CN116023512A - 一条靶向dna损伤修复蛋白的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一条靶向DNA损伤修复蛋白的多肽及其用途。所述多肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRDVPQWEVFFKR。所述多肽能够高效靶向抑制Artemis和DNA连接酶IV结合，随后抑制DNA损伤修复过程。该多肽BAL与放射治疗可协同增加胞内ROS累积、阻滞细胞周期、抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。并且，本发明将多肽BAL应用于荷瘤小鼠模型中并证实该多肽在体内具备放射增敏作用。本发明对于开发新的放射增敏药物而提高临床上肿瘤放射治疗效果并改善肿瘤患者预后具有重要意义。

Description

一条靶向DNA损伤修复蛋白的多肽及其用途

技术领域

本发明属于生物医药抗癌领域的一种多肽及其用途，具体涉及了一条靶向DNA损伤修复蛋白可发挥肿瘤放射增敏作用的多肽及其用途。

背景技术

放射治疗是目前恶性肿瘤最重要和最有效的治疗手段之一，但大部分实体肿瘤如胶质母细胞瘤、胃肠道腺癌等，对射线非常抗拒，即使高剂量照射后仍容易复发导致治疗失败。证据表明肿瘤对放射线反应的最主要决定因素是肿瘤细胞的内在放射敏感性，即修复放射线造成的DNA双链断裂(DSBs)的能力。抑制DNA修复能增加受照射的肿瘤组织的放射敏感性，而对未照射的正常组织无毒性作用，而且肿瘤组织常有修复机制缺陷，对DNA修复抑制剂更加敏感，因此DNA修复抑制剂是近些年来肿瘤放射增敏研究的热点。然而，近年文献虽然报道了一些放射增敏剂，如DNA-PKcs抑制剂等，但因毒副作用大等原因限制了其应用，目前临床仍非常缺乏高效低毒、靶向性强的放射增敏剂。而且，肿瘤的高度异质性决定了个体化治疗的必要性，探索新的靶点及增敏剂显得尤为重要。

哺乳动物对DNA双链断裂的修复主要由非同源性末端连接(NHEJ)通路完成，已知该通路至少包括7个主要成员：Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Artemis、XRCC4、DNA连接酶IV、XLF。任一成员的缺陷或功能障碍都会造成细胞对放射线高度敏感。其中，Artemis蛋白是近几年研究的热点。在放射性照射诱导的DSBs修复中，Artemis作为多功能的磷酸化蛋白质参与DNA损伤反应的多个方面。首先，Artemis主要通过经典的NHEJ通路直接参与DSBs修复。在NHEJ中，Artemis的核酸内切酶活性能够处理复杂的DNA断端，抑制Artemis能显著降低NHEJ修复的效率。研究表明，Artemis参与了所有的放射性照射诱导的DSBs修复通路，包括备用修复通路。因此，Artemis在放射性照射诱导的DSBs修复反应中，不仅是效应器也是信号传递分子，在参与DNA修复、整合DNA损伤信号通路和细胞反应方面具有关键性作用。

在NHEJ修复通路中，被磷酸化的Artemis进一步和下游蛋白DNA连接酶IV相结合，促进NHEJ的完成。最近的研究发现突变Artemis的氨基酸位点W489、F492和F493突变能阻止Artemis和DNA连接酶IV的结合，进而损害细胞V(D)J重组和DNA修复能力，证明这三个位点对于Artemis和DNA连接酶IV的相互结合至关重要。晶体结构分析也进一步证明了Artemis的C末端485-495肽段能够和DNA连接酶IV相互结合构成稳定复合物。

具有靶向性的小分子多肽作为治疗药物是药物研发的新方向。已经有较多研究表明使用小分子多肽抑制相关蛋白的结合和目的蛋白的磷酸化是可行的。例如Mickael等设计包含有NBS1和ATM结合位点的小分子肽段，并与聚精氨酸序列融合作用于细胞，结果发现该融合多肽能够进入细胞核内并抑制内源性NBS1和ATM的结合，进而抑制了细胞被放射线照射诱导的DNA损伤修复过程。

发明内容

为了解决背景技术中的问题和需求，本发明提供了一条靶向DNA损伤修复蛋白的多肽，该多肽通过穿膜肽导入肿瘤细胞内，与内源性Artemis竞争性结合DNA连接酶IV，干扰它们各自的相互结合，从而抑制Artemis所发挥的DNA损伤修复作用，进而损害肿瘤细胞的修复能力，增加肿瘤细胞的放射敏感性。本发明还提供一种新的肿瘤放射增敏剂，为临床上提高肿瘤患者放射治疗疗效和预后提供研究基础。

本发明的技术方案如下：

一、一条多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

二、一种生物活性物质，包含所述的多肽，包括共价键连接的化合物、纳米颗粒或抗体偶联药物。

三、一种核苷酸序列，能够编码所述的多肽，或者能够编码所述的生物活性物质。

四、一种多肽类药物，包含所述的多肽。

五、在制备用于肿瘤靶向治疗的放射增敏剂和联合用药中的应用。

六、在制备用于通过靶向抑制Artemis和DNA连接酶IV结合实现肿瘤靶向治疗的放射增敏剂和联合用药中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明合成一条靶向Artemis和DNA连接酶IV结合的多肽BAL，且该多肽通过抑制DNA损伤修复通路发挥放射增敏以及抑癌作用，是可依赖于DNA连接酶IV发挥功能的新型放射增敏剂和抑癌药物。同时，该多肽和放射治疗可协同抑制细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡以及增加胞内ROS累积。该多肽在荷瘤小鼠模型中具备放射增敏与抑癌作用，且其在体内对正常组织器官表现为低毒性，无明显副反应。本发明对于开发新的放射增敏剂和抑癌药物，提高临床上肿瘤放射治疗以及靶向治疗效果，改善肿瘤患者预后具有重要意义。

附图说明

图1为该多肽BAL的HPLC检测结果图。

图2为该多肽BAL的质谱鉴定结果图。

图3为在荧光显微镜下观察细胞内的荧光信号来检测该多肽BAL的入胞效率和动力学：用20μM多肽BAL处理Hela细胞，在不同时间点收集细胞，FITC-Streptavidin染色后在荧光显微镜下观察该多肽在细胞中的分布。

图4为Hela细胞用不同浓度的多肽BAL处理，继续培养24-48小时后检测细胞活力。

图5为蛋白免疫共沉淀实验检测该多肽BAL对Artemis和DNA连接酶IV结合的影响。

图6为邻位连接技术检测该多肽BAL在细胞内和DNA连接酶IV的结合。图像的三个部分被放大以清晰呈现：对照肽Bs列出一个显示框，该多肽BAL列出两个显示框。

图7为该多肽BAL延长放射线照射诱导γ-H2AX焦点形成的实验结果图。

图8为该多肽BAL在不同肿瘤细胞系中的克隆形成实验结果以及mRNA的表达水平。

图9为DCLRE1C在TCGA数据库的胆囊癌+肝癌+肝内胆管癌、宫颈癌和前列腺癌病人中肿瘤组织和正常组织中表达水平的统计结果。

图10为该多肽BAL在人胆囊癌细胞GBC-SD和人宫颈癌细胞Hela中的克隆形成实验结果。

图11为图10中GBC-SD和Hela克隆存活曲线的相关参数。n,外推数；k,拟合曲线的钝化常数；D0,平均致死剂量；Dq,准阈值剂量；D37,存活率37％时的照射剂量；SF2,照射剂量2Gy时的存活率；SER,增敏比。

图12为该多肽BAL在敲减LIG4的Hela细胞中的克隆形成实验结果。

图13为图12中Hela克隆存活曲线的相关参数。

图14为该多肽BAL在敲减LIG4的Hela细胞中影响放射线照射诱导γ-H2AX焦点形成的结果。

图15为CCK-8试剂盒检测该多肽BAL抑制放射线照射后细胞的增殖。

图16为该多肽BAL加重放射线照射诱导的细胞周期阻滞结果。

图17为该多肽BAL促进放射线照射诱导的细胞凋亡结果。

图18为该多肽BAL联合放射线照射可进一步导致胞内ROS累积的结果。GBC-SD和Hela细胞处理后用CM-H2DCFDA染色，流式细胞术检测细胞内ROS的水平。

图19为荷瘤小鼠模型中该多肽BAL在肿瘤组织以及正常组织中的分布情况。

图20为该多肽BAL在荷瘤小鼠模型中发挥放射增敏作用的结果。

图21为荷瘤小鼠各重要器官H&E染色结果。

图22为该多肽BAL发挥抑制DNA损伤修复和抗肿瘤活性功能的原理说明示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。但是，本发明并不限于下述的实施例。

具体实施中，由一个标记蛋白生物素(Biotin)、一条穿膜肽TAT(YGRKKRRQRRR)和一段靶向DNA损伤修复蛋白Artemis与DNA连接酶IV的相互作用的氨基酸序列(DVPQWEVFFKR)构成，命名为BAL(Biotin-Artemis-Ligase IV)。标记蛋白生物素(Biotin)设置在多肽的N端，方便对多肽进行检测。穿膜肽TAT对多肽的入胞效率发挥作用。

如图22所示，该多肽BAL发挥抑制DNA损伤修复和抗肿瘤活性的功能：I)放射线照射产生DNA双链断裂；II)通过识别末端3'羟基，DNA连接酶IV:X4复合物被募集到DNA末端的3'突出；III)Artemis与DNA连接酶IV:X4复合物结合并切割3'端的悬垂DNA链，进而后续通过NHEJ途径进一步修复DNA；IV)该多肽BAL竞争性抑制Artemis和DNA连接酶IV:X4复合物的结合，并随后抑制DNA损伤修复过程。该多肽BAL与放射治疗可协同增加胞内ROS累积、阻滞细胞周期、抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。并且，本发明将多肽BAL应用于荷瘤小鼠模型中并证实该多肽在体内具备放射增敏和抗肿瘤作用。

实施例1

肽合成的特征是在两个氨基酸之间形成肽键。固相合成法为多肽和蛋白质合成中常用的技术。如图1所示，体外肽合成通常将输入氨基酸的羧基偶联到正在延长的肽链的氨基端，这种从羧基端(C端)向氨基端(N端)的合成与蛋白质生物合成相反。需要注意的是，由于氨基酸含有多个反应基团，为了防止反应过程中出现副产物，必须添加具有保护作用的化学基团，这些化学基团与氨基酸反应基团结合并阻止或保护功能基团免于非特异性反应。9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl,Fmoc)是常见的N端保护基团，是碱不稳定的保护基团，可以用弱碱，例如哌啶(piperidine)去除。另外，输入氨基酸在被添加上去之前，其羧基需要被活化。虽然肽合成的常见方法有一些关键差异，但它们都遵循相同的逐步方法，一次一个地将氨基酸添加到不断延长的肽链中。

经过以下两个步骤可添加一个新的氨基酸，不断重复至添加完肽链中所有的氨基酸即可：1.脱保护：从新添加的氨基酸中去除特定的保护基团，以允许下一个进入的氨基酸以正确的方向连接到不断延长的肽链上。2.活化与偶联：合成肽偶联前需要使用碳二亚胺如二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)或二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,DIC)激活输入氨基酸上的C端羧基。偶联试剂与羧基反应形成高反应性的O-酰基异脲(O-acylisourea)中间体，该中间体通过亲核攻击快速取代肽链N端脱保护的伯氨基基团，形成新生的肽键。

多肽BAL(Biotin-YGRKKRRQRRRDVPQWEVFFKR)的合成方法如下：

1)树脂浸泡：树脂Fmoc-Arg(Pbf)-wang resin，合成反应器为玻璃管子，置于摇床上反应。

2)氨基酸脱保护：树脂中加入脱保护试剂：20％哌啶/二甲基甲酰胺，30分钟后；脱保护洗涤：二甲基甲酰胺×1次，甲醇×2次，二甲基甲酰胺×3次，得到含有脱保护氨基酸的树脂。

3)氨基酸活化：下一个输入氨基酸:二异丙基碳二亚胺:1-羟基苯并三唑的摩尔比为1:1:1，在玻璃管子中混合并连接1-2小时；连接洗涤：二甲基甲酰胺×2次，甲醇×2次，二甲基甲酰胺×3次，得到活化的输入氨基酸；

4)氨基酸偶联：含有脱保护氨基酸的树脂:活化的输入氨基酸:O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯:N-甲基吗啉的摩尔比为1:3:3:6，于二甲基甲酰胺溶液里混合反应1-3小时；再用二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。

重复以上氨基酸脱保护、活化与偶联步骤至肽链延伸结束，获得包含有初始肽链氨基酸序列的树脂。

4)Biotin偶联：当肽链氨基酸序列偶联结束后，即可进行Biotin的偶联。包含有初始肽链氨基酸序列的树脂:Biotin:O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸:N-甲基吗啉的摩尔比为1:5:5:10，在二甲基甲酰胺溶液里混合反应1-3小时。用甲醇洗涤树脂3次，抽干甲醇，获得包含有Biotin偶联肽链氨基酸序列的树脂。

5)裂解：用裂解液对包含有Biotin偶联肽链氨基酸序列的树脂进行裂解(10ml/kg树脂)，裂解液中，三氟乙酸:三异丙基硅烷:H₂O的摩尔比为90:2.5:2.5，裂解2.5小时；再加入冷乙醚(10ml/ml裂解液)进行沉淀和离心后弃上清液，获得沉淀物，最后将沉淀物真空干燥得到多肽粗品。

6)序列和纯度的验证：用乙睛和水溶解多肽粗品后，用高效液相色谱仪(HPLC)检测分析，收集样品，再用冻干机冻干收集液得到多肽粉末，多肽粉末为目标多肽。图1即为该多肽BAL的HPLC检测结果图。图2为该多肽BAL的质谱鉴定结果图。

测试1：细胞免疫荧光实验

利用Streptavidin-Biotin系统高亲和力结合的特点，用FITC-Streptavidin进行免疫荧光实验，在荧光显微镜下观察细胞内的绿色荧光信号来检测多肽BAL的入胞效率和动力学。

细胞免疫荧光观察多肽入胞情况：1)选择状态较好的Hela细胞，用0.25％胰酶消化成细胞悬液并计数；2)用RPMI-1640完全培养基将Hela细胞重悬至5×10⁴/ml；3)将灭菌细胞爬片放置于12孔板中，然后每孔加入1ml Hela细胞悬液，置于培养箱中培养过夜；4)观察细胞贴壁及生长状态，按照设计的实验组和对照组，加入对应的多肽(终浓度0-40μM)，重新放置于培养箱中孵育，分别于0.5、2、4、8、12、24小时收集细胞进行检测；5)除去培养基，加入PBS清洗细胞一次；6)加入4％多聚甲醛(1ml/孔)室温下固定15分钟后吸弃，PBS清洗一次，5分钟/次；7)加入含1％ TritonX-100/PBS的破膜缓冲液，室温下透膜5分钟，PBS清洗3次；8)加入3％ BSA/TBST封闭液，于摇床上室温封闭30分钟；9)加入3％ BSA/TBST封闭液稀释的FITC-streptavidin(1:500)，于摇床上室温避光孵育2小时；PBS清洗3次，10分钟/次；10)加入DAPI(300μl/孔)复染核，室温下孵育1分钟；PBS清洗2次，10分钟/次；11)用镊子夹取细胞爬片后倒扣在滴加过抗荧光淬灭剂的载玻片上封片；12)荧光显微镜下观察并拍照，图3为在荧光显微镜下观察细胞内的荧光信号来检测该多肽BAL的入胞率和动力学。

结果证实细胞穿膜肽(TAT)序列能够有效介导该多肽穿过细胞膜和核膜，进入细胞的多肽能够稳定存在4-8小时，并在24小时内被细胞清除。

测试2：CCK-8实验

CCK-8检测细胞活力和增殖：1)将生长状态良好的细胞消化下来后计数；2)用完全培养基将细胞稀释至5×10⁴/ml，按100μl/孔接种于96孔细胞培养板中，放置于培养箱中培养过夜；3)显微镜下观察细胞的状态以及贴壁是否均匀；按照设计的实验组和对照组分别加入多肽和等体积的DMSO，放回培养箱中继续培养24-48小时；4)撤去含多肽的培养基，加入含10％ CCK-8试剂的新鲜培养基，于37℃培养箱继续孵育2小时；5)用酶标仪测定450nm处的吸光度并记录；6)根据测得的吸光度，以未经处理的对照组细胞为参照，计算各组细胞的相对活力和增殖情况。图4为Hela细胞用不同浓度的多肽BAL处理后培养24-48小时用CCK-8检测的细胞活力。图15为CCK-8试剂盒检测该多肽BAL联合放射线照射后的细胞活力。

通过分析CCK-8实验的结果发现该多肽BAL本身对肿瘤细胞没有明显的生长抑制作用，即使在100μM的浓度下作用48小时也没有表现出细胞毒作用。因此，该多肽本身细胞毒作用对正常组织细胞的基本无损伤。

放射线照射可抑制细胞增殖，在CCK-8试剂盒检测细胞活力实验中发现该多肽BAL联合放射线照射可进一步抑制细胞增殖。

测试3：蛋白免疫共沉淀(Co-IP)实验

1)冰上预冷PBS、coIP-lysis Buffer和细胞刮；2)取出待检测的细胞，用预冷的PBS洗2次，加入预冷的含1％蛋白酶抑制剂的coIP-lysis Buffer(1ml/10⁷个细胞)，置于冰上；3)用预冷细胞刮刮下细胞，收集细胞悬液至1.5ml EP管中，置于水平摇床上缓慢晃动裂解15分钟，以上所有操作需在冰上进行；4)4℃，12000g离心15分钟，将上清转移到新的EP管中；5)测定蛋白浓度，收集的蛋白可马上进行下一步实验或分装后保存在-20℃一个月；6)用PBS将总蛋白稀释到约1ug/ul，取500ul总蛋白，按照抗体说明书加入一定体积的anti-Flag，置于摇床上4℃孵育1小时；7)次日加入20ul Protein A琼脂糖珠，置于摇床上4℃孵育3小时；8)3000rpm离心1分钟，吸弃上清，用预冷的coIP-lysis Buffer洗沉淀物3次，1ml/次，3000rpm离心1分钟；9)最后一次的沉淀加入80ul 1x SDS loading buffer混匀，置于金属浴中95℃煮5分钟变性后保存于-20℃。图5为该Co-IP实验的样品进行Western Blot，检测该多肽BAL对Artemis和DNA连接酶IV结合的影响。通过蛋白免疫共沉淀实验检测到该多肽BAL在细胞内能够有效抑制Artemis和DNA连接酶IV的相互作用。

测试4：邻位连接技术

邻位连接技术是一项在内源性蛋白质水平上原位检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术，通过邻位连接技术在细胞原位观察到该多肽能够与DNA连接酶IV结合。

邻位连接技术：1)将Hela细胞接种到孔内放置有无菌细胞爬片的6孔细胞培养板中(10⁵个细胞/孔)，置于CO₂培养箱中培养过夜；2)观察细胞状态，加入40μM BAL或Bs处理1小时后，给细胞4Gy的放射线辐照，照射2小时后收集细胞；3)弃培养基，加入4％多聚甲醛，室温固定15分钟；4)弃4％多聚甲醛，PBS缓冲液洗3次；5)用含5μg/ml WGA(Wheat germagglutinin)的PBS染色细胞膜，并在室温下避光孵育5分钟；从此步骤开始，下面的所有步骤都需要避光操作；6)吸出PBS并向细胞中加入50μl预冷的100％甲醇。在-20℃下孵育15-30分钟使其渗透；7)PBS洗两次；在室温下使用

封闭液封闭细胞1小时。8)在

抗体稀释缓冲液中稀释一抗，并在4℃下染色过夜。9)封闭液洗两次，10分钟/次；10)在洗涤时，根据以下体系准备PLA探针(或抗体)，每个反应的总体积为15μl：3μlPLUS抗体+3μl MINUS抗体+9μl

ab稀释缓冲液。混合并在室温下静置20分钟；11)向每个样品中加入15μl的二抗溶液，并在37℃下孵育1小时；12)轻轻吸出二抗溶液，并在1×wash buffer A中洗涤载玻片2次，5分钟/每次；13)根据以下体系准备ligation mix：每个反应的总体积为15μl：3μl(5×)连接原液+11.63μl ddH₂O+0.375μl连接酶；14)向每个样品中加入15μl ligation mix，并在37℃下孵育30分钟；15)用1×wash buffer A清洗细胞两次，2分钟/次；16)根据以下程序准备amplification mix，每个反应的总体积为15μl：3μl(5×)扩增原液+11.81μl蒸馏水+0.1875μl连接酶；17)向每个样品中加入15μlamplification mix，并在37℃下孵育100分钟；18)吸出amplification mix，并用1×washbuffer B洗涤两次，10分钟/次；19)用0.01×wash buffer B清洗细胞1分钟；20)吸出washbuffer B，然后加入DAPI染细胞核；21)取出细胞爬片，用抗荧光淬灭剂封片；22)荧光显微镜下观察并拍照，其结果见图6，显示该多肽BAL在细胞内和DNA连接酶IV的结合。可知，该多肽在细胞内可有效地竞争性抑制Artemis和DNA连接酶IV的相互作用。

测试5：细胞内基因表达水平检测

(1)细胞总RNA提取：1)吸弃培养基，用预冷的PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后加入1ml Trizol裂解细胞，室温静置5分钟；2)收集细胞裂解液至1.5ml RNase-free的Eppendorf(EP)管内，室温静置5分钟；3)加入200μl氯仿，在涡旋混合仪上振荡至EP管内液体充分混合呈乳白色，室温静置5分钟；4)4℃12000rpm离心15分钟；5)离心后混合液分为三层，吸取400μl上层无色水相液体至新的1.5ml EP管中；6)加入400μl异丙醇并颠倒混匀，室温静置10分钟；7)4℃12000rpm离心10分钟，弃上清；8)加入800μl 75％乙醇(DEPC水配置)，轻轻颠倒震荡EP管；9)4℃7500rpm离心5分钟，吸去乙醇；10)室温干燥沉淀，加入适量DEPC水溶解；11)用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度。

(2)逆转录反应：

按照下表配置逆转录反应体系：

表1：基因组DNA去除

反应条件为：42℃，2分钟。

表2：第一链cDNA合成反应

反应条件为：50℃，15分钟；85℃，2分钟。

(3)配置qPCR反应体系(表3)，进而在表4的反应条件下开展：

表3：qPCR反应体系

表4：反应条件为：

计算2^-△△Ct值，分析基因表达差异。图8的b为qPCR检测DCLRE1C在这几种肿瘤细胞系中的mRNA的表达水平；图12的a、14的c为qPCR检测在Hela细胞中LIG4的敲减效率。

测试6：γ-H2AX焦点实验

H2AX是组蛋白H2A家族成员之一，在细胞发生DNA双链断裂后，H2AX139位上的丝氨酸残基被磷酸化后形成γ-H2AX，并迅速招募其他DNA修复蛋白到损伤部位，因此γ-H2AX焦点的出现和持续存在的时间与DNA双链断裂的发生以及DNA修复进程密切相关，是判断是否发生DNA双链断裂和评价DNA损伤修复效率的标志物。

γ-H2AX焦点实验：1)将Hela细胞按照5×10⁴个/孔种植到事先加好灭菌爬片的12孔板中，置于培养箱中培养过夜；2)观察细胞贴壁及生长状态，按照设计的实验组和对照组，加入对应的多肽(终浓度40μM)，放置于培养箱中孵育1小时；3)将细胞置于直线加速器下进行照射，之后放回培养箱中继续培养；4)分别在照射后的0、0.5、1、2、4、8、18和24小时收集细胞，除去培养基，加入PBS清洗细胞一次；5)加入4％多聚甲醛(0.5ml/孔)室温下固定15分钟后吸弃，PBS清洗一次，5分钟/次；6)加入含1％ TritonX-100/PBS的破膜缓冲液，室温下透化5分钟，PBS清洗3次，5分钟/次；7)加入3％ BSA/TBST封闭液室温封闭1小时；8)加入3％ BSA/TBST3封闭液稀释的anti-γ-H2AX(Ser139)抗体(1:1000)，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，10分钟/次；9)加入3％BSA/TBST封闭液稀释的Alexa Fluor 488偶联二抗(1:500)，室温孵育1小时；PBS清洗3次，10分钟/次；10)加入DAPI(300μl/孔)复染核后，用抗荧光淬灭剂封片；11)荧光显微镜下观察并拍照。图7的a为该多肽BAL延长放射线照射诱导γ-H2AX焦点形成的免疫荧光染色图，图7的b为γ-H2AX焦点数目统计图。为了验证该多肽BAL发挥放射增敏作用依赖于Artemis和DNA连接酶IV的DNA损伤修复作用，敲减LIG4后分析该多肽对放射线照射后细胞内γ-H2AX焦点存在时间的影响。图14为该多肽BAL在敲减LIG4的Hela细胞中影响放射线照射诱导γ-H2AX焦点形成的结果，结果显示LIG4表达水平被抑制后，该多肽没有显著增加γ-H2AX焦点的数量，也没有延长γ-H2AX焦点存在的时间，提示其不能发挥抑制DNA损伤修复的作用。图14的a为γ-H2AX焦点形成的免疫荧光染色图；图14的b为γ-H2AX焦点数量的统计图。图14的c为LIG4的敲减效率。

通过免疫荧光实验染色γ-H2AX，本发明观察到该多肽BAL能够显著增加放射线照射后细胞内γ-H2AX焦点的数量并延长其存在时间，说明该多肽对DNA损伤修复通路有抑制作用，且依赖于DNA连接酶IV的DNA损伤修复能力发挥放射增敏作用。

测试7：克隆形成实验

在八种细胞系(三种不同肿瘤类型)中应用克隆存活实验研究该多肽对细胞放射敏感性的影响，结果表明在DCLRE1C(Artemis的编码基因)表达高的细胞系(胆囊癌细胞GBC-SD、前列腺癌细胞DU145以及宫颈癌细胞Hela)中，该多肽BAL显著抑制克隆存活率。说明该多肽对肿瘤细胞放射敏感性的调控可能与细胞内DCLRE1C的表达水平相关，细胞内DCLRE1C的表达水平较高时，该多肽的放射增敏作用较强。该结论一定程度上也论证了该多肽对Artemis的靶向作用影响其放射增敏作用。同时分析TCGA数据库中临床患者组织标本的转录组数据，发现胆囊癌+肝癌+肝内胆管癌以及宫颈癌病人的DCLRE1C在肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织。说明该多肽BAL对Artemis的靶向抑制作用，在胆囊癌+肝癌+肝内胆管癌以及宫颈癌病人中有潜在的临床应用前景。

克隆形成实验是基于单个细胞生长成克隆的能力的体外细胞存活试验，是研究细胞放射敏感性的经典方法。

克隆形成实验：1)将细胞消化后吹散成单细胞悬液并计数，取6孔细胞培养板，每个孔分别接种合适数量的细胞；2)按照设计的实验组和对照组，分别加入40μM多肽，于37℃培养箱中孵育1小时；3)1小时后，用直线加速器按照对应的放射剂量0、2、4和6Gy照射细胞，照射后放回培养箱中继续培养；4)培养24小时后小心吸弃含有多肽的培养基，更换新鲜的完全培养基，继续培养10-14天，每隔5天更换一次培养基；5)显微镜下观察细胞状态及克隆形成的大小和数量；弃掉培养基，PBS清洗1次，再加入75％乙醇室温固定20分钟；6)弃掉乙醇，PBS清洗1次，加入0.5％结晶紫染色液染色1小时；7)弃掉结晶紫染色液，用流水小心冲洗，晾干后计数克隆(≥50个细胞，计数为1个克隆)；8)计算克隆形成率，在Graphpad上用线性回归法(linear regression analyses)拟合存活曲线，并计算D0值(平均致死剂量)、Dq值(准阈值剂量)和D37值(细胞存活37％所需的放射剂量)，计算放射增敏比SER＝对照细胞Dq值/多肽处理细胞Dq值。

图8的a为该多肽BAL在不同肿瘤细胞系中的克隆形成实验结果；图10为该多肽BAL在GBC-SD和Hela细胞中的克隆形成实验结果；图10为a和c分别为克隆形成实验检测该多肽BAL对GBC-SD和Hela细胞的放射增敏作用；图10为b和d分别为该多肽BAL在GBC-SD和Hela细胞中的克隆存活曲线。为了验证该多肽BAL发挥放射增敏作用依赖于其对Artemis和DNA连接酶IV结合的靶向作用，在Hela细胞中转染针对LIG4(DNA连接酶IV的编码基因)的siRNAs，在70％以上LIG4被敲减的条件下，通过克隆形成实验来评价该多肽对细胞放射敏感性的影响，并绘制存活曲线。图12为该多肽BAL在敲减LIG4的Hela细胞中的克隆形成实验结果，结果表明融合多肽依赖于DNA连接酶IV发挥放射增敏作用。图12的a为qPCR检测在Hela细胞中LIG4的敲减效率；图12的b为敲减LIG4的Hela细胞经过不同剂量放射线照射后的克隆存活曲线。图11和图13分别为图10和图12中克隆存活曲线的相关参数。n,外推数；k,拟合曲线的钝化常数；D0,平均致死剂量；Dq,准阈值剂量；D37,存活率37％时的照射剂量；SF2,照射剂量2Gy时的存活率；SER,增敏比。

测试8：细胞周期检测

放射线照射造成细胞周期阻滞，用流式细胞仪检测PI染色后的细胞，分析细胞周期分布情况：1)将待检测的细胞用胰酶消化成细胞悬液，离心后弃上清；2)加入1ml预冷的PBS缓冲液清洗一遍细胞；3)轻轻弹击离心管底以分散细胞，加入1ml预冷的75％乙醇重悬固定细胞，放入4℃冰箱中固定过夜；4)1000rpm，离心5分钟，去除上清，加入预冷PBS缓冲液洗细胞3次；5)每管细胞样品中加入0.5ml PI染色液(染色缓冲液+PI染色液(20×)+RNaseA(50×))，37℃染色30分钟；7)上流式细胞仪检测，用ModFit分析检测结果。图16为该多肽BAL处理GBC-SD细胞后第24小时进行PI染色，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。图16的a为GBC-SD细胞处理后第24小时进行PI染色，流式细胞术检测细胞周期分布情况；图16的b为图16的a图中四个处理组细胞周期分布的统计作图。

结果显示放射线照射导致G2/M期细胞比例增多，在此基础上联合该多肽BAL可进一步增加G2/M期细胞的比例。说明该多肽联合放射线照射可进一步增加细胞周期阻滞。

测试9：细胞凋亡检测

放射线照射诱导细胞凋亡，用7-AAD和AnnexinV将细胞染色后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况：1)细胞经过相应的培养刺激后，收集培养液至15ml离心管内；2)PBS洗细胞一次，加入无EDTA的0.25％胰酶消化细胞，注意避免过度消化；3)将细胞转移至含原先培养基的15ml离心管内，离心后弃上清，加入PBS重悬细胞并计数；4)取5-10万个细胞；用ddH₂O稀释5×binding buffer至1×工作液，并取500μl重悬细胞；5)分别加入5μl AnnexinV-APC和5μl 7-AAD染液，轻轻混匀后，室温避光孵育15分钟；6)在1小时内上流式分析仪检测，用FlowJo分析检测结果。图17为该多肽BAL处理GBC-SD细胞后第96小时进行Annexin V-APC/7-AAD染色，流式细胞以检测细胞凋亡情况。图17的a为GBC-SD细胞处理后第96小时进行AnnexinV-APC/7-AAD染色，流式细胞术检测细胞凋亡情况；图17的b为图17的a图中四个处理组凋亡细胞比例作图。

结果显示该多肽BAL联合放射线照射可协同促进细胞凋亡。

测试10：细胞内ROS检测

放射线照射造成胞内ROS累积，将放射线照射以及多肽处理的细胞用ROS敏感性探针CM-H2DCFDA进行染色，流式细胞术检测细胞内ROS：1)用DMSO溶解CM-H2DCFDA，配置成浓度为10mM的储液；2)将经过多肽和放射线处理过的细胞取出，加入CM-H2DCFDA染液(终浓度为2μM)，37℃避光孵育30分钟；3)吸弃含CM-H2DCFDA染液的培养基，用PBS缓冲液洗一遍，将细胞消化成悬液并转移至离心管，800rpm离心5分钟，4)吸弃上清，加入500μl PBS缓冲液重悬细胞；5)流式细胞仪检测，用FlowJo分析数据。图18为该多肽BAL处理GBC-SD和Hela细胞后用CM-H2DCFDA染色，流式细胞术检测细胞内ROS的水平。

结果显示在GBC-SD和Hela细胞中，在该多肽BAL联合放射线照射可进一步造成胞内ROS累积的增多。

测试11：小鼠荷瘤模型构建与治疗

建立GBC-SD异种移植瘤小鼠模型，将荷瘤小鼠根据处理方式不同分为四组，依次为无处理、放疗+生理盐水、放疗+对照肽Bs和放疗+多肽BAL处理组，腹腔注射多肽及肿瘤部位放射治疗：

1)选择状态良好的人胆囊癌细胞系GBC-SD，用0.25％胰酶消化成细胞悬液并计数；2)将10⁶个GBC-SD细胞接种于6周龄裸鼠右大腿背侧皮下，约2周可成瘤；3)抓取小鼠颈部皮肤，翻转使其腹部朝上，头部略向下倾斜，从右侧腹股沟处进针，缓慢将融合多肽注入小鼠腹腔；观察15分钟，看小鼠有无异常反应；4)注射多肽一小时后，将小鼠麻醉，然后固定在照射专用容器中；5)放射线下透视，将照射部位框出，身体未荷瘤部分用铅块遮挡；6)直线加速器下对肿瘤部位进行放射线照射。治疗后每周两次测量肿瘤大小，并绘制肿瘤生长曲线。图20为该多肽BAL联合放疗治疗荷瘤小鼠，显示多肽BAL联合放疗抑制肿瘤生长，发挥放射增敏作用。图20为该多肽BAL在荷瘤小鼠模型中发挥放射增敏作用的结果。图20的a为多肽BAL联合放疗抑制肿瘤生长；图20的b和c分别为放疗后第31天各组的肿瘤体积和重量。

实验结果显示，与放疗+生理盐水以及放疗+对照肽Bs处理组相比较，放疗+多肽BAL处理组的肿瘤生长速度明显延缓。说明该多肽BAL在荷瘤小鼠体内发挥放射增敏作用，其联合放疗显著抑制肿瘤生长。

测试12：检测多肽在体内组织中的分布情况

有效的肿瘤放射增敏剂应具备高肿瘤组织靶向性和低正常组织靶向性，取多肽腹腔注射后的小鼠肿瘤、肺脏、肾脏和肝脏组织，通过流式细胞术检测多肽标记蛋白Biotin分析其分布情况：1)构建小鼠荷瘤模型；2)在给荷瘤小鼠腹腔注射该多肽BAL后2小时和6小时处死小鼠，取肿瘤组织，消化、研磨以及过滤成单细胞悬液后，用Streptavidin-FITC进行染色；3)在腹腔注射该多肽2小时后取小鼠肺脏、肾脏和肝脏组织，消化、研磨以及过滤成单细胞悬液后，用Streptavidin-FITC进行染色；4)通过流式细胞仪检测染色标记过的肿瘤、肺脏、肾脏和肝脏细胞，分析阳性细胞占比，图19即为荷瘤小鼠模型中该多肽BAL在肿瘤组织以及正常组织中的分布情况。

结果显示该多肽进入肿瘤组织的比例高，并随着时间的延长有一定的降解，而该多肽进入肺脏、肾脏和肝脏中的比例非常低。因而，该多肽进入肿瘤组织的比例远高于其他正常组织，说明该多肽在荷瘤小鼠体内具有肿瘤组织靶向性。测试13：H&E(hematoxylin-eosin staining)染色

合格的放射增敏剂必须对正常组织无毒或低毒，安全性是临床应用的基础。取无处理、放疗+生理盐水、放疗+对照肽Bs和放疗+多肽BAL处理组荷瘤小鼠的肾脏、脾脏、肝脏、肺和心脏等重要器官，通过H&E染色，观察各组小鼠上述器官的组织形态，以及是否出现损伤和坏死。

H&E染色：1)在处理后适当的时间点将小鼠安乐死，分离肿瘤组织；2)将肿瘤组织浸入4％多聚甲醛，4℃固定1小时以上；3)将固定后的组织冰切成4-20μm的切片，粘贴于载玻片上，室温干燥1小时；4)ddH₂O浸泡切片2分钟，苏木素染色液染色5分钟；5)将切片浸入自来水中，置于水平脱色摇床上洗去多余的染色液，约10分钟；6)ddH₂O洗一遍，伊红染色液染色1分钟；7)脱水：70％乙醇10秒，80％乙醇10秒，90％乙醇10秒，无水乙醇10秒；8)将切片浸入二甲苯透明5分钟；9)更换二甲苯，重复一遍步骤7；10)用中性树胶封片；11)显微镜下观察并拍照，图21即为经过不同处理的荷瘤小鼠各重要器官的H&E染色结果。

结果显示，该多肽BAL联合放疗后，小鼠各重要器官的组织形态没有明显改变，说明联合治疗对正常组织器官的毒性较低，可系统性给药，具备潜在的临床应用前景。

本发明涉及的氨基酸序列如下：

SEQ ID No.1；

名称：多肽的氨基酸序列

来源：人工序列(Artificial Sequence)

YGRKKRRQRRRDVPQWEVFFKR

Claims (7)

1.一条多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种生物活性物质，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽，包括共价键连接的化合物、纳米颗粒或抗体偶联药物。

3.一种核苷酸序列，其特征在于，能够编码权利要求1所述的多肽，或者能够编码权利要求2所述的生物活性物质。

4.一种多肽类药物，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。

5.权利要求1所述多肽、权利要求2所述生物活性片段、权利要求3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的多肽类药物的应用，其特征在于：在制备用于肿瘤靶向治疗的多肽类药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备用于肿瘤靶向治疗中放射增敏剂以及联合用药的应用。

7.权利要求5或6所述的应用，其特征在于：在制备用于通过靶向抑制Artemis和DNA连接酶IV结合实现肿瘤靶向治疗的放射增敏剂以及联合用药中的应用。

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