzugt wird, angepasst werden. Beispielsweise sind in bevorzugten analogen Codonsequenzen seltene Codons (d. h Codons mit einer Gebrauchshäufigkeit von weniger als etwa 20% in bekannten Sequenzen des gewünschten Wirts) typischerweise durch häufigere Codons ersetzt. Die Codonpräferenzen für eine bestimmte Spezies werden beispielsweise berechnet, indem Codonnutzungstabellen hinzugezogen werden, die im INTERNET zur Verfügung stehen, beispielsweise: http://www.dna.affrc.go.jp/ nakamura/codon.html.
Es sind weitere Sequenzmodifikationen bekannt, um die Proteinexpression in einem zellulären Wirt zu erhöhen. Diese umfassen Eliminierung von Sequenzen, die störende Polyadenylierungssignale, Exon/Intron-Splicestellensignale, Transposon-artige Wiederholungen (Repeats) und/oder andere derartige gut charakterisierte Sequenzen kodieren, die für die Genexpression nachteilig sind. Der GC-Gehalt der Sequenz wird auf ein Maß angepasst, wie es für einen bestimmten zellulären Wirt den Durchschnitt darstellt, wie durch Bezugnahme auf bekannte, in der Wirtszelle exprimierte Gene berechnet wird. Wenn möglich, wird die Sequenz modifiziert, um prognostizierte mRNA-Haarnadel-Sekundärstrukturen zu vermeiden. Andere geeignete Modifikationen umfassen das Hinzufügen einer Translationsinitiationskonsensussequenz zu Beginn des offenen Leserasters, wie beschrieben in Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989). Der Fachmann weiß, dass die allgemeine Regel, dass eukaryotische Ribosomen die Translation ausschließlich am proximalen 5'-AUG-Codon beginnen, nur unter seltenen Bedingungen außer Kraft gesetzt ist (siehe z.B. Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) und Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).
IV.) MIT 103P2D6 VERWANDTE PROTEINE
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt mit 103P2D6 verwandte Proteine bereit. Spezifische Ausführungsformen von 103P2D6-Proteinen umfassen ein Polypeptid, das die ganze oder einen Teil der Aminosäuresequenz von humanem 103P2D6 aufweist, wie gezeigt in 2 Alternativ umfassen Ausführungsformen von 103P2D6-Proteinen variante, homologe oder analoge Polypeptide, die Änderungen der Aminosäuresequenz von 103P2D6, gezeigt in 2, aufweisen.
Im Allgemeinen teilen natürlich vorkommende Allelvarianten des humanen 103P2D6 ein hohes Maß an struktureller Identität und Homologie (z.B. eine Homologie von mindestens 90%). Typischerweise enthalten Allelvarianten des 103P2D6-Proteins konservative Aminosäuresubstitutionen in den hierin beschriebenen 103P2D6-Sequenzen oder eine Substitution einer Aminosäure aus einer korrespondierenden Position in einem Homolog von 103P2D6. Eine Klasse von 103P2D6-Allelvarianten sind Proteine, die einen hohen Grad an Homologie mit mindestens einer kleinen Region einer bestimmten 103P2D6-Aminosäuresequenz teilen, aber darüber hinaus eine radikale Abweichung von der Sequenz enthalten, wie beispielsweise eine nicht-konservative Substitution, Trunkierung, Insertion oder eine Leserasterverschiebung. Bei Vergleichen von Proteinsequenzen haben die Begriffe „Ähn lichkeit", „Identität" und „Homologie" jeweils eine gesonderte Bedeutung, wie im Feld der Genetik bekannt ist. Darüber hinaus können Orthologie und Paralogie wichtige Konzepte sein, welche die Beziehung von Mitgliedern einer bestimmten Proteinfamilie in einem Organismus zu den Mitgliedern derselben Familie in anderen Organismen beschreiben.
Tabelle II enthält Aminosäureabkürzungen. In einem Protein können häufig konservative Aminosäuresubstitutionen vorgenommen werden, ohne die Konformation oder die Funktion des Proteins zu verändern. Solche Änderungen umfassen die Substitution von Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) durch eine andere dieser hydrophoben Aminosäuren; Asparaginsäure (D) durch Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) durch Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) durch Threonin (T) und umgekehrt. Andere Substitutionen können auch als konservativ betrachtet werden, je nach der Umgebung der jeweiligen Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Beispielsweise sind Glycin (G) und Alanin (H) häufig untereinander austauschbar, genauso wie Alanin (A) und Valin (V). Methionin (M), das relativ hydrophob ist, kann häufig für Leucin und Isoleucin und bisweilen für Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig an Stellen untereinander austauschbar, an denen das wesentliche Merkmal des Aminosäurerestes seine Ladung ist und die unterschiedlichen pK-Werte dieser beiden Aminosäurereste unerheblich sind. In bestimmten Umgebungen können noch andere Austausche als „konservativ" betrachtet werden (siehe z.B. die Tabelle III hierin; Seite 13-15 „Biochemistry" 2. Auflage, Lubert Stryer Hrsg. (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol. 89, 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995, May 19; 270 (20): 11882-6).
Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung umfassen ein breites Spektrum an im Stand der Technik anerkannten Varianten oder Analogen von 103P2D6-Proteinen, wie beispielsweise Polypeptide, die Aminosäureinsertionen, -deletionen und -substitutionen aufweisen. 103P2D6-Varianten können mithilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren wie beispielsweise durch positionsgerichtete Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese hergestellt werden. Mit der klonierten DNA können positionsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), Kassettenmutagenese (Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) oder andere bekannte Techniken durchgeführt werden, um die 103P2D6-DNA-Variante herzustellen.
Um mindestens eine Aminosäure entlang einer kontigen Sequenz zu identifizieren, die an einer bestimmten biologischen Aktivität beteiligt ist, wie beispielsweise an einer Protein-Protein-Interaktion, kann auch eine Scanning-Aminosäureanalyse verwendet werden. Die bevorzugten Scanning-Aminosäuren umfassen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. In dieser Gruppe ist Alanin typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure, da es die Seitenkette jenseits des Beta-Kohlenstoffes eliminiert und weniger dazu neigt, die Hauptkettenkonformation der Variante zu verändern. Alanin wird außerdem typischerweise bevorzugt, da es sich hierbei um die häufigste Aminosäure handelt. Darüber hinaus kommt sie häufig sowohl in versteckter (buried) als auch in exponierter Position vor (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)). Wenn eine Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen einer Variante ergibt, kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
Wie hierin definiert, haben 103P2D6-Varianten, -Analoge oder -Homologe das Unterscheidungsmerkmal, mindestens ein Epitop aufzuweisen, das mit einem 103P2D6-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 „kreuzreaktiv" ist. Wie in diesem Satz verwendet, bedeutet „kreuzreaktiv", dass ein Antikörper oder eine T-Zelle, die spezifisch an eine 103P2D6-Variante binden, auch spezifisch an das 103P2D6-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 bindet. Ein Polypeptid ist keine Variante des in SEQ ID Nr.: 2 gezeigten Proteins mehr, wenn es kein Epitop mehr aufweist, das von einem Antikörper oder eine T-Zelle erkannt werden kann, die spezifisch an das 103P2D6-Protein binden. Ein Fachmann weiß, dass Antikörper, die Proteine erkennen, an Epitope verschiedener Größe binden, und eine Gruppierung in der Größenordnung von etwa vier oder fünf Aminosäuren, kontig oder nicht, gilt als typische Anzahl von Aminosäuren in einem Minimalepitop. Siehe z.B. Nair et al., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26(9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4): 2598-608.
Eine andere Klasse von mit 103P2D6 verwandten Proteinvarianten teilt eine Ähnlichkeit von 70%, 75%, 80%, 85% oder 90% oder mehr mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder verwandten Proteinvarianten. Eine andere spezifische Klasse von 103P2D6-Proteinvariante oder -Analogen umfasst mindestens eines der hierin beschriebenen oder aus dem derzeitigen Stand der Technik bekannten biologischen Motive von 103P2D6. Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch Analoge von 103P2D6-Fragmenten (Nuklein- oder Aminosäure) mit veränderten funktionellen (z.B. immunogenen) Eigenschaften relativ zum Ausgangsfragment. Es versteht sich, dass auf die Nuklein- oder Aminosäuresequenzen von 2 Motive anzuwenden sind, die jetzt oder in Zukunft zum Stand der Technik gehören.
Es sind Polypeptide beschrieben, die eine kürzere Sequenz als die 532 Aminosäuren des in 2 gezeigten 103P2D6-Proteins aufweisen. So können sie beispielsweise 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr kontige Aminosäuren des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins besitzen.
Darüber hinaus sind Polypeptide beschrieben, die aus etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 10 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 10 bis etwa Aminosäure 20 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 20 bis etwa Aminosäure 30 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 30 bis etwa Aminosäure 40 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 40 bis etwa Aminosäure 50 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 50 bis etwa Aminosäure 60 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 60 bis etwa Aminosäure 70 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 70 bis etwa Aminosäure 80 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 90 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 90 bis etwa Aminosäure 100 des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen, etc. über die gesamte 103P2D6-Sequenz hinweg. Darüber hinaus definiert diese Definition Polypeptide, die aus Abfolgen von 10 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von Aminosäure 100–532 des 103P2D6-Proteins bestehen. Darüber hinaus Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 1 (oder 20 oder 30 oder 40 etc) bis etwa Aminosäure 20 (oder 130 oder 140 oder 150 etc.) des in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Proteins bestehen. Es versteht sich, dass sich die Start- und Stopp-Positionen in diesem Absatz auf die spezifizierten Positionen sowie auf die Position plus oder minus 3 Reste beziehen.
Mit 103P2D6 verwandte Proteine werden mithilfe von aus dem Stand der Technik gut bekannter Peptidsynthese-Standardtechnologie oder chemischen Spaltungsverfahren hergestellt. Alternativ können Rekombinationsverfahren verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle herzustellen, die ein mit 103P2D6 verwandtes Protein kodieren. In einer Ausführungsform bieten Nukleinsäuremoleküle ein Mittel zur Herstellung definierter Fragmente des 103P2D6-Proteins (oder von Varianten, Homologen oder Analogen davon).
IV.A.) Ausführungsformen motivtragender Proteine
Es sind 103P2D6-Polypeptide beschrieben, welche die Aminosäurereste von mindestens einem der biologischen Motive, die in der in 2 oder 2 ausgeführten 103P2D6-Polypeptidsequenz enthalten sind, aufweisen. Im Stand der Technik sind verschiedene Motive bekannt, und ein Protein kann durch eine Reihe öffentlich verfügbarer Internetstellen hinsichtlich des Vorhandenseins solcher Motive untersucht werden (siehe z.B. http://pfam.wustl.edu; http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/sec-search/strucpredict.html; http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp; http://www.cbs.dtu.dk/; http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; http://www.expasy.org/tools/scnpsit1.html; Epimatrix^TM und Epimer^TM4, Brown University, http://www.brown.edu/Research/ TB-HIVLab/epimatrix/epimatrix.html; sowie BIMAS, http://bimas.cit.nih.gov/).
Motiv-tragende Untersequenzen des 103P2D6-Proteins sind in Tabelle XIX ausgeführt und identifiziert.
Tabelle XX führt mehrere häufig vorkommende Motive ausgehend von Recherchen in pfam auf (http://pfam.wustl. edu). Die Spalten von Tabelle XX listen (1) Abkürzungen von Motivnamen, (2) prozentuale Identität, die zwischen den verschiedenen Mitgliedern der Motivfamilie gefunden wird, (3) Motivname oder -beschreibung und (4) die gängigste Funktion; Positionsinformationen sind enthalten, wenn das Motiv für die Position relevant ist.
In Anbetracht der Beobachtung, dass die oben erläuterten 103P2D6-Motive mit Wachstumsregulationsstörungen in Verbindung stehen und weil 103P2D6 in bestimmten Karzinomen überexprimiert ist, sind Polypeptide, die mindestens eines der oben erörterten 103P2D6-Motive aufweisen, nützlich, um die spezifischen Kennzeichen eines malignen Phänotyps zu beleuchten (siehe z.B. Tabelle I). Beispielsweise sind die Caseinkinase II, die cAMP- und die cCMP-abhängige Proteinkinase und Proteinkinase C Enzyme, die bekanntlich mit der Entwicklung des malignen Phänotyps in Zusammenhang stehen (siehe z.B. Chef et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) und O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Darüber hinaus sind sowohl Glykosylierung als auch Myristoylierung Proteinmodifikationen, die ebenfalls mit Krebs und dem Fortschreiten von Krebs in Zusammenhang stehen (siehe z.B. Dennis et al., Biochem Biophys. Acta 1473(1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997). Auch die Amidierung ist eine Proteinmodifikation, die mit Krebs und dem Fortschreiten von Krebs in Zusammenhang steht (siehe z.B. Treston et al, J. Natl. Cancer Inst Monogr. (13): 169-175 (1992).
In einer anderen Ausführungsform umfassen erfindungsgemäße Proteine mindestens eines der nach im Stand der Technik anerkannten Verfahren identifizierten immunreaktiven Epitope, beispielsweise die Peptide, die in Tabelle V bis XVIII ausgeführt sind. ZTL-Epitope lassen sich mithilfe spezifischer Algorithmen bestimmen, um innerhalb eines 103P2D6-Proteins Peptide zu identifizieren, die optimal an bestimmte HLA-Allele binden können (z.B. Tabelle IV (A) und Table IV (8); Epimatrix^TM und Epimer^TM, Brown University, http://www.brown.edu/Research/TB-HIVLab/epimatrix/ epimatrix.html und BIMAS, http://bimas.cit.nih.gov/. Darüber hinaus sind Abläufe zur Identifizierung von Peptiden, die ausreichende Bindungsaffinität für HLA-Moleküle aufweisen und mit immunogenen Epitopen korrelieren, aus dem Stand der Technik wohlbekannt und werden ohne überflüssige Experimentierung durchgeführt. Außerdem sind Prozesse zur Identifizierung von Peptiden, bei denen es sich um immunogene Epitope handelt, aus dem Stand der Technik gut bekannt, und werden in vitro oder in vivo ohne überflüssige Experimentierung durchgeführt
Aus dem Stand der Technik sind auch Prinzipien zur Herstellung von Analogen zu solchen Epitopen bekannt, um die Immunogenität zu modulieren. Beispielsweise wird mit einem Epitop begonnen, das ein ZTL- oder HTL-Motiv trägt (siehe z.B. die HLA-Klasse-I-Motive oder Tabelle Table IV (A) und das HTL-Motiv von Tabelle IV (B)). Das Epitop wird durch Substitution einer Aminosäure an einer der spezifizierten Positionen durch eine andere, für diese Position spezifizierte Aminosäure in ein Analog verwandelt.
Verschiedene Bezugsquellen geben den Stand der Technik bezüglich der Identifizierung und Herstellung von Epitopen in einem relevanten Protein und Analogen davon wieder. Siehe beispielsweise WO 9733602 an Chestnut et al.; Sette, Immunogenetics 199950(3-4): 201-212; Sette et al., J Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 199745(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996157(8): 3480-90; und Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 und Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.
Polypeptide, die Kombinationen der verschiedenen Motive aufweisen, sind in Tabelle XIX ausgeführt und/oder werden mit mindestens einem der prognostizierten ZTL-Epitope in Tabelle V bis Tabelle XVIII und/oder mindestens einem der T-Zell-Bindungsmotive, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, kombiniert. Keine Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in den Motiven oder den dazwischen liegenden Sequenzen der Polypeptide sind bevorzugt. Darüber hinaus kann eine Anzahl N-terminaler und/oder C-terminaler Aminosäurereste auf jeder Seite dieser Motive wünschenswert sein (um beispielsweise einen größeren Anteil der Polypeptidarchitektur einzuschließen, in der sich das Motiv befindet). Typischerweise liegt die Anzahl an N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäureresten auf jeder Seite eines Motivs zwischen etwa 1 bis etwa 100 Aminosäureresten, vorzugsweise bei 5 bis etwa 50 Aminosäureresten.
Mit 103P2D6 verwandte Proteine sind in vielen Formen ausgeführt, vorzugsweise in isolierter Form. Ein gereinigtes 103P2D6-Proteinmolekül ist im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Molekülen, die die Bindung von 103P2D6 an einen Antikörper, eine T-Zelle oder einen sonstigen Liganden behindern. Die Art und der Grad der Isolierung und Reinigung richten sich nach dem beabsichtigten Gebrauch. Ausführungsformen eines mit 103P2D6 verwandten Proteins umfassen gereinigte, mit 103P2D6 verwandte Proteine und funktionelle, lösliche, mit 103P2D6 verwandte Proteine. In einer Ausführungsform behalten ein funktionelles lösliches 103P2D6-Protein oder ein Fragment davon die Fähigkeit bei, von einem Antikörper, einer T-Zelle oder einem sonstigen Liganden gebunden zu werden.
Es sind 103P2D6-Proteine beschrieben, die biologisch aktive Fragmente der in 2 gezeigten 103P2D6-Amino säuresequenz aufweisen. Solche Proteine weisen Eigenschaften des 103P2D6-Proteins auf, wie beispielsweise die Fähigkeit, die Bildung von Antikörpern hervorzurufen, die ein mit dem 103P2D6-Protein assoziiertes Epitop spezifisch binden, von solchen Antikörpern gebunden zu werden, die Aktivierung von HTL oder ZTL zu bewirken und/oder von HTL oder ZTL erkannt zu werden.
Mit 103P2D6 verwandte Polypeptide, die besonders relevante Strukturen enthalten, lassen sich anhand verschiedener, aus dem Stand der Technik gut bekannter Analysetechniken, einschließlich zum Beispiel der Analyseverfahren nach Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson-Wolf, oder auf Basis der Immunogenität vorhersagen und/oder identifizieren. Fragmente, die solche Strukturen enthalten, sind besonders für die Herstellung von für Untereinheiten spezifischen Anti-103P2D6-Antikörpern oder T-Zellen geeignet oder zur Identifizierung von zellulären Faktoren, die an 103P2D6 binden.
ZTL-Epitope können mithilfe spezifischer Algorithmen bestimmt werden, um innerhalb eines 103P2D6-Proteins Peptide zu identifizieren, die optimal an spezifische HLA-Allele binden können (z.B. Tabelle IV (A) und Tabelle IV (B); Epimatrix^TM und Epimer^TM, Brown University (http://www.brown. edu/Research/TB-HIVLab/epimatrix/epimatrix.html); und BIMAS, http://bimas.dcrt.nih.gov/). Zur Veranschaulichung dessen wurden Peptidepitope von 103P2D6, die im Kontext mit humanen MHC-Klasse-I-Molekülen HLA-A1, -A2, -A3, -A11, -A24, -B7 und -B35 präsentiert werden, vorhergesagt (Tabelle V–XVIII). Insbesondere wurde die vollständige Aminosäuresequenz des 103P2D6-Proteins in den HLA-Peptidmotiv-Suchalgorithmus eingegeben, der in der Rubrik „Bioinformatik und Molekulare Analyse" (Bioinformatics and Molecular Analysis Section) der oben genannten Internetseite zu finden ist. Der HLA-Peptidmotiv-Suchalgorithmus wurde von Dr. Ken Parker auf Basis der Bindung spezifischer Peptidsequenzen in der Grube (Groove) von HLA-Klasse-I-Molekülen und insbesondere von HLA-A2 entwickelt (siehe z.B. Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)). Dieser Algorithmus gestattet die Lokalisierung und die Einordnung von 8-mer-, 9-mer- und 10-mer-Peptiden aus einer vollständigen Proteinsequenz hinsichtlich der vorhergesagten Bindung an HLA-A2 sowie an zahlreiche andere HLA-Klasse-I-Moleküle. Viele Peptide, die an HLA-Klasse-I binden, sind 8-Mere, 9-Mere, 10-Mere der 11-Mere. Beispielsweise enthalten die Epitope für Klasse-I-HLA-A2 vorzugsweise ein Leucin (L) oder Methionin (M) an Position 2 und ein Valin (V) oder Leucin (L) am C-Terminus (siehe z.B. Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992)). Ausgewählte Beispiele von 103P2D8-Peptiden mit vorhergesagter Bindung sind in Tabelle V-XVIII hierin gezeigt. In Tabelle V-XVIII sind die 50 am höchsten eingeordneten Kandidaten, 9-Mere und 10-Mere, für jedes Familienmitglied sowie deren Position, die Aminosäuresequenz eines jeden spezifizierten Peptids und ein geschätzter Bindungswert angegeben. Der Bindungswert entspricht der geschätzten Halbwertszeit der Dissoziation von Komplexen, die das Peptid enthalten, bei 37°C und pH 6,5. Peptide mit dem höchsten Bindungswert binden voraussichtlich am stärksten und am längsten an HLA-Klasse-I auf der Zelloberfläche und stellen daher die besten immunogenen Ziele für die Erkennung durch T-Zellen dar.
Die tatsächliche Bindung von Peptiden an ein HLA-Allel lässt sich durch Stabilisierung der HLA-Expression auf der Zelllinie T2 mit defekter Antigenprozessierung untersuchen (siehe z.B. Xue et al., Prostate 30: 73-8 (1997) und Peshwa et al., Prostate 36: 129-38 (1998)). Die Immunogenität spezifischer Peptide lässt sich in vitro durch Stimulation zytotoxischer CD8⁺-T-Lymphozyten (ZTL) in Gegenwart von An tigen präsentierenden Zellen wie beispielsweise dendritischen Zellen untersuchen.
Jedes Epitop, das von der BIMAS-Internetseite, der Epimer^TM- und der Epimatrix^TM-Internetseite vorhergesagt oder von den aus dem Stand der Technik verfügbaren oder in den Stand der Technik eingehenden HLA-Klasse-I- oder Klasse-II-Motiven spezifiziert wird, wie beispielsweise ausgeführt in Tabelle IV (A) und Tabelle IV (B), soll auf das 103P2D6-Protein angewandt werden. Wie in diesem Kontext verwendet, bedeutet „angewandt", dass das 103P2D6-Protein untersucht wird, z.B. visuell oder mit rechnerbasierten Verfahren zur Auffindung von Mustern, wie sie einem Fachmann bekannt sind. Im Umfang der Erfindung sind alle Untersequenzen von 103P2D6 mit 8, 9, 10 oder 11 Aminosäureresten, die ein HLA-Klasse-I-Motiv tragen, oder eine Untersequenz von mindestens 9 Aminosäureresten, die ein HLA-Klasse-II-Motiv tragen, eingeschlossen.
IV.B.) Expression von mit 103P2D6 verwandten Proteinen
In einer in den folgenden Beispielen beschriebenen Ausführungsform kann 103P2D6 geeignet in Zellen (wie beispielsweise in 293T-Zellen) exprimiert werden, die mit einem handelsüblichen Expressionsvektor transfiziert sind, wie beispielsweise mit einem ZMV-gesteuerten Expressionsvektor, der 103P2D6 mit einem C-terminalen 6XHis- und MYC-Marker kodiert (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen, oder Tag5, GenHunter Corporation, Nashville, TN, USA). Der Tag5-Vektor liefert ein IgGK-Sekretionssignal, das verwendet werden kann, um die Produktion eines sezernierten 103P2D6-Proteins in transfizierten Zellen zu ermöglichen. Das sezernierte 103P2D6 mit HIS-Marker im Kulturmedium kann gereinigt werden, z.B. mithilfe einer Nickelsäule unter Verwendung von Standardtechniken.
IV.C.) Modifikationen von mit 103P2D6 verwandten Proteinen
Es sind Modifikationen von mit 103P2D6 verwandten Proteinen beschrieben, wie beispielsweise kovalente Modifikationen. Ein Typ einer kovalenten Modifikation umfasst das Umsetzen von Aminosäurezielresten eines 103P2D6-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsagens, das mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten von 103P2D6 reagieren kann. Ein anderer Typ einer kovalenten Modifikation des 103P2D6-Polypeptids umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters eines erfindungsgemäßen Proteins. Ein anderer Typ einer kovalenten Modifikation von 103P2D6 umfasst das Verknüpfen des 103P2D6-Polypeptids mit einem aus verschiedenen nicht-proteinösen Polymeren, z.B. Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylenen, auf die Art und Weise, die in US-Patent Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 ausgeführt ist.
Die mit 103P2D6 verwandten Proteine können auch modifiziert werden, um ein chimäres Molekül zu bilden, welches 103P2D6, fusioniert mit einem anderen, heterologen Polypeptid oder einer Aminosäuresequenz, umfasst. Ein solches chimäres Molekül kann chemisch oder rekombinant synthetisiert werden. Ein chimäres Molekül kann ein erfindungsgemäßes Protein aufweisen, das mit einem anderen tumorassoziierten Antigen oder Fragment davon fusioniert ist. Alternativ kann ein Protein eine Fusion von Fragmenten der 103P2D8-Sequenz (Amino- oder Nukleinsäure) aufweisen, so dass ein Molekül geschaffen wird, das auf seiner gesamten Länge nicht direkt mit der Amino- bzw. Nukleinsäuresequenz von 2 homolog ist. Ein solches chimäres Molekül kann Vielfache derselben Untersequenz von 103P2D6 aufweisen. Ein chimäres Molekül kann eine Fusion eines mit 103P2D6 verwandten Proteins mit einem Polyhistidinepitop-Marker aufweisen, welcher ein Epitop liefert, an das immobilisiertes Nickel selektiv binden kann. Der Epitop-Marker wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxylterminus von 103P2D6 platziert. In einer alternativen Ausführungsform kann das Chimäre Molekül eine Fusion eines mit 103P2D6 verwandten Proteins mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins aufweisen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls (auch als „Immunadhäsin" bezeichnet) könnte eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (mit deletierter oder inaktivierter Transmembrandomäne) eines 103P2D6-Polypeptids anstelle mindestens einer variablen Region in einem Ig-Molekül. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Scharnier (Hinge)-, CH2- und CH3- oder die Scharnier (Hinge)-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgGI-Moleküls. Für die Produktion von Immunglobulinfusionen siehe z.B. US-Patent Nr. 5.428.130 , erteilt am 27. Juni 1995.
IV.D.) Verwendung von mit 103P2D6 verwandten Proteinen
Die erfindungsgemäßen Proteine finden eine Reihe unterschiedlicher spezifischer Anwendungen. Da 103P2D6 in Prostatakarzinomen und anderen Karzinomen stark exprimiert ist, werden mit 103P2D6 verwandte Proteine in Verfahren eingesetzt, die den Status von 103P2D6-Genprodukten in normalem gegenüber kanzerösem Gewebe untersuchen, wodurch der maligne Phänotyp aufgeklärt wird. Typischerweise werden Polypeptide aus spezifischen Regionen des 103P2D6-Proteins verwendet, um das Vorhandensein von Perturbationen (wie beispielsweise Deletionen, Insertionen, Punktmutationen, etc.) in solchen Regionen (wie beispielsweise in Regionen, die mindestens ein Motiv enthalten) zu untersuchen. Exemplarische Assays verwenden Antikörper oder T-Zellen gegen mit 103P2D6 verwandte Proteine, welche die Aminosäurereste von mindestens einem der biologischen Motive aufweisen, die in der 103P2D6-Polypeptidsequenz enthalten sind, um die Kennzeichen dieser Region in normalem gegenüber kanzerösem Gewebe zu untersuchen oder eine Immunreaktion gegen dieses Epitop hervorzurufen. Alternativ werden mit 103P2D6 verwandte Proteine verwendet, welche die Aminosäurereste mindestens eines der biologischen Motive in dem 103P2D6-Protein enthalten, um nach Faktoren zu suchen, welche mit dieser Region von 103P2D6 interagieren.
103P2D6-Proteinfragmente/-Untersequenzen sind besonders zum Erzeugen und Charakterisieren domänenspezifischer Antikörper (z.B. Antikörper, welche ein extrazelluläres oder intrazelluläres Epitop eines 103P2D6-Proteins erkennen) geeignet, um Stoffe oder zelluläre Faktoren zu identifizieren, welche an 103P2D6 oder eine besondere strukturelle Domäne davon binden, und in verschiedenem therapeutischem und diagnostischem Kontext, einschließlich unter anderem in diagnostischen Assays, Krebsimpfstoffen und Verfahren zum Herstellen solcher Impfstoffe.
Proteine, welche von den 103P2D6-Genen oder von Analogen, Homologen oder Fragmenten davon kodiert werden, finden verschiedene Anwendungen, einschließlich unter anderem zur Erzeugung von Antikörpern und in Verfahren zum Identifizieren von Liganden und anderen Stoffen und zellulären Bestandteilen, die an ein 103P2D6-Genprodukt binden. Antikörper, die gegen ein 103P2D6-Protein oder ein Fragment davon erzeugt werden, sind für diagnostische und prognostische Assays und in Bildgebungsverfahren zum Management von Krebserkrankungen des Menschen geeignet, die durch die Expression von 103P2D6-Protein gekennzeichnet sind, wie beispielsweise die in Tabelle I genannten. Solche Antikörper können intrazellulär exprimiert und in Verfahren zum Behandeln von Patienten mit solchen Krebserkrankungen verwendet werden. Mit 103P2D6 verwandte Nukleinsäuren oder Proteine werden ebenfalls bei der Erzeugung von HTL- oder ZTL-Reaktionen verwendet.
Es werden verschiedene immunologische Assays für den Nachweis von 103P2D6-Proteinen verwendet, einschließlich unter anderem verschiedener Typen von Radioimmunassays, enzymverknüpften Immunadsorptionsassays (Enzym-Linked Immunosorbent Assays, ELISAs), enzymverknüpften Immunfluoreszenzassays (ELIFAs), immunzytochemischen Verfahren und dergleichen. Antikörper können markiert und als immunologische Bildgebungsreagenzien verwendet werden, die 103P2D6 exprimierende Zellen nachweisen können (z.B. in Radioszintigraphie-Bildgebungsverfahren). 103P2D6-Proteine sind auch besonders für die Erzeugung von Krebsimpfstoffen geeignet, wie hierin weiter beschrieben ist.
V.) 103P2D6-Antikörper
Ein weiterer Aspekt stellt Antikörper bereit, welche an mit 103P2D6 verwandte Proteine binden. Bevorzugte Antikörper binden spezifisch an ein mit 103P2D6 verwandtes Protein und binden nicht (oder binden schwach) an Peptide oder Proteine, bei denen es sich nicht um 103P2D6 verwandte Proteine handelt. So können beispielsweise Antikörper, die 103P2D6 binden, 103P2D6 verwandte Proteine binden, wie beispielsweise die Homologe oder Analoge hiervon.
103P2D6-Antikörper sind besonders nützlich bei der Diagnose eines Prostatakarzinoms und in prognostischen Assays und Bildgebungsverfahren. Entsprechend sind solche Antikörper bei der Behandlung, Diagnose und/oder Prognose anderer Karzinome nützlich, soweit 103P2D6 auch in diesen anderen Karzinomen exprimiert oder überexprimiert ist. Darüber hinaus sind intrazellulär exprimierte Antikörper (z.B. einzelkettige Antikörper) bei der Behandlung von Karzinomen therapeutisch geeignet, die mit der Expression von 103P2D6 einhergehen, wie beispielsweise bei fortgeschrittenem oder metastasiertem Prostatakarzinom.
Hierin sind verschiedene immunologische Assays erläutert, die für den Nachweis und die Quantifizierung von 103P2D6 und mutierten mit 103P2D6 verwandten Proteinen geeignet sind. Solche Assays können mindestens einen 103P2D6-Antikörper aufweisen, die gegebenenfalls ein mit 103P2D6 verwandtes Protein erkennen und binden können. Diese Assays werden in verschiedenen, aus dem Stand der Technik bekannten, immunologischen Assayformaten durchgeführt, einschließlich unter anderem verschiedener Arten von Radioimmunassays, enzymverknüpfter Immunadsorptionsassays (Enzym-Linked Immunosorbent Assays, ELISAs), enzymverknüpfter Immunfluoreszenzassays (ELIFAs) und dergleichen.
Immunologische Nicht-Antikörper-Assays umfassen auch T-Zell-Immunogenitätsassays (inhibitorisch oder stimulatorisch) sowie Haupthistokompatibilitätskomplex-Bindungsassays (Major Histocompatibility Complex- oder MHC-Bindungsassays).
Darüber hinaus sind auch immunologische Bildgebungsverfahren bereit gestellt, die ein Prostatakarzinom und andere, 103P2D6 exprimierende Karzinome detektieren können, einschließlich unter anderem radioszintigraphische Bildgebungsverfahren unter Verwendung von markierten 103P2D6-Antikörpern. Solche Assays sind klinisch bei dem Nachweis, der Überwachung und der Prognose von 103P2D6 exprimierenden Karzinomen wie beispielsweise Prostatakarzinom nützlich.
103P2D6-Antikörper werden auch in Verfahren zum Reinigen eines mit 103P2D6 verwandten Proteins und zum Isolieren von 103P2D6-Homologen und verwandten Molekülen verwendet. Ein Verfahren zum Reinigen eines mit 103P2D6 verwandten Proteins umfasst beispielsweise das Inkubieren eines 103P2D6-Antikörpers, der an eine feste Matrix gekoppelt ist, mit einem Lysat oder einer anderen Lösung, die ein mit 103P2D6 verwandtes Protein enthält, unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass der 103P2D6-Antikörper an das mit 103P2D6 verwandte Protein bindet; Waschen der festen Ma trix, um Verunreinigungen zu beseitigen, und Eluieren des mit 103P2D6 verwandten Proteins von dem gekoppelten Antikörper. Andere Anwendungen der 103P2D6-Antikörper umfassen das Erzeugen von Anti-Idiotyp-Antikörpern, welche das 103P2D6-Protein nachahmen.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren für die Herstellung von Antikörpern bekannt. Antikörper können beispielsweise hergestellt werden, indem ein geeigneter Säugerwirt mit einem mit 103P2D6 verwandten Protein, Peptid oder Fragment in isolierter oder immunkonjugierter Form immunisiert wird (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Hrsg., Harlow and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Darüber hinaus können auch Fusionsproteine von 103P2D6 verwendet werden, wie beispielsweise ein 103P2D6-GST-Fusionsprotein. In einer bestimmten Ausführungsform wird ein GST-Fusionsprotein hergestellt, das die ganze oder den größten Teil der Aminosäuresequenz von 2 oder 3 umfasst, und anschließend als Immunogen verwendet, um entsprechende Antikörper zu erzeugen. In einer anderen Ausführungsform wird ein mit 103P2D6 verwandtes Protein synthetisiert und als Immunogen verwendet.
Darüber hinaus werden aus dem Stand der Technik bekannte Immunisierungstechniken mit nackter DNA verwendet (mit oder ohne gereinigte mit 103P2D6 verwandte Proteine oder 103P2D6 exprimierende Zellen), um eine Immunreaktion gegen das kodierte Immunogen zu erzeugen (zur Übersicht siehe Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
Die Aminosäuresequenz von 103P2D6, wie in 2 oder 3 gezeigt, kann analysiert werden, um spezifische Regionen des 103P2D6-Proteins zum Erzeugen von Antikörpern auszuwählen. Es können beispielsweise Hydrophobizitäts- und Hydrophilie-Analysen der 103P2D6-Aminosäuresequenz verwendet werden, um hydrophile Regionen in der 103P2D6-Struktur zu identifizieren. Regionen des 103P2D6-Proteins, die eine immunogene Struktur zeigen, sowie andere Regionen und Domänen, können leicht anhand verschiedener anderer aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren identifiziert werden, wie beispielsweise durch eine Analyse nach Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson-Wolf. Deshalb ist jede von einem dieser Programme oder Verfahren identifizierte Region im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Verfahren für das Erzeugen von 103P2D6-Antikörpern sind weiter durch die hierin bereit gestellten Verfahren veranschaulicht. Verfahren zum Herstellen eines Proteins oder Polypeptids zur Verwendung als Immunogen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Auch Verfahren zum Herstellen immunogener Konjugate eines Proteins mit einem Träger, wie beispielsweise BSA, KLH oder einem anderen Trägerprotein, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. In manchen Fällen wird eine direkte Konjugation unter Verwendung von beispielsweise Carbodiimid-Reagenzien durchgeführt; in anderen Fällen sind Verknüpfungsreagenzien wie beispielsweise die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA erhältlichen, wirksam. Die Verabreichung eines 103P2D6-Immunogens wird häufig durch Injektion über einen geeigneten Zeitraum und unter Zuhilfenahme eines geeigneten Adjuvans durchgeführt, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Während des Immunisierungsplans können die Titer von Antikörpern ermittelt werden, um die Adäquanz der Antikörperbildung zu bestimmen.
Durch verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte Mittel können monoklonale 103P2D6-Antikörper hergestellt werden. Beispielsweise werden mithilfe der Hybridomstandardtechnologie nach Köhler und Milstein oder durch Modifikationen, die Antikörper produzierende B-Zellen immortalisieren, wie generell bekannt ist, immortalisierte Zelllinien hergestellt, die einen gewünschten monoklonalen Antikörper sezernieren. Immortalisierte Zelllinien, die die ge wünschten Antikörper sezernieren, werden mittels Immunassays gescreent, in denen das Antigen ein mit 103P2D6 verwandtes Protein ist. Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur identifiziert ist, können die Zellen expandiert, und entweder aus In-vitro-Kulturen oder aus Aszitesflüssigkeit können Antikörper gewonnen werden.
Die Antikörper oder Fragmente können auch rekombinant hergestellt werden. Regionen, die spezifisch an die gewünschten Regionen des 103P2D6-Proteins binden, können auch im Kontext chimärer oder CDR-grafted (mit einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) versehenen) Antikörpern hergestellt werden, die von mehreren Spezies stammen. Es können auch humanisierte oder humane 103P2D6-Antikörper hergestellt werden und sind für die Verwendung in therapeutischem Kontext bevorzugt. Verfahren zum Humanisieren von murinen und anderen nicht-humanen Antikörpern durch Substituieren mindestens einer der CDR der nicht-humanen Antikörper durch korrespondierende humane Antikörpersequenzen sind gut bekannt (siehe z.B. Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Siehe auch Carter et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 4285 und Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.
Verfahren zum Herstellen vollständig humaner monoklonaler Antikörper umfassen Phagendisplayverfahren und transgene Verfahren (zur Übersicht siehe Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Vollständig humane monoklonale 103P2D6-Antikörper können mithilfe von Klonierungstechniken erzeugt werden, bei denen große kombinatorische Bibliotheken humaner Ig-Gene (d. h. Phagen-Display) verwendet werden (Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system; human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Hrsg.), Nottingham Academic, S. 45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id, S. 65-82). Vollständig humane monoklonale 103P2D6-Antikörper können auch mithilfe transgener Mäuse produziert werden, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie humane Immunglobulingenloci enthalten, wie beschrieben in der Patentanmeldung WO98124893 , Kucherlapati and Jakobovits et al., veröffentlicht am 3. Dezember 1997 (siehe auch Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest Drugs 7(4): 607-614; US-Patent 6.162.963 , erteilt am 19. Dezember 2000; 6.150.584 ; erteilt am 12. November 2000; und 6.114.598 , erteilt am 5. September 2000). Diese Verfahren umgehen die In-vitro-Manipulation, die bei der Phagen-Display-Technologie erforderlich ist, und produzieren effizient hoch affine authentische humane Antikörper.
Die Reaktivität von 103P2D6-Antikörpern mit einem mit 103P2D6 verwandten Protein lässt sich durch eine Anzahl gut bekannter Mittel feststellen, einschließlich Western Blot, Immunpräzipitation, ELISA und FACS-Analysen mit entsprechend geeigneten mit 103P2D6 verwandten Proteinen, 103P2D6 exprimierenden Zellen oder Extrakten davon. Ein 103P2D6-Antikörper oder Fragmente davon können mit einem detektierbaren Marker gelabelt oder an ein zweites Molekül konjugiert werden. Geeignete nachweisbare Marker umfassen unter anderem ein Radioisotop, eine Fluoreszenzverbindung, eine Biolumineszenzverbindung, eine Chemilumineszenzverbindung, einen Metallchelatbildner oder ein Enzym. Darüber hinaus werden bispezifische Antikörper, die für mindestens zwei 103P2D6-Epitope spezifisch sind, mithilfe von Verfahren erzeugt, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind. Homodimere Antikörper können auch durch aus dem Stand der Technik bekannte Vernetzungstechniken hergestellt werden (z.B. Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
VI.) 103P2D6-Transgene Tiere
Nukleinsäuren, die ein mit 103P2D6 verwandtes Protein kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knock-out"-Tiere zu erzeugen, die wiederum bei der Entwicklung und dem Screening von therapeutisch nützlichen Reagenzien geeignet sind. 103P2D6 kodierende cDNA kann nach etablierten Techniken verwendet werden, um genomische DNA zu klonieren, die 103P2D6 kodiert. Die klonierten genomischen Sequenzen können dann verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, welche DNA exprimieren, die 103P2D6 kodiert. Verfahren zum Erzeugen transgener Tiere, insbesondere Tiere wie Mäuse oder Ratten, sind im Stand der Technik mittlerweile gebräuchlich und sind beispielsweise in US-Patent Nr. 4.736.866 , erteilt am 12. April 1988, und 4.870.009 , erteilt am 26. September 1989, beschrieben. Typischerweise würde das 103P2D6-Transgen mit gewebespezifischen Enhancern in bestimmte Zellen eingebaut.
Transgene Tiere, die eine Kopie eines 103P2D6 kodierenden Transgens aufweisen, können verwendet werden, um den Effekt einer verstärkten Expression von DNA zu untersuchen, die 103P2D6 kodiert. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz beispielsweise vor pathologischen Zuständen in Verbindung mit dessen Überexpression verleihen. Nach diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit einem Reagens behandelt, und eine reduzierte Inzidenz eines pathologischen Zustandes im Vergleich zu unbehandelten Tieren, die das Transgen tragen, würde auf eine mögliche therapeutische Intervention bei dem pathologischen Zustand deuten.
Alternativ können nicht-humane Homologe von 103P2D6 verwendet werden, um ein 103P2D6-„Knock out”-Tier herzustellen, bei dem das Gen für 103P2D6 als Ergebnis einer homologen Rekombination zwischen dem endogenen, 103P2D6 ko dierenden Gen und veränderter 103P2D6 kodierender, genomischer DNA, die in eine embryonale Zelle des Tieres eingeführt wurde, defekt oder verändert ist. Beispielsweise kann 103P2D6 kodierende cDNA verwendet werden, um 103P2D6 kodierende, genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren. Ein Anteil der 103P2D6 kodierenden, genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie beispielsweise durch ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert, welcher zur Überwachung der Integration verwendet werden kann. Typischerweise weist der Vektor mehrere Kilobasen an unveränderter flankierender DNA auf (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) (siehe z.B. Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) für eine Beschreibung von Vektoren für die homologe Rekombination). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen die eingeführte DNA eine homologe Rekombination mit der endogenen DNA durchgeführt hat, werden selektiert (siehe z.B. Li et al., Cell, 69: 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tieres (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, in Teratocarcinomas und Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg. (IRL, Oxford, 1987), S. 113-152). Anschließend kann ein chimärer Embryo in ein geeignetes scheinschwangeres weibliches Fostertier implantiert werden, das den Embryo austrägt, um ein „Knock out"-Tier zu erhalten. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihrem Keimzellen enthalten, lassen sich durch Standardtechniken identifizieren und verwenden, um Tiere zu züchten, bei denen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knock-out-Tiere können beispielsweise hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Abwehr bestimmter pathologischer Zustände oder hinsichtlich ihrer Entwicklung pathologischer Zustände infolge des Nichtvorhandenseins des 103P2D6-Polypeptids charakterisiert werden.
VII.) Verfahren zur Detektion von 103P2D6
Es sind Verfahren zur Detektion von 103P2D6-Polynukleotiden und mit 103P2D6 verwandten Proteinen sowie Verfahren zum Identifizieren einer Zelle, die 103P2D6 exprimiert, beschrieben. Aufgrund seines Expressionsprofils ist 103P2D6 ein diagnostischer Marker für eine metastasierte Krankheit. Entsprechend liefert der Status der 103P2D6-Genprodukte Informationen, die nützlich sind, um verschiedene Faktoren vorherzusagen, einschließlich der Anfälligkeit für eine Krankheit im fortgeschrittenen Stadium, der Progressionsrate und/oder der Aggressivität des Tumors. Wie hierin ausführlich erläutert, lässt sich der Status der 103P2D6-Genprodukte in Patientenproben anhand verschiedener, aus dem Stand der Technik gut bekannter Protokolle analysieren, einschließlich durch immunhistochemische Analyse, die verschiedenen Northern-Blotting-Techniken, einschließlich Insitu-Hybridisierung, RT-PCR-Analyse (beispielsweise von Lasermikrodissektionsproben), Western-Blot-Analyse und Gewebe-Array-Analyse.
Insbesondere sind Assays für die Detektion von 103P2D6-Polynukleotiden in einer biologischen Probe bereitgestellt, beispielsweise in Serum, Knochen, Prostata und anderen Geweben, Harn, Samen, Zellpräparationen und dergleichen. Detektierbare 103P2D6-Polynukleotide umfassen beispielsweise ein 103P2D6-Gen oder ein Fragment davon, 103P2D6-mRNA, alternative 103P2D6-mRNA-Splicevarianten und rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein 103P2D6-Polynukleotid enthalten. Aus dem Stand der Technik ist eine Reihe von Verfahren zum Amplifizieren und/oder Detektieren des Vorhandenseins von 103P2D6-Polynukleotiden bekannt, die sich in der Praxis dieses Aspekts der Erfindung anwenden lassen.
Ein Verfahren zum Nachweisen einer 103P2D6-mRNA in einer biologischen Probe umfasst das Herstellen von cDNA aus der Probe durch reverse Transkription mithilfe mindestens eines Primers, Amplifizieren der so hergestellten cDNA mithilfe von 103P2D6-Polynukleotiden als Sense- und Antisenseprimer, um 103P2D6-cDNA darin zu amplifizieren, und Nachweisen des Vorhandeneins der amplifizierten 103P2D6-cDNA. Gegebenenfalls kann die Sequenz der amplifizierten 103P2D6-cDNA bestimmt werden.
Ein anderes Verfahren zum Nachweisen eines 103P2D6-Gens in einer biologischen Probe umfasst zunächst das Isolieren genomischer DNA aus der Probe, Amplifizieren der isolierten genomischen DNA mithilfe von 103P2D6-Polynukleotiden als Sense- und Antisenseprimer, und Detektieren des Vorhandeneins des amplifizierten 103P2D6-Gens. Aus den für 103P2D6 bereit gestellten Nukleotidsequenzen (2) kann eine beliebige Anzahl geeigneter Kombinationen von Sense- und Antisense-Sonden entworfen und für diesen Zweck verwendet werden.
Es sind Assays zum Detektieren eines 103P2D6-Proteins in einem Gewebe oder einer anderen biologischen Probe wie beispielsweise Serum, Samen, Knochen, Prostata, Harn, Zellpräparationen und dergleichen beschrieben. Verfahren zum Detektieren eines mit 103P2D6 verwandten Proteins sind ebenfalls gut bekannt und umfassen beispielsweise Immunpräzipitation, immunhistochemische Analyse, Western-Blot-Analyse, molekulare Bindungsassays, ELISA, ELIFA und dergleichen. Beispielsweise umfasst ein Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins eines mit 103P2D6 verwandten Proteins in einer biologischen Probe zunächst das Kontaktieren der Probe mit einem 103P2D6-Antikörper, einem mit 103P2D6 reagierenden Fragment davon oder einem rekombinanten Protein, das eine Antigenbindungsregion eines 103P2D6-Antikörpers enthält, und anschließend das Detektieren der Bindung des mit 103P2D6 verwandten Proteins in der Probe.
Es sind außerdem Verfahren zum Identifizieren einer Zelle, die 103P2D6 exprimiert, erläutert, sowie ein Assay zum Identifizieren einer Zelle, die ein 103P2D6-Gen exprimiert, welcher das Detektieren des Vorhandenseins von 103P2D6-mRNA in der Zelle umfasst. Verfahren für das Detektieren bestimmter mRNAs in Zellen sind gut bekannt und umfassen beispielsweise Hybridisierungsassays unter Verwendung komplementärer DNA-Sonden (wie beispielsweise In-situ-Hybridisierung unter Verwendung markierter 103P2D6-Ribosonden(-Riboprobes), Northern Blot und verwandter Techniken) und verschiedene Nukleinsäureamplifizierungsassays (wie beispielsweise RT-PCR unter Verwendung komplementärer Primer, die für 103P2D6 spezifisch sind, und andere Detektionsverfahren vom Amplifizierungstyp, wie beispielsweise verzweigte (branched) DNA, SISBA, TMA und dergleichen). Alternativ umfasst ein Assay zum Identifizieren einer Zelle, die ein 103P2D6-Gen exprimiert, das Detektieren des Vorhandenseins eines mit 103P2D6 verwandten Proteins in der Zelle oder eines von der Zelle sezernierten mit 103P2D6 verwandten Proteins. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zum Detektieren von Proteinen gut bekannt und werden für die Detektion von mit 103P2D6 verwandten Proteinen und von Zellen, die mit 103P2D6 verwandte Proteine exprimieren, angewandt.
Die 103P2D6-Expressionsanalyse ist auch als Hilfsmittel zum Identifizieren und Untersuchen von Stoffen geeignet, welche die Expression des 103P2D6-Gens modulieren. Beispielsweise ist die 103P2D6-Expression bei Prostatakrebs signifikant hochreguliert, und 103P2D6 ist in Karzinomen der in Tabelle I aufgeführten Gewebe exprimiert. Die Identifizierung eines Moleküls oder biologischen Agens, das bzw. der die 103P2D6-Expression oder Überexpression in Krebszellen hemmt, ist von therapeutischem Wert. Beispielsweise lässt sich ein solches Agens durch Verwendung eines Tests identifizieren, der die 103P2D6-Expression mittels RT-PCR, Nukleinsäurehybridisierung oder Antikörperbindung quantifiziert.
VIII.) Verfahren zum Überwachen des Status von mit 103P2D6 verwandten Genen und ihren Produkten
Die Onkogenese ist bekanntlich ein mehrstufiger Prozess, bei dem das zelluläre Wachstum einer fortschreitenden Fehlregulation unterworfen ist und Zellen von einem normalen physiologischen Zustand zu vorkanzerösen und anschließend kanzerösen Stadien fortschreiten (siehe z.B. Alers et al., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) und Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). In diesem Kontext ermöglicht die Untersuchung einer biologischen Probe auf Hinweise fehlregulierten Zellwachstums (wie beispielsweise eine aberrante 103P2D6-Expression bei Karzinomen) die Früherkennung einer solchen aberranten Physiologie, bevor ein pathologischer Zustand wie beispielsweise Krebs zu einem Stadium fortschreitet, in dem therapeutische Optionen eingeschränkter sind oder die Prognose ungünstiger ist. Bei solchen Untersuchungen kann der Status von 103P2D6 in einer biologischen Probe beispielsweise mit dem Status von 103P2D6 in einer entsprechenden normalen Probe (z.B. einer Probe aus dem Individuum oder alternativ einem anderen Individuum, das nicht von einer Pathologie betroffen ist) verglichen werden. Eine Veränderung des Status von 103P2D6 in der biologischen Probe (im Vergleich zu der Normalprobe) liefert eine Evidenz für fehlreguliertes zelluläres Wachstum. Außer einer biologischen Probe, die nicht von einer Pathologie betroffen ist, kann auch ein im Voraus bestimmter normativer Wert wie beispielsweise ein im Voraus bestimmter normaler Grad an mRNA-Expression als Normalprobe verwendet werden (siehe z.B. Grever et al., J. Corp. Neurol. 1996 Dec 9; 376(2): 306-14 und US-Patent Nr. 5.837.501 ), um den 103P2D6-Status in einer Probe zu vergleichen.
Der Begriff „Status" in diesem Kontext wird nach seiner im Stand der Technik akzeptierten Bedeutung verwendet und betrifft den Zustand oder Status eines Gens und seines Produktes. Der Fachmann verwendet typischerweise eine Reihe von Parametern, um den Zustand bzw. Status eines Gens und seiner Produkte zu untersuchen. Dazu gehören unter anderem die Lokalisierung exprimierter Genprodukte (einschließlich der Lokalisierung von 103P2D6-exprimierenden Zellen) sowie die Menge und die biologische Aktivität exprimierter Genprodukte (wie beispielsweise 103P2D6-mRNA-Polynukleotide und -Polypeptide). Eine Veränderung des Status von 103P2D6 umfasst typischerweise eine Veränderung der Lokalisierung von 103P2D6 und/oder von 103P2D6-exprimierenden Zellen und/oder einen Anstieg der 103P2D6-mRNA- und/oder -Proteinexpression.
Der 103P2D6-Status in einer Probe kann durch eine Reihe von aus dem Stand der Technik gut bekannten Mitteln analysiert werden, einschließlich ohne Einschränkung immunhistochemische Analyse, In-situ-Hybridisierung, RT-PCR-Analyse von Lasermikrodissektionsproben, Western-Blot-Analyse und Gewebe-Array-Analyse. Typische Protokolle zum Untersuchen des Status des 103P2D6-Gens und der 103P2D6-Genprodukte sind beispielsweise zu finden in Ausubel et al., Hrsg., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unit 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) und 18 (PCR-Analyse). Der Status von 103P2D6 in einer biologischen Probe wird also durch verschiedene, vom Fachmann eingesetzte Verfahren untersucht, einschließlich unter anderem durch genomische Southern-Analyse (um beispielsweise Perturbationen des 103P2D6-Gens zu untersuchen), Northern-Analyse und/oder PCR-Analyse von 103P2D6-mRNA (um beispielsweise Veränderungen der Polynukleotidsequenzen oder des Expressionsgrads von 103P2D6-mRNAs zu untersuchen) und Western-Analyse und/oder immunhistochemische Analyse (um beispielsweise Veränderungen von Polypeptidsequenzen, Ver änderungen der Polypeptidlokalisierung in einer Probe, Veränderungen des Expressionsgrads von 103P2D6-Proteinen und/oder Assoziationen von 103P2D6-Proteinen mit Polypeptidbindungspartnern zu untersuchen). Nachweisbare 103P2D6-Polynukleotide umfassen beispielsweise ein 103P2D6-Gen oder Fragment davon, 103P2D6-mRNA, alternative Splicevarianten, 103P2D6-mRNAs und rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein 103P2D6-Polynukleotid enthalten.
103P2D6 ist aufgrund seines Expressionsprofils ein diagnostischer Marker für eine lokale und/oder metastasierte Krankheit und liefert Informationen über das Wachstum oder das onkogene Potenzial einer biologischen Probe. Insbesondere liefert der Status von 103P2D6 Informationen, die nützlich sind, um die Anfälligkeit für bestimmte Krankheitsstadien, Progression und/oder Tumoraggressivität vorherzusagen. Es sind Verfahren und Assays für die Bestimmung des 103P2D6-Status und zum Diagnostizieren von Karzinomen erläutert, die 103P2D6 exprimieren, wie beispielsweise Karzinome der in Tabelle I aufgeführten Gewebe. Weil 103P2D6-mRNA in einem Prostatakarzinom und anderen Karzinomen relativ zu normalen Prostatagewebe so stark exprimiert ist, können beispielsweise Assays, die die Menge an 103P2D6-mRNA-Transkripten oder -Proteinen in einer biologischen Probe untersuchen, verwendet werden, um eine Krankheit zu diagnostizieren, die mit einer Fehlregulierung von 103P2D6 assoziiert ist, und können prognostische Informationen liefern, die für die Definition geeigneter therapeutischer Optionen nützlich sind.
Der Expressionsstatus von 103P2D6 liefert Informationen, einschließlich über das Vorhandensein, das Stadium und die Lokalisierung dysplastischer, vorkanzeröser und kanzeröser Zellen, was die Anfälligkeit gegenüber verschiedenen Stadium der Krankheit vorhersagt und es ermöglicht, die Tumoraggressivität zu beurteilen. Darüber hinaus ist es aufgrund des Expressionsprofils ein nützliches Bildgebungs reagens für eine metastasierte Krankheit. Folglich zielt ein Aspekt der Erfindung auf die verschiedenen molekularen prognostischen und diagnostischen Verfahren zum Untersuchen des Status von 103P2D6 in biologischen Proben ab, wie beispielsweise von Individuen, die an einer Pathologie leiden oder bei denen der Verdacht besteht, dass sie an einer Pathologie leiden, die von einem fehlregulierten zellulären Wachstum wie beispielsweise Krebs gekennzeichnet ist.
Wie oben beschrieben, lässt sich der Status von 103P2D6 in einer biologischen Probe mithilfe einer Reihe von aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren untersuchen. Beispielsweise lässt sich der Status von 103P2D6 in einer aus einer bestimmten Stelle im Körper entnommenen biologischen Probe untersuchen, indem die Probe hinsichtlich des Vorhandenseins oder des Nichtvorhandenseins von 103P2D6 exprimierenden Zellen untersucht wird (z.B. solche, die 103P2D6-mRNAs oder -Proteine exprimieren). Diese Untersuchung kann Hinweise auf fehlreguliertes zelluläres Wachstum liefern, beispielsweise wenn 103P2D6 exprimierende Zellen in einer biologischen Probe gefunden werden, die solche Zellen normalerweise nicht enthält (beispielsweise in einem Lymphknoten), weil solche Veränderungen des Status von 103P2D6 in einer biologischen Probe häufig mit fehlreguliertem zellulärem Wachstum assoziiert sind. Insbesondere ist die Metastasierung von Krebszellen von einem Ursprungsorgan (wie der Prostata) zu einem anderen Körperbereich (wie beispielsweise zu einem Lymphknoten) ein Hinweis auf fehlreguliertes zelluläres Wachstum. In diesem Kontext ist die Evidenz für fehlreguliertes zelluläres Wachstum wichtig, beispielsweise, da bei einem wesentlichen Anteil von Patienten mit Prostatakarzinom okkulte Lymphknotenmetastasen festgestellt werden können, und solche Metastasen mit bekannten Prädiktoren der Krankheitsprogression assoziiert sind (siehe z.B. Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) und Freeman et al., J Urol 1995 Aug; 154(2 Pt 1): 474-8).
Es sind Verfahren zum Überwachen von 103P2D6-Genprodukten durch Bestimmen des Status von 103P2D6-Genprodukten, die von Zellen eines Individuums exprimiert werden, das vermutlich eine Krankheit hat, die mit fehlreguliertem zellulärem Wachstum assoziiert ist (beispielsweise Hyperplasie oder Krebs), und anschließendem Vergleichen des so bestimmten Status von 103P2D6-Genprodukten in einer entsprechenden normalen Probe bereit gestellt. Das Vorhandensein aberranter 103P2D6-Genprodukte in der Testprobe relativ zu der Normalprobe liefert einen Hinweis auf das Vorhandensein von fehlreguliertem zellulärem Wachstum in den Zellen des Individuums.
Es sind Assays beschrieben, die für die Bestimmung des Vorhandenseins von Krebs in einem Individuum von Nutzen sind und die den Nachweis eines wesentlichen Anstiegs der Expression von 103P2D6-mRNA- oder -Protein in einer Testzelle oder Gewebeprobe relativ zu dem Grad der Expression in den entsprechenden normalen Zellen oder dem normalen Gewebe umfassen. Das Vorhandensein von 103P2D6-mRNA kann beispielsweise in Gewebeproben untersucht werden, einschließlich unter anderem in den in Tabelle I aufgeführten. Das Vorhandensein einer wesentlichen 103P2D6-Expression in einem dieser Gewebe ist geeignet, um das Auftreten, das Vorhandensein und/oder den Schweregrad einer Krebserkrankung anzuzeigen, da die entsprechenden Normalgewebe keine oder weniger 103P2D6-mRNA exprimieren.
In einer verwandten Ausführungsform wird der 103P2D6-Status auf Proteinebene anstatt auf Nukleinsäureebene bestimmt. Beispielsweise umfasst ein solches Verfahren das Bestimmen der von Zellen in einer Testgewebeprobe exprimierten Menge an 103P2D6-Protein und Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an 103P2D6, das in einer entsprechenden normalen Probe exprimiert wird. In einer Aus führungsform wird das Vorhandensein von 103P2D6-Protein beispielsweise mithilfe von immunhistochemischen Verfahren untersucht. 103P2D6-Antikörper oder Bindungspartner, die eine Expression von 103P2D6-Protein feststellen können, werden in verschiedenen aus dem Stand der Technik für diesen Zweck gut bekannten Assayformaten verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Status von 103P2D6-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe untersucht werden, um Perturbationen in der Struktur dieser Moleküle zu identifizieren. Diese Perturbationen können Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen umfassen. Solche Untersuchungen sind von Nutzen, da Perturbationen in den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen bei einer großen Anzahl von Proteinen beobachtet wird, die mit einem Phänotyp fehlregulierten Wachstums assoziiert sind (siehe z.B. Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378). Eine Mutation in der Sequenz von 103P2D6 kann beispielsweise das Vorhandensein oder die Begünstigung eines Tumors anzeigen. Solche Assays haben daher diagnostischen und prädiktiven Wert, wenn eine Mutation in 103P2D6 einen möglichen Funktionsverlust oder eine Beschleunigung des Tumorwachstums anzeigt.
Aus dem Stand der Technik ist ein breites Spektrum an Assays zum Beobachten von Perturbationen gut bekannt. Beispielsweise werden Größe und Struktur von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen von 103P2D6-Genprodukten durch die hierin erläuterten Northern-, Southern-, Western-, PCR- und DNA-Sequenzierungsprotokolle beobachtet. Darüber hinaus sind weitere Verfahren zum Beobachten von Perturbationen in Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen wie beispielsweise die Analyse von Einzelstrangkonformationspolymorphismen aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.382.510 , erteilt am 7. September 1999, und 5.952.170 , erteilt am 17. Januar 1995).
Darüber hinaus kann der Methylierungsstatus des 103P2D6-Gens in einer biologischen Probe untersucht werden. Bei immortalisierten und transformierten Zellen tritt häufig eine aberrante Demethylierung und/oder Hypermethylierung von CpG-Inseln in regulatorischen 5'-Regionen auf und kann zu einer veränderten Expression verschiedener Gene führen. Beispielsweise scheint die Hypermethylierung des Promotors der Glutathion-S-Transferase der pi-Klasse (einem Protein, das in der normalen Prostata exprimiert wird, aber bei > 90% der Prostatakarzinome nicht) die Transkription dieses Gens permanent stumm zu schalten, und ist die am häufigsten festgestellte genomische Veränderung bei Prostatakarzinomen (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Diese Veränderung ist darüber hinaus in mindestens 70% der Fälle einer hochgradigen intraepithelialen Prostataneoplasie (PIN) vorhanden (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998,7: 531-536). In einem anderen Beispiel wird die Expression des tumorspezifischen Gens LAGE-I (das in normalem Gewebe nicht exprimiert ist, aber bei 25–50% der Prostatakarzinome) in lymphoblastoiden Zellen durch Desoxyazacytidin induziert, was nahe legt, dass die Expression im Tumor die Folge einer Demethylierung ist (Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Assays zum Untersuchen des Methylierungsstatus bekannt. Beispielsweise können bei Hybridisierungsansätzen vom Southern-Typ methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme verwendet werden, die nicht in der Lage sind, Sequenzen mit methylierten CpG-Stellen zu spalten, um den Methylierungsstatus von CpG-Inseln zu untersuchen. Darüber hinaus kann eine MSP (methylierungsspezifische PCR) schnell ein Profil des Methylierungsstatus aller in einer CpG-Insel eines bestimmten Gens vorhandenen CpG-Stellen erstellen. Dieser Vorgang umfasst zunächst die Modifizierung von DNA durch Natriumbisulfit (bei der alle nicht methylierten Cytosine zu Uracil umge wandelt werden), gefolgt von einer Amplifizierung unter Verwendung von Primern, die für methylierte versus nicht-methylierte DNA spezifisch sind. Es existieren auch Protokolle, die eine Methylierungsinterferenz (Methylation Interference) beinhalten, beispielsweise in Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. Hrsg., 1995.
Die Genamplifizierung stellt ein weiteres Verfahren zur Feststellung des Status von 103P2D6 dar. Genamplifizierung wird direkt in einer Probe gemessen, beispielsweise durch konventionelles Southern Blotting oder Northern Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205), durch Dot Blotting (DNA-Analyse) oder durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereit gestellten Sequenzen. Alternativ werden Antikörper verwendet, die spezifische Duplexe (Doppelstränge) erkennen, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper selbst sind markiert und der Assay wird durchgeführt, indem der Duplex an eine Fläche gebunden ist, so dass nach Ausbildung des Duplex auf der Fläche das Vorhandensein von an den Duplex gebundenem Antikörper festgestellt werden kann.
Gewebebiopsien und peripheres Blut können geeignet auf Vorhandensein von Krebszellen untersucht werden, indem beispielsweise Northern Blot, Dot Blot oder RT-PCR-Analyse verwendet werden, um die Expression von 103P2D6 festzustellen. Das Vorhandensein von 103P2D6-mRNA, die sich durch RT-PCR amplifizieren lässt, liefert einen Hinweis auf das Vorhandensein von Krebs. RT-PCR-Assays sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Derzeit werden RT-PCR-Nachweistests für Tumorzellen im peripheren Blut für die Anwendung bei der Diagnose und bei der Behandlung einer Reihe von soliden Tumoren des Menschen untersucht. Auf dem Gebiet der Prosta ta-Onkologie gehören dazu RT-PCR-Assays für die Detektion von Zellen, die PSA und PSM exprimieren (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem 41: 1687-1688).
Ein weiterer Aspekt ist die Bestimmung der Anfälligkeit eines Individuums für die Entwicklung von Krebs. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Vorhersagen der Anfälligkeit für Krebs das Nachweisen von 103P2D6-mRNA oder 103P2D6-Protein in einer Gewebeprobe, wobei das Vorhandensein eine Anfälligkeit für Krebs anzeigt, wobei der Grad der Expression von 103P2D6-mRNA mit dem Grad der Anfälligkeit korreliert. In einer spezifischen Ausführungsform wird das Vorhandensein von 103P2D6 in Prostatagewebe oder anderem Gewebe untersucht, wobei das Vorhandensein von 103P2D6 in der Probe einen Hinweis auf Anfälligkeit für Prostatakrebs liefert (oder auf die Ausbildung oder das Vorhandensein eines Prostatatumors). Entsprechend kann die Integrität von 103P2D6-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe untersucht werden, um Perturbationen in der Struktur dieser Moleküle, wie beispielsweise Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen, zu identifizieren. Das Vorhandensein von mindestens einer Perturbation in 103P2D6-Genprodukten in der Probe ist ein Hinweis auf eine Anfälligkeit für Krebs (oder auf die Ausbildung oder das Vorhandensein eines Tumors).
Es sind auch Verfahren zur Messung der Tumoraggressivität beschrieben. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Messung der Tumoraggressivität das Bestimmen der Menge an von Tumorzellen exprimierter 103P2D6-mRNA oder exprimiertem 103P2D6-Protein, das Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an 103P2D6-mRNA oder 103P2D6-Protein, die in einem demselben Individuum entnommenen, entsprechenden normalen Gewebe oder in einer Referenzprobe aus normalem Gewebe exprimiert wird, wobei das Maß der Ex pression von 103P2D6-mRNA oder 103P2D6-Protein in der Tumorprobe relativ zu der normalen Probe den Grad der Aggressivität angibt. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Aggressivität eines Tumors bestimmt, indem festgestellt wird, in welchem Maß 103P2D6 in den Tumorzellen exprimiert wird, wobei ein höheres Maß an Expression einen aggressiveren Tumor anzeigt. Eine andere Ausführungsform ist die Evaluierung der Integrität von 103P2D6-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe, um Perturbationen in der Struktur dieser Moleküle wie beispielsweise Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen zu identifizieren. Das Vorhandensein von mindestens einer Perturbation deutet auf einen aggressiveren Tumor hin.
Eine weitere Ausführungsform betrifft Verfahren zum Beobachten des Fortschreitens eines Malignoms in einem Individuum über die Zeit. In einer Ausführungsform umfassen Verfahren zum Beobachten des Fortschreitens eines Malignoms in einem Individuum über die Zeit das Bestimmen der Menge an von Zellen in einer Probe des Tumors exprimierter 103P2D6-mRNA oder exprimiertem 103P2D6-Protein, das Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an 103P2D6-mRNA oder 103P2D6-Protein, die in einer demselben Individuum zu einem anderen Zeitpunkt entnommenen, äquivalenten Gewebeprobe exprimiert wird, wobei das Maß der Expression von 103P2D6-mRNA oder 103P2D6-Protein in der Tumorprobe über die Zeit Informationen über das Fortschreiten der Krebserkrankung liefert. In einer spezifischen Ausführungsform wird das Fortschreiten einer Krebserkrankung bestimmt, indem die 103P2D6-Expression in den Tumorzellen über die Zeit bestimmt wird, wobei eine verstärkte Expression über die Zeit das Fortschreiten der Krebserkrankung anzeigt. Es kann auch die Integrität von 103P2D6-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe untersucht werden, um Perturbationen in der Struktur dieser Moleküle wie beispielsweise Insertionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen zu identifizieren, wobei das Vorhandensein von mindestens einer Perturbation auf das Fortschreiten der Krebserkrankung hinweist.
Die obigen diagnostischen Ansätze können mit einem beliebigen aus einem breiten Spektrum an aus dem Stand der Technik bekannten prognostischen und diagnostischen Protokollen kombiniert werden. Beispielsweise betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung Verfahren zum Beobachten einer Koinzidenz zwischen der Expression des 103P2D6-Gens und von 103P2D6-Genprodukten (bzw. Perturbationen im 103P2D6-Gen und in 103P2D6-Genprodukten) und einem Faktor, der mit einem Malignom assoziiert ist, um den Status einer Gewebeprobe zu diagnostizieren und zu prognostizieren. Es können viele verschiedene, mit einem Malignom assoziierte Faktoren verwendet werden, beispielsweise die Expression von Genen, die mit einem Malignom assoziiert sind (z.B. bei Prostatakrebs die Expression von PSA, PSCA und PSM, etc.) sowie grobe zytologische Beobachtungen (siehe z.B. Bocking et al., 1984, Anal. Quant Cytol. 6(2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2): 223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6): 543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8): 918-24). Beispielsweise können Verfahren zum Beobachten einer Koinzidenz zwischen der Expression des 103P2D6-Gens und von 103P2D6-Genprodukten (bzw. Perturbationen im 103P2D6-Gen und in 103P2D6-Genprodukten) und einem anderen, mit einem Malignom assoziierten Faktor nützlich sein, da das Vorhandensein einer Reihe spezifischer Faktoren, deren Auftreten zeitlich mit dem Auftreten einer Krankheit zusammenfällt, Informationen liefert, die für das Diagnostizieren und Prognostizieren des Status einer Gewebeprobe ausschlaggebend sind.
In einer Ausführungsform umfassen Verfahren zum Beobachten einer Koinzidenz zwischen der Expression des 103P2D6-Gens und von 103P2D6-Genprodukten (bzw. Perturbationen im 103P2D6-Gen und in 103P2D6-Genprodukten) und ei nem anderen, mit einem Malignom assoziierten Faktor das Feststellen der Überexpression von 103P2D6-mRNA oder -Protein in einer Gewebeprobe, Feststellen der Überexpression von PSA-mRNA oder -Protein in einer Gewebeprobe (oder der PSCA- oder PSM-Expression) und das Beobachten einer Koinzidenz der Überexpression von 103P2D6-mRNA oder -Protein und PSA-mRNA oder -Protein (oder der Expression von PSCA oder PSM). In einer spezifischen Ausführungsform wird die Expression von 103P2D6- und PSA-mRNA in Prostatagewebe untersucht, wobei die Koinzidenz der Überexpression von 103P2D6- und PSA-mRNA in der Probe auf das Vorhandensein von Prostatakrebs, auf eine Anfälligkeit für Prostatakrebs oder auf die Ausbildung oder den Zustand eines Prostatatumors hinweist.
Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren der Expression von 103P2D6-mRNA oder -Protein sind hierin beschrieben, und Standardtechnologien zum Nachweis und zur Quantifizierung von Nukleinsäure und Protein sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Standardverfahren für den Nachweis und die Quantifizierung von 103P2D6-mRNA umfassen In-situ-Hybridisierung unter Verwendung markierter 103P2D6-Riboprobes, Northern Blot und verwandte Techniken unter Verwendung von 103P2D6-Polynukleotidsonden, RT-PCR-Analyse unter Verwendung von für 103P2D6 spezifischen Primern und andere Nachweisverfahren vom Amplifikationstyp, wie beispielsweise verzweigte (branched) DNA, SISBA, TMA und dergleichen. In einer spezifischen Ausführungsform wird halbquantitative RT-PCR verwendet, um die Expression von 103P2D6-mRNA festzustellen und zu quantifizieren. Für diesen Zweck kann eine beliebige Anzahl von Primern verwendet werden, die 103P2D6 amplifizieren können, einschließlich unter anderem der verschiedenen Primersätze, die hierin spezifisch beschrieben sind. In einer spezifischen Ausführungsform können in einem immunhistochemischen Assay mit Gewebebiopsien polyklonale oder monoklonale Antikörper ver wendet werden, die spezifisch mit dem 103P2D6-Wildtypprotein reagieren.
IX.) IDENTIFIZIERUNG VON MOLEKÜLEN, DIE MIT 103P2D6 INTERAGIEREN
Das hierin beschriebene 103P2D6-Protein und die hierin beschriebenen 103P2D6-Nukleinsäuresequenzen ermöglichen einem Fachmann die Identifizierung von Proteinen, kleinen Molekülen und anderen Stoffen, die mit 103P2D6 interagieren, sowie Signalwege, die von 103P2D6 aktiviert werden, mit einem beliebigen aus einer Vielzahl von im Stand der Technik anerkannten Protokollen. Beispielsweise kann eines der so genannten „Interaction Trap"-Systeme (auch als „Two Hybrid"-Assay bezeichnet) verwendet werden. Bei solchen Systemen findet durch Interaktion von Molekülen die Rekonstitution eines Transkriptionsfaktors statt, der die Expression eines Reportergens steuert, woraufhin die Expression des Reportergens untersucht wird. Andere Systeme identifizieren Protein-Protein-Interaktionen durch Rekonstitution eines eukaryotischen Transkriptionsaktivators, siehe z.B. US-Patent Nr. 5.955.280 , erteilt am 21. September 1999, 5.925.523 , erteilt am 20. Juli 1999, 5.846.722 , erteilt am 8. Dezember 1998, und 6.004.746 , erteilt am 21. Dezember 1999.
Alternativ können Peptidbibliotheken durchsucht werden, um Moleküle zu identifizieren, die mit 103P2D6-Proteinsequenzen interagieren. Bei solchen Verfahren werden Peptide, die an ein Molekül wie 103P2D6 binden, identifiziert, indem Bibliotheken durchsucht werden, welche eine zufällige oder kontrollierte Sammlung von Aminosäuren kodieren. Von den Bibliotheken exprimierte Peptide werden als Fusionsproteine von Bakteriophagen-Hüllproteinen exprimiert, und die Bakteriophagenpartikel werden anschließend gegen das relevante Protein getestet.
Entsprechend werden so Peptide mit einem breiten Anwendungsspektrum, beispielsweise therapeutische, prognostische oder diagnostische Reagenzien, ohne jegliche vorherige Information über die Struktur des erwarteten Liganden oder Rezeptormoleküls identifiziert. Typische Peptidbibliotheken und Durchsuchungsverfahren, die zur Identifizierung von Molekülen, die mit 103P2D6-Proteinsequenzen interagieren, verwendet werden können, sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5.723.286 , erteilt am 3. März 1998, und 5.733.731 , erteilt am 31. März 1998, beschrieben.
Alternativ werden Zelllinien verwendet, die 103P2D6 exprimieren, um von 103P2D6 vermittelte Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren. Solche Interaktionen lassen sich anhand von Immunpräzipitationstechniken untersuchen (siehe z.B. Hamilton BJ, et al. Biochem Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646-51). Das 103P2D6-Protein kann aus 103P2D6 exprimierenden Zelllinien mithilfe von Anti-103P2D6-Antikörpern immunpräzipitiert werden. Alternativ können Antikörper gegen einen His-Marker (His-Tag) in einer Zelllinie verwendet werden, die gentechnisch verändert wurde, um 103P2D6 zu exprimieren (oben erwähnte Vektoren). Der immunpräzipitierte Komplex kann mittels Verfahren wie Western Blotting, ³⁵S-Methionin-Markierung von Proteinen, Proteinmikrosequenzierung, Silberfärbung und zweidimensionaler Gelelektrophorse hinsichtlich einer Assoziierung mit Protein untersucht werden.
Kleine Moleküle und Liganden, die mit 103P2D6 interagieren, können mittels verwandter Ausführungsformen solcher Screening-Assays identifiziert werden. Beispielsweise können kleine Moleküle identifiziert werden, welche die Proteinfunktion stören, einschließlich Moleküle, die die Fähigkeit von 103P2D6 zur Vermittlung von Phosphorylierung und Dephosphorylierung, Second-Messenger-Signalübertragung oder Tumorgenese stören. Entsprechend können Liganden, welche die Funktion von 103P2D6 regulieren, auf Basis ihrer Fähigkeit, 103P2D6 zu binden und ein Reporterkonstrukt zu aktivieren, identifiziert werden. Typische Verfahren sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5.928.868 , erteilt am 27. Juli 1999, erläutert, und umfassen Verfahren zum Ausbilden von Hybridliganden, bei denen mindestens ein Ligand ein kleines Molekül ist. In einer veranschaulichenden Ausführungsform werden Zellen verwendet, die nach gentechnischer Veränderung ein Fusionsprotein aus 103P2D6 und einem DNA-bindenden Protein exprimieren, um gleichzeitig ein Fusionsprotein aus einem Hybridliganden/kleinen Molekül und einem Transkriptionsaktivatorprotein aus einer cDNA-Bibliothek zu exprimieren. Die Zellen enthalten darüber hinaus ein Reportergen, dessen Expression auf die Nähe des ersten und zweiten Fusionsproteins zueinander konditioniert ist, d. h. auf ein Ereignis, das nur dann stattfindet, wenn der Hybridligand an Zielstellen auf beiden Hybridproteinen bindet. Zellen, die das Reportergen exprimieren, werden selektiert, und das unbekannte kleine Molekül bzw. der unbekannte Ligand werden identifiziert. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Aktivatoren und Inhibitoren von 103P2D6.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung umfasst ein Verfahren des Screenings auf ein Molekül, das mit einer in 2 und 3 gezeigten 103P2D6-Aminosäuresequenz interagiert, welches die folgenden Schritte umfasst: Kontaktierens einer Population von Molekülen mit der 103P2D6-Aminosäuresequenz, Interagierenlassen der Population von Molekülen und der 103P2D6-Aminosäuresequenz unter Bedingungen, die eine Interaktion ermöglichen, Bestimmen des Vorhandenseins eines Moleküls, das mit der 103P2D6-Aminosäuresequenz interagiert, und anschließendes Trennen von Molekülen, die nicht mit der 103P2D6-Aminosäuresequenz interagieren, von Molekülen, bei denen dies der Fall ist. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren des Weiteren das Reinigen eines Moleküls, das mit der 103P2D6- Aminosäuresequenz interagiert. Das identifizierte Molekül kann verwendet werden, um eine von 103P2D6 durchgeführte Funktion zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die 103P2D6-Aminosäuresequenz mit einer Bibliothek von Peptiden kontaktiert.
X.) THERAPEUTISCHE VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN
Die Identifikation von 103P2D6 als Protein, das normalerweise in einem begrenzten Satz von Geweben, aber auch in einem Prostatakarzinom und in anderen Karzinomen exprimiert wird, eröffnet eine Anzahl therapeutischer Strategien für die Behandlung solcher Krebserkrankungen. Wie hierin erläutert, ist es möglich, dass 103P2D6 als Transkriptionsfaktor fungiert, der an der Aktivierung von Tumor-fördernden Genen oder an der Unterdrückung von Genen beteiligt ist, die eine Tumorgenese blockieren.
Entsprechend sind für Patienten, die an einem Karzinom leiden, das 103P2D6 exprimiert, therapeutische Ansätze geeignet, welche die Aktivität des 103P2D6-Proteins hemmen. Diese therapeutischen Ansätze fallen generell in zwei Klassen. Eine Klasse umfasst Verfahren zum Hemmen der Bindung oder Assoziierung des 103P2D6-Proteins mit seinem Bindungspartner oder mit anderen Proteinen. Die andere Klasse umfasst verschiedene Verfahren zum Hemmen der Transkription des 103P2D6-Gens oder der Translation von 103P2D6-mRNA.
X.A.) 103P2D6 als Ziel für eine Therapie auf Antikörper basis
103P2D6 ist ein attraktives Ziel für therapeutische Strategien auf Antikörperbasis. Aus dem Stand der Technik ist eine Reihe von Antikörperstrategien bekannt, um extra- und intrazelluläre Moleküle anzugreifen (siehe z.B. Komplement- und ADCC-vermitteltes Killing sowie die Verwendung von intrazellulären Antikörpern (Intrabodies)). Da 103P2D6 von Krebszellen verschiedener Abstammung exprimiert und von den entsprechenden normalen Zellen nicht exprimiert wird, werden 103P2D6-immunreaktive Zusammensetzungen für die systemische Verabreichung hergestellt, die hervorragende Empfindlichkeit ohne durch Bindung der immunreaktiven Zusammensetzung an Nicht-Zielorgane und -Gewebe verursachte toxische, unspezifische und/oder nicht-zielgerichtete Effekte aufweisen. Antikörper, die spezifisch mit Domänen von 103P2D6 reagieren, sind geeignet, um 103P2D6 exprimierende Karzinome systemisch zu behandeln, entweder als Konjugate mit einem Toxin oder therapeutischen Agens oder als nackte Antikörper mit der Fähigkeit zur Hemmung der Zellproliferation oder -funktion.
Antikörper gegen 103P2D6 können derart einem Patienten eingeführt werden, dass der Antikörper an 103P2D6 bindet und eine Funktion moduliert, beispielsweise eine Interaktion mit einem Bindungspartner, und somit die Vernichtung der Tumorzellen vermittelt und/oder das Wachstum der Tumorzellen hemmt. Mechanismen, durch welche solche Antikörper einen therapeutischen Effekt ausüben, können komplementvermittelte Zytolyse, antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität, Modulierung der physiologischen Funktion von 103P2D6, Hemmung der Ligandenbindung oder von Signalübertragungswegen, Modulierung der Tumorzelldifferenzierung, Veränderung von Tumorangiogenesefaktorprofilen und/oder Apoptose umfassen.
Ein Fachmann weiß, dass Antikörper verwendet werden können, um immunogene Moleküle, wie beispielsweise eine immunogene Region der in 2 gezeigten 103P2D6-Sequenz, spezifisch anzugreifen und zu binden. Darüber hinaus ist einem Fachmann bekannt, dass die Konjugation von Antikörpern an zytotoxische Stoffe Routine ist. Werden zytotoxische und/oder therapeutische Stoffe direkt zu Zellen transportiert, beispielsweise, indem sie an Antikörper konjugiert werden, die für ein von dieser Zelle exprimiertes Mo lekül (z.B. 103P2D6) spezifisch sind, übt das zytotoxische Agens seinen bekannten biologischen Effekt (d. h. Zytotoxizität) auf diese Zellen aus.
Aus dem Stand der Technik ist ein breites Spektrum an Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung von Konjugaten aus Antikörper und zytotoxischem Agens bekannt, um Zellen zu töten. Im Kontext mit Krebserkrankungen umfassen typische Verfahren das Verabreichen einer biologisch wirksamen Menge eines Konjugates, das ein mit einem gezielt wirkenden Agens (z.B. einem Anti-103P2D6-Antikörper) verknüpftes, ausgewähltes, zytotoxisches und/oder therapeutisches Agens umfasst, welches an einen Marker (z.B. 103P2D6) bindet, der exprimiert, zugänglich für Bindung oder auf den Zelloberflächen lokalisiert ist, an ein Tier mit einem Tumor. Eine typische Ausführungsform ist ein Verfahren des Abgebens eines zytotoxischen und/oder therapeutischen Agens an eine Zelle, die 103P2D6 exprimiert, umfassend das Konjugieren des zytotoxischen Agens mit einem Antikörper, der immunspezifisch an ein 103P2D6-Epitop bindet, und das Exponieren der Zelle gegenüber dem Antikörper-Agens-Konjugat. Eine andere veranschaulichende Ausführungsform ist ein Verfahren des Behandelns eines Individuums, das vermutlich an einer metastasierten Krebserkrankung leidet, umfassend den Schritt des parenteralen Verabreichens einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das Individuum, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers aufweist, der mit einem zytotoxischen und/oder therapeutischen Agens konjugiert ist.
Eine Krebsimmuntherapie unter Verwendung von Anti-103P2D6-Antikörper kann nach verschiedenen Ansätzen erfolgen, die bei der Behandlung anderer Arten von Krebs erfolgreich angewandt worden sind, einschließlich unter anderem Kolonkrebs (Arlen et al., 1998, Crit Rev. Immunol. 18: 133-138), multiples Myelom (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), Magen krebs (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), B-Zelllymphom (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), Leukämie (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), Kolorektalkrebs (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54: 6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55: 4398-4403) und Brustkrebs (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127). Einige therapeutische Ansätze umfassen das Konjugieren eines nackten Antikörpers mit einem Toxin, beispielsweise das Konjugieren von ¹³¹I mit Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituxan^TM, IDEC Pharmaceuticals Corp.), während andere die gemeinsame Verabreichung von Antikörpern und anderen therapeutischen Stoffen umfassen, wie beispielsweise Herceptin^TM (Trastuzumab) mit Paclitaxel (Genentech, Inc.). Zur Behandlung von Prostatakrebs können beispielsweise 103P2D6-Antikörper in Verbindung mit Bestrahlung, Chemotherapie oder Hormonablation verabreicht werden.
Obgleich eine Therapie mit 103P2D6-Antikörpern in allen Stadien einer Krebserkrankung anwendbar ist, kann eine Antikörpertherapie insbesondere bei fortgeschrittenen oder metastasierten Krebserkrankungen geeignet sein. Die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Antikörpertherapie ist für Patienten angezeigt, die mindestens einen Zyklus einer Chemotherapie erhalten haben. Alternativ wird eine Antikörpertherapie bei Patienten, die keine chemotherapeutische Behandlung erhalten haben, mit einem chemotherapeutischen oder strahlentherapeutischen Behandlungsregime kombiniert. Darüber hinaus kann eine Antikörpertherapie die Anwendung reduzierter Dosierungen einer begleitenden Chemotherapie ermöglichen, insbesondere bei Patienten, die die Toxizität des Chemotherapeutikums nicht sehr gut vertragen.
Krebspatienten können hinsichtlich des Vorhandenseins und des Grades der Expression von 103P2D6 untersucht werden, vorzugsweise unter Zuhilfenahme von immunhistochemischen Untersuchungen von Tumorgewebe, quantitativer 103P2D6-Bildgebung oder anderen Techniken, welche das Vorhandensein und den Grad der 103P2D6-Expression zuverlässig anzeigen. Für diesen Zweck wird die immunhistochemische Analyse von Tumorbiopsien oder chirurgischen Proben bevorzugt. Verfahren zur immunhistochemischen Analyse von Tumorgeweben sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Monoklonale Anti-103P2D6-Antikörper, die Prostatakrebs und andere Krebserkrankungen behandeln, umfassen solche, die eine potente Immunantwort gegen den Tumor auslösen, oder solche, die direkt zytotoxisch sind. Diesbezüglich können monoklonale Anti-103P2D6-Antikörper (mAbs) die Tumorzelllyse entweder durch Mechanismen der komplementvermittelten oder der antikörperabhängigen Zellzytotoxizität (Antibody-Dependent Cell cytotoxicity, ADCC) hervorrufen, die beide für die Interaktion mit Fc-Rezeptorstellen der Effektorzelle auf Komplementproteinen einen intakten Fc-Anteil des Immunglobulinmoleküls benötigen. Darüber hinaus sind Anti-103P2D6-mAbs, die eine direkte biologische Wirkung auf das Tumorwachstum ausüben, zur Behandlung von Karzinomen geeignet, die 103P2D6 exprimieren. Mechanismen, über die zytotoxische mAbs direkt wirken, umfassen: Hemmung des Zellwachstums, Modulierung der Zelldifferenzierung, Modulierung der Tumorangiogenesefaktorprofile und die Induktion von Apoptose. Der bzw. die Mechanismen, über die ein bestimmter Anti-103P2D6-mAb eine gegen einen Tumor gerichtete Wirkung ausübt, wird bzw. werden anhand einer beliebigen Anzahl von In-vitro-Tests zur Untersuchung von Zelltod bestimmt, wie beispielsweise ADCC, ADMMC, komplementvermittelte Zelllyse und so weiter, wie im Stand der Technik generell bekannt ist.
Bei manchen Patienten kann die Anwendung muriner oder sonstiger nicht-humaner monoklonaler Antikörper oder von chimären Mensch/Maus-mAbs mittelstarke bis starke Immunreaktionen gegen den nicht-menschlichen Antikörper auslösen. Dies kann dazu führen, dass der Antikörper aus dem Blut kreislauf entfernt und die Wirksamkeit reduziert wird. In den meisten schweren Fällen kann eine solche Immunreaktion zur extensiven Ausbildung von Immunkomplexen führen, die potenziell zu Nierenversagen führen können. Entsprechend sind bei den erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren solche monoklonalen Antikörper bevorzugt, die entweder gänzlich human oder humanisiert sind und die an das 103P2D6-Zielantigen spezifisch mit hoher Affinität binden, aber in dem Patienten geringe oder keine Antigenität aufweisen.
Therapeutische Verfahren erwägen die Verabreichung eines einzelnen Anti-103P2D6-Antikörpers sowie von Kombinationen bzw. Cocktails verschiedener mAbs. Solche mAb-Cocktails können, insofern, als sie mAbs enthalten, die verschiedene Zielepitope haben, verschiedene Effektormechanismen nutzen oder direkt zytotoxische mAbs mit mAbs kombinieren, die auf Immuneffektorfunktionalität beruhen, gewisse Vorteile haben. Solche mAbs in Kombination können synergistische therapeutische Wirkungen aufweisen. Darüber hinaus können Anti-103P2D6-mAbs in Begleitung mit anderen therapeutischen Modalitäten verabreicht werden, einschließlich unter anderem mit verschiedenen Chemotherapeutika, Androgenblockern, Immunmodulatoren (z.B. IL-2, GM-CSF), einem chirurgischen Eingriff oder einer Bestrahlung. Die Anti-103P2D6-mAbs werden in ihrer „nackten" bzw. unkonjugierten Form verabreicht oder können mindestens ein therapeutisches Agens aufweisen, das mit ihnen konjugiert ist.
Anti-103P2D6-Antikörperformulierungen werden auf jedem Weg verabreicht, der die Antikörper an eine Tumorzelle abgeben kann. Verabreichungswege umfassen unter anderem intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, in den Tumor, intradermal und dergleichen. Die Behandlung umfasst generell eine wiederholte Verabreichung der Anti-103P2D6-Antikörperzubereitung über einen akzeptablen Verabreichungsweg, wie beispielsweise durch intravenöse Injektion (i.v.), typi scherweise in einer Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht. Im Allgemeinen sind Dosen im Bereich von 10–500 mg mAb pro Woche wirksam und gut verträglich.
Ausgehend von der klinischen Erfahrung mit dem mAb Herceptin bei der Behandlung von metastasiertem Brustkrebs stellt eine anfängliche Aufsättigungsdosis von etwa 4 mg/kg Patientenkörpergewicht i.v., gefolgt von wöchentlichen Dosen von etwa 2 mg/kg i.v., der Anti-103P2D6-mAb-Zubereitung ein akzeptables Dosierungsregime dar. Vorzugsweise wird die anfängliche Aufsättigungsdosis als Infusion über mindestens 90 Minuten verabreicht. Die periodische Erhaltungsdosis wird als Infusion über mindestens 30 Minuten verabreicht, vorausgesetzt, die erste Dosis wird gut vertragen. Wie einem Fachmann bekannt ist, kann das ideale Dosisregime im jeweiligen Fall von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden. Dazu gehören beispielsweise die Bindungsaffinität und die Halbwertszeit des verwendeten Ab bzw. der verwendeten mAbs, der Grad der 103P2D6-Expression in dem Patienten, wie viel abgeschiedenes 103P2D6-Antigen im Blutkreislauf vorhanden ist, die gewünschte Antikörperkonzentrationsstufe im Gleichgewichtszustand, die Behandlungshäufigkeit und der Einfluss von Chemotherapeutika oder anderen Stoffen, die in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren angewandt werden, sowie der Gesundheitszustand des jeweiligen Patienten.
Gegebenenfalls sollten die Patienten hinsichtlich der Menge an 103P2D6 in einer bestimmten Probe untersucht werden (z.B. hinsichtlich der Menge an zirkulierendem 103P2D6-Antigen und/oder an Zellen, die 103P2D6 exprimieren), um die Bestimmung des wirksamsten Dosierungsregimes, etc. zu unterstützen. Solche Untersuchungen werden auch zu Überwachungszwecken während der Behandlung angewandt und sind geeignet, um den Therapieerfolg in Kombination mit der Unter suchung anderer Parameter (wie beispielsweise den PSA-Serumspiegel bei der Therapie von Prostatakrebs) zu messen.
X.B.) Anti-Krebs-Impstoffe
Es sind Krebsimpfstoffe beschrieben, die ein mit 103P2D6 verwandtes Protein oder eine mit 103P2D6 verwandte Nukleinsäure umfassen. In Anbetracht der Expression von 103P2D6 verhindern und/oder behandeln Krebsimpfstoffe 103P2D6 exprimierende Zellen, ohne unspezifische Wirkungen auf Nicht-Zielgeweben zu bewirken. Die Verwendung eines Tumorantigens in einem Impfstoff, der humorale und/oder zellvermittelte Immunreaktionen, erzeugt, als Antikrebstherapie ist im Stand der Technik gut bekannt und wurde bei Prostatakrebs mit humanem PSMA und PAP-Immunogenen von Nagern angewandt (Hodge et at, 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117).
Es können genetische Immunisierungsverfahren angewandt werden, um prophylaktische oder therapeutische humorale und zelluläre Immunantworten gegen Krebszellen zu erzeugen, die 103P2D6 exprimieren. Konstrukte, die DNA umfassen, welche ein mit 103P2D6 verwandtes Protein/Immunogen und geeignete regulatorische Sequenzen kodiert, können direkt in den Muskel oder die Haut eines Individuums injiziert werden, so dass die Zellen des Muskels oder der Haut das Konstrukt aufnehmen und das kodierte 103P2D6-Protein/-Immunogen exprimieren. Alternativ umfasst ein Impfstoff ein mit 103P2D6 verwandtes Protein. Die Expression des mit 103P2D6 verwandten immunogenen Proteins ruft eine prophylaktische oder therapeutische humorale und zelluläre Immunität gegen Zellen hervor, die das 103P2D6-Protein tragen. Es können verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte prophylaktische und therapeutische genetische Immunisierungstechniken angewandt werden (zur Übersicht siehe die unter der Inter netadresse www.genweb.com veröffentlichten Informationen und Bezugsverweise).
Solche Verfahren können einfach praktiziert werden, indem ein mit 103P2D6 verwandtes Protein oder ein 103P2D6 kodierendes Nukleinsäuremolekül und rekombinante Vektoren verwendet werden, die das 103P2D6-Immunogen (das typischerweise eine Reihe von Antikörper- oder T-Zellepitopen aufweist) exprimieren und präsentieren können. Ein Fachmann weiß, dass im Stand der Technik ein breites Spektrum an Impfstoffsystemen zur Verabreichung von immunreakktiven Epitopen bekannt ist (siehe z.B. Herlyn et al., Ann Med 1999 Feb; 31(1): 66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun; 49(3): 123-32). Solche Verfahren des Erzeugens einer Immunantwort (z.B. humoral und/oder zellvermittelt) in einem Säuger umfassen in Kürze folgende Schritte: Aussetzen des Immunsystems eines Säugers gegenüber einem immunreaktiven Epitop (z.B. einem Epitop, das in dem in SEQ ID Nr.: 2 gezeigten 103P2D6-Protein vorhanden ist, oder ein Analog oder Homolog davon), so dass der Säuger eine Immunantwort erzeugt, die für dieses Epitop spezifisch ist (z.B. Antikörper erzeugt, die dieses Epitop spezifisch erkennen). Bei einem bevorzugten Verfahren enthält das 103P2D6-Immunogen ein biologisches Motiv.
ZTL-Epitope können mithilfe spezifischer Algorithmen zur Identifizierung von Peptiden innerhalb des 103P2D6-Proteins bestimmt werden, die optimal an spezifische HLA-Allele binden können (z.B. Tabelle IV (A) und Tabelle IV (B); Epimer^TM und Epimatrix^TM, Brown University (http://www.brown.edu/Research/TB-HIVLab/epimatrix/epimatrix.html); und BIMAS, (http://bimas.dcrt.nih.gov/). In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das 103P2D6-Immunogen mindestens eine Aminosäuresequenz, die anhand einer der aus dem Stand der Technik gut bekannten geeigneten Analysetechniken identifiziert worden ist, wie beispielsweise die in Tabelle V-XVIII gezeigten Sequenzen, oder ein Peptid aus 8, 9, 10 oder 11 Aminosäuren, die durch ein HLA-Klasse-I-Motiv spezifiziert sind (z.B. Tabelle IV (A)), und/oder ein Peptid aus mindestens 9 Aminosäuren, das ein HLA-Klasse-II-Motiv umfasst (z.B. Tabelle IV (B)). Wie im Stand der Technik anerkannt ist, besitzt die HLA-Klasse-I-Bindungsgrube (Binding Groove) im Wesentlichen ein geschlossenes Ende, so dass nur Peptide eines bestimmten Größenbereiches in die Grube passen und gebunden werden können; HLA-Klasse-I-Epitope sind generell 8, 9, 10 oder 11 Aminosäuren lang. Die HLA-Klasse-II-Bindungsgrube besitzt dagegen ein offenes Ende, daher können mindestens etwa 9 Aminosäuren von einem HLA-Klasse-II-Molekül gebunden werden. Aufgrund der Unterschiede der Bindungsgrube zwischen HLA-Klasse-I- und -II sind HLA-Klasse-I-Motive längenspezifisch, d. h. Position zwei eines Klasse-I-Motivs ist die zweite Aminosäure in Amino-zu-Carboxyl-Richtung des Peptids. Die Aminosäurepositionen in einem Klasse-II-Motiv beziehen sich nur aufeinander und nicht auf das ganze Peptid, d. h. es können zusätzliche Aminosäuren an das Amino- und/oder Carboxylende einer motivtragenden Sequenz hinzugefügt sein. HLA-Klasse-II-Epitope sind häufig 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Aminosäuren lang, können aber länger als 25 Aminosäuren sein.
Aus dem Stand der Technik ist ein breites Spektrum an Verfahren zum Erzeugen einer Immunantwort in einem Säuger bekannt (beispielsweise als erster Schritt bei der Erzeugung von Hybridomas). Verfahren des Erzeugens einer Immunantwort in einem Säuger umfassen das Aussetzen des Immunsystems des Säugers gegenüber einem immunogenen Epitop auf einem Protein (z.B. dem 103P2D6-Protein), so dass eine Immunantwort generiert wird. Eine typische Ausführungsform besteht aus einem Verfahren zum Erzeugen einer Immunantwort gegen 103P2D6 in einem Wirt, indem der Wirt mit einer ausreichenden Menge mindestens eines 103P2D6-Epitops für B-Zellen oder zytotoxische T-Zellen oder einem Analog davon in Kontakt gebracht wird; und mindestens einem periodischen Intervall danach, in dem der Wirt erneut mit dem 103P2D6-Epitop für B-Zellen oder zytotoxische T-Zellen oder dem Analog davon in Kontakt gebracht wird. Eine spezifische Ausführungsform besteht aus einem Verfahren des Erzeugens einer Immunantwort gegen ein mit 103P2D6 verwandtes Protein oder ein künstliches Multiepitop-Peptid, umfassend: Verabreichen eines 103P2D6-Immunogens (z.B. des 103P2D6-Proteins oder eines Peptidfragmentes davon, eines 103P2D6-Fusionsproteins oder eines Analogs, etc.) in einer Impfstoffzubereitung an einen Menschen oder einen anderen Säuger. Typischerweise enthalten solche Impfstoffzubereitungen des Weiteren ein geeignetes Adjuvans (siehe z.B. US-Patent Nr. 6.146.635 ) oder ein universelles Helferepitop, wie beispielsweise ein PADRE^TM-Peptid (Epimmune Inc., San Diego, CA; siehe z.B., Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 und Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92). Ein Alternativverfahren umfasst das Erzeugen einer Immunantwort in einem Individuum gegen ein 103P2D6-Immunogen durch: Verabreichen eines DNA-Moleküls, welches eine DNA-Sequenz aufweist, die ein 103P2D6-Immunogen kodiert, in vivo in einen Muskel oder die Haut des Körpers des Individuums, wobei die DNA-Sequenz funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, welche die Expression der DNA-Sequenz steuern, wobei das DNA-Molekül von Zellen aufgenommen, die DNA-Sequenz in den Zellen exprimiert und eine Immunantwort gegen das Immunogen erzeugt wird (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.962.428 ). Die DNA kann von einem infektiösen Agens dissoziiert sein. Gegebenenfalls wird auch ein Vermittlerstoff für genetische Impfstoffe verabreicht, wie beispielsweise anionische Lipide, Saponine, Lektine, Estrogenverbindungen, hydroxylierte niedere Alkyle, Dimethylsulfoxid und Harnstoff.
Zur Verabreichung eines mit 103P2D6 verwandten Nukleinsäuremoleküls werden somit virale Genabgabesysteme verwendet. Verschiedene virale Genabgabesysteme, die in der Ausübung der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem Kuhpocken (Vakzinia), Hühnerpocken (Fowlpox), Kanarienpocken (Canarypox), Adenovirus, Influenza, Poliovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Lentivirus und Sindbusvirus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663). Es können auch nichtvirale Abgabesysteme verwendet werden, indem nackte DNA, die ein mit 103P2D6 verwandtes Protein kodiert, in den Patienten eingeführt wird (z.B. intramuskulär oder intradermal), um eine Reaktion gegen den Tumor zu induzieren. In einer Ausführungsform wird die humane 103P2D6-cDNA in voller Länge verwendet. In einer anderen Ausführungsform werden 103P2D6-Nukleinsäuremoleküle verwendet, die spezifische Epitope für zytotoxische T-Lymphozyten (ZTL) und/oder Antikörper kodieren.
Es können auch verschiedene Ex-vivo-Strategien angewandt werden, um eine Immunantwort zu erzeugen. Ein Ansatz beinhaltet die Verwendung von Antigen präsentierenden Zellen (APC) wie beispielsweise dendritischen Zellen, um ein 103P2D6-Antigen dem Immunsystem eines Patienten zu präsentieren. Dendritische Zellen exprimieren MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle, B7-Costimulator und IL-12 und sind damit hoch spezialisierte Antigen präsentierende Zellen. Bei Prostatakrebs werden in einer klinischen Phase-I-Prüfung mit Peptiden des prostataspezifischen Membranantigens (PSMA) gepulste, autologe dendritische Zellen verwendet, um das Immunsystem der Prostatakrebspatienten zu stimulieren (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Dendritische Zellen können somit verwendet werden, um 103P2D6-Peptide im Kontext von MHC-Klasse-I- oder -II-Molekülen T-Zellen zu präsentieren. In einer Ausführungsform werden autologe dendritische Zellen mit 103P2D6-Peptiden gepulst, die an MHC-Klasse-I- und/oder -Klasse-II-Moleküle binden können. In einer anderen Ausführungsform werden dendritische Zellen mit dem kompletten 103P2D6-Protein gepulst. Eine weitere Ausführungsform umfasst die gentechnisch erzeugte Überexpression des 103P2D6-Gens in dendritischen Zellen mithilfe verschiedener Implementierungsvektoren aus dem Stand der Technik, wie beispielsweise Adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4; 17-25), Retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), Lentivirus, Adeno-assoziiertes Virus, DNA-Transfektion (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869) oder Transfektion von aus dem Tumor stammender RNA (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). Zellen, die 103P2D6 exprimieren, können außerdem gentechnisch verändert werden, um Immunmodulatoren wie beispielsweise GM-CSF zu exprimieren, und als Immunisierungsmittel eingesetzt werden.
In der Antikrebstherapie können auch Anti-103P2D6-Antikörper vom Antiidiotyp als Impfstoff zur Induktion einer Immunantwort gegen ein mit 103P2D6 verwandtes Protein exprimierende Zellen verwendet werden. Insbesondere die Erzeugung von Antiidiotyp-Antikörpern ist aus dem Stand der Technik gut bekannt; diese Verfahrensweise lässt sich einfach anpassen, um Anti-103P2D6-Antikörper vom Antiidiotyp herzustellen, die ein Epitop auf einem mit 103P2D6 verwandten Protein nachahmen (siehe beispielsweise Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al.. 1995, J. Clin. Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43: 65-76). Ein solcher Antiidiotyp-Antikörper kann bei Krebsimpfstoffstrategien verwendet werden.
XI.) HEMMUNG DER FUNKTION DES 103P2D6-PROTEINS
Es sind verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen für das Hemmen der Bindung von 103P2D6 an seinen Bindungspartner oder seine Assoziierung mit anderen Proteinen sowie Verfahren für das Hemmen der der Funktion von 103P2D6 beschrieben.
XI.A.) Hemmen von 103P2D6 mit intrazellulären Antikörpern
In einem Ansatz wird ein rekombinanter Vektor, der einzelkettige Antikörper kodiert, welche an 103P2D6 spezifisch binden, über Gentransfertechnologien in 103P2D6 exprimierende Zellen eingeführt. Entsprechend wird der kodierte einzelkettige Anti-103P2D6-Antikörper intrazellulär exprimiert, bindet an das 103P2D6-Protein und hemmt dadurch seine Funktion. Verfahren zum gentechnischen Herstellung solcher intrazellulärer Einzelkettenantikörper sind gut bekannt. Solche intrazellulären Antikörper, auch als „Intrabodies" bekannt", sind spezifisch auf ein bestimmtes Kompartiment in der Zelle gerichtet, was eine Kontrolle über den Schwerpunkt der inhibitorischen Aktivität der Behandlung bietet. Diese Technologie wurde im Stand der Technik erfolgreich angewandt (zur Übersicht siehe Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH Vol. 13). Intrabodies bewirken nachweislich praktisch eine Eliminierung der Expression von ansonsten zahlreich vorhandenen Zelloberflächenrezeptoren (siehe z.B. Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 2393123936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337).
Einzelkettenantikörper umfassen die variablen Domänen der schweren und der leichten Kette, die mit einem flexiblen Linkerpolypeptid verknüpft sind und als einzelnes Polypeptid exprimiert werden. Gegebenenfalls werden Einzelkettenantikörper als einzelkettiges Fragment der variablen Region exprimiert, das mit der konstanten Region der leichten Kette verknüpft ist. In rekombinante Polynukleotidvektoren, die solche Einzelkettenantikörper kodieren, werden gut bekannte intrazelluläre Trafficking-Signale gentechnisch eingefügt, um den Intrabody präzise und gezielt in das gewünschte intrazelluläre Kompartiment zu steuern. Bei spielsweise werden in Intrabodies für das endoplasmatische Retikulum (ER) gentechnisch ein Leader-Peptid und gegebenenfalls ein C-terminales ER-Retentionssignal eingebaut, wie beispielsweise das KDEL-Aminosäuremotiv. Intrabodies, die im Kern aktiv sein sollen, erhalten gentechnisch ein Kernlokalisierungssignal. Um den Intrabody an die zytosolische Seite der Plasmamembran zu binden, werden Lipideinheiten mit Intrabodies verknüpft. Intrabodies können auch auf eine Funktion im Zytosol ausgerichtet sein. Beispielsweise werden zytosolische Intrabodies verwendet, um Faktoren im Zytosol abzusondern und sie so daran zu hindern, an ihren natürlichen Bestimmungsort in der Zelle transportiert zu werden.
In einer Ausführungsform werden Intrabodies verwendet, um 103P2D6 im Kern zu fangen, wodurch seine Aktivität im Kern verhindert wird. In solche 103P2D6-Intrabodies werden Signale gentechnisch eingebaut, die auf den Kern ausgerichtet sind, um das gewünschte Targeting zu erreichen. Solche 103P2D6-Intrabodies sind ausgelegt, um spezifisch an eine bestimmte 103P2D6-Domäne zu binden. In einer anderen Ausführungsform werden zytosolische Intrabodies verwendet, die spezifisch an das 103P2D6-Protein binden, um zu verhindern, dass 103P2D6 in den Kern gelangt, wodurch verhindert wird, dass es im Kern biologisch aktiv ist (z.B. wird verhindert, dass 103P2D6 Transkriptionskomplexe mit anderen Faktoren bildet).
Um die Expression solcher Intrabodies spezifisch auf bestimmte Zellen zu richten, wird die Transkription des Intrabodies spezifisch unter die regulatorische Kontrolle eines geeigneten tumorspezifischen Promotors und/oder Enhancers gestellt. Um eine spezifische Intrabody-Expression in der Prostata zu erreichen, können beispielsweise der PSA-Promotor und/oder -Promotor/Enhancer verwendet werden (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5.919.652 , erteilt am 6. Juli 1999).
XI.B.) Hemmung von 103P2D6 mit rekombinanten Proteinen
Bei einem anderen Ansatz binden rekombinante Moleküle an 103P2D6 und hemmen dadurch die Funktion von 103P2D6. Beispielsweise verhindern oder hemmen diese rekombinanten Moleküle, dass 103P2D6 Zugang zu seine(m)(n) Bindungspartner(n) erhält/an seine(n) Bindungspartner bindet oder mit anderen Proteinen assoziiert. Solche rekombinanten Moleküle können beispielsweise den bzw. die reaktiven Teil(e) eines spezifischen 103P2D6-Antikörpermoleküls enthalten. In einer bestimmten Ausführungsform wird die 103P2D6-Bindungsgdomäne eines 103P2D6-Bindungspartners gentechnisch in ein dimeres Fusionsprotein eingefügt, wodurch das Fusionsprotein zwei 103P2D6-Ligandenbindungsdomänen aufweist, die mit dem Fc-Anteil eines humanen IgG wie beispielsweise humanem IgG1 verknüpft sind. Ein solcher IgG-Anteil kann beispielsweise die CH2- und CH3-Domänen und die Scharnierregion enthalten, aber nicht die C_H1-Domäne. Solche dimeren Fusionsproteine werden in löslicher Form an Patienten verabreicht, die an einer Krebserkrankung leiden, welche mit der Expression von 103P2D6 assoziiert ist, wodurch das dimere Fusionsprotein spezifisch an 103P2D6 bindet und die Interaktion von 103P2D6 mit einem Bindungspartner blockiert. Solche dimeren Fusionsproteine werden weiter zu multimeren Proteinen kombiniert, wobei bekannte Antikörperverknüpfungstechnologien zur Anwendung kommen.
XI.C.) Hemmung der Transkription oder Translation von 103P2D6
Die vorliegende Erfindung umfasst auch verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen zum Hemmen der Transkription des 103P2D6-Gens. Entsprechend stellt die Erfindung auch Verfahren und Zusammensetzungen zum Hemmen der Translation der 103P2D6-mRNA zu Protein bereit.
Bei einem Ansatz umfasst ein Verfahren für das Hemmen der Transkription des 103P2D6-Gens das Inkontaktbringen des 103P2D6-Gens mit einem 103P2D6-Antisense-Polynukleotid. Bei einem anderen Ansatz umfasst ein Verfahren für das Hemmen der Translation von 103P2D6-mRNA das Inkontaktbringen der 103P2D6-mRNA mit einem Antisense-Polynukleotid. Solche Antisense- und Ribozym-basierten Verfahren können auch auf die regulatorischen Regionen des 103P2D6-Gens ausgerichtet sein, wie beispielsweise auf die Promotor- und/oder Enhancerelemente von 103P2D6. Entsprechend werden Proteine, die einen 103P2D6-Gentranskriptionsfaktor hemmen können, verwendet, um die Transkription von 103P2D6-mRNA zu hemmen. Die verschiedenen Polynukleotide und Zusammensetzungen, die bei den oben erwähnten Verfahren nützlich sind, sind oben beschrieben. Die Verwendung von Antisense- und Ribozymmolekülen zur Hemmung von Transkription und Translation sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Es sind auch andere Faktoren, welche die Transkription von 103P2D6 hemmen, indem sie in die transkriptionelle Aktivierung von 103P2D6 eingreifen, geeignet, um Karzinome zu behandeln, die 103P2D6 exprimieren. Entsprechend sind Faktoren, die in die Prozessierung von 103P2D6 eingreifen, geeignet, um Karzinome zu behandeln, die 103P2D6 exprimieren. Krebsbehandlungsverfahren, bei denen solche Faktoren verwendet werden, sind im Umfang der Erfindung ebenfalls enthalten.
XI.D.) Allgemeine Überlegungen für therapeutische Strategien
Gentransfer und Gentherapietechnologien können verwendet werden, um therapeutische Polynukleotidmoleküle an Tumorzellen abzugeben, die 103P2D6 synthetisieren (d. h. Antisense, Ribozym, Polynukleotide kodierende Intrabodies und andere 103P2D6 hemmende Moleküle). Aus dem Stand der Tech nik ist eine Anzahl von Gentherapieansätzen bekannt. Mithilfe solcher Gentherapieansätze können rekombinante Vektoren, die 103P2D6-Antisense-Polynukleotide kodieren, Ribozyme, zum Eingreifen in die Transkription von 103P2D6 geeignete Faktoren und so weiter an Tumorzielzellen abgegeben werden.
Die obigen therapeutischen Ansätze können mit einem beliebigen aus einem breiten Spektrum an chirurgischen, chemotherapeutischen oder strahlentherapeutischen Therapieregimes kombiniert werden. Die therapeutischen Ansätze der Erfindung können die Anwendung reduzierter Dosierungen einer Chemotherapie (oder anderer Therapien) und/oder eine weniger häufige Verabreichung ermöglichen, was ein Vorteil für alle Patienten und insbesondere für solche ist, welche die Toxizität des Chemotherapeutikums nicht gut vertragen.
Die gegen den Tumor gerichtete Aktivität einer bestimmten Zusammensetzung (z.B. Antisense, Ribozym, Intrabody) oder einer Kombination solcher Zusammensetzungen lässt sich mithilfe verschiedener In-vitro- und In-vivo-Assaysysteme untersuchen. In-vitro-Assays, die therapeutische Aktivität untersuchen, umfassen Zellwachstumsassays, Weichagarassays und andere Assays, die eine tumorbegünstigende Aktivität anzeigen, Bindungsassays, die bestimmen können, in welchem Maß eine therapeutische Zusammensetzung die Bindung von 103P2D6 an einen Bindungspartner hemmt, etc.
In vivo kann der Effekt einer therapeutischen Zusammensetzung für 103P2D6 in einem geeigneten Tiermodell untersucht werden. Beispielsweise können xenogene Prostatakrebsmodelle verwendet werden, wobei humane Prostatakarzinomexplantate oder passagierte Xenograftgewebe in immunkompromitierte Tiere wie beispielsweise Nackt- oder SCID-Mäuse eingeführt werden (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Beispielsweise beschreibt die PCT-Patentanmeldung WO 98/16628 , Sawyers et al., veröffentlich am 23. April 1998, verschiedene Xenograft-Modelle des Prostatakrebses des Menschen, welche die Entwicklung von Primärtumoren, Mikrometastasen und die Bildung von osteoblastischen Metastasen, die für eine Krankheit im Spätstadium kennzeichnend sind, wiedergeben können. Die Wirksamkeit kann anhand von Assays vorhergesagt werden, welche die Hemmung der Tumorbildung, der Tumorregression oder -metastasierung und dergleichen messen. In-vivo-Assays, welche die Begünstigung von Apoptose untersuchen, sind bei der Beurteilung therapeutischer Zusammensetzungen nützlich. In einer Ausführungsform können Xenografts von tumortragenden Mäusen, die mit der therapeutischen Zusammensetzung behandelt worden sind, hinsichtlich des Vorhandenseins apoptotischer Foci untersucht und mit unbehandelten Xenograft-tragenden Kontrollmäusen verglichen werden. Der Umfang, in dem apoptotische Foci in den Tumoren der behandelten Mäuse gefunden werden, liefert einen Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit der Zusammensetzung.
Die in der Ausübung der obigen Verfahren verwendeten therapeutischen Zusammensetzungen können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, welche einen für das gewünschte Verabreichungsverfahren geeigneten Träger aufweisen. Geeignete Träger umfassen jedes Material, das bei Kombination mit der therapeutischen Zusammensetzung die gegen den Tumor gerichtete Funktion der therapeutischen Zusammensetzung behält und generell nicht mit dem Immunsystem des Patienten reagiert. Beispiele umfassen unter anderem einen beliebigen aus einer Anzahl von pharmazeutischen Standardträgerstoffen, wie beispielsweise sterile phosphatgepufferte Salzlösungen, bakteriostatisches Wasser und dergleichen (siehe generell Remington's Pharmaceutical Sciences 16. Auflage, A. Osal., Hrsg., 1980).
Therapeutische Formulierungen können gelöst und auf jede Art verabreicht werden, welche die therapeutische Zusammensetzung an die Stelle des Tumors abgibt. Potenziell effektive Verabreichungsarten umfassen unter anderem intra venös, parenteral, intraperitoneal, intramuskulär, in den Tumor, intradermal, in das Organ, orthotopisch und dergleichen. Eine bevorzugte Formulierung zur intravenösen Injektion umfasst die therapeutische Zusammensetzung einer Lösung aus konserviertem, bakteriostatischem Wasser, sterilem, nicht konserviertem Wasser und/oder verdünnt in Polyvinylchlorid- oder Polyethylenbeuteln, die 0,9% steriles Natriumchlorid zur Injektion, USP, enthalten. Therapeutische Proteinzubereitungen können lyophilisiert und als sterile Pulver aufbewahrt werden, vorzugsweise unter Vakuum, und anschließend vor der Injektion in bakteriostatischem Wasser (das beispielsweise Benzylalkohol als Konservierungsmittel enthält) oder in sterilem Wasser rekonstituiert werden.
Dosierungen und Verabreichungsprotokolle für die Behandlung von Krebserkrankungen mit den obigen Verfahren variieren je nach Verfahren und der zu behandelnden Krebserkrankung und richten sich generell nach einer Reihe weiterer Faktoren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
XII.) Kits
Es sind auch Kits für den Gebrauch in den hierin beschriebenen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen offenbart. Solche Kits können einen Träger, eine Einheit oder einen Behälter umfassen, die mit Kompartimenten versehen sind, um mindestens einen Behälter wie beispielsweise Fläschchen, Röhrchen und dergleichen aufzunehmen, wobei jeder Behälter eines der in dem Verfahren zu verwendenden separaten Elemente aufweist. Beispielsweise können der oder die Behälter eine Sonde aufweisen, die detektierbar gelabelt ist oder gelabelt werden kann. Bei einer solchen Sonde kann es sich um einen Antikörper bzw. um ein Polynukleotid handeln, das für ein mit 103P2D6 verwandtes Protein bzw. ein 103P2D6-Gen oder eine -mRNA spezifisch ist. Wenn das Verfahren Nukleinsäurehybridisierung anwendet, um die Zielnukleinsäure zu detektieren, kann das Kit auch Behälter aufweisen, die mindestens ein Nukleotid für die Amplifizierung der Zielnukleinsäure enthalten, und/oder einen Behälter, der ein Reportermittel wie beispielsweise ein Biotinbindungsprotein wie beispielsweise Avidin oder Streptavidin, gebunden an ein Reportermolekül wie beispielsweise ein Enzym-, Fluoreszenz- oder Radioisotop-Label, umfasst. Das Kit kann die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz von 2 oder Analoge davon oder ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das solche Aminosäuresequenzen kodiert.
Das Kit umfasst typischerweise den oben beschriebenen Behälter und mindestens einen weiteren Behälter, der Material aufweist, welches vom kommerziellen Standpunkt und vom Standpunkt des Anwenders aus wünschenswert ist, einschließlich Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Kanülen, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanleitungen.
Auf dem Behälter kann ein Etikett vorhanden sein, um darauf hinzuweisen, dass die Zusammensetzung für eine spezifische Therapie oder für eine nicht-therapeutische Anwendung verwendet wird, und es kann auch Anleitungen für den Gebrauch in vivo oder in vitro angeben, wie beispielsweise die oben beschriebenen. Anleitungen und/oder sonstige Hinweise können auch in einer Beilage des Kits enthalten sein.
p103P2D6-B (Klon B) wurde nach den Anforderungen des Budapester Vertrags am 19. Mai 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA, hinterlegt und erhielt als Kennung die ATCC-Zugangsnummer PTA-1895. p103P2D6-2 (Klon 2) wurde nach den Anforderungen des Budapester Vertrags am 6. Januar 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA, hinterlegt und erhielt als Kennung die ATCC-Zugangsnummer PTA-1155.
BEISPIELE
Verschiedene Aspekte der Erfindung sind anhand mehrerer, nun folgender Beispiele weiter beschrieben, von denen keines den Umfang der Erfindung beschränken soll.
Beispiel 1: Isolierung eines cDNA-Fragmentes des 103P2D6-Gens mittels SSH
Charakterisierung von 103P2D6 mittels SSH (Suppression Subtractive Hybridization)
Wie nachfolgend ausführlich erläutert ist, haben Experimente mit dem LAPC-4 AD-Xenograft bei männlichen SCID-Mäusen zur Identifizierung von Genen geführt, die an dem Fortschreiten von androgenabhängigem (AD) Prostatakrebs zu androgenunabhängigem (AI) Krebs beteiligt sind. Kurz beschrieben, wurden Mäuse, die LAPC-4 AD-Xenografts trugen, kastriert, als die Tumoren eine Größe von 1 cm im Durchmesser erreicht hatten. Die Tumoren verkleinerten sich und produzierten vorübergehend kein androgenabhängiges PSA-Protein mehr. Sieben bis vierzehn Tage nach der Kastration war im Blut der Mäuse erneut ein PSA-Spiegel detektierbar. Solche Tumore entwickeln schließlich einen AI-Phänotyp und beginnen, in den kastrierten Männchen wieder zu wachsen. Die Tumore wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Kastration entnommen, um Gene zu identifizieren, die während des Übergangs zur Androgenunabhängigkeit ein- oder ausgeschaltet werden.
Anschließend wurde das Verfahren der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) (Diatchenko et al., 1996, PNAS 93: 6025) angewandt, um neuartige Gene zu identifizieren, beispielsweise solche, die bei Prostatakrebs überexprimiert sind, indem cDNAs von verschiedenen androgenabhängigen und androgenunabhängigen LAPC-Xenografts verglichen wurden. Diese Strategie führte zur Identifizierung neuartiger Gene mit prostatakrebsspezifischer Expression. Eines dieser Gene, das als 103P2D6 bezeichnet wurde, wurde bei einer Subtraktion identifiziert, bei der cDNA aus einem LAPC-4-Tumor vom AD-Typ, der in einem intakten männlichen Tier wuchs, von cDNA subtrahiert wurde, die 21 Tage nach der Kastration aus einem LAPC-4-Tumor vom AD-Typ gewonnen worden war. Die SSH-DNA-Sequenz von etwa 342 bp (1) ist neu und weist keine Homologie zu Sequenzen in den öffentlichen Datenbanken auf.
103P2D6 kodiert ein Transmembranprotein mit tumorspezifischer Expression. Die Expressionsanalyse von 103P2D6 zeigt, dass es ausschließlich in Prostatakarzinomen und anderen Krebsgeweben exprimiert wird. 103P2D6 wird im fetalen Herzen, der fetalen Niere und der fetalen Lunge, aber nicht in normalem Gewebe von Erwachsenen exprimiert. Die Expression von 103P2D6 bei Krebs liefert Evidenz dafür, dass dieses Protein bei der Tumorprogression und/oder -initiation eine funktionelle Rolle spielt. Möglicherweise fungiert 103P2D6 als Rezeptor, der an der Aktivierung oder Modulierung von Proliferationssignalen im Rahmen der Tumorgenese und Regulierung des Zellwachstums beteiligt ist.
Wie hierin weiter beschrieben ist, sind das 103P2D6-Gen und das 103P2D6-Protein anhand einer Reihe von Analyseansätzen charakterisiert worden. Beispielsweise wurden Analysen der Nukleotidkodierungs- und Aminosäuresequenzen durchgeführt, um potenziell verwandte Moleküle sowie erkennbare Strukturdomänen, topologische Merkmale und andere Elemente in der 103P2D6-mRNA- und -Proteinstruktur zu identifizieren. Es wurden Northern Blot-Analysen der 103P2D6-mRNA-Expression durchgeführt, um festzustellen, in welchem Umfang normale und kanzeröse Gewebe 103P2D6-mRNA exprimieren.
Material und Verfahren
LAPC-Xenografts und Humangewebe:
LAPC-Xenografts wurden erhalten von Dr. Charles Sawyers (UCLA) und wie beschrieben generiert (Klein et al., 1997, Nature Med. 3; 402-408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Androgenabhängige und -unabhängige LAPC-4-Xenografts (LAPC-4 AD bzw. AI) und LAPC-9-Xenografts (LAPC-9 AD bzw. AI) wuchsen in intakten bzw. kastrierten männlichen SCID-Mäusen und wurden als kleine Gewebestücke in die männlichen Empfängertiere übertragen. LAPC-4 AI-Xenografts entstanden aus LAPC-4 AD-Tumoren und LAPC-9 AI-Xenografts aus LAPC-9 AD-Tumoren. Zur Erzeugung der AI-Xenografts wurden männliche Mäuse mit LAPC AD-Tumoren kastriert und 2–3 Monate gehalten. Nachdem die LAPC-Tumoren ihr Wachstum wiederaufgenommen hatten, wurden die Tumoren entnommen und in kastrierte männliche oder weibliche SCID-Mäuse übertragen.
Zelllinien:
Humane Zelllinien (z.B. HeLa) stammten aus der ATCC und wurden in DMEM mit 5% fetalem Kälberserum gehalten.
RNA-Isolierung:
Tumorgewebe und Zelllinien wurden in Trizol-Reagens homogenisiert (Life Technologies, Gibco BRL), wobei zur Isolierung von Gesamt-RNA 10 ml/g Gewebe oder 10 ml/10⁸ Zellen verwendet wurde. Aus Gesamt-RNA wurde mithilfe der Oligotex mRNA Mini- und Midi-Kits von Qiagen Poly A-RNA gereinigt. Gesamt-RNA und mRNA wurden spektrophotometrisch quantifiziert (O.D. 260/280 nm) und gelelektrophoretisch analysiert.
Oligonukleotide:
Es wurden die folgenden HPLC-gereinigten Oligonukleotide verwendet: DPNCDN (cDNA-Syntheseprimer):
Adapter 1:
Adapter 2:
PCR-Primer 1:
Nested Primer (NP) 1:
Nested Primer (NP) 2:
Suppression Subtractive Hybridization:
Das Verfahren der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) wurde verwendet, um cDNAs zu identifizieren, die Genen entsprechen, welche bei Prostatakrebs möglicherweise differenziell exprimiert werden. Die SSH-Reaktion verwendete cDNA aus zwei LAPC-4 AD-Xenografts. Insbesondere wurde die 103P2D6-SSH-Sequenz bei einer Subtraktion identifiziert, bei der cDNA aus einem LAPC-4 AD-Tumor aus einem intakten Männchen von cDNA subtrahiert wurde, die aus einem LAPC-4 AD-Tumor 21 Tage nach der Kastration stammte. Der LAPC-4 AD-Xenografttumor, 21 Tage nach der Kastration, wurde als Quelle der „Tester"-cDNA verwendet, während die cDNA aus dem LAPC-4 AD-Tumor aus dem intakten Männchen als Quelle der „Driver"-cDNA verwendet wurde.
Doppelsträngige cDNAs, die der Tester- bzw. der Driver-cDNA entsprachen, wurden aus 2 μg poly(A)⁺-RNA synthetisiert, die aus relevantem Xenograft-Gewebe wie oben beschrieben isoliert wurde, wobei das PCR-Select cDNA-Selektionskist von CLONTECH und 1 ng des Oligonukleotids DPNCDN als Primer verwendet wurden. Die Synthese des ersten und des zweiten Stranges erfolgte nach der Beschreibung in der Gebrauchsanleitung des Kits (CLONTECH Protokoll Nr. PT1117-1, Artikel-Nr. K1804-1). Die resultierende cDNA wurde für 3 Std. bei 37°C mit Dpn II verdaut. Die verdaute cDNA wurde mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.
Driver-cDNA wurde gewonnen, indem mit Dpn II verdaute cDNA aus dem relevanten Xenograft (siehe oben) mit einem Gemisch aus verdauten cDNAs, die aus einer humanen benignen Prostatahyperplasie (BPH), den menschlichen Zelllinien He-La, 293, A431, Colo205 und Mäuseleber stammten, im Verhältnis 1:1 kombiniert wurde.
Tester-cDNA wurde gewonnen, indem 1 μl der mit Dpn II verdauten cDNA aus dem relevanten Xenograft (siehe oben) (400 ng) in 5 μl Wasser verdünnt wurde. Die verdünnte cDNA (2 μl, 160 ng) wurde anschließend mit 2 μl Adapter 1 und Adapter 2 (10 μM) in separaten Ligierungsreaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 μl bei 16°C über Nacht und unter Verwendung von 400 Einheiten T4-DNA-Ligase (CLONTECH) ligiert. Die Ligation wurde mit 1 μl 0,2 M EDTA und 5-minütigem Erhitzen bei 72°C gestoppt.
Die erste Hybridisierung erfolgte durch Zugabe von je 1,5 μl (600 ng) Driver-cDNA zu zwei Röhrchen, die 1,5 μl (20 ng) Adapter-1- und Adapter-2-ligierte Tester-cDNA enthielten. Die Proben wurden in einem Endvolumen von 4 μl mit Mineralöl überschichtet, in einem Thermal Cycler von MJ Research bei 98°C für 1,5 Minuten denaturiert und konnten dann 8 Std. bei 68°C hybridisieren. Die beiden Hybridisierungen wurden dann zusammen gemischt, und es wurde ein weiterer Mikroliter frisch denaturierte Driver-cDNA zugegeben, woraufhin der Ansatz über Nacht bei 68°C hybridisieren konnte. Die zweite Hybridisierung wurde anschließend in 200 μl 20 mM Hepes, pH 8,3, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA verdünnt, bei 70°C für 7 Min. erhitzt und bei –20°C aufbewahrt.
PCR-Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung von Genfragmenten, die mithilfe von SSH gewonnen wurden:
Zur Amplifizierung von Genfragmenten aus SSH-Reaktionen wurden zwei PCR-Amplifikationen durchgeführt. Bei der primären PCR-Reaktion wurde 1 μl des verdünnten fertigen Hybridisierungsgemisches zu 1 μl PCR-Primer (10 μM), 0,5 μl dNTP-Gemisch (10 μM), 2,5 μl 10 × Reaktionspuffer (CLONTECH) und 0,5 μl 50 × Advantage cDNA Polymerase Mix (CLONTECH) in einem Endvolumen von 25 μl gegeben. Die PCR 1 wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 75°C für 5 Min., 94°C für 25 Sek., anschließend 27 Zyklen bei 94°C für 10 Sek., 66°C für 30 Sek., 72°C für 1,5 Min. Je Experiment wurden fünf separate primäre PCR-Reaktionen durchgeführt. Die Produkte wurden gepoolt und 1:10 mit Wasser verdünnt. Für die sekundäre PCR-Reaktion wurde 1 μl der gepoolten und verdünnten primären PCR-Reaktion dem gleichen Reaktionsgemisch zugegeben, wie es auch für die PCR 1 verwendet wurde, außer, dass anstelle von PCR-Primer 1 die Primer NP1 und NP2 (10 μM) verwendet wurden. Die PCR 2 umfasste 10–12 Zyklen aus 94°C für 10 Sek., 68°C für 30 Sek. und 72°C für 1,5 Minuten. Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch im 2%igen Agarosegel analysiert.
Die PCR-Produkte wurden mithilfe des T/A-Vektorklonierungskits (Invitrogen) in pCR2.1 eingesetzt. Transformierte E. coli wurden einer Blau/Weiß- und Ampicillin-Selektion unterzogen. Weiße Kolonien wurden gepickt und in Platten mit 96 Vertiefungen angeordnet und über Nacht in Flüssigkultur wachsen gelassen. Zur Identifizierung von Inserts wurde mit 1 ml Bakterienkultur eine PCR-Amplifizierung unter den Bedingungen der PCR 1 und unter Verwendung von NP1 und NP 2 als Primer durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch im 2%igen Agarosegel analysiert.
Bakterienklone wurden in 20% Glycerol in einem Format mit 96 Vertiefungen aufbewahrt. Plasmid-DNA wurde präpariert, sequenziert und einer Nukleinsäurehomologiesuche in den Datenbanken GenBank, dBest und NCI-CGAP unterzogen.
Ergebnisse
Zwei unter „Material und Verfahren" oben beschriebene SSH-Experimente führten zur Isolierung zahlreicher Kandidatengenfragmentklone (SSH-Klone). Alle Kandidatenklone wurden sequenziert und einer Homologieanalyse gegen alle in den großen öffentlichen Gen- und EST-Datenbanken unterzogen, um Informationen über die Identität des entsprechenden Gens zu erhalten und die Entscheidung zur Analyse eines bestimmten Gens für die differenzielle Expression zu unterstützen. Allgemein wurden Genfragmente, die keine Homologie mit einer bekannten Sequenz in keiner der durchsuchten Datenbanken aufwiesen und daher als neuartige Gene wiedergebend betrachtet wurden, sowie Genfragmente, die Homologie mit zuvor sequenzierten exprimierten Sequenztags (ESTs) zeigen, einer Differenzialexpressionsanalyse durch RT-PCR und/oder einer Northern Analyse unterzogen.
Einer der SHH-Klone, der etwa 342 bp umfasste, zeigte keine Homologie zu einem bekanntem Gen oder zu einer Sequenz in den öffentlichen Datenbanken und wurde als 103P2D6 bezeichnet. Die Northern-Expressionsanalyse von First-Strand-cDNAs von 16 Normalgeweben zeigte ein Expressionsmuster mit hoher Spezifität für Prostatakrebs in Gewebe von Erwachsenen (4).
Beispiel 2: Klonierung von 103P2D6 in voller Länge und Homologievergleich mit bekannten Sequenzen
Aus einer LAPC-4 AD-cDNA-Bibliothek (Lambda ZAP Express, Stratagene) wurde ein partieller 103P2D6-cDNA-Klon (Klon 2) mit 1687 Basenpaaren (bp) kloniert. Aus einer Bibliothek aus humanem fetalem Hirn (Pangene Inc.) wurde ein 103P2D6-cDNA-Klon in Volllänge (2) (Klon B) mit 4728 Basenpaaren (bp) kloniert. Die cDNA kodiert ein putatives offenes Leseraster (ORF) aus 563 Aminosäuren. Sein berechnetes Molekulargewicht (MW) beträgt 63,4 kDa, und sein pI-Wert ist 8,15. Auf Proteinebene zeigt 103P2D6 eine Identität von 24,9% und eine Homologie von 32,8%, wobei etwaige Lücken berücksichtigt sind, zu einem Hüllprotein (Q9UNM3), das aus einem humanen endogenen retroviralen Protein, HERV-H, isoliert wurde (Virology 1999, 258: 441). Die 103P2D6-Nukleinsäuresequenz überlappt mit einigen ESTs aus Niere, Fetus, Hirn und Placenta.
Die 103P2D6-cDNA in Volllänge (Klon B) wurde am 19. Mai 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) als Plasmid p103P2D6-B hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer PTA-1895. Die partielle 103P2D6-cDNA (Klon 2) wurde am 6. Januar 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) als Plasmid p103P2D6-2 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer PTA-1155.
Beispiel 3: Analyse der Expression des 103P2D6-Gens & 103P2D6-Proteins
Northern-Expressionsanalyse:
Die Expression von 103P2D6-mRNA in Normalgeweben wurde durch Northern Blotting mehrerer Gewebeblots (Clontech; Palo Alto, Kalifornien) analysiert, die insgesamt 16 verschiedene normale Humangewebe umfassten, wobei gelabeltes 103P2D6-SSH-Fragment (Beispiel 1) als Sonde verwendet wurde. Die RNA-Proben wurden quantitativ mit einer β-Aktinsonde normalisiert. Die mit einer 103P2D6-SSH-Fragmentsonde mit 16 Normalgeweben durchgeführte Northern Blot-Analyse zeigte keine Expression in Normalgewebe, einschließlich Hirn, Eierstock, Herz, Lunge, Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm, Plazenta, Leukozyten, Hoden, Prostata, Kolon, Skelettmuskel, Thymus und Milz (5).
Zur Analyse der Expression von 103P2D6 in Krebsgeweben wurde ein Northern Blotting mit RNA aus LAPC-Xenografts und mehreren Prostata- und Nicht-Prostatakrebszelllinien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein hohes Maß an Expression eines 3-kb-Transkriptes in LAPC-4 AD, LAPC-4 AI, LAPC-9 AD und LAPC-9 AI (5, 6). Eine ausführlichere Analyse der LAPC-4-Xenografts zeigte, dass 103P2D6 in gleichem Maß exprimiert wird, wenn die Xenografts subkutan (LAPC-4 sc) oder in der Tibia der Mäuse (LAPC-4 AD it) wachsen (7). Auch in einem Xenograft, das in Humanknochenexplantaten in SCID-Mäusen wuchs (LAPC-4 AD2), wurde eine Expression festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass das Wachstum dieser Prostatakrebsgewebe im Knochen ihre Expression nicht mindert.
Die Expression von 103P2D6 wurde in mehreren Krebszelllinien festgestellt, die aus der Prostata (LNCaP, DU145, LAPC-4 CL), Blase (HT1197, 5637), der Bauchspeicheldrüse (BxPC-3, HPAC, CAPAN-1), dem Kolon (SK-CO-1, CACO-2), dem Knochen (HOS, U2-OS, RD-ES), der Lunge (CALU-1), der Brust (MCF-7), dem Hoden (NCCIT, TERA-1), dem Gebärmutterhals (A431) und dem Eierstock (OV-1063, PA-1, SW626) stammten (6). Diese Ergebnisse legen nahe, dass 103P2D6 generell in Krebszellen und Krebsgeweben hochreguliert ist, insbesondere in einem Prostata-, Nieren- und Blasenkarzinom, und als geeignetes Ziel für eine Krebstherapie dient.
Die Northern-Blot-Analyse von 103P2D6 zeigte nur eine Expression in Krebsgeweben und Krebszelllinien, aber nicht in normalem erwachsenem Gewebe. Darüber hinaus wurde das 103P2D6-Gen aus einer Bibliothek aus fetalem Hirn kloniert, was nahe legt, dass es sich dabei um ein fetales Gen handelt, das während der Tumorgenese aktiviert wird. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde RNA aus 6 Organen eines 9 Wochen alten Fetus und aus dem ganzen Fetus durch Northern Blotting mit einer 103P2D6-SSH-Sonde analysiert. Die Ergebnisse (8) zeigen, dass 103P2D6 im 9-Wochen-Stadium im fetalen Herzen, der fetalen Niere und der fetalen Lunge exprimiert wird. Dies weist darauf hin, dass 103P2D6 tatsächlich ein fetales Gen ist, das bei Krebs eingeschaltet wird und eine Rolle bei der Biologie eines Karzinoms spielt.
Die Expression von 103P2D6 wurde in einem Panel humaner Karzinome (T) und deren entsprechendem Normalgewebe (N) auf RNA-Dotblots untersucht (13). Eine Expression von 103P2D6 war erkennbar in Niere, Brust, Prostata, Gebärmutter, Eierstock, Gebärmutterhals, Kolon, Magen und Rektum. 103P2D6 war auch in zwei humanen Krebszelllinien, der CML-Linie K562 und dem Kolorektalkarzinom SW480, stark exprimiert. Die in normalem benachbartem Gewebe (isoliert aus erkranktem Gewebe), aber nicht in aus gesunden Spendern isoliertem Normalgewebe festgestellte Expression deutet darauf hin, dass diese Gewebe nicht vollständig normal sind und dass 103P2D6 in Tumoren im Frühstadium exprimiert sein könnte und als diagnostischer Marker von Nutzen ist.
14 zeigt Northern-Daten, für die RNA aus Prostatatumoren (T) und deren benachbartem normalem Gewebe (N) aus folgenden Prostatakrebspatienten (Pt) isoliert wurde: Patient 1, Gleason-Score 4 + 5; Patient 2, Gleason-Score 3 + 4; und Patient 3, Gleason-Score 4 + 3. Für die Northern-Analyse wurden 10 μg Gesamt-RNA von jeder Probe verwendet. In allen drei getesteten Tumorproben und in deren entsprechendem Normalgewebe wurde eine Expression von 103P2D6 beobachtet.
In 15 sind Daten einer Northern-Analyse gezeigt, für die RNA aus Nierentumoren (T) und deren benachbartem normalem Gewebe (N) aus Nierenkrebspatienten (Pt) isoliert wurde. Die Patientenspezifikationen sind wie folgt: Patient 1 – Papillärer Typ, Stadium I, Grad 2/4; Patient 2 – Invasives papilläres Karzinom, Grad 2/4; Patient 3 – Klarzelltyp Grad 1/3, fokal 2/3; Patient 4 – Klarzelltyp, Stadium III, Grad 2/4; Patient 5 – Klarzelltyp, Stadium III, Grad 3/4; Patient 6 – Klarzelltyp, Stadium III, Grad 3/4; Patient 7 – Klarzelltyp, Grad III. In 15.: CL = Zelllinien (von links nach rechts): 769-P, A498, SW839; NK = Normale Niere; N = Normales benachbartes Gewebe; T = Tumor. Für die Northern-Analyse wurden 10 μg Gesamt-RNA von jeder Probe verwendet. In Nierentumoren und deren entsprechendem benachbartem Normalgewebe aus Nierenkrebspatienten wurde im Vergleich zu einer normalen Niere eine Expression von 103P2D6 beobachtet.
16 zeigt die Ergebnisse einer Northern-Analyse, für die RNA aus Blasenkarzinomen und benachbartem Normalgewebe aus den Blasenkrebspatienten isoliert wurde. Für die Northern-Analyse wurden 10 μg Gesamt-RNA von jeder Probe verwendet. Eine Expression von 103P2D6 wurde in den Blasentumoren, aber nicht in benachbartem Normalgewebe beobachtet.
RT-PCR-Expressionsanalyse:
Aus 1 μg RNA lassen sich durch Priming mit Oligo (dT)12–18 und unter Verwendung des Superscript Preamplifi cation-System von Gibco-BRL First-Strand-cDNAs herstellen. Es wurde das Protokoll des Herstellers befolgt, welches eine Inkubation für 50 Min. bei 42°C mit reverser Transkriptase, gefolgt von einer Behandlung mit RNAse H bei 37°C für 20 Min. enthält. Nach Abschluss der Reaktion kann das Volumen vor der Normalisierung mit Wasser auf 200 μl erhöht werden. Von Clontech sind First-Strand-cDNAs aus 16 verschiedenen humanen Normalgeweben erhältlich.
Die Normalisierung der First-Strand-cDNAs aus mehreren Geweben erfolgte unter Verwendung der Primer 5'-ATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAA-3' (SEQ ID Nr.: XX) und 5'-AGCCACACGCAGCTCATTGTAGAAGG-3' (SEQ ID Nr.: XX) zur Amplifizierung von β-Aktin. First-Strand-cDNA (5 μl) wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl amplifiziert, das 0,4 μM Primer, 0,2 μM jedes dNTP, 1 × PCR-Puffer (Clontech, 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl, 50 mM KCl, pH 8,3) und 1 × Klentaq-DNA-Polymerase (Clontech) enthielt. In Zyklus 18, 20 und 22 können 5 μl der PCR-Reaktion entnommen und für die Agarosegelelektrophorese verwendet werden. Die PCR wurde mit einem Thermal Cycler von MJ Research und unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Anfängliche Denaturierung gegebenenfalls bei 94°C für 15 Sek., gefolgt von 18, 20 und 22 Zyklen mit jeweils 94°C für 15 Sek., 65°C für 2 Min., 72°C für 5 Sek. Eine abschließende Extension wurde für 2 Min. bei 72°C durchgeführt. Nach der Agarosegelelektrophorese wurde die Intensität der β-Aktinbanden mit 283 bp aus mehreren Geweben durch Sichtprüfung verglichen. Es wurden die Verdünnungsfaktoren für die First-Strand-cDNAs berechnet, um nach 22 PCR-Zyklen die gleiche Intensität der β-Aktinbande in allen Geweben zu erhalten. Es können drei Normalisierungsrunden erforderlich sein, um nach 22 PCR-Zyklen gleiche Bandenintensitäten in allen Geweben zu erhalten.
Zur Bestimmung des Expressionsgrades des 103P2D6-Gens wurden 5 μl von normalisierter First-Strand-cDNA mittels PCR in 25, 30 und 35 Amplifikationszyklen analysiert. Das Vergleichen der PCR-Produkte nach einer Zykluszahl, die leichte Bandenintensitäten ergibt, ermöglicht eine halbquantitative Analyse der Expression.
In einer typischen RT-PCR-Expressionsanalyse, gezeigt in 9, wurde die RT-PCR-Expressionsanalyse mit First-Strand-cDNAs aus Gewebepools mehrerer Proben durchgeführt. Die cDNAs wurden anschließend mithilfe einer Beta-Aktin-PCR normalisiert. Die höchste Expression wurde im Kolonkarzinompool, dem Xenograft-Pool und bei einem Lungenkrebspatienten beobachtet. Der niedrigste Expressionsgrad wurde in Pools aus normaler Prostata, Prostatakarzinom, Blasenkarzinom und Nierenkarzinom beobachtet.
In einer weiteren Analyse wurde mittels RT-PCR die Expression von 103P2D6 in Normalgeweben und in von Patienten stammenden Karzinomen analysiert. Aus 1 μg RNA wurde durch Priming mit Oligo (dT)12–18 und unter Verwendung des Superscript Preamplification-System von Gibco-BRL First-Strand-cDNAs hergestellt. Es wurde das Protokoll des Herstellers befolgt, welches eine Inkubation für 50 Min. bei 42°C mit reverser Transkriptase, gefolgt von einer Behandlung mit RNAse H bei 37°C für 20 Min. enthält. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Volumen vor der Normalisierung mit Wasser auf 200 μl erhöht. First-Strand-cDNAs wurden aus normaler Prostata, normaler Niere und aus HeLa-Zellen sowie aus einem Prostatatumorpool, einem Nierentumorpool und einem Blasentumorpool präpariert. Die Tumorpools wurden aus Tumorgewebe von Patienten präpariert. Die Normalisierung erfolgte mittels PCR unter Verwendung von Primern für Aktin und GAPDH. Es wurde eine halbquantitative PCR unter Verwendung von Primern für 103P2D6 durchgeführt. Folgende 103P2D6-Primer wurden für die RT-PCR verwendet: CTTGGGAGGTCCTAGTGCTAAGTG (SEQ ID Nr.: ) und CAATGAAGGGACTAACAACCCATC (SEQ ID Nr.: XX). Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt und bestätigen, dass 103P2D6 in kan zerösen Geweben exprimiert ist, insbesondere in Prostata- und Blasenkrebsgeweben aus Patienten.
Proteinexpressionsanalyse:
Die Expression von 103P2D6-Protein wurde in Bauchspeicheldrüsen-, Kolon- und Prostatakrebszelllinien durch Western Blot und Durchflusszytometrie analysiert. Wie in 11A–B gezeigt, wurden Zelllysate (∼25 μg) von den angegebenen Zelllinien durch SDS-PAGE getrennt und einer Western Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-103P2D6-pAb unterzogen (siehe Beispiel 4 unten). Der Pfeil zeigt auf eine starke Anti-103P2D6-pAb-immunreaktive Bande von etwa 60 kD, die in den Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien HPAC und Bx PC-3, der Kolonkrebszelllinie CaCo-2 vorhanden ist, sowie auf eine weniger intensive Bande in LAPC9-Prostatakarzinomzellen, was auf eine endogene Expression von 103P2D6-Protein hinweist. Ebenfalls mit einem Pfeil gekennzeichnet ist die in mit V5-His markierter 103P2D6-cDNA transfizierten 293T-Zellen vorhandene, immunreaktive Bande mit 85 kD.
Bx PC-3-Bauchspeicheldrüsenkrebszellen wurden mit Anti-103P2D6-pAb (10 μg/ml) oder Kaninchen-Kontroll-IgG-Ab gefärbt und nach Inkubation mit einem mit Anti-Kaninchen-IgG-FITC-konjugierten sekundären Ab einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen. Mit dem Anti-103P2D6-pAb gefärbte Bx PC-3-Zellen zeigten gegenüber den mit Kaninchen-Kontroll-IgG gefärbten Zellen eine Fluoreszenzverschiebung, was auf eine Zelloberflächenexpression von 103P2D6 hinweist. Die Ergebnisse sind in 11C gezeigt.
Beispiel 4: Herstellung von polyklonalen 103P2D6-Anti körpern
Herstellung polyklonaler Antikörper (pAbs)
Zur Herstellung polyklonaler Antikörper (pAb) gegen 103P2D6 wurde ein Peptid synthetisiert, das den Aminosäuren 163–176 (DVTNESRNDDDDTS) der 103P2D6-Proteinsequenz entsprach. Das Peptid wurde an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) gekoppelt und folgenderweise verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Das Kaninchen wurde zunächst mit 200 μg Peptid-KLH, gemischt in komplettem Freund-Adjuvans, immunisiert. Anschließend wurde dem Kaninchen alle zwei bis drei Wochen 200 μg Peptid-KLH in inkomplettem Freund-Adjuvans injiziert. Etwa 7–10 Tage nach jeder Immunisierung wurde Blut entnommen. Der Serumtiter war mindestens 1:64.000, wie durch ELISA mit dem Peptid bestimmt wurde.
Affinitätsgereinigte polyklonale 103P2D-Antikörper wurden durch Passage von ungereinigtem Serum aus dem immunisierten Kaninchen über eine Affinitätsmatrix, umfassend 103P2D-Peptid, kovalent gekoppelt an Affigel 10 (BioRad), gewonnen. Nach ausführlichem Waschen der Matrix mit PBS wurden mit Glycinpuffer mit einem niedrigen pH-Wert (0,1 M, pH 2,5) Antikörper eluiert, die für das 103P2D-Peptid spezifisch waren. Western Blotting unter Verwendung des affinitätsgereinigten pAb zeigten das Vorhandensein einer immunreaktiven Anti-103P2D-Bande von etwa 85 kD in 293T-Zellen, die transient mit der 103P2D-cDNA im Vektor pCDNA 3.1 V5-His transfiziert waren, aber nicht in Zellen mit dem leeren Kontrollvektor (12A). Dieser pAb detektierte auch die Zelloberflächenexpression von 103P2D-Protein in transfizierten 293T-Zellen, wie durchflusszytometrisch bestimmt wurde (12B)
pAbs wurden auch durch Immunisierung von Mäusen, Kaninchen, Ziegen und Schafen mit rekombinanten bakteriellen Fusionsproteinen hergestellt, welche die 103P2D-Sequenz in voller Länge oder verschiedene Regionen davon kodieren. Die rekombinanten bakteriellen Proteine umfassen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-Bindungsprotein (MBP) und HISmarkierte Fusionsproteine von 103P2D6, die aus induzierten Bakterien mithilfe der entsprechenden Affinitätsmatrix gereinigt wurden. Als Immunogene für die Produktion von pAb werden auch in Säugern exprimierte sezernierte Tag5- oder FC-Fusionsproteine verwendet, welche die extrazelluläre Domäne kodieren.
Polyklonale Antikörper können in einem Säuger beispielsweise durch mindestens eine Injektion eines Immunisierungsmittels und, falls gewünscht, eines Adjuvans erzeugt werden. Typischerweise werden das Immunisierungsmittel und/oder das Adjuvans durch mehrere subkutane oder intraperitoneale Injektionen in den Säuger injiziert. Beispielsweise werden 103P2D6, rekombinante bakterielle Fusionsproteine oder Peptide verwendet, die verschiedene Regionen der 103P2D6-Sequenz kodieren, um New Zealand White-Kaninchen zu immunisieren. Typischerweise kann ein Peptid aus einer Kodierungsregion von 103P2D6 entworfen werden. Das Peptid kann an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) konjugiert und verwendet werden, um ein Kaninchen zu immunisieren. Alternativ kann das Immunisierungsmittel das gesamte 103P2D6-Protein oder Anteile des 103P2D6-Proteins, Analoge oder Fusionsproteine davon aufweisen. Beispielsweise kann die 103P2D6-Aminosäuresequenz mit verschiedenen Fusionsproteinpartnern fusioniert werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, beispielsweise das Maltosebindungsprotein, LacZ, Thioredoxin oder die konstante Region eines Immunglobulin (siehe z.B. Current Protocols In Molecular Biology, Band 2, Unit 16, Frederick M. Ausubul et al., Hrsg., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. und Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174, 561-566). Sonstige rekombinante bakterielle Proteine umfassen Glutathion-S-Transferase (GST) und HIS-markierte Fusionsproteine von 103P2D6, die unter Verwendung der geeigneten Affinitätsmatrix aus induzierten Bakterien gereinigt werden.
Gegebenenfalls ist es nützlich, das Immunisierungsmittel mit einem Protein mit bekannter Immunogenität in dem immunisierten Säuger zu konjugieren. Beispiele solcher immunogener Proteine umfassen unter anderem Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, bovines Thyreoglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele von geeigneten Adjuvanzien umfassen komplettes Freund-Adjuvant und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat).
Bei einem typischen Protokoll werden Kaninchen zunächst subkutan etwa 200 μg Fusionsprotein oder mit KLH konjugiertes Peptid, gemischt in komplettem Freund-Adjuvans, injiziert. Anschließend wird den Kaninchen alle zwei Wochen 200 μg Immunogen in inkomplettem Freund-Adjuvans subkutan injiziert. Etwa 7–10 Tage nach jeder Immunisierung wird Blut entnommen und verwendet, um den Titer des Antiserums durch ELISA zu überwachen.
Zur Testung von Serum, wie beispielsweise Kaninchenserum, auf Reaktivität mit 103P2D6-Proteinen kann die 103P2D6-cDNA in Volllänge in einen Expressionsvektor kloniert werden, wie beispielsweise in einen, der am Carboxyterminus ein 6His-Tag liefert (pCDNA 3.1 myc-his, Invitrogen). Nach Transfektion der Konstrukte in 293T-Zellen können Zelllysate mit dem Anti-His-Antikörper (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) als Sonde und dem Anti-103P2D6-Serum anhand von Western Blotting untersucht werden. Alternativ wird die Spezifität des Antiserums durch Western Blot und Immunpräzipitation mit Lysaten von Zellen getestet, die 103P2D6 exprimieren. Serum von mit GST- oder MBP-Fusionsproteinen immunisierten Kaninchen wird zunächst durch Entfernung der Anti-GST- oder Anti-MBP-Antikörper durch Passage über GST- bzw. MBP-Proteinsäulen halbgereinigt. Seren von mit His-markierten Protein und Peptid immunisierten Kaninchen sowie GST- und MBP-depletierte Seren werden durch Passage über eine Affinitätssäule gereinigt, die aus dem entsprechenden Immunogen, gekoppelt an eine Affigel-Matrix (BioRad), zusammengesetzt ist.
Beispiel 5: Produktion von rekombinantem 103P2D6 in bakteriellen Systemen und Säugersystemen
BAKTERIELLE KONSTRUKTE
pGEX-Konstrukte
Zur Expression von 103P2D6 in Bakterienzellen wurden Anteile von 103P2D6 durch Klonierung in pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) mit dem Gen der Glutathion-S-Transferase (GST) fusioniert. Die Konstrukte wurden hergestellt, um rekombinante 103P2D6-Proteinsequenzen mit am N-Terminus fusionierter GST und einem Epitop aus sechs Histidinen am C-Terminus zu erhalten. Der Epitopmarker aus sechs Histidinen wird hergestellt, indem die Histidincodons dem Klonierungsprimer am 3'-Ende des offenen Leserasters (ORF) hinzugefügt werden. Eine PreScission^TM-Erkennungsstelle erlaubt die Spaltung des GST-Markers von dem mit 103P2D6 verwandten Protein. Das Ampicillinresistenzgen und der pBR322-Origin gestatten die Selektion und Erhaltung des Plasmides in E. coli. Beispielsweise wurde in pGEX-6P-1 cDNA kloniert, welche die folgenden Fragmente des 103P2D6-Proteins kodiert: Aminosäure 24 bis 487; Aminosäure 39 bis 176, Aminosäure 170 to 360 und Aminosäure 1 bis 536, oder einem aus 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 kontigen Aminosäuren von 103P2D6 oder einem Analog davon.
pMAL-Konstrukte
Zur Expression von 103P2D6 in bakteriellen Zellen wird die gesamte oder ein Teil der 103P2D6-Nukleinsäuresequenz mit dem Gen des Maltosebindungsproteins (MBP) durch Klonieren in pMAL-c2X und pMAL-p2X (New England Biolabs, MA, USA) fusioniert. Die Konstrukte dienen der Herstellung rekombi nanter 103P2D6-Proteinsequenzen mit am N-Terminus fusioniertem MBP und einem Epitop aus sechs Histidinen am C-Terminus. Der Epitopmarker aus sechs Histidinen wird hergestellt, indem die Histidincodons dem Klonierungsprimer am 3'-Ende hinzugefügt werden. Eine Faktor Xa-Erkennungsstelle erlaubt die Abspaltung des GST-Markers von 103P2D6. Die Vektoren pMAL-c2X und pMAL-p2X sind für die Expression des rekombinanten Proteins im Zytoplasma bzw. im Periplasma optimiert. Die Expression in Periplasma verstärkt die Faltung von Proteinen mit Disulfidbindungen. Beispielsweise wird cDNA, welche folgende Fragmente des 103P2D6-Proteins kodiert, in pGEX-6P-1 kloniert: Aminosäure 24 bis 487; Aminosäure 39 bis 176; Aminosäure 170 bis 360 und Aminosäure 1 bis 536 oder eine von 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 kontigen Aminosäuren aus 103P2D6 oder einem Analog davon.
pCRII
Zur Herstellung von 103P2D6-Sense- und -Antisense-Riboprobes für RNA-Untersuchungen in situ wurde unter Verwendung der cDNA-Sequenz, die Aminosäure 44-181 kodiert, ein pCRII-Konstrukt hergestellt. Der pCRII-Vektor verfügt über Sp6- und T7-Promotoren, die das Insert flankieren, um die Produktion von 108P5H8-RNA-Riboprobes anzutreiben, die in RNA-Experimenten mit In-situ-Hybridisierung verwendet werden.
SÄUGERKONSTRUKTE
Zur Expression von rekombinantem 103P2D6 kann die 103P2D6-cDNA in voller oder partieller Länge in einen beliebigen aus verschiedenen aus dem Stand der Technik bekannten Expressionsvektoren kloniert werden. Die Konstrukte können in beliebige aus einer großen Vielzahl an Sängerzellen transfiziert werden, wie beispielsweise in 293T-Zellen. Lysate von transfizierten 283T-Zellen können mit dem poly klonalen Anti-103P2D6-Serum, beschrieben in Beispiel 4 oben, als Sonde in einem Western Blot untersucht werden.
Die 103P2D6-Gene können auch in den retroviralen Expressionsvektor pSRαMSVtkneo subkloniert und folgenderweise verwendet werden, um 103P2D6 exprimierende Zelllinien zu etablieren: Die 103P2D6-Kodierungssequenz (vom Translationsinitiationscodon ATG und der Kozak-Translationsstartkonsensussequenz bis zu den Terminationscodons) wird aus 103P2D6-cDNA mittels PCR unter Verwendung einer ds cDNA-Vorlage amplifiziert. Das PCR-Produkt wird in den Vektor pSRαMSVtkneo subkloniert und in kompetente DH5α-Zellen transformiert. Es werden Kolonien gepickt, um nach Klonen mit einmalig vorhandenen internen Restriktionsschnittstellen auf der cDNA zu suchen. Der positive Klon wird durch Sequenzierung des cDNA-Inserts bestätigt. Die retroviralen Vektoren können anschließend für die Infektion und Erzeugung verschiedener Zelllinien verwendet werden, wobei beispielsweise NIH 3T3, TsuPr1, 293 oder rat-1-Zellen verwendet werden.
Weitere veranschaulichende Säuger- und Bakteriensysteme sind weiter unten erläutert.
pcDNA4/HisMax-TOPO-Konstrukte
Zum Exprimieren von 103P2D6 in Säugerzellen wird der 103P2D6-ORF in cDNA4/HisMax-TOPO-Version A (Artikel-Nr. K864-20, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Zytomegalievirus (ZMV)-Promoter und dem SP163-Translationsenhancer gesteuert. Das rekombinante Protein verfügt über das Xpress^TM-Epitop und sechs Histidinepitope in Fusion mit dem N-Terminus, um die Detektion und die Reinigung des rekombinanten Proteins zu unterstützen. Der pcDNA4/HisMax-TOPO-Vektor enthält außerdem das Polyadenylierungssignal und die Transkriptionsterminationssequenz des bovinen Wachstumshormons (BGH) zur Erhöhung der mRNA-Stabilität sowie den SV40-Origin für die episomale Replikation und einfaches Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Das Zeocin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen und der ColE1-Origin gestatten die Selektion und Erhaltung des Plasmids in E. coli.
pcDNA3.1/MycHis-Konstrukte
Zur Expression von 103P2D6 in Säugerzellen wird der ORF mit der Kozak-Translationsinitiationskonsensusstelle in pcDNA3.1/MycHis-Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Zytomegalievirus (ZMV)-Promoter gesteuert. Das rekombinante Protein verfügt über das myc-Epitop und sechs Histidinepitope in Fusion mit dem C-Terminus, um die Detektion und die Reinigung des rekombinanten Proteins zu unterstützen. Der pcDNA3.1/MycHis-Vektor enthält außerdem das Polyadenylierungssignal und die Transkriptionsterminationssequenz des bovinen Wachstumshormons (BGH) zur Erhöhung der mRNA-Stabilität sowie den SV40-Origin für die episomale Replikation und einfaches Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Es kann das Neomycin-Resistenzgen verwendet werden, da es die Selektion von Säugerzellen gestattet, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen und der ColE1-Origin gestatten die Selektion und Erhaltung des Plasmids in E. coli.
pcDNA3.1/V5His-TOPO-Konstrukte
Zur Expression von 103P2D6 in Säugerzellen wird die den 103P2D6-ORF und die Kozak-Translationsinitiationskonsensussequenz kodierende cDNA in pcDNA4/V5His-TOPO (Artikel-Nr. K4800-01, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Zytomegalievirus (ZMV)-Promoter gesteuert. Das rekombinante Protein verfügt über das V5^TM-Epitop und sechs Histidinepitope in Fusion mit dem C-Terminus, um die Detektion und die Reinigung des rekombinanten Proteins zu unterstützen. Der pcDNA4/V5His-TOPO-Vektor enthält außerdem das Polyadenylierungssignal und die Transkriptionsterminationssequenz des bovinen Wachstumshormons (BGH) zur Erhöhung der mRNA-Stabilität sowie den SV40-Origin für die episomale Replikation und einfaches Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Das Zeocin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Sängerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen und der ColE1-Origin gestatten die Selektion und Erhaltung des Plasmids in E. coli.
Proteinexpression
Der Säugerexpressionsvektor pcDNA3.1/V5-His, der die 103P2D6-cDNA kodiert, wurde verwendet, um zur Beurteilung der 103P2D6-Proteinexpression humane embryonale 293T-Nierenzellen zu transfizieren. Die Western-Analyse von Zelllysaten mit einem Anti-103P2D6-pAb ergab eine immunreaktive Bande von etwa 85 kD in 293T-Zellen, die transient mit der 103P2D6-cDNA transfiziert waren, aber nicht in Zellen, die mit dem leeren Kontrollvektor transfiziert waren (12A). Die Durchflusszytometrieanalyse derselben Zellen, gefärbt mit dem Anti-103P2D6-pAb, ergab eine Fluoreszenzverschiebung der mit 103P2D6 transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, was auf eine Zelloberflächenexpression des 103P2D6-Proteins hinweist (12B). Die Western-Analyse von 103P2D6-mRNA-positiven Bauchspeicheldrüsenkarzinomzellen HPAC und Bx PC-3, Kolonkarzinomzellen CaCo-2 und Prostatakarzinomzellen LAPC9 zeigte eine Expression einer immunreaktiven Anti-103P2D6-Bande bei 60 kD, was auf eine wesentliche endogene Expression des 103P2D6-Proteins hinweist (Beispiel 3 oben; 11A–B). Das höhere Molekulargewicht von 103P2D6 in transfizierten 293T-Zellen (85 kD) könnte auf das Vorhandensein des in der cDNA vorhandenen V5-His-Aminosäuremarkers oder auf posttranslationale Prozessierung oder Modifizierung von 103P2D6 bei Überexpression in 293T-Zellen zurückzuführen sein. Der Durchflusszytometrieanalyse zufolge wird das 103P2D6-Protein auf der Zelloberfläche von Bx PC-3-Zellen exprimiert (Beispiel 3 oben; 11C)
pcDNA3.1CT-GFP-TOPO-Konstrukt
Zur Expression von 103P2D6 in Säugerzellen und zur Detektion des rekombinanten Proteins mittels Fluoreszenz wird der ORF mit der Kozak-Translationsinitiationskonsensusstelle in pcDNA3.1CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA, USA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Zytomegalievirus (ZMV)-Promoter gesteuert. Das rekombinante Protein verfügt über das Green-Fluorescent-Protein (GFP) in Fusion mit dem C-Terminus, welches eine nicht-invasive Detektion und Zellbiologiestudien in vivo ermöglicht. Der pcDNA3.1/MycHis-Vektor enthält außerdem das Polyadenylierungssignal und die Transkriptionsterminationssequenz des bovinen Wachstumshormons (BGH) zur Erhöhung der mRNA-Stabilität sowie den SV40-Origin für die episomale Replikation und einfaches Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Das Neomycin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen und der ColE1-Origin gestatten die Selektion und Erhaltung des Plasmids in E. coli. In pcDNA3.1INT-GFP-TOPO, welches die gesamte Länge des 103P2D6-Proteins umspannt, wird ein weiteres Konstrukt mit einer N-terminalen GFP-Fusion hergestellt.
pAPtag-Konstrukte
Die cDNA, welche die 103P2D6-Aminosäuren 24–487 kodiert, wird in pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN, USA) kloniert. Dieses Konstrukt erzeugt eine Fusion mit alkalischer Phosphatase am C-Terminus des 103P2D6-Proteins, während es an den N-Terminus die IgGK-Signalsequenz fusioniert. Das resultierende rekombinante 103P2D6-Protein ist für die Sezernierung in das Medium transfizierter Säugerzellen optimiert und kann verwendet werden, um Proteine wie beispielsweise Liganden oder Rezeptoren zu identifizieren, die mit dem 103P2D6-Protein interagieren. Die Proteinexpression wird vom ZMV-Promotor gesteuert, und das rekombinante Protein enthält außerdem myc und sechs Histidine in Fusion mit dem C-Terminus der alkalischen Phosphatase, um die Detektion und Reinigung des rekombinanten Proteins zu unterstützen. Das Zeocin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen gestattet die Selektion des Plasmids in E. coli.
ptag5-Konstrukte
Die cDNA, welche die 103P2D6-Aminosäuren 24–487, 24–174, 24–233 und 234–487 kodiert, wurde in plag-5 kloniert. Dieser Vektor ist ähnlich wie pAPtag, weist aber keine Fusion mit alkalischer Phosphatase auf. Dieses Konstrukt erzeugt eine Fusion mit dem Fc von Immunglobulin G1 am C-Terminus des 103P2D6-Proteins, während es an den N-Terminus die IgGK-Signalsequenz fusioniert. Das resultierende rekombinante 103P2D6-Protein ist für die Sezernierung in das Medium transfizierter Säugerzellen optimiert und kann verwendet werden, um Proteine wie beispielsweise Liganden oder Rezeptoren zu identifizieren, die mit dem 103P2D6-Protein interagieren. Die Proteinexpression wird vom ZMV-Promotor gesteuert, und das rekombinante Protein enthält außerdem myc und sechs Histidine in Fusion mit dem C-Terminus, um die Detektion und Reinigung des rekombinanten Proteins zu unterstützen. Das Zeocin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen gestattet die Selektion des Plasmids in E. coli.
psecFc-Konstrukte
Die cDNA, welche die 103P2D6-Aminosäuren 24–487, 24–233 und 234–487 kodiert, wurde in psecFc kloniert. Der psecFc-Vektor wurde konstruiert, indem der Fc-Teil (Scharnier-, CH2-, CH3-Region) von Immunglobulin G1 in pSecTag2 (Invitrogen, Kalifornien, USA) kloniert wurde. Dieses Konstrukt erzeugt eine Fusion mit dem Fc-Teil von Immunglobulin G1 am C-Terminus des 103P2D6-Proteins, während es an den N-Terminus die IgGK-Signalsequenz fusioniert. Das resultierende rekombinante 103P2D6-Protein ist für die Sezernierung in das Medium transfizierter Säugerzellen optimiert und kann verwendet werden, um Proteine wie beispielsweise Liganden oder Rezeptoren zu identifizieren, die mit dem 103P2D6-Protein interagieren. Die Proteinexpression wird vom ZMV-Promotor gesteuert. Das Zeocin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen gestattet die Selektion des Plasmids in E. coli.
pSRα-Konstrukte
Zur Erzeugung von Säugerzelllinien, die 103P2D6 konstitutiv exprimieren, wurde der ORF in pSRα-Konstrukte kloniert. Durch Transfektion von pSRα-Konstrukten in die 293T-10A1-Verpackungszelllinie bzw. Cotransfektion von pSRα und einem Helfer-Plasmid (φ∼) in die 293T-Zellen wurden amphotrope bzw. ecotrope Retroviren erzeugt. Das Retrovirus kann verwendet werden, um verschiedene Säugerzelllinien zu infizieren, was zur Integration des klonierten Gens, 103P2D6, in die Wirtszelllinien führt. Die Proteinexpression wird von einer langen endständigen Wiederholungssequenz (Long Terminal Repeat, LTR) gesteuert. Das Neomycin-Resistenzgen gestattet die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillin-Resistenzgen und der ColE1-Origin gestatten die Selektion und Erhaltung des Plasmids in E. coli.
Es wurde ein weiteres pSRα-Konstrukt hergestellt, das den FLAG-Marker mit dem C-Terminus fusioniert, um die Detektion mit Anti-FLAG-Antikörpern zu ermöglichen. Dem Klonierungsprimer am 3'-Ende des ORF wurde die FLAG-Sequenz 5'-gat tac aag gat gac gac gat aag-3' (SEQ ID Nr.: XX) hinzugefügt.
Es wurden weitere pSRα-Konstrukte hergestellt, um N-terminale und C-terminale GFP- und myc/6HIS-Fusionsproteine des 103P2D6-Proteins in Volllänge herzustellen.
Beispiel 6: Produktion von rekombinantem 103P2D6 in einem Bakulovirus system
Zur Erzeugung eines rekombinanten 103P2D6-Proteins in einem Bakulovirus-Expressionssystem wurde die das 103P2D6-Protein kodierende cDNA-Sequenz in den Bakulovirus-Transfervektor pBlueBac 4.5 (Invitrogen) kloniert, welcher ein His-Tag am N-Terminus liefert. pBlueBac--103P2D6 wurde insbesondere mit dem Helferplasmid pBac-N-Blue (Invitrogen) in SF9 (Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen kotransfiziert, um rekombinantes Bakulovirus zu erzeugen (Einzelheiten sind der Gebrauchsanleitung von Invitrogen zu entnehmen). Anschließend wird Bakulovirus aus dem Zellüberstand gewonnen und durch Plaque-Assay gereinigt.
Durch Infektion von HighFive-Insektenzellen (Invitrogen) mit dem gereinigten Bakulovirus wird dann rekombinan tes 103P2D6-Protein erzeugt. Das rekombinante 103P2D6-Protein lässt sich mithilfe eines Anti-103P2D6-Antikörpers detektieren. Das 103P2D6-Protein kann gereinigt und in verschiedenen zellbasierten Assays oder als Immunogen verwendet werden, um für 103P2D6 spezifische, polyklonale und monoklonale Antikörper herzustellen.
Beispiel 7: Chromosomale Kartierung (Mapping) des 103P2D6- Gens
Die chromosomale Lokalisierung von 103P2D6 wurde mithilfe des Mensch/Hamster-Radiation Hybrid (RH) Panels Gene-Bridge4 (Walter et al., 1994, Nat. Genetics 7: 22) (Research Genetics, Huntsville, Al, USA) bestimmt.
Es wurden folgende PCR-Primer verwendet, um 103P2D6 zu lokalisieren:
Der resultierende Kartierungsvektor für die 93 Radiation Hybrid Panel-DNAs war:
01000111010110100110111111001120010010000100111001111100100 0101101100100110110110110101000011. Dieser Vektor und das Kartierungsprogramm unter http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl platzierten 103P2D6 auf Chromosom 4p12–p14 (D4S3197-D4S1577).
Beispiel 8: Identifizierung möglicher Signalübertragungswege
Auf Basis seiner Lokalisierung an der Zelloberfläche vermag 103P2D6, wichtige Signalübertragungswege zu regulieren. Verschiedene Übertragungswege, die bekanntermaßen eine Rolle in der Biologie von Krebserkrankungen spielen, können von 103P2D6 reguliert werden, einschließlich Phospholipid-Wege wie beispielsweise PI3K, AKT, etc., sowie mitogene Übertragungskaskaden/für das Überleben der Zelle wichtige Übertragungskaskaden wie beispielsweise ERK, p38, etc (Cell Growth Differ. 2000, 11: 279; J Biol. Chem. 1999, 274: 801; Oncogene. 2000, 19: 3003.). Die Rolle, die 103P2D6 bei der Regulierung dieser Übertragungswege spielt, lässt sich durch Western Blotting-Techniken und Reporterassays untersuchen. Zellen, denen 103P2D6 fehlt, und Zellen, die 103P2D6 exprimieren, werden entweder unbehandelt verwendet oder mit Serum, Zytokinen, Androgen oder Antikörpern stimuliert. Zur Feststellung der Phosphorylierung und Regulierung von ERK, p38, AKT, PI3K, PLC und anderen Signalisierungsmolekülen werden Zelllysate mit antiphosphorspezifischen Antikörpern (Cell Signaling, Santa Cruz Biotechnology) analysiert. Wenn 103P2D6 eine Rolle bei der Regulierung von Signalübertragungswegen spielt, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Zur Bestimmung, ob 103P2D6 bekannte Signalübertragungswege in Zellen direkt oder indirekt aktiviert, werden Assays mit Luziferase (luc)-basierten transkriptionellen Reportern mit Zellen durchgeführt, die 103P2D6 exprimieren. Diese transkriptionellen Reporter enthalten Konsensus-Bindungsstellen für bekannte Transkriptionsfaktoren, die stromabwärts (downstream) von gut charakterisierten Signalübertragungswegen liegen. Einige der Reporter und Beispiele der mit ihnen assoziierten Transkriptionsfaktoren, Signalübertragungswege und Aktivierungsstimuli sind nachfolgend aufgeführt:

1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-Kinase/SAPK: Wachstum/Apoptose/Stress;
2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK: Wachstum/Differenzierung;
3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC: Wachstum/Apoptose/Stress;
4. ARE-luc, Androgenrezeptor; Steroide/MAPK: Wachstum/Differenzierung/Apoptose;
5. p53-luc, p53; SAPK: Wachstum/Differenzierung/Apoptose;
6. CRE-luc, CREB/ATF2: PKA/p38; Wachstum/Apoptose/Stress.

Wenn 103P2D6 eine Rolle bei der Regulierung von Wachstum, Apoptose, Stress oder Differenzierung spielt, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Von 103P2D6 vermittelte Effekte werden in Zellen untersucht, die 103P2D6-mRNA exprimieren. Beispielsweise können Luziferase-Reportergen-Plasmide durch lipidvermittelte Transfektion (TFX-50, Promega) eingeführt werden. Luziferaseaktivität, ein Indikator relativer Transkriptionsaktivität, wird gemessen, indem Zellextrakte mit Luziferin-Substrat inkubiert werden und die Lumineszenz der Reaktion in einem Luminometer beobachtet wird. Dieser Assay ermöglicht die Bestimmung des Effektes einer Aktivierung von Signalübertragungswegen, Wenn 103P2D6 eine Rolle bei der Aktivierung von Signalübertragungswegen spielt, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 9: Erzeugung von monoklonalen 103P2D6-Antikörpern (mAbs)
Zur Erzeugung von mAbs gegen 103P2D6 werden Mäuse intraperitoneal mit 10–50 μg Proteinimmunogen, mit komplettem Freund-Adjuvans gemischt, immunisiert. Proteinimmunogene umfassen Peptide, rekombinante 103P2D6-Proteine und in Säugern exprimierte humane IgG-Fc-Fusionsproteine. Die Mäuse werden anschließend alle 2–4 Wochen mit 10–50 μg Antigen, mit inkomplettem Freund-Adjuvans gemischt, immunisiert. Alternativ wird für die ersten Immunisierungen Ribi-Adjuvans verwendet. Darüber hinaus wird ein DNA-basiertes Immunisie rungsprotokoll verwendet, bei dem ein Säugerexpressionsvektor zur Immunisierung von Mäusen durch direkte Injektion der Plasmid-DNA verwendet wird. Beispielsweise wird ein pCDNA3.1 verwendet, der 103P2D6-cDNA alleine oder als IgG-Fc-Fusion kodiert. Dieses Protokoll wird alleine oder in Kombination mit Proteinimmunogenen verwendet. Sieben bis zehn Tage nach der Immunisierung werden Testblutungen durchgeführt, um den Titer und die Spezifität der Immunreaktion zu beobachten. Sobald eine angemessene Reaktivität und Spezifität erhalten ist, was durch ELISA, Western Blotting und Immunpräzipitation bestimmt wird, erfolgen die Fusion und die Erzeugung von Hybridomas nach aus dem Stand der Technik bekannten etablierten Verfahren (Harlow and Lane, 1988).
Bei einem veranschaulichenden Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen 103P2D6-Antikörpern wird ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein synthetisiert, das ein 103P2D6-Protein aufweist, und als Immunogen verwendet. Balb/c-Mäuse werden zunächst mit 200 μg des GST-103P2D6-Fusionsproteins, gemischt in komplettem Freund-Adjuvans intraperitoneal immunisiert. Anschließend werden die Mäuse alle zwei Wochen mit 75 μg GST-103P2D6-Protein, gemischt in inkomplettem Freund-Adjuvans, insgesamt dreimal immunisiert. Die Reaktivität des Serums von immunisierten Mäusen auf das 103P2D6-Protein in Volllänge wird mittels ELISA unter Verwendung einer partiell gereinigten Zubereitung von HIS-markiertem 103P2D6-Protein, exprimiert von 293T-Zellen (Beispiel 5), beobachtet. Die Mäuse, die die stärkste Reaktivität zeigen, können drei Wochen ruhen, bevor sie eine letzte Injektion von Fusionsprotein in PBS erhalten und dann vier Tage später getötet werden. Die Milzen der getöteten Mäuse werden entnommen und nach Standardverfahren (Harlow and Lane, 1988) mit SPO/2-Myelomzellen fusioniert. Überstände von Wachstum aufweisenden Vertiefungen nach HAT-Selektion werden mittels ELISA und Western Blot untersucht, um Klone zu identifizieren, die für 103P2D6 spezifische Antikörper produzieren.
Die Bindungsaffinität eines monoklonalen 103P2D6-Antikörpers wird mithilfe von Standardtechnologien bestimmt. Affinitätsmessungen quantifizieren die Stärke des Antikörpers hinsichtlich der Epitopbindung und können verwendet werden, um behilflich zu sein, zu definieren, welche monoklonalen 103P2D6-Antikörper für den diagnostischen oder therapeutischen Gebrauch bevorzugt sind. Das BIAcore-System (Uppsala, Schweden) ist ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität. Das BIAcore-System verwendet Oberflächenplasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance bzw. SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) zur Beobachtung biomolekularer Interaktionen in Echtzeit. Die BIA-core-Analyse generiert auf geeignete Weise Konstanten der Assoziationsrate, Konstanten der Dissoziationsrate, Konstanten der Dissoziation im Äquilibrium und Affinitätskonstanten.
Beispiel 10: Beteiligung von 103P2D6 am Wachstum und dem Fortschreiten eines Karzinoms
Der Befund, dass 103P2D6 in Krebszellen differenziell exprimiert ist, legt nahe, dass 103P2D6 an dem Vorgang der Tumorbildung und/oder -progression beteiligt ist. Dies wird durch das Vorhandensein anderer Hüllprotein-artiger Proteine in Prostata-, Kolon- und Endotheltumorzelllinien, die in normalen Zellen nicht vorhanden sind, gestützt (Pathobiology. 1997, 65: 123; Cancer Lett. 1998, 124: 213). Beispielsweise wird HERV-K, ein anderes Hüllprotein, in Teratokarzinom- und Tumorzelllinien exprimiert (J Gen Virol. 1996; 77: 2983), und HERV-R wird in Gonadoblastomen exprimiert (Virchows Arch. 1999; 434: 11).
103P2D6 trägt durch mehrere Mechanismen zum Wachstum von Prostata- und anderen Karzinomzellen bei (siehe Tabelle I). Das 103P2D6-Protein kann als Zelloberflächenrezeptor oder als Transporter fungieren und trägt zum Wachstum des Tumors bei, indem es die Proliferation der Tumorzellen reguliert oder auf Tumorzellen, Endothelzellen oder Stroma reagiert. Alternativ trägt 103P2D6 zum Wachstum des Tumors bei, indem es zelluläre Adhäsion, Transformation oder die Expression von stromabwärts gelegenen (downstream) Genen vermittelt. Die Funktionen von 103P2D6 lassen sich z.B. mithilfe gentechnisch veränderter Zelllinien untersuchen, die 103P2D6 exprimieren. Beispielsweise werden primäre Zellen wie PrEC, Karzinomzelllinien und NIH 3T3-Zellen, die gentechnisch verändert sind, um 103P2D6 zu exprimieren, hinsichtlich des Zellwachstumspotenzials untersucht. Wenn 103P2D6 an neoplastischem Zellwachstum beteiligt ist, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Darüber hinaus wird die Rolle, die 103P2D6 bei der Transformation spielt, untersucht. Primäre Zellen, wie beispielsweise PrEC, Karzinomzelllinien und NIH 3T3-Zellen, die gentechnisch verändert sind, um 103P2D6 zu exprimieren, werden mit 103P2D6-negativen Zellen verglichen, um ihre Fähigkeit zu untersuchen, in Weichagar Kolonien zu bilden (Song Z. et al. Cancer Res. 2000; 60: 6730), wobei eine Koloniebildung das Vorhandensein transformierter Zellen anzeigt. Wenn 103P2D6 Transformation vermittelt, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Die Expression von 103P2D6 in den verschiedenen, in Tabelle I aufgeführten Karzinomen zeigt, dass dieses Gen eine funktionelle Rolle beim Fortschreiten eines Tumors besitzt. Die Funktion von 103P2D6 lässt sich in Säugerzellen mithilfe von In-vitro-Ansätzen bestimmen. Säugerzellen, die mit dem retroviralen Vektor pSRαtkneo oder pSRα-103P2D6 infiziert sind, werden mithilfe verschiedener Assays, einschließlich Zellproliferation, in Gewebekultur und durch In-vitro-Invasion mit einem Membraninvasionskultursystem system (Welch et al., Int. J. Cancer 43: 449–457) verglichen (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785). Zelllinien, die 103P2D6 exprimieren, werden hinsichtlich invasiver und migratorischer Eigenschaften getestet, indem die Passage von Zellen durch ein mit Matrigel beschichtetes Transwell-System (Becton Dickinson) gemessen wird (Cancer Res. 1999; 59: 6010). Die Passage von Zellen durch die Membran zur gegenüber liegenden Seite wird mit einem Fluoreszenzassay überwacht (Becton Dickinson, Technisches Bulletin Nr. 428). Zellen, die kein 103P2D6 aufweisen, und Zellen, die 103P2D6 exprimieren, werden beispielsweise mit dem Fluoreszenzfarbstoff Calcein beladen und in die obere Vertiefung des Transwell-Einsatzes ausplatiert. Eine Invasion wird durch Fluoreszenz von Zellen in der unteren Kammer relativ zu der Fluoreszenz der Gesamtpopulation bestimmt. Wenn 103P2D6 an der Zellinvasion beteiligt ist, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Hüllproteine haben nachweislich chemotaktische Fähigkeiten (Lin CL, Sewell AK, Gao fGF, Whelan KT, Phillips RE, Austyn JM. J Exp Med. 2000, 192: 587). In Anbetracht seiner Ähnlichkeit zu Hüllproteinen und zur Bestimmung, ob 103P2D6 exprimierende Zellen solche chemokine Eigenschaften (als „Chemoattractant") aufweisen, werden Indikatorzellen hinsichtlich der Passage durch das Transwell-System zu einem Gradienten von mit 103P2D6 konditioniertem Medium im Vergleich zu Kontrollmedium beobachtet. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um eine spezifische Neutralisierung von Wirkungen von 103P2D6 zu beschreiben und zu quantifizieren. Beispielsweise kann die Neutralisierung durch therapeutische Kandidatenzusammensetzungen gegen Krebs erfolgen. Wenn 103P2D6 eine Gewebeinvasion, beispielsweise durch Chemota xis, vermittelt, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Die Funktion von 103P2D6 lässt sich mithilfe von RNA-Antisense-Technologie, gekoppelt mit den verschiedenen hierin beschriebenen funkionellen Tests, z.B. von Wachstum, Invasion und Migration, untersuchen. RNA-Antisenseoligonukleotide können in 103P2D6 exprimierende Zellen eingeführt werden, wodurch die Expression von 103P2D6 verhindert wird. Kontrollzellen und Antisense enthaltende Zellen können hinsichtlich Proliferation, Invasion, Migration, dem apoptotischen und dem transkriptionellen Potenzial analysiert werden. Untersucht werden können die lokale sowie die systemische Wirkung des Verlustes der Expression von 103P2D6.
Beispiel 11: Proteinassoziation und Zelladhäsion
Hüllptoteine vermitteln nachweislich Zelladhäsion und die Bildung von Synzitien (J. Immunol. 1996, 156: 1307; AIDS. 1991, 5: 1425). Auf Grund seiner Ähnlichkeit mit Hüllproteinen kann 103P2D6 eine Protein-Protein-Assoziation vermitteln, was zu multimeren Komplexen führt. Die Assoziation von Proteinen zu großen Komplexen ist ein wesentlicher Schritt bei mehreren biologischen Vorgängen, einschließlich der Signalübertragung, der Zellkommunikation, der Ubiquitinierung, der Transkriptionsregulierung, etc.
Alternativ kann 103P2D6 an der Regulierung der Zelladhäsion und -kommunikation beteiligt sein. Um zu bestimmen, in welchem Ausmaß die Expression von 103P2D6 die Zelladhäsion reguliert, werden Zellen, die kein 103P2D6 aufweisen, mit Zellen verglichen, die 103P2D6 exprimieren, wobei aus dem Stand der Technik bekannte Techniken zur Anwendung kommen (siehe z.B. Haier et al., Br. J. Cancer. 1999, 80: 1867; Lehr and Pienta, J. Natl. Cancer Inst. 1998, 90: 118). In einer Ausführungsform werden, in Kürze, Zellen mit einem Fluoreszenzmarker wie beispielsweise Calcein gelabelt und auf Gewebekulturvertiefungen, die nur mit Medium oder mit Matrixproteinen beschichtet sind, inkubiert. Adhärente Zellen werden durch fluorimetrische Analyse detektiert. Die Rolle, die 103P2D6 bei der Adhäsion spielt, lässt sich durch Verwendung von Anti-103P2D6-Antikörper bestätigen. Da die Zelladhäsion eine wichtige Rolle beim Wachstum, dem Fortschreiten und der Kolonisierung eines Tumors spielt, dient die Hemmung von durch 103P2D6 vermittelten Interaktionen als diagnostische, präventive und therapeutische Modalität.
Beispiel 12: In-Vivo-Assay auf Förderung des Tumorwachstums durch 103P2D6
Die Wirkung des 103P2D6-Proteins auf das Wachstum von Tumorzellen lässt sich in vivo durch Genüberexpression in tumortragenden Mäusen untersuchen. Beispielsweise können 1 × 10⁶ PC3-, TSUPR1- oder DU145-Zellen, die den leeren tkNeo-Vektor oder 103P2D6 enthalten, SCID-Mäusen an jeder Flanke subkutan injiziert werden. Es können mindestens zwei Strategien angewandt werden: (1) Konstitutive Expression von 103P2D6 unter der Regulierung eines Promotors, wie beispielsweise eines konstitutiven Promotors aus dem Genom von Viren wie dem Polyoma-Virus, dem Hühnerpocken-Virus ( UK 2,211,504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (z.B. Adenovirus 2), dem bovinen Papillom-Virus, dem Vogelsarkomvirus, dem Zytomegalievirus, einem Retrovirus, dem Hepatitis-B-Virus und dem Simian Virus 40 (SV40), oder durch heterologe Säugerpromotoren, z.B. dem Aktinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit dem Wirtszellsystem kompatibel; (2) Regulierte Expression unter der Kontrolle eines induzierbaren Vektorsystems wie beispielsweise Ecdyson, tet, etc., vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel. Beim Auftreten tastbarer Tumoren wird das Tumorvolumen überwacht und über die Zeit nachverfolgt, um zu bestimmen, ob 103P2D6 exprimierende Zellen schneller wachsen und ob Tumoren, die von 103P2D6 exprimierenden Zellen hervorgebracht werden, Kennzeichen veränderter Aggressivität (z.B. verstärkte Metastasierung, Vaskularisierung, reduzierte Responsivität gegenüber Chemotherapeutika) aufweisen. Darüber hinaus können 1 × 10⁵ der gleichen Zellen orthotopisch in Mäuse implantiert werden, um zu bestimmen, ob 103P2D6 einen Effekt auf das lokale Wachstum in der Prostata oder auf die Fähigkeit der Zellen zur Metastasierung, insbesondere zur Lunge, den Lymphknoten und in das Knochenmark, hat. Siehe auch Saffron et al. „Anti-PSCA mAbs inhibit tumor growth and metastasis formation und prolong the survival of mice bearing human prostate cancer xenografts" PNAS (in Druck, 2001).
Der Assay ist auch geeignet, um die Hemmwirkung von 103P2D6 auf therapeutische Kandidatenzusammensetzungen wie beispielsweise 103P2D6-Intrabodies, 103P2D6-Antisensemoleküle und -Ribozyme zu bestimmen.
Beispiel 13: Western-Analyse der Expression von 103P2D6 in subzellulären Fraktionen
Die zelluläre Lokalisierung von 103P2D6 lässt sich mithilfe von Techniken der subzellulären Fraktionierung untersuchen, die in der Zellbiologie häufig verwendet werden (Storrie B, et al., Methods Enzymol. 1990; 182: 203-25). Prostatazelllinien oder andere Zelllinien lassen sich in Kern-, Zytosol- und Membranfraktionen trennen. Die Expression von 103P2D6 in den verschiedenen Fraktionen kann mittels Western-Blotting-Techniken getestet werden.
Zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von 103P2D6 können alternativ 293T-Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der HIS-markiertes 103P2D6 kodiert (PCDNA 3.1 MYC/HIS, Invitrogen). Die transfizierten Zellen können geerntet und einem Protokoll der differenziellen subzellulären Fraktionierung, wie zuvor beschrieben (Pemberton, P.A. et al., 1997, J of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1697-1706), unterzogen werden. Dieses Protokoll trennt die Zelle in Fraktionen auf, in denen Kerne, schwere Membranen (Lysosomen, Peroxisomen und Mitochondrien), leichte Membranen (Plasmamembran und endoplasmatisches Retikulum) und lösliche Proteine angereichert sind.
Beispiel 14: Lokalisierung von 103P2D6
Auf Grund seiner Struktur dürfte 103P2D6 mit der Zelloberfläche assoziiert sein. Oberflächenfärbungsexperimente bestätigen, dass die cDNA von 103P2D6 an der Zelloberfläche exprimiert ist (siehe z.B. 11–12). Wenn 103P2D6 an der Zellmembran lokalisiert ist, könnte es folgende Funktionen haben: (1) als Oberflächenrezeptor, der Signale an den Zellkern überträgt, oder (2) als Transporter, der Ionen und Proteine in die Zelle und aus der Zelle transportiert, oder (3) als Vermittler der Zelladhäsion und der Zell-Zell-Interaktion. Die zelluläre Lokalisierung von 103P2D6 lässt sich mithilfe von Techniken der subzellulären Fraktionierung untersuchen, die in der Zellbiologie häufig verwendet werden (siehe z.B. Storrie B, et al., Methods Enzymol. 1990; 182: 203-25). Zelllinien aus Prostata-, Kolon-, Blasen-, Nieren oder Bauchspeicheldrüsentumoren werden in Fraktionen des Kerns, des Zytosols, der schweren Membranen (Lysosomen, Peroxisomen und Mitochondrien) und leichten Membranen (Plasmamembran und endoplasmatisches Retikulum) aufgetrennt. Die Expression von 103P2D6 wird in jeder Fraktion durch Western-Blotting nachverfolgt. Wenn 103P2D6 an der Zelladhäsion oder der Zell-Zell-Kommunikation teilnimmt, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 15: Durch 103P2D6 vermittelte Protein-Protein-Interaktion
Die Bestimmung der spezifischen Proteine, mit denen 103P2D6 assoziiert, einschließlich dem Zytoskelett und Integrinen, kann z.B. mithilfe von Copräzipitations- und Western-Blotting-Techniken erfolgen (siehe z.B., Hamilton BJ, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646). Immunpräzipitate von Zellen, die 103P2D6 exprimieren, und von Zellen, denen 103P2D6 fehlt, werden hinsichtlich spezifischer Protein-Protein-Assoziationen verglichen. 103P2D6 assoziiert auch mit Effektormolekülen, wie beispielsweise mit Proteinen, die eine C2-Domäne enthalten. Studien zum Vergleich von 103P2D6-positiven und 103P2D6-negativen Zellen sowie zum Vergleich von unstimulierten/ruhenden Zellen und Zellen, die mit Epithelzellaktivatoren wie beispielsweise Zytokinen, Androgen und Antikörpern behandelt worden sind, zeigen spezielle Interaktionen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Interaktionen mithilfe des „Two-Yeast-Hybrid"-Verfahrens (siehe z.B. Curr Opin Chem Biol. 1999, 3: 64) untersucht werden. Ein Vektor, der eine Bibliothek von Proteinen trägt, welche mit der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert sind, wird in Hefen eingeführt, die ein 103P2D6-DNA-Bindungsdomänenfusionsprotein und ein Reporterkonstrukt exprimieren. Eine Protein-Protein-Interaktion wird durch kolorimetrische Reporteraktivität detektiert. Die spezifische Assoziation mit Effektormolekülen und Transkriptionsfaktoren weist einen Fachmann auf die Wirkungsweise von 103P2D6 hin und identifiziert somit therapeutische, präventive und/oder diagnostische Ziele in Verbindung mit Krebs.
Beispiel 16: Regulierung der Transkription durch 103P2D6
Das 103P2D6-Protein enthält einen Leucin-Zipper an seinem Aminoterminus. Leucin-Zipper spielen eine Rolle bei der Proteindimerisierung und bestimmen die sequenzspezifische DNA-Bindung (Luscher B, Larsson LG. Oncogene. 1999; 18: 2955) und sind daher Regulatoren der Transkription. Analog vermag 103P2D6 die Tumorprogression durch Regulierung der Genexpression regulieren. Die Rolle, die 103P2D6 bei der Regulierung der Genexpression spielt, kann beispielsweise durch Untersuchung der Genexpression in Zellen, die 103P2D6 exprimieren, bzw. in Zellen, denen 103P2D6 fehlt, beurteilt werden. Beispielsweise wird RNA aus parenteralen und 103P2D6 exprimierenden NIH3T3- und PC3-Zellen extrahiert und mit im Handel erhältlichen Genarrays (Clontech) hybridisiert. Es wird ein Vergleich zwischen ruhenden Zellen und Zellen angestellt, die mit Serum, Zytokinen, Androgen oder Antikörpern behandelt wurden. Differenziell exprimierte Gene werden identifiziert und biologischen Übertragungswegen zugeordnet. Wenn 103P2D6 die Transkription reguliert, wird es als Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 17: Durch monoklonale 103P2D6-Antikörper vermittelte Hemmung von Prostatatumoren in vivo
Die signifikante Expression von 103P2D6 in Krebsgewebe und seine restriktive Expression in normalem Gewebe machen 103P2D6 zu einem Ziel für eine Antikörpertherapie. Entsprechend ist 103P2D6 ein Ziel für eine Immuntherapie auf Basis von T-Zellen. Die therapeutische Wirksamkeit von Anti-103P2D6-mAbs bei Mausmodellen mit einem humanen Prostatakarzinom-Xenograft wird demnach durch Verwendung des androgenabhängigen LAPC-9-Xenografts (Craft, N., et al., Cancer Res, 1999. 59(19): p. 5030-6) und der androgenunabhängigen rekombinanten Zelllinie PC3-103P2D6 (siehe z.B. Kaighn, M,E., et al., Invest Urol, 1979.17(1): S. 16-23) untersucht.
Die Wirksamkeit des Antikörpers auf das Tumorwachstum und die Metastasenbildung wird z.B. in einem Mausmodell mit einem orthotopischen Prostatakarzinom-Xenograft untersucht. Diese Studien zeigen, dass Anti-103P2D6-mAbs die Bildung des androgenabhängigen LAPC-9- und des androgenunabhängigen PC3-103P2D6-Tumorxenografts verhindern. Anti-103P2D6-mAbs verzögern auch das Wachstum etablierter orthotopischer Tumoren erheblich und verlängerten das Überleben tumortragender Mäuse. Diese Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit von Anti-103P2D6-mAbs bei der Behandlung von lokalem Prostatakrebs und von Prostatakrebs im fortgeschrittenen Stadium.
Die Verabreichung der Anti-103P2D6-mAbs führt zur Retardierung des Wachstums eines etablierten orthotopischen Tumors und zur Hemmung der Metastasierung an entfernte Stellen mit dem Resultat einer signifikanten Verlängerung des Überlebens tumortragender Mäuse. Diese Studien zeigen, dass 103P2D6 ein attraktives Ziel für eine Immuntherapie ist, und demonstrieren das therapeutische Potenzial von Anti-103P2D6-mAbs für die Behandlung von lokalem und metastasiertem Prostatakrebs. Dieses Beispiel zeigt, dass unkonjugierte monoklonale 103P2D6-Antikörper das Wachstum humaner Prostatatumor-Xenografts in SCID-Mäusen effektiv hemmen können; entsprechend ist auch eine Kombination solcher effektiver monoklonaler Antikörper wirksam.
Tumorhemmung mithilfe multipler unkonjugierter 103P2D6-mAbs Material und Verfahren
Monoklonale 103P2D6-Antikörper:
Monoklonale Antikörper gegen 103P2D6 werden wie in Beispiel 9 beschrieben erzeugt.
Antikörper werden durch ELISA, Western Blot, FACS und Immunpräzipitation hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bindung von 103P2D6 charakterisiert. Epitopkartierungsdaten für die Anti-103P2D6-mAbs, wie bestimmt durch ELISA- und Western- Analyse, erkennen Epitope auf dem 103P2D6-Protein. Es wird eine immunhistochemische Analyse von Prostatakrebszellen und Zellen mit diesen Antikörpern durchgeführt.
Antikörperbildung:
Die monoklonalen Antikörper werden aus Überständen von Hybridomgewebekulturen durch Protein-G-Sepharosechromatographie gereinigt, gegen PBS dialysiert, steril filtriert und bei –20°C aufbewahrt. Proteinbestimmungen werden mithilfe eines Bradford-Assays (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) durchgeführt. Es wird ein therapeutischer monoklonaler Antikörper oder ein Cocktail, umfassend ein Gemisch aus individuellen monoklonalen Antikörpern, hergestellt und für die Behandlung von Mäusen verwendet, die subkutane oder orthotopische Injektionen von LAPC-9-Prostatatumor-Xenografts erhalten.
Prostatakrebs-Xenografts und -Zelllinien:
Das LAPC-9-Xenograft, das einen Wildtyp-Androgenrezeptor exprimiert und prostataspezifisches Antigen (PSA) produziert, wird als subkutanes Trokarimplantat in 6 bis 8 Wochen alte männliche ICR-Mäuse mit schwerer kombinierter Immundefizienz (Severe Combined Immunodeficiency, SCID) (Taconic Farms) passagiert (Craft, N., et al., oben). Es werden Einzelzellsuspensionen von LAPC-9-Tumorzellen hergestellt, wie in Craft et al. beschrieben. Die Prostatakarzinomzelllinie PC3 (American Type Culture Collection) wird in DMEM gehalten, das mit L-Glutamin und 10% (Vol./Vol.) fetalem Rinderserum (FRS) ergänzt ist.
Durch retroviralen Gentransfer, wie beschrieben in Hubert, R.S., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25): S. 14523-8, wird eine PC3-103P2D6-Zellpopulation hergestellt. Anti-103P2D6-Färbung wird mithilfe eines FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Antikörpers (Southern Biotech nology Associates), gefolgt von einer Analyse auf einem Epics-XL-Durchflusszytometer von Coulter, detektiert.
Xenograft-Mausmodelle:
Subkutane (s.c.) Tumoren werden durch Injektion von 1 × 10⁶ LAPC-9-, PC3- oder PC3103P2D6-Zellen, in einer Verdünnung von 1:1 mit Matrigel (Collaborative Research) gemischt, in die rechte Flanke männlicher SCID-Mäuse erzeugt. Zur Testung der Wirksamkeit der Antikörper auf die Tumorbildung wird am selben Tag, an dem die Tumorzellinjektionen erfolgen, mit Antikörperinjektionen i.p. begonnen. Als Kontrolle werden Mäuse mit gereinigtem Maus-IgG (ICN) oder PBS oder mit einem gereinigten monoklonalen Mausantikörper injiziert, der ein irrelevantes Antigen erkennt, das nicht in menschlichen Zellen exprimiert wird. In vorläufigen Studien wurde kein Unterschied zwischen Maus-IgG oder PBS auf das Tumorwachstum festgestellt. Die Größe der Tumoren wird durch Messung mit einem Messschieber bestimmt, und das Tumorvolumen wird als Länge × Breite × Höhe berechnet. Mäuse mit subkutanen Tumoren mit einem Durchmesser über 1,5 cm werden getötet. Der PSA-Spiegel wird mithilfe eines PSA-ELISA-Kits (Anogen, Mississauga, Ontario, Kanada) bestimmt. Der zirkulierende Spiegel an Anti-103P2D6-mAbs wird mithilfe eines Capture-ELISA-Kits (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) bestimmt.
Orthotopische Injektionen werden unter Anästhesie mit Ketamin/Xylazin durchgeführt. Durch die Abdominalmuskulatur wird ein Einschnitt vorgenommen, um die Blase und Samenblase frei zu legen, die dann durch die Inzision nach außen gezogen werden, um die dorsale Prostata frei zu legen. In jeden Dorsallappen werden LAPC-9-Zelllen (5 × 10⁵), gemischt mit Matrigel, in einem Volumen von 10 μl injiziert. Zur Überwachung des Tumorwachstums werden die Mäuse wöchentlich geblutet, um den PSA-Spiegel zu bestimmen. Die Mäuse werden auf Basis des PSA-Spiegels für die entsprechenden Behandlungen in Gruppen aufgeteilt. Zur Testung der Wirkung von Anti-103P2D6-mAbs auf etablierte orthotopische Tumoren wird mit Antikörperinjektionen i.p. begonnen, wenn der PSA-Spiegel 2–80 ng/ml erreicht.
Anti-103P2D6-mAbs hemmen die Bildung von 103P2D6 exprimierenden Prostatakrebstumoren
Als Nächstes testeten wir mithilfe des orthotopischen LAPC-9-Modells den Effekt von Anti-103P2D6-mAbs auf die Tumorbildung. Im Vergleich zum Modell mit dem subkutanen Tumor kam es in dem Modell mit dem orthotopischen Tumor, das eine Injektion von Tumorzellen direkt in die Prostata der Maus erfordert, zu einem lokalen Tumorwachstum, der Entwicklung von Metastasen an entfernten Stellen, einer Verschlechterung der Gesundheit der Maus und zu anschließendem Exitus (Saffran, D., et al., PNAS 10: 1073-1078 oder www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698; Fu, X., et al., Int J Cancer, 1992. 52(6): S. 987-90; Kubota, T., J Cell Biochem, 1994. 56(1): S. 4-8). Aufgrund dieser Merkmale ist das orthotopische Modell repräsentativer für das Fortschreiten der Krankheit beim Menschen und gestattete es uns, die therapeutische Wirkung von mAbs auf klinisch relevante Endpunkte zu verfolgen.
Entsprechend werden LAPC-9-Tumorzellen in die Mausprostata injiziert, und 2 Tage später werden die Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt und dreimal wöchentlich für zwei Wochen mit 200 μg lG8-mAb oder PBS behandelt. Die Mäuse werden wöchentlich hinsichtlich des zirkulierenden PSA-Spiegels als Indikator des Tumorwachstums überwacht.
Ein Hauptvorteil des orthotopischen Prostatakrebsmodells ist die Möglichkeit zur Untersuchung der Entwicklung von Metastasen. Die Bildung von Metastasen bei Mäusen, die etablierte orthotopische Tumoren tragen, wird durch IHC- Analyse von Lungenschnitten mit einem Antikörper gegen ein prostataspezifisches Zelloberflächenprotein, STEAP, untersucht, das in LAPC-9-Xenografts in hohem Maß exprimiert wird (Hubert, R.S., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25): S. 14523-8.
Mäuse, die etablierte orthotopische LAPC-9-Tumoren tragen, erhalten über einen Zeitraum von 4 Wochen 11 Injektionen eines Anti-103P2D6-mAb oder von PBS. Die Mäuse in beiden Gruppen können eine hohe Tumorlast entwickeln (PSA-Spiegel über 300 ng/ml), um eine hohe Häufigkeit der Metatastasenbildung in der Lunge der Mäuse zu gewährleisten. Die Mäuse werden anschließend getötet, und ihre Prostata und Lunge werden mithilfe einer IHC-Analyse mit Anti-STEAP auf Vorhandensein von LAPC-9-Zellen analysiert.
Diese Studien zeigen die breite Anti-Tumor-Wirksamkeit von Anti-103P2D6-Antikörpern auf die Bildung und Progression von Prostatakrebs in Xenograft-Mausmodellen. Anti-103P2D6-Antikörper hemmen die Bildung von androgenabhängigen und androgenunabhängigen Tumoren, verzögern das Wachstum bereits etablierter Tumoren und verlängern das Überleben behandelter Mäuse. Darüber hinaus zeigen Anti-103P2D6-mAbs eine drastische Hemmwirkung auf die Streuung eines lokalen Prostatatumors zu entfernten Orten, selbst bei Vorhandensein einer hohen Tumorlast. Anti-103P2D6-mAbs sind daher in Bezug auf wichtige, klinisch relevante Endpunkte/den PSA-Spiegel (Tumorwachstum), die Verlängerung des Überlebens und die Gesundheit wirksam.
TABELLEN

TABELLE I: Krebsgewebe, die 103P2D6 exprimieren

Prostata

Kolon

Magen

Lunge

Bauchspeicheldrüse

Brust

Blase

Knochen

Niere

Hoden

Gebärmutterhals

Eierstock

Gebärmutter

TABELLE II: AMINOSÄUREABKÜRZUNGEN

EIN-BUCHSTABEN-CODE	DREI-BUCHSTABEN-CODE	VOLLSTÄNDIGE BEZEICHNUNG

F	Phe	Phenylalanin
L	Leu	Leucin
S	Ser	Serin
Y	Tyr	Tyrosin
C	Cys	Cystein
W	Trp	Tryptophan
P	Pro	Prolin
H	His	Histidin
Q	Gln	Glutamin
R	Arg	Arginin
I	Ile	Isoleucin
M	Met	Methionin
T	Thr	Threonin
N	Asn	Asparagin
K	Lys	Lysin
V	Val	Valin
A	Ala	Alanin
D	Asp	Asparaginsäure
E	Glu	Glutaminsäure
G	Gly	Glycin

TABELLE III: AMINOSÄURESUBSTITUTIONSMATRIX

Adaptiert ausgehend von der GCG-Software 9.0 BLOSUM62-Aminosäuresubstitutionsmatrix (Blocksubstitutionsmatrix). Je höher der Wert, desto wahrscheinlicher ist es, dass in verwandten, natürlichen Proteinen eine Substitution gefunden wird.

A

C

D

E

F

G

H

I

K

L

M

N

P

Q

R

S

T

V

W

Y

4

0

–2

–1

–2

0

–2

–1

–2

–1

1

0

–3

–2

A

9

–3

–4

–2

–3

–1

–3

–1

–3

–1

–2

C

6

2

–3

–1

–3

–1

–4

–3

1

–1

0

–2

0

–1

–3

–4

–3

D

5

–3

–2

0

–3

1

–3

–2

0

–1

2

0

–1

–2

–3

–2

E

6

–3

–1

0

–3

0

–3

–4

–3

–2

–1

1

3

F

6

–2

–4

–2

–4

–3

0

–2

0

–2

–3

–2

–3

G

8

–3

–1

–3

–2

1

–2

0

–1

–2

–3

–2

2

H

4

–3

2

1

–3

–2

–1

3

–3

–1

I

5

–2

–1

0

–1

1

2

0

–1

–2

–3

–2

K

4

2

–3

–2

–1

1

–2

–1

L

5

–2

0

–1

1

–1

M

6

–2

0

1

0

–3

–4

–2

N

7

–1

–2

–1

–2

–4

–3

P

5

1

0

–1

–2

–1

Q

5

–1

–3

–2

R

4

1

–2

–3

–2

S

5

0

–2

T

4

–3

–1

V

11

2

W

7

Y

TABELLE IV (A): HLA-KLASSE-I-SUPERMOTIVE

SUPERMOTIV	POSITION 2	C-TERMINUS

A2	L, I, V, M, A, T, Q	L, I, V, M, A, T
A3	A, V, I, L, M, S, T	R, K
B7	P	A, L, I, M, V, F, W, Y
B44	D, E	F, W, Y, L, I, M, V, A
A1	T, S, L, I, V, M	F, W, Y
A24	F, W, Y, L, V, I, M, T	F, I, Y, W, L, M
B27	R, H, K	A, L, I, V, M, Y, F, W
B58	A, S, T	F, W, Y, L, I, V
B62	L, V, M, P, I, Q	F, W, Y, M, I, V

TABELLE IV (B): HLA-KLASSE-II-SUPERMOTIVE

1	6	9

W, F, Y, V, I, L	A, V, I, L, P, C, S, T	A, V, I, L, C, S, T, M, Y

Tabelle V: Scoring-Ergebnisse 103P2D6-HLA-Peptide A1 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	52	NAEQPELVF	45,000
2	253	LTEAHGKWR	22,500
3	105	SMEAQGLSF	22,500
4	356	DTDNPPLYC	6,250
5	153	STDGTFMPS	6,250
6	161	SIDVTNESR	5,000
7	321	YLVPSLTRY	5,000
8	374	ALFPSLGTY	5,000
9	425	VLDIPTTQR	5,000
10	473	LLDWQGIFA	2,500
11	500	CLFIFVLIY	2,500
12	208	TQDYKWVDR	1,500
13	538	VSETSCQVS	1,350
14	450	YSEEIKSNI	1,350
15	203	IGLPNTQDY	1,250
16	69	WTYSGQWMY	1,250
17	506	LIYVRVFRK	1,000
18	434	QTACGTVGK	1,000

Tabelle V: Scoring-Ergebnisse 103P2D6-HLA-Peptide A1 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
19	378	SLGTYDLEK	1,000
20	405	TLEAHQSKV	0,900
21	461	LHEASENLK	0,900
22	118	LLEGNFSLC	0,900
23	126	CVENKNGSG	0,900
24	84	QAEVQNHST	0,900
25	520	NSQPLNLAL	0,750
26	63	ASASTWWTY	0,750
27	222	WSGNDTCLY	0,750
28	233	QNQTKGLLY	0,625
29	21	LVQPQHLLA	0,500
30	404	QTLEAHQSK	0,500
31	136	FLGNIPKQY	0,500
32	496	IVLFCLFIF	0,500
33	291	SVNNSGLFF	0,500
34	383	DLEKAILNI	0,450
35	394	AMEQEFSAT	0,450
36	55	QPELVFVPA	0,450
37	299	FLCGNGVYK	0,400
38	313	WSGRCGLGY	0,375
39	442	KQCCLYINY	0,375
40	414	SSLASASRK	0,300
41	413	VSSLASASR	0,300
42	71	YSGQWMYER	0,300
43	134	GPFLGNIPK	0,250
44	354	QGDTDNPPL	0,250
45	174	DTSVCLGTR	0,250
46	224	GNDTCLYSC	0,250
47	540	ETSCQVSNR	0,250
48	150	WFDSTDGTF	0,250
49	502	FIFVLIYVR	0,200
50	505	VLIYVRVFR	0,200

Tabelle VI: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A1 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	473	LLDWQGIFAK	50,000
2	394	AMEQEFSATK	18,000
3	354	QGDTDNPPLY	12,500
4	262	CADASITNDK	10,000
5	483	VGDWFRSWGY	6,250
6	118	LLEGNFSLCV	4,500
7	464	ASENLKNVPL	2,700
8	538	VSETSCQVSN	2,700
9	153	STDGTFMPSI	2,500
10	356	DTDNPPLYCN	2,500
11	337	ITNLRSFIHK	2,500
12	499	FCLFIFVLIY	2,500
13	451	SEEIKSNIQR	2,250
14	253	LTEAHGKWRC	2,250
15	46	LCEHLDNAEQ	1,800
16	52	NAEQPELVFV	1,800
17	450	YSEEDCSNIQ	1,350
18	438	GTVGKQCCLY	1,250
19	505	VLIYVRVFRK	1,000
20	49	HLDNAEQPEL	1,000
21	84	QAEVQNHSTS	0,900
22	405	TLEAHQSKVS	0,900
23	104	ASMEAQGLSF	0,750
24	290	LSVNNSGLFF	0,750
25	203	IGLPNTQDYK	0,500
26	161	SIDVTNESRN	0,500
27	202	LIGLPNTQDY	0,500
28	425	VLDIPTTQRQ	0,500
29	358	DNPPLYCNPK	0,500
30	373	RALFPSLGTY	0,500
31	207	NTQDYKWVDR	0,500
32	495	LIVLFCLFIF	0,500
33	86	EVQNHSTSSY	0,500
34	198	SAVPLIGLPN	0,500
35	55	QPELVFVPAS	0,450
36	105	SMEAQGLSFA	0,450
37	542	SCQVSNRAMK	0,400
38	552	GLTTHQYDT	7,452
39	246	NLFCSYGLT	5,377
40	405	TLEAHQSKV	4,451

Tabelle VI: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A1 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	242	QLFRNLFCS	3,678
42	238	GLLYQLFRN	3,678
43	156	GTFMPSIDV	3,574
44	322	LVPSLTRYL	3,495
45	38	LTNQSNCWL	2,774
46	36	SELTNQSNC	2,527
47	387	AILNISKAM	2,527
48	499	FCLFIFVLI	2,202
49	106	MEAQGLSFA	2,077
50	490	WGYVLLIVL	1,936

Tabelle VII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A2 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	497	VLFCLFIFV	4571,688
2	117	RLLEGNFSL	1879,592
3	493	VLLIVLFCL	1792,489
4	45	WLCEHLDNA	105,596
5	282	WLTGSNLTL	98,267
6	492	YVLLIVLFC	93,592
7	13	TLTAFLTIL	76,550
8	10	LQLTLTAFL	74,930
9	75	WMYERVWYP	61,634
10	495	LIVLFCLFI	50,968
11	79	RVWYPQAEV	50,512
12	318	GLGYLVPSL	49,134
13	329	YLTLNASQI	47,991
14	241	YQLFRNLFC	47,151
15	339	NLRSFIHKV	46,199
16	239	LLYQLFRNL	44,160
17	11	QLTLTAFLT	43,222
18	460	RLHEASENL	42,917
19	537	LVSETSCQV	42,418
20	20	ILVQPQHLL	36,316
21	228	CLYSCQNQT	23,846
22	110	GLSFAQVRL	21,362
23	518	SLNSQPLNL	21,362

Tabelle VII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A2 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
24	289	TLSVNNSGL	21,362
25	393	KAMEQEFSA	21,249
26	473	LLDWQGIFA	18,580
27	535	QLLVSETSC	18,382
28	8	ALLQLTLTA	18,382
29	292	VNNSGLFFL	17,393
30	53	AEQPELVFV	17,108
31	27	LLAPVFRTL	13,800
32	108	AQGLSFAQV	13,398
33	26	HLLAPVFRT	12,506
34	19	TILVQPQHL	10,868
35	119	LEGNFSLCV	8,737
36	336	QITNLRSFI	7,890
37	219	GLTWSGNDT	7,452
38	552	GLTTHQYDT	7,452
39	246	NLFCSYGLT	5,377
40	405	TLEAHQSKV	4,451
41	242	QLFRNLFCS	3,678
42	238	GLLYQLFRN	3,678
43	156	GTFMPSIDV	3,574
44	322	LVPSLTRYL	3,495
45	38	LTNQSNCWL	2,774
46	36	SILTNQSNC	2,527
47	387	AILNISKAM	2,527
48	499	FCLFIFVLI	2,202
49	106	MEAQGLSFA	2,077
50	490	WGYVLLIVL	1,936

Tabelle VIII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A2 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	500	CLFIFVLIYV	3255,381
2	497	VLFCLFIFVL	2792,698
3	492	YVLLIVLFCL	424,398
4	496	IVLFCLFIFV	400,023
5	494	LLIVLFCLFI	370,677
6	296	GLFFLCGNGV	257,342
7	502	FIFVLIYVRV	244,154
8	37	ILTNQSNCWL	199,738
9	9	LLQLTLTAFL	199,738
10	117	RLLEGNFSLC	143,193
11	291	SVNNSGLFFL	137,144
12	136	FLGNIPKQYC	125,690
13	536	LLVSETSCQV	118,238
14	321	YLVPSLTRYL	108,094
15	13	TLTAFLTILV	69,552
16	148	ILWFDSTDGT	51,522
17	331	TLNASQITNL	49,134
18	3	SLSNCALLQL	49,1314
19	238	GLLYQLFRNL	30,036
20	118	LLEGNFSLCV	28,756
21	22	VQPQHLLAPV	27,573
22	10	LQLTLTAFLT	27,564
23	527	ALSPQQSAQL	21,362
24	11	QLTLTAFLTI	19,822
25	445	CLYINYSEEI	16,359
26	338	TNLRSFIHKV	14,682
27	404	QTLEAHQSKV	14,654
28	329	YLTLNASQIT	14,054
29	518	SLNSQPLNLA	11,426
30	19	TILVQPQHLL	10,868
31	393	KAMEQEFSAT	10,441
32	110	GLSFAQVRLL	9,827
33	472	PLLDWQGIFA	9,119
34	353	TQGDTDNPPL	8,880
35	20	ILVQPQHLLA	8,446
36	318	GLGYLVPSLT	7,452
37	12	LTLTAFLTIL	6,687
38	205	LPNTQDYKWV	6,368
39	335	SQITNLRSFI	5,818
40	378	SLGTYDLEKA	5,599

Tabelle VIII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A2 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	439	TVGKQCCLYI	5,021
42	234	NQTKGLLYQL	4,982
43	325	SLTRYLTLNA	4,968
44	525	NLALSPQQSA	4,968
45	544	QVSNRAMKGL	4,299
46	220	LTWSGNDTCL	4,186
47	58	LVFVPASAST	4,101
48	488	RSWGYVLLIV	3,554
49	61	VPASASTWWT	3,411
50	343	FIHKVTPHRC	3,142

Tabelle IX: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-PEPTIDE A3 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	500	CLFIFVLIY	360,000
2	378	SLGTYDLEK	120,000
3	304	GVYKGFPPK	90,000
4	506	LIYVRVFRK	90,000
5	204	GLPNTQDYK	60,000
6	299	FLCGNGVYK	30,000
7	321	YLVPSLTRY	13,500
8	374	ALFPSLGTY	13,500
9	505	VLIYVRVFR	9,000
10	494	LLIVLFCLF	9,000
11	502	FIFVLIYVR	9,000
12	493	VLLIVLFCL	6,075
13	425	VLDIPTTQR	6,000
14	134	GPFLGNIPK	6,000
15	497	VLFCLFIFV	6,000
16	318	GLGYLVPSL	5,400
17	117	RLLEGNFSL	4,050
18	178	CLGTRQCSR	4,000
19	105	SMEAQGLSF	4,000
20	136	FLGNIPKQY	3,000
21	69	WTYSGQWMY	3,000
22	9	LLQLTLTAF	3,000
23	13	TLTAFLTIL	2,700

Tabelle IX: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-PEPTIDE A3 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
24	404	QTLEAHQSK	2,250
25	26	HLLAPVFRT	2,025
26	447	YINYSEEIK	2,000
27	110	GLSFAQVRL	1,800
28	282	WLTGSNLTL	1,800
29	20	ILVQPQHLL	1,350
30	75	WMYERVWYP	1,350
31	496	IVLFCLFIF	1,350
32	518	SLNSQPLNL	1,200
33	434	QTACGTVGK	1,000
34	552	GLTTHQYDT	0,900
35	118	LLEGNFSLC	0,900
36	339	NLRSFIHKV	0,900
37	239	LLYQLFRNL	0,900
38	460	RLHEASENL	0,900
39	543	CQVSNRAMK	0,900
40	242	QLFRNLFCS	0,900
41	442	KQCCLYINY	0,720
42	289	TLSVNNSGL	0,600
43	359	NPPLYCNPK	0,600
44	343	FIHKVTPHR	0,600
45	329	YLTLNASQI	0,600
46	508	YVRVFRKSR	0,600
47	8	ALLQLTLTA	0,600
48	495	LIVLFCLFI	0,540
49	383	DLEKAILNI	0,540
50	228	CLYSCQNQT	0,500

Tabelle X: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A3 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	505	VLIYVRVFRK	270,000
2	228	CLYSCQNQTK	100,000
3	473	LLDWQGIFAK	90,000
4	394	AMEQEFSATK	60,000
5	242	QLFRNLFCSY	60,000
6	497	VLFCLFIFVL	40,500
7	460	RLHEASENLK	30,000
8	239	LLYQLFRNLF	30,000
9	252	GLTEAHGKWR	9,000
10	493	VLLIVLFCLF	9,000
11	445	CLYINYSEEI	9,000
12	337	ITNLRSFIHK	6,000
13	549	AMKGLTTHQY	6,000
14	494	LLIVLFCLFI	5,400
15	500	CLFIFVLIYV	4,500
16	8	ALLQLTLTAF	4,500
17	478	GIFAKVGDWF	4,500
18	11	QLTLTAFLTI	3,600
19	296	GLFFLCGNGV	3,000
20	142	KQYCNQILWF	2,700
21	178	CLGTRQCSRF	2,000
22	121	GNFSLCVENK	1,800
23	73	GQWMYERVWY	1,800
24	118	LLEGNFSLCV	1,800
25	3	SLSNCALLQL	1,800
26	403	KQTLEAHQSK	1,800
27	204	GLPNTQDYKW	1,800
28	495	LIVLFCLFIF	1,350
29	117	RLLEGNFSLC	1,350
30	438	GTVGKQCCLY	1,350
31	412	KVSSLASASR	1,200
32	499	FCLFIFVLIY	1,080
33	331	TLNASQITNL	0,900
34	304	GVYKGFPPKW	0,900
35	527	ALSPQQSAQL	0,900
36	504	FVLIYVRVFR	0,900
37	467	NLKNVPLLDW	0,900
38	424	HVLDIPTTQR	0,900
39	238	GLLYQLFRNL	0,810
40	75	WMYERVWYPQ	0,675

Tabelle X: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A3 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	492	YVLLIVLFCL	0,608
42	49	HLDNAEQPEL	0,600
43	219	GLTWSGNDTC	0,600
44	246	NLFCSYGLTE	0,600
45	20	ILVQPQHLLA	0,600
46	9	LLQLTLTAFL	0,600
47	289	TLSVNNSGLF	0,600
48	37	ILTNQSNCWL	0,600
49	433	RQTACGTVGK	0,600
50	110	GLSFAQVRLL	0,540

Tabelle XI:Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A11 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzre-ste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	304	GVYKGFPPK	12,000
2	134	GPFLGNIPK	2,400
3	506	LIYVRVFRK	2,400
4	404	QTLEAHQSK	1,500
5	204	GLPNTQDYK	1,200
6	434	QTACGTVGK	1,000
7	543	CQVSNRAMK	0,900
8	378	SLGTYDLEK	0,800
9	320	GYLVPSLTR	0,720
10	229	LYSCQNQTK	0,400
11	447	YINYSEEIK	0,400
12	299	FLCGNGVYK	0,400
13	502	FIFVLIYVR	0,320
14	122	NFSLCVENK	0,200
15	508	YVRVFRKSR	0,200
16	359	NPPLYCNPK	0,200
17	338	TNLRSFIHK	0,120
18	474	LDWQGIFAK	0,120
19	156	GTFMPSIDV	0,120
20	505	VLIYVRVFR	0,120
21	208	TQDYKWVDR	0,120
22	308	GFPPKWSGR	0,120
23	79	RVWYPQAEV	0,120

Tabelle XI: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A11 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
24	253	LTEAHGKWR	0,100
25	496	IVLFCLFIF	0,090
26	178	CLGTRQCSR	0,080
27	425	VLDIPTTQR	0,080
28	343	FIHKVTPHR	0,080
29	161	SIDVTNESR	0,080
30	480	FAKVGDWFR	0,080
31	142	KQYCNQILW	0,072
32	540	ETSCQVSNR	0,060
33	395	MEQEFSATK	0,060
34	174	DTSVCLGTR	0,060
35	117	RLLEGNFSL	0,054
36	438	GTVGKQCCL	0,045
37	365	NPKDNSTIR	0,040
38	21	LVQPQHLLA	0,040
39	69	WTYSGQWMY	0,040
40	291	SVNNSGLFF	0,040
41	89	NHSTSSYRK	0,040
42	333	NASQITNLR	0,040
43	237	KGLLYQLFR	0,036
44	393	KAMEQEFSA	0,036
45	442	KQCCLYINY	0,036
46	251	YGLTEAHGK	0,030
47	414	SSLASASRK	0,030
48	12	LTLTAFLTI	0,030
49	337	ITNLRSFIH	0,030
50	380	GTYDLEKAI	0,030

Tabelle XII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A11 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	337	ITNLRSFIHK	2,000
2	505	VLIYVRVFRK	1,800
3	433	RQTACGTVGK	1,800
4	403	KQTLEAHQSK	1,800
5	473	LLDWQGIFAK	1,200
6	412	KVSSLASASR	1,200
7	460	RLHEASENLK	1,200
8	228	CLYSCQNQTK	0,800
9	504	FVLIYVRVFR	0,600
10	446	LYINYSEEIK	0,600
11	424	HVLDIPTTQR	0,600
12	508	YVRVFRKSRR	0,400
13	250	SYGLTEAHGK	0,400
14	394	AMEQEFSATK	0,400
15	298	FFLCGNGVYK	0,300
16	121	GNFSLCVENK	0,240
17	542	SCQVSNRAMK	0,200
18	262	CADASITNDK	0,200
19	207	NTQDYKWVDR	0,200
20	70	TYSGQWMYER	0,160
21	87	VQNHSTSSYR	0,120
22	304	GVYKGFPPKW	0,120
23	108	AQGLSFAQVR	0,120
24	384	LEKAILNISK	0,120
25	252	GLTEAHGKWR	0,120
26	501	LFIFVLIYVR	0,120
27	492	YVLLIVLFCL	0,090
28	479	IFAKVGDWFR	0,080
29	88	QNHSTSSYRK	0,080
30	142	KQYCNQILWF	0,072
31	193	RTWNSSAVPL	0,060
32	291	SVNNSGLFFL	0,060
33	97	KVTWHWEASM	0,060
34	380	GTYDLEKAIL	0,060
35	177	VCLGTRQCSR	0,060
36	496	IVLFCLFIFV	0,060
37	507	IYVRVFRKSR	0,060
38	342	SFIHKVTPHR	0,060
39	438	GTVGKQCCLY	0,045
40	439	TVGKQCCLYI	0,040

Tabelle XII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A11 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	213	WVDRNSGLTW	0,040
42	133	SGPFLGNIPK	0,040
43	73	GQWMYERVWY	0,036
44	303	NGVYKGFPPK	0,030
45	203	IGLPNTQDYK	0,030
46	307	KGFPPKWSGR	0,024
47	478	GIFAKVGDWF	0,024
48	451	SEEIKSNIQR	0,024
49	204	GLPNTQDYKW	0,024
50	296	GLFFLCGNGV	0,024

Ta Delle XIII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A24 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	381	TYDLEKAIL	200,000
2	491	GYVLLIVLF	180,000
3	240	LYQLFKNLF	180,000
4	143	QYCNQILWF	100,000
5	446	LYINYSEEI	82,500
6	398	EFSATKQTL	24,000
7	486	WFRSWGYVL	20,000
8	498	LFCLFIFVL	20,000
9	511	VFRKSRRSL	20,000
10	212	KWVDRNSGL	14,400
11	117	RLLEGNFSL	14,400
12	479	IFAKVGDWF	14,000
13	507	IYVRVFRKS	13,860
14	245	RNLFCSYGL	12,000
15	150	WFDSTDGTF	10,000
16	460	RLHEASENL	9,600
17	520	NSQPLNLAL	8,640
18	493	VLLIVLFCL	8,400
19	27	LLAPVFRTL	8,064
20	81	WYPQAEVQN	7,500
21	529	SPQQSAQLL	7,200
22	10	LQLTLTAFL	7,200
23	322	LVPSLTRYL	7,200

Tabelle XIII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A24 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
24	19	TILVQPQHL	7,200
25	94	SYRKVTWHW	7,000
26	210	DYKWVDRNS	7,000
27	38	LTNQSNCWL	6,000
28	449	NYSEEIKSN	6,000
29	20	ILVQPQHLL	6,000
30	545	VSNRAMKGL	6,000
31	4	LSNCALLQL	6,000
32	292	VNNSGLFFL	6,000
33	231	SCQNQTKGL	6,000
34	528	LSPQQSAQL	6,000
35	2	GSLSNCALL	6,000
36	518	SLNSQPLNL	6,000
37	438	GTVGKQCCL	6,000
38	232	CQNQTKGLL	6,000
39	466	ENLKNVPLL	6,000
40	194	TWNSSAVPL	6,000
41	371	TIRALFPSL	5,760
42	239	LLYQLFRNL	5,760
43	305	VYKGFPPKW	5,500
44	362	LYCNPKDNS	5,000
45	6	NCALLQLTL	4,800
46	235	QTKGLLYQL	4,800
47	42	SNCWLCEHL	4,800
48	103	EASMEAQGL	4,800
49	490	WGYVLLIVL	4,800
50	318	GLGYLVPSL	4,800

Tabelle XIV: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A24 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	328	RYLTLNASQI	150,000
2	449	NYSEEIKSNI	84,000
3	375	LFPSLGTYDL	30,000
4	486	WFRSWGYVLL	20,000
5	503	IFVLIYVRVF	15,000
6	517	RSLNSQPLNL	12,000
7	491	GYVLLIVLFC	10,500
8	26	HLLAPVFRTL	10,080
9	370	STIRALFPSL	8,640
10	238	GLLYQLFRNL	8,640
11	321	YLVPSLTRYL	8,640
12	498	LFCLFIFVLI	8,400
13	492	YVLLIVLFCL	8,400
14	510	RVFRKSRRSL	8,000
15	193	RTWNSSAVPL	8,000
16	240	LYQLFRNLFC	7,500
17	320	GYLVPSLTRY	7,500
18	76	MYERVWYPQA	7,500
19	41	QSNCWLCEHL	7,200
20	18	LTILVQPQHL	7,200
21	528	LSPQQSAQLL	7,200
22	9	LLQLTLTAFL	7,200
23	317	CGLGYLVPSL	7,200
24	109	QGLSFAQVRL	6,000
25	29	APVFRTLSIL	6,000
26	331	TLNASQITNL	6,000
27	464	ASENLKNVPL	6,000
28	288	LTLSVNNSGL	6,000
29	231	SCQNQTKGLL	6,000
30	281	WWLTGSNLTL	6,000
31	362	LYCNPKDNST	6,000
32	291	SVNNSGLFFL	6,000
33	12	LTLTAFLTIL	6,000
34	19	TILVQPQHLL	6,000
35	381	TYDLEKAILN	5,000
36	305	VYKGFPPKWS	5,000
37	489	SWGYVLLIVL	4,800
38	234	NQTKGLLYQL	4,800
39	380	GTYDIEKAIL	4,800
40	519	LNSQpLNLAL	4,800

Tabelle XIV: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A24 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	140	IPKQyCNQIL	4,800
42	5	SNCAILQLTL	4,800
43	353	TQGDtDNPPL	4,800
44	527	ALSPqQSAQL	4,800
45	49	HLDNaEQPEL	4,400
46	493	VLLIvLFCLF	4,320
47	544	QVSNrAMKGL	4,000
48	323	VPSLtRYLTL	4,000
49	1	MGSLsNCALL	4,000
50	485	DWFRsWGYVL	4,000

Tabelle XV: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide B7 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	376	FPSLGTYDL	80,000
2	529	SPQQSAQLL	80,000
3	371	TIRALFPSL	40,000
4	314	SGRCGLGYL	40,000
5	29	APVFRTLSI	24,000
6	322	LVPSLTRYL	20,000
7	103	EASMEAQGL	12,000
8	418	SASRKDHVL	12,000
9	471	VPLLDWQGI	8,000
10	140	IPKQYCNQI	8,000
11	20	ILVQPQHLL	6,000
12	197	SSAVPLIGL	6,000
13	275	GHRTPTWWL	6,000
14	511	VFRKSRRSL	6,000
15	235	QTKGLLYQL	4,000
16	453	EIKSNIQRL	4,000
17	110	GLSFAQVRL	4,000
18	493	VLLIVLFCL	4,000
19	486	WFRSWGYVL	4,000
20	282	WLTGSNLTL	4,000
21	4	LSNCALLQL	4,000
22	545	VSNRAMKGL	4,000
23	520	NSQPLNLAL	4,000

Tabelle XV: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide B7 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
24	42	SNCWLCEHL	4,000
25	231	SCQNQTKGL	4,000
26	239	LLYQLFRNL	4,000
27	528	LSPQQSAQL	4,000
28	13	TLTAFLTIL	4,000
29	10	LQLTLTAFL	4,000
30	490	WGYVLLIVL	4,000
31	27	LLAPVFRTL	4,000
32	111	LSFAQVRLL	4,000
33	466	ENLKNVPLL	4,000
34	518	SLNSQPLNL	4,000
35	2	GSLSNCALL	4,000
36	19	TILVQPQHL	4,000
37	6	NCALLQLTL	4,000
38	318	GLGYLVPSL	4,000
39	332	LNASQITNL	4,000
40	460	RLHEASENL	4,000
41	1	MGSLSNCAL	4,000
42	289	TLSVNNSGL	4,000
43	23	QPQHLLAPV	4,000
44	438	GTVGKQCCL	4,000
45	232	CQNQTKGLL	4,000
46	245	RNLFCSYGL	4,000
47	38	LTNQSNCWL	4,000
48	117	RLLEGNFSL	4,000
49	292	VNNSGLFFL	4,000
50	554	TTHQYDTSL	4,000

Tabelle XVI: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide B7 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	29	APVFRTLSIL	240,000
2	140	IPKQYCNQIL	80,000
3	323	VPSLTRYLTL	80,000
4	510	RVFRKSRRSL	30,000
5	492	YVLLIVLFCL	20,000
6	291	SVNNSGLFFL	20,000
7	544	QVSNRAMKGL	20,000
8	310	PPKWSGRCGL	12,000
9	417	ASASRKDHVL	12,000
10	527	ALSPQQSAQL	12,000
11	407	EAHQSKVSSL	12,000
12	419	ASRKDHVLDI	12,000
13	196	NSSAVPLIGL	6,000
14	274	DGHRTPTWWL	6,000
15	19	TILVQPQHLL	6,000
16	97	KVTWHWEASM	5,000
17	109	QGLSFAQVRL	4,000
18	220	LTWSGNDTCL	4,000
19	528	LSPQQSAQLL	4,000
20	331	TLNASQITNL	4,000
21	370	STIRALFPSL	4,000
22	437	CGTVGKQCCL	4,000
23	110	GLSFAQVRLL	4,000
24	231	SCQNQTKGLL	4,000
25	353	TQGDTDNPPL	4,000
26	193	RTWNSSAVPL	4,000
27	517	RSLNSQPLNL	4,000
28	41	QSNCWLCEHL	4,000
29	519	LNSQPLNLAL	4,000
30	238	GLLYQLFRNL	4,000
31	26	HLLAPVFRTL	4,000
32	234	NQTKGLLYQL	4,000
33	205	LPNTQDYKWV	4,000
34	128	ENKNGSGPFL	4,000
35	486	WFRSWGYVLL	4,000
36	12	LTLTAFLTIL	4,000
37	529	SPQQSAQLLV	4,000
38	553	LTTHQYDTSL	4,000
39	317	CGLGYLVPSL	4,000
40	288	LTLSVNNSGL	4,000

Tabelle XVI: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide B7 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	380	GTYDLEKAIL	4,000
42	18	LTILVQPQHL	4,000
43	554	TTHQYDTSLL	4,000
44	37	ILTNQSNCWL	4,000
45	515	SRRSLNSQPL	4,000
46	9	LLQLTLTAFL	4,000
47	321	YLVPSLTRYL	4,000
48	497	VLFCLFIFVL	4,000
49	5	SNCALLQLTL	4,000
50	3	SLSNCALLQL	4,000

Tabelle XVII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide B35 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	140	IPKQYCNQI	24,000
2	376	FPSLGTYDL	20,000
3	529	SPQQSAQLL	20,000
4	222	WSGNDTCLY	15,000
5	391	ISKAMEQEF	15,000
6	471	VPLLDWQGI	12,000
7	63	ASASTWWTY	10,000
8	313	WSGRCGLGY	10,000
9	61	VPASASTWW	10,000
10	205	LPNTQDYKW	10,000
11	29	APVFRTLSI	8,000
12	528	LSPQQSAQL	5,000
13	520	NSQPLNLAL	5,000
14	545	VSNRAMKGL	5,000
15	197	SSAVPLIGL	5,000
16	111	LSFAQVRLL	5,000
17	2	GSLSNCALL	5,000
18	290	LSVNNSGLF	5,000
19	4	LSNCALLQL	5,000
20	103	EASMEAQGL	4,500
21	23	QPQHLLAPV	4,000
22	117	RLLEGNFSL	4,000
23	460	RLHEASENL	4,000

Tabelle XVII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide B35 9-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
24	442	KQCCLYINY	4,000
25	488	RSWGYVLLI	4,000
26	314	SGRCGLGYL	3,000
27	235	QTKGLLYQL	3,000
28	453	EIKSNIQRL	3,000
29	418	SASRKDHVL	3,000
30	128	ENKNGSGPF	3,000
31	371	TIRALFPSL	3,000
32	115	QVRLLEGNF	3,000
33	92	TSSYRKVTW	2,500
34	167	ESRNDDDDT	2,250
35	69	WTYSGQWMY	2,000
36	482	KVGDWFRSW	2,000
37	200	VPLIGLPNT	2,000
38	309	FPPKWSGRC	2,000
39	323	VPSLTRYLT	2,000
40	203	IGLPNTQDY	2,000
41	136	FLGNIPKQY	2,000
42	500	CLFIFVLIY	2,000
43	387	AILNISKAM	2,000
44	245	RNLFCSYGL	2,000
45	439	TVGKQCCLY	2,000
46	321	YLVPSLTRY	2,000
47	428	IPTTQRQTA	2,000
48	132	GSGPFLGNI	2,000
49	98	VTWHWEASM	2,000
50	278	TPTWWLTGS	2,000

Tabelle XVIII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A35 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
1	140	IPKQYCNQIL	60,000
2	323	VPSLTRYLTL	20,000
3	23	QPQHLLAPVF	20,000
4	471	VPLLDWQGIF	20,000
5	29	APVFRTLSIL	20,000
6	365	NPKDNSTIRA	12,000
7	386	KAILNISKAM	12,000
8	373	RALFPSLGTY	12,000
9	517	RSLNSQPLNL	10,000
10	104	ASMEAQGLSF	10,000
11	541	TSCQVSNRAM	10,000
12	549	AMKGLTTHQY	6,000
13	310	PPKWSGRCGL	6,000
14	205	LPNTQDYKWV	6,000
15	419	ASRKDHVLDI	6,000
16	528	LSPQQSAQLL	5,000
17	230	YSCQNQTKGL	5,000
18	334	ASQITNLRSF	5,000
19	313	WSGRCGLGYL	5,000
20	41	QSNCWLCEHL	5,000
21	417	ASASRKDHVL	5,000
22	196	NSSAVPLIGL	5,000
23	290	LSVNNSGLFF	5,000
24	529	SPQQSAQLLV	4,000
25	97	KVTWHWEASM	4,000
26	353	TQGDTDNPPL	3,000
27	235	QTKGLLYQLF	3,000
28	128	ENKNGSGPFL	3,000
29	380	GTYDLEKAIL	3,000
30	407	EAHQSKVSSL	3,000
31	73	GQWMYERVWY	3,000
32	93	SSYRKVTWHW	2,500
33	391	ISKAMEQEFS	2,250
34	167	ESRNDDDDTS	2,250
35	438	GTVGKQCCLY	2,000
36	82	YPQAEVQNHS	2,000
37	232	CQNQTKGLLY	2,000
38	242	QLFRNLFCSY	2,000
39	61	VPASASTWWT	2,000
40	510	RVFRKSRRSL	2,000

Tabelle XVIII: Scoring-Ergebnisse 103P2D6 HLA-Peptide A35 10-MERE
Rang	Startposition	Liste der Untersequenzreste	Score (Schätzung der Halbwertszeit der Dissoziation eines Moleküls, das diese Untersequenz enthält)
41	51	DNAEQPELVF	2,000
42	159	MPSIDVTNES	2,000
43	348	TPHRCTQGDT	2,000
44	488	RSWGYVLLIV	2,000
45	278	TPTWWLTGSN	2,000
46	142	KQYCNQILWF	2,000
47	193	RTWNSSAVPL	2,000
48	86	EVQNHSTSSY	2,000
49	202	LIGLPNTQDY	2,000
50	499	FCLFIFVLIY	2,000

Tabelle XIX
Motivtragende Untersequenzen des 103P2D6-Proteins
Posttranslationale Modifizierungsstellen 15 N-Glykosylierungsstellen
Eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinasephoshorylierunsstelle

1 96-99 RKVT

Acht Proteinkinase-C-Phosphorylierunsstellen

1 94–96 SYR

2 191–193 TNR

3 314–316 SGR

4 371–373 TIR

5 420–422 SRK

6 431–433 TQR

7 515–517 SRR

8 546–548 SNR

Signifikanz posttranslationaler Modifikationen Vier Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen

1 168–171 SRND

2 223–226 SGND

3 353–356 TQGD

4 420–423 SRKD

Neun N-Myristoylierungsstellen

1 2–7 GSLSNC

2 110–115 GLSFAQ

3 180–185 GTRQCS

4 204–209 GLPNTQ

5 219–224 GLTWSG

6 224–229 GNDTCL

7 252–257 GLTEAH

8 285–290 GSNLTL

9 304–309 GVYKGF
Die Glykosylierung bzw. die Anbringung von Kohlenhydratketten an Asparagine, Serin- oder Threonineinheiten spielt eine wichtige Rolle bei der Faltung, Stabilität und dem Schutz von Proteinen vor einem Abbau (Biochem J. 2000, 348: 1). Darüber hinaus ermöglicht die Glykosylierung die Sortierung von Proteinen aus dem endoplasmatischen Retikulum entlang dem sekretorischen Pfad als Beitrag zur Proteinlokalisierung (FERS Lett. 2000, 476: 32). Die Glykosylierung trägt außerdem häufig zur Zelladhäsion und Immunerkennung bei (J Mol Biol. 1999, 293: 351).
Phosphorylierung, sei es durch PKC, cAMP- und c-GMP-abhängige Kinasen oder Caseinkinasen, übt einen tief greifenden Effekt auf Proteine aus. Eine Phosphorylierung vermittelt Protein-Protein-Interaktionen sowie die Aktivierung von Signalübertragungswegen. Sie steuert ferner die Lokalisierung, Translokation und enzymatische Aktivierung von Proteinen und reguliert die Aktivierung der Transkription (Mol Immunol. 2000, 37: 1; Cell Mol Life Sci. 2000, 57: 1172-83). Phosphorylierung reguliert zelluläre Funktionen, einschließlich Proliferation, Migration und Genexpression, mittels posttranslationaler Modifizierung von Proteinen (Cell Prolif. 2000, 33: 341; Mol Biol Cell. 2001, 12: 351).
Myristoylierung dient dazu, zahlreiche Proteine auf der zytoplasmatische Seite der Plasmamembran zu verankern. Dieser Vorgang dient dazu, die Proteinrekrutierung, die Assemblierung von Komplexen und die Signalisierung durch Proteine zu ermöglichen (Current Opinion Cell Biol. 1994, 6: 219; J Biol Chem. 1996, 271: 1573).
In 103P2D6 gefundene Motive

14–35 Leucin-Zipper-Muster LTAFLTILVQPQHLLAPVFRTL,
484–516 Mechanosensitiver Kanal mit hoher Leitfähigkeit (Large-conductance mechanosensitive channel), GDWFRSWGYVLLIVLFCLFIFVLIYVRVFRKSRR,
487–507 Natrium/Chlorid-Neurotransmittersymporter-Signatur FRSWGYVLLIVLFCLFIFVLI.

Topologie und Transmembrandomänen
Nach Anwendung von drei verschiedenen Vorhersageprogrammen wird vorgeschlagen, dass 103P2D6 ein membranassoziiertes Protein ist, das überwiegend an der Zelloberfläche exprimiert ist (64%). Es besteht die Möglichkeit, dass 103P2D6 mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiert ist (21%).
Mehrere Möglichkeiten für Transmembran-Domänen und Topologien:

• PSORT (http://psort.nibb.ac.jp) zeigt das Vorhandensein 1 Transmembran-Domäne in AA 493–509 (VLLIVLFCLFIFVLIYV) und 1 Signalsequenz in AA 1–24 (MGSLSNCALLQLTLTAFLTILVQP) an, wobei sich zwischen AA 24 und AA 25 eine Spaltungsstelle befindet.
• TMpred (www.ch.3mbnet.org) zeigt, dass 103P2D6 vier Transmembran-Domänen aufweisen könnte, die nachfolgend aufgeführt sind: TM1 AA 4–22 – a-i TM2 AA 58–77 – i-a TM3 AA 283–300 – a-i TM4 AA 493–509 – i-a

Wenngleich die Wahrscheinlichkeit des Auftretens dieses Szenariums geringer ist, ist es in Anbetracht der Ähnlichkeit mit einem Hüllprotein mit einer einzelnen Transmembran-Domäne möglich, dass 103P2D6 eine multiple Transmembran-Konfiguration aufweist.

• In allen Fällen verläuft der N-Terminus außerhalb der Zelle, während sich der C-Terminus in der Zelle befindet.

Tabelle XX: Häufig vorkommende Motive
Bezeichnung	Durchschnittliche Identität in %	Beschreibung	Mögliche Funktion
zf-C2H2	34%	Zinkfinger, C2H2-Typ	Nukleinsäurebindungsprotein, fungiert als Transkriptionsfaktor, Lokalisierung im Kern wahrscheinlich
Cytochrom b N	68%	Cytochrom b(N-terminal)/b6/petB	Membrangebundene Oxidase, erzeugt Superoxid
ig	19%	Immunglobulindomäne	Domänen sind einhundert Aminosäuren lang und enthalten eine konservierte Disulfidbindung in der Domäne
WD40	18%	WD-Domäne, G-beta-Wiederholung(-Repeat)	Tandem-Wiederholungen aus etwa 40 Resten, die jeweils ein Trp-Asp-Motiv enthalten. Funktion bei der Signalübertragung und Proteininteraktion
PDZ	23%	PDZ-Domäne	Leitet möglicherweise Signalübertragungsmoleküle zu submembranären Stellen
LRR	28%	Leucin-reiche Wiederholung (Leucine Rich Repeat)	Motive mit kurzer Sequenz, die an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind
pkinase	23%	Proteinkinase-Domäne	Konservierter katalytischer Kern, der Serin/Threonin- und Tyrosinproteinkinasen gemeinsam ist, mit einer ATP-Bindungsstelle und einem katalytischen Zentrum
PH	16%	PH-Domäne	Pleckstrin-Homologie, beteiligt an der intrazellulären Signalweiterleitung oder als Bestandteile des Zytoskeletts
EGF	34%	EGF-artige Domäne	30–40 Aminosäuren lang, kommt in der extrazellulären Domäne von membrangebundenen Proteinen oder in sezernierten Proteinen vor
rvt	49%	Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase)
ank	25%	Ank-Wiederholung	Zytoplasmatisches Protein, assoziiert integrale Membranproteine mit dem Zytoskelett
oxidored ql	32%	NADH-Ubichinon/Plastochinon (Komplex I), verschiedene Ketten	Membranassoziiert. Ist an der Translokation von Protonen durch die Membran beteiligt.
efhand	24%	EF-Hand	Kalziumbindungsdomäne, besteht aus einer Schleife aus 12 Resten, beidseitig flankiert von einer Alphahelixdomäne mit 12 Resten
rvp	79%	Retrovirale Aspartylprotease	Aspartyl- oder Säureproteasen, zentriert auf einem katalytischen Aspartylrest
Collagen	42%	Collagendreifachhelix-Wiederholung (20 Kopien)	Extrazelluläre Strukturproteine, beteiligt an der Bildung von Bindegewebe. Die Sequenz besteht aus dem G-X-Y, und die Polypeptidketten bilden eine Dreifachhelix.
fn3	20%	Fibronektin-Typ-III-Domäne	Befindet sich in der extrazellulären Ligendenbindungsregion von Rezeptoren und hat eine Länge von etwa 200 Aminosäuren, wobei zwei Cysteinpaare Disulfidbrücken ausbilden.
7tm 1	19%	Rezeptor mit 7 Transmem-brandomänen (Rhodopsin-Familie)	Sieben hydrophobe Transmembranregionen, wobei sich der N-Terminus extrazellulär und der C-Terminus im Zytoplasma befinden. Signalisierung durch G-Proteine.

SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Polynukleotid, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einem Polynukleotid, welches die in 2 dargestellte Sequenz aufweist, wobei T auch U sein kann; (b) einem Polynukleotid, welches aus der in 2 dargestellten Sequenz von dem Nukleotidrest Nummer 805 bis zu dem Nukleotidrest Nummer 2493 aufweist, wobei T auch U sein kann; (c) einem Polynukleotid, welches für ein 103P2D6 Protein kodiert, dessen Sequenz in 3 dargestellt ist, kodiert durch eine cDNA, welche in dem Plasmid enthalten ist, welches als p103P2D6-B oder p103P2D6-2 bezeichnet und in der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer PTA-1895 bzw. PTA-1155 hinterlegt ist; (d) einem Polynukleotid, welches für die in 3 dargestellte Aminosäuresequenz kodiert; (e) einem Polynukleotid, welches für die in 3 dargestellte Aminosäuresequenz an den Positionen 25–563 kodiert; und (f) einem Polynukleotid, welches in Bezug auf ein beliebiges Polynukleotid gemäß (a) bis (e) gänzlich komplementär ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, welches für die in 3 dargestellte Polypeptidsequenz an den Positionen 25–563 kodiert.
Polynukleotid, welche für ein immunreaktives Epitop-Peptid kodiert, das aus einer Aminosäuresequenz gebildet ist, wie sie in Tabelle V bis Tabelle XVIII dargestellt ist.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 (a) bis (e) oder 2, welches mit einem detektierbaren Marker gelabelt ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, welcher ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 (a) bis (e), 2 oder 3 enthält.
Isolierte Wirtszelle, welche einen Expressionsvektor nach Anspruch 5 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines in 3 dargestellten Proteins oder Peptides, welches die Kultivierung einer Wirtszelle nach Anspruch 6 unter Bedingungen umfasst, die für die Erzeugung des Proteins und Peptides hinreichend sind, um das erzeugte Protein und Peptid wiederzugewinnen.
Isoliertes Protein oder Peptid, kodiert durch das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 (a) bis (e), 2 oder 3.
Isoliertes Protein oder Peptid nach Anspruch 8, welches von der in 3 dargestellten Aminosäuresequenz an den Positionen 25 bis 563 gebildet ist.
Verwendung eines Proteins oder Peptides nach Anspruch 8 oder 9 oder eines Polynukleotides nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten gegen Krebs, wobei der Krebs eine der Krebsarten Prostata-, Darm-, Magen-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Brust-, Blasen-, Knochen-, Nieren-, Hoden- oder Gebärmutterhalskrebs umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Protein nach Anspruch 8 oder 9 oder ein Polynukleotid, welches für dieses Protein kodiert, und gegebenenfalls einen physiologisch verträglichen Träger enthält.