ES2293247T3

ES2293247T3 - Polipeptidos quimericos y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2293247T3
Application number: ES04727873T
Authority: ES
Inventors: Christian Kuhne; Andras Simoncsits
Original assignee: ICGEB; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
Current assignee: ICGEB; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
Priority date: 2003-04-18
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2024-04-16
Also published as: DE602004009301T2; AU2004230254B2; DK1616011T3; AU2004230254A1; JP2006523448A; PL1616011T3; PT1616011E; KR20110074948A; US20150018409A1; JP2011182792A; JP4794432B2; CA2522525A1; ITMI20030821A1; KR20060003029A; EP1616011B1; CN1768142A; KR101360781B1; US20110033384A1; CN100584950C; WO2004092194A3

Abstract

Polipéptido quimérico que puede penetrar membranas biológicas que comprende: a. un polipéptido que muestra afinidad por secuencias nucleótidas específicas. b. una enzima que modifica el ADN. c. una región con una actividad de suministro que cruza la membrana celular, en el que la enzima que modifica el ADN es una endonucleasa de restricción del tipo de clase II o sus subunidades o fragmentos funcionales y las regiones a., b., y c, están unidas covalentemente entre ellas.

Description

Polipéptidos quiméricos y su utilización.

El campo técnico de la invención se refiere a moléculas y procedimientos para el estudio de los sistemas celulares que controlan la actividad de reparación de ADN y el control del ciclo celular.

Los genomas de los organismos vivos están expuestos permanentemente al daño químico que resulta del daño bioquímico o químico endógeno espontáneo o de la exposición a agentes exógenos que dañen el genoma.

Para asegurar los ritmos necesarios de estabilidad genómica, pero para proporcionar asimismo el flujo genómico esencial para la evolución y la adaptación indispensable para todas las especies vivas, se han desarrollado en las células sistemas altamente complejos para las maquinarias de la reparación del ADN y de la recombinación del ADN. El equilibrio entre los dos sistemas responsables por un lado de la fidelidad del genoma y de la generación de diversidad molecular, es regulado por mecanismos de control que aseguran exactitud y precisión. Los niveles de los controles están representados por el denominado "punto de comprobación" o "control de vigilancia" que contribuye a asegurar la fidelidad del genoma en cualquier organismo vivo. Para una revisión con respecto a los mecanismos y los genes conocidos
implicados y para una nomenclatura de referencia, véase, a saber, Zhou B. y S. Elledge, Nature, 2000, 408:433-439.

Recientemente, se han desarrollado muchas herramientas moleculares para el análisis del mecanismo implicado en la reparación del ADN, y de modo más significativo, para el control y la regulación de estos mecanismos. En la patente US nº 6.307.015 por ejemplo, se describen procedimientos y productos que se basan en la proteína Chk1, que se supone permiten la identificación de los mecanismos y productos génicos que son importantes para el control de las verificaciones celulares y de la reparación del ADN por la proteína Chk1.

Además, se desarrollaron procedimientos para la introducción de la recombinación en el genoma de una célula: por ejemplo, Peitz et al, en Proc. Natl. Acad, Sci, 2002, 99:4489-4494 obtuvieron la traducción de una recombinasa quimérica Cre que puede recombinar sitios lox-P que se introdujeron previamente en el genoma con una eficiencia del orden del 50%. Además, en el documento WO 00/46386 se describe asimismo la introducción de la recombinación cromosómica en los sitios SceI introducidos específicamente en combinación con un vector que expresa la meganucleasa SceI.

Tanaka et al (J. Biomed Sci 9 (2002): 534-541) se refiere a una terapia génica para las enfermedades mitocondriales, suministrando la endonucleasa de restricción SmaI en las mitocondrias, proporcionando una proteína de fusión que comprende dicha endonucleasa de restricción fusionada a una secuencia diana mitocondrial.

En Donahue S.L. (Nucleic Acid Res 29 (2001): 1582-1589, se describe una proteína de fusión de una secuencia diana mitocondrial CDC9 fusionada a una endonucleasa de restricción. El gen que codifica dicha proteína de fusión se introduce mediante procedimientos genéticos en el genoma de Saccharomyces cerevisiae.

Rosenberg et al (Innovations 6 (1996): 1-6), describe la tecnología de exhibición fágica y da a conocer una molécula ácido nucleica fágica que transporta una T7 endonucleasa que cuando es transfectada a una célula huésped conduce a la secreción e inmovilización de dicha endonucleasa en la superficie de dicho huésped.

Nishigori C. et al (J. Immunol 161 (1998): 2684-2691), se refiere a liposomas que tienen endonucleasas de restricción HindIII. Dichos liposomas pueden utilizarse para provocar daños en el ADN en células de la piel y, por tanto, para imitar cambios causados regularmente por la radiación UV-B.

En el documento WO-0058488 se describe un procedimiento para modular un procedimiento celular para poner en contacto un cultivo celular con una molécula que modifique el mismo, conjugada a un polipéptido translocante. Dicha proteína translocante es preferentemente el péptido VP22 del Virus del Herpes Simplex tipo 1. La enzima modificadora del procedimiento, que está fusionada a dicha proteína translocante, puede ser una proteína que se una al ADN, en particular la T7-ARN-polimerasa.

En el documento WO-02/096952 se refiere a un conjugado proteico que está formado por dos dominios, en el que el primer dominio es una proteína de transporte y el segundo dominio un polipéptido para la regulación de una señal de marcado.

Phelan et al (Nature Biotech 16 (1998): 440-443) describen una proteína de fusión que comprende la proteína VP22 del Virus del Herpes Simplex fusionada a la proteína p53 que se encuentra en un gran número de tumores en una forma mutada y que es responsable de la regulación del ciclo celular.

Melekhovets et al (Nucleic Acids Res 24 (1996): 1908-1912) se refieren a proteínas de fusión que comprenden una unión específica ARN/ADN y a un dominio ARN/ADN de fragmentación. Los autores describen la producción de una TAT (aminoácidos 1-72) como un dominio de unión al ARN, fusionado con una proteína ARNasa H. Esto da lugar a ARNasa H que ha conseguido su función en una ARNasa para el HIV-1 TAR ARN (naturalmente, la ARNasa H trabaja sólo como una ARNasa para la parte ARN de un híbrido ADN-ARN como único sustrato) y es TAT 1-71 que proporciona la unión específica del ARN a las secuencias TAR.

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La dificultad en el análisis de la reparación del daño al ADN después de la inducción con un agente genotóxico, es que todos estos agentes que dañan al ADN simultáneamente provocan un espectro amplio de distintas lesiones del ADN; así, la introducción de sistemas que actúan sobre el ADN de forma uniespecífica, es de un gran interés. Esto permitiría con alta precisión la definición de productos génicos que están implicados en las vías de control del ciclo celular y, en particular, en la reparación del ADN. La eficiencia de estas vías es esencial para una correcta replicación celular, y su conocimiento detallado permite el desarrollo de sistemas de evaluación para intervenciones farmacéuticas y terapéuticas más selectivas y dirigidas.

Una amplia gama de enfermedades somáticas y hereditarias se asocia con defectos en el mecanismo de reparación del ADN o, más generalmente, en el control de la información genética codificada por el ADN. Muchos de estos defectos constituyen la causa principal de la patología tumoral (por ejemplo, mutaciones en el gen de p53, como ARE', 14-3-3 Sigma, p16, Rb, etc). pero además, estos defectos bien podrían ser además responsables de muchas patologías todavía no caracterizadas y que se clasifican simplemente como "mutaciones somáticas" o " predisposición genética". Ya las mutaciones localizadas en una de las vías y que constituyen la base genética de las enfermedades hereditarias, son: ataxia-telangiectasia (A-T), y los trastornos que se correlacionan con la ataxia (trastorno ATLD, Mre 11 de tipo ataxia-telangiectasia), el síndrome Nijmegen de rotura (NBS), la anemia de Fanconi, el síndrome de Rothmund-Thomson, los linfomas no Hodgkianos (NHL), el síndrome Werner, el síndrome Blooms, el síndrome de la ADN Ligasa IV (LIG4), el Xeroderma pigmentosa, BRCAI.

Las roturas del ADN bicatenario (DSB) representan la alteración más peligrosa del genoma. Puede inducirse, por ejemplo, mediante radiaciones ionizantes, mediante tipos reactivos de oxígeno (ROS) que pueden ser de origen exógeno pero también de condiciones endógenas, por ejemplo del estrés celular. Los ROS son inducidos, asimismo, por agentes quimioterapéuticos que se utilizan en la terapia tumoral, por ejemplo mediante agentes que se intercalan en ADN o se reticulan con el ADN. La reparación de DSB es más difícil que otros tipos de alteración del ADN: los eventos de reparación y de unión de los extremos del DSB provocan inestabilidad genética debida a la pérdida, amplificación o modificación del material genético y son potencialmente tumorigénicos.

Debido al hecho de que estos eventos inducen vías de reparación y de sus controles celulares, su comprensión es de interés fundamental porque esto, a su vez, puede implicar una utilización potencial en terapia.

El objetivo de la presente invención consiste por lo tanto en proporcionar un agente eficiente para tratar dichos defectos en el mecanismo de reparación del ADN o del control de la información genética. Preferentemente, estos agentes tienen que suministrarse a las células y especialmente al núcleo, para que ejerzan en éste su actividad.

Por tanto, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende:

a.: un polipéptido que muestra afinidad por secuencias nucleótidas específicas.

b.: una enzima que modifica al ADN.

c.: una región con actividad de suministro intracelular, en la que la enzima que modifica al ADN es una endonucleasa de restricción del tipo II o sus subunidades o fragmentos funcionales y regiones a., b., y c, están unidas covalentemente a entre ellas.

La presente invención proporciona un sistema para modificar el genoma celular, introduciendo DSB con las moléculas quiméricas de la invención que muestran sitios específicos relacionados en el genoma. Una de las ventajas de las moléculas quiméricas de la invención es la cinética lineal de la actividad, la actividad uniespecífica, y el hecho de que estas moléculas son capaces de penetrar asimismo en la totalidad de las poblaciones celulares de forma independiente del receptor. Ventajosamente, estas eventos provocados por las moléculas quiméricas pueden inducirse sin que se realice una selección por los reactivos selectivos, amplificando intensamente su utilización.

La primera forma de realización de la invención se refiere a moléculas quiméricas que están formadas por: una región, preferentemente de naturaleza polipeptídica, que contiene actividad específica de unión al ADN, derivada ventajosamente de una enzima de restricción de tipo II, una región preferentemente de naturaleza polipeptídica que muestra una actividad catalítica de modificación del ADN, que consiste en una actividad endonucleolítica de las enzimas de restricción de tipo II, y una región con una actividad de suministro de reticulación de la membrana nuclear y/o celular. Estas regiones funcionales mencionadas anteriormente están unidas covalentemente entre ellas.

Otra importante forma de realización de la invención se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican las moléculas quiméricas de la invención si éstas son total o parcialmente de naturaleza polipeptídica.

Según otra forma de realización de la invención, que se deduce de las actividades de los polipéptidos de la invención para interferir con puntos clave de la regulación del ciclo celular y de sus controles de punto de comprobación, debido a la introducción de roturas del ADN bicatenario, la invención contiene varios procedimientos, caracterizados en su totalidad por la utilización de las moléculas quiméricas de la invención en células in vivo. En particular, estos procedimientos según la invención contienen procedimientos diagnósticos para evaluar alteraciones genéticas de los genes que codifican los productos que están implicados en el control del ciclo celular y de la reparación del ADN, que incluyen procedimientos para la selección de composiciones con actividades biológicas capaces de modular estas actividades de control.

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La invención contiene asimismo procedimientos que utilizan las moléculas quiméricas de la invención para el cribado de nuevas actividades de suministro o combinaciones de actividades de suministro.

La invención proporciona además la utilización terapéutica de dichas composiciones como agentes antiproliferantes, antineoplásicos, antibióticos, antiparasitarios, o antivíricos.

Los diversos aspectos de la invención se basan en los resultados de los experimentos proporcionados por los inventores, en el sentido de que es posible introducir interrupciones monoespecíficas en el ADN bicatenario (DSB) en el genoma de una célula in vivo y que estas DSB representan una señal suficiente para la activación de puntos de control (puntos de comprobación) durante el ciclo celular. La mayoría de estas activaciones se conservan a lo largo de la evolución del hombre a las levaduras, encontrándose asimismo mecanismos correspondientes en los procariotas y las arquibacterias.

En los eucariotas estas activaciones son mediadas por la modulación de los productos génicos: ATM (proteína mutada de la Ataxia-Teleangectasia), ATR (Relacionada con la Ataxia-Teleangectasia), ADN- PK_{CS} (subunidad catalítica de la Proteina-Quinasa dependiente del ADN), y sus sustratos directos o indirectos tales como Chk1 (Quinasa 1 "comprobadora de vigilancia"), Chk2 (Quinasa 2 "comprobadora de vigilancia"), Brca1 (Susceptibilidad-1 al cáncer de mama), Brca2 (Susceptibilidad-2 al cáncer de mama), Mre11 (Recombinación meiótica 11), Rad50 (reparación de la rotura del ADN bicatenario debida a la radiación 50), Nbs 1 (síndrome Mijemegen de rotura), Rad51 (reparación de la rotura del ADN bicatenario debida a la radiación 51), FANCD2 (complemento D2 de la anemia de Fanconi), histonas, helicasas como BLM mutación del síndrome de Bloom), WRN (mutación del síndrome de Werner), p53, y las dianas transcripcionales directas o indirectas de p53, como por ejemplo 21 y 14-3-3 sigma, mientras que esta lista no está completa y se conocen asimismo muchas otras dianas e incluso otras todavía por descubrir.

En particular se descubrió que la activación de algunos de estos productos génicos se supone que coordina el mantenimiento de la homeostasis de la integridad del genoma durante la reparación del ADN, la apoptosis o los bloqueos del ciclo celular.

La presente invención proporciona moléculas quiméricas que pueden atravesar la membrana celular, para penetrar en el núcleo en el caso de células eucarióticas o en parásitas en las células, y unirse a sitios específicos en el ADN bicatenario, modificando idealmente el ADN con una cinética de primer orden.

Claramente, estos hallazgos y su modo de utilización, abren la posibilidad de muchas aplicaciones prácticas para la medicina, así como para fines científicos, y proporciona procedimientos únicos para el estudio de los mecanismos de la reparación del ADN, del control de ésta, y del ciclo celular en general, y de productos capaces de modificar el genoma de cualquier célula de una forma selectiva.

En una forma de realización principal, las moléculas quiméricas inventadas contienen tres componentes funcionales:

-: una región constituida por un polipéptido, que muestra actividad por secuencias específicas de ADN o ARN. Esta región está preferentemente representada por una enzima de restricción de clase II, siendo capaces sus subunidades o fragmentos funcionales de reconocer secuencias palindrómicas en el ADN;

-: una región, formada por un polipéptido, que muestra una actividad endonucleolítica de ADN de una enzima de restricción de clase II;

-: una región que contiene una actividad de suministro que es capaz de cruzar las membranas celulares y/o las membranas nucleares y transportar moléculas heterólogas a la célula o a las organelas; esta actividad se denomina "suministradora", mientras que por "suministrador" se quiere hacer referencia a una estructura química que está formada preferentemente por un polipéptido o péptido que puede penetrar en membranas biológicas celulares, y en el caso de los eucariotas, también además en las membranas celulares y en las membranas nucleares, o en las membranas de cualquier otra organela, que incluyen las mitocondrias o los plástidos. Se prefieren específicamente suministradores que permiten el transporte al núcleo.

Los dominios funcionales mencionados anteriormente están conectados covalentemente. Las moléculas quiméricas de la presente invención se obtienen a partir de síntesis química, o, si las regiones funcionales son de naturaleza peptídica, se sintetizan preferentemente mediante tecnologías del ADN recombinante. Para esta forma de realización y para la presente invención, las secuencias nucleótidas que codifican las proteínas quiméricas que contienen las tres regiones funcionales tal como se han definido anteriormente, sirven para la expresión del polipéptido recombinante en un sistema huésped, preferentemente de origen procariótico.

Las moléculas quiméricas de la invención pueden producirse asimismo con tecnologías mezcladas, como mediante procedimientos químicos o recombinantes, mientras que por lo menos una región se relaciona con procedimientos químicos para otros dos productos que son producidos mediante técnicas del ADN recombinante.

En una forma de realización preferida en la molécula quimérica de la invención, la región con actividad de unión específica al ADN es de una endonucleasa de tipo II. Entre las endonucleasas, se seleccionan preferentemente: EcoRV PvuII, HinfI, o sus subunidades o fragmentos funcionales. A continuación en la presente invención, se pretende que como fragmento funcional de un polipéptido se incluya como secuencia aminoácida una secuencia que se derive parcialmente de la secuencia de una de estas proteínas completas que contienen por lo menos una función de la enzima nativa.

Según la presente invención, la región para la actividad de modificación del ADN es una endonucleasa de restricción de tipo II, seleccionada preferentemente de entre la misma endonucleasa que contiene la actividad específica de unión al ADN y en particular, EcoRV, PvuII, HinfI o sus subunidades o fragmentos funcionales. En esta forma de realización preferida, están conectadas en una única proteína homodimérica, las actividades de modificación de ADN y de reconocimiento del ADN.

En este último caso, en una forma de realización preferida, la enzima de restricción está contenida ventajosamente como una molécula de cadena única, mientras que todas las subunidades de la enzima están conectadas convenientemente y expresadas como una única cadena polipeptídica, tal como se describe para la enzima PvuII en Simoncsits A. et al, J. Mol. Biol, 2001, 309, 89-97, conservando las características de unión y fragmentación comparables con la enzima de tipo salvaje.

Los inventores han desarrollado asimismo en la estructura de esta invención una molécula quimérica en la que la enzima de restricción se contiene como una proteína de cadena única y en la que la actividad modificadora cambia o desaparece debido a mutaciones puntuales, deleciones u otras variaciones estructurales de la región, del dominio catalítico o subunidad de la enzima de restricción, permaneciendo comparables con las de la enzima nativa, la afinidad para el reconocimiento y la unión relacionados con el ADN. Las mutaciones específicamente preferidas incluyen dichos mutantes en los que su capacidad de unión ha sido sustancialmente conservada (o incluso potenciada) para los ácidos nucleicos, pero que han perdido una parte significativa (por ejemplo, >50%) o la mayoría (> 80%) de su actividad enzimática (de fragmentación).

Para este último aspecto de la invención que incluye asimismo moléculas quiméricas que contienen por lo menos la región para la transducción o suministro intracelular o suministrador y la región de unión al ADN, tal como se definió anteriormente y que se caracteriza porque la secuencia aminoácida que muestra la afinidad para secuencias específicas del ADN, se prefiere que sea de naturaleza endonucleolítica y tenga por lo menos una homología secuencial del 95% con una enzima de restricción del tipo II. En dichas moléculas quiméricas la actividad enzimática desaparece y se utilizan como vectores para suministro las secuencias específicas del ADN en el genoma, sin utilizar la capacidad de modificación. Una forma de realización preferida de este aspecto de la invención se contiene por la enzima quimérica que se obtiene utilizando, en vez de la secuencia original de la enzima PvuII (como en SCPVUTAT), el mutante D34G del sitio catalítico obtenido mediante la mutación sustitutiva en posición 34 (Asp34/Gly34) de la enzima PvuII, tal como se describe en Nastri et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:25761-25767. En dicha enzima mutada (SC34), la actividad de reconocimiento del ADN es comparable a la de la enzima de tipo salvaje, pero desaparece la actividad endonucleolítica. Dichas moléculas son útiles asimismo como controles para utilizarse en paralelo con las moléculas quiméricas que muestran actividad de modificación.

El suministrador o región para el suministro a través de las membranas celulares y/o de las membranas nucleares, es ventajosamente un péptido. Este se selecciona ventajosamente de entre: la proteína VP22 de HSV, la tercera hélix alfa del homeodominio de la proteína de Antennapedia, las proteínas Tat y Rev de HIV-1 o sus fragmentos o mutantes funcionales. Ejemplos de mutaciones funcionales son los descritos en Ho et al., 2001, Cancer Research., 61:474-577. Una forma de realización preferida son los péptidos de Tat y los que contienen los dominios funcionales con la secuencia YGRKKRRQRRR (que corresponde a la región 47-57 de TAt) del péptido SYGRKKR-RQRRRGGS. Las mutaciones funcionales de este péptido entre los descritos en Ho et al., se utilizan de modo intercambiable. En otra forma de realización las secuencias del suministrador pueden ser específicas para cualquier tipo celular de cualquier especie y de parásitos, incluyendo virus. Por ejemplo, se seleccionan secuencias de secuencias suministradoras bacterianas que conducen a la importación específica de las moléculas quiméricas en los procariotas. A título de ejemplo no limitativo, el suministrador bacteriano puede seleccionarse de entre secuencias oligopéptidas que se describen y revisan en Rajarao et al., 2002, FEMS Microbiology Letters; 215:267-272. Estos péptidos pueden contener un motivo FKDE para un suministro a través de las membranas de E. coli como la secuencia CFFKDEL y sus derivados funcionales. Por ejemplo, para S. aureus pueden utilizarse motivos conteniendo PFS tales como VLTNENPFSDP y para B. subtilis, el motivo YKKSNNPFSD. En otro ejemplo, pueden utilizarse para un suministro específico a las células de levadura, moléculas de la invención que contienen secuencias conocidas en la técnica para penetrar en las levaduras, tales como homólogos del S. cerevisiae alfa y o factores en combinación con secuencias nucleares de importación. Ejemplos de secuencias para un suministro en varias cepas de levaduras son las que se describen en Riezman et al., 1997; Cell 91, 731-738 y en Rajarao et al., 2002, FEMS Microbiology Letters; 215:267-272, especialmente PFS-, YGR-, PFR-, PMF- o motivos conteniendo DCMD.

Una forma preferida de este aspecto de la invención es la utilización de endonucleasas de restricción del tipo II que pueden atravesar las membranas bacterianas y hacer diana y fragmentar a su ADN. Las enzimas de restricción representan el sistema asesino más potente y desarrollado que ha surgido naturalmente en el reino procariótico. La actividad enzimática de las nucleasas se asemeja a una vasta amplificación de una actividad de alteración del ADN, requiriéndose sólo trazas de enzimas para extinguir el crecimiento bacteriano. En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, estas moléculas quiméricas pueden utilizarse para actividades antibióticas y pueden usarse ventajosamente para detener el crecimiento bacteriano de una forma muy selectiva. Se supone que los suministradores bacterianos no penetran en otros tipos celulares como las células humanas y al contrario, los suministradores como las secuencias TAT no penetran en las células bacterianas.

Los antibióticos, los agentes antitumorales (por ejemplo, citostáticos), y otros agentes activos, pueden suministrarse específicamente según la presente invención, preferentemente mediante el acoplamiento covalente de los polipéptidos de la presente invención a dichos agentes activos.

En una ventajosa forma particular de realización, el suministrador o región para el suministro a través de las membranas celulares y/o de las membranas nucleares y de las membranas de las organelas, puede contener un componente adicional modificador o dominio "auxiliar", preferentemente un polipéptido o un compuesto químico. Este dominio puede estar conectado con las secuencias del suministrador o puede situarse en cualquier otra parte de las moléculas quiméricas de la invención. La adición de estas moléculas puede obtenerse con técnicas conocidas, tales como técnicas recombinantes o acoplamiento químico. Como ejemplo pero sin exclusión, para hacer que las moléculas de la invención específicas de un tipo celular constituyan un dominio auxiliar adicional que se encargue de un sitio de unión para un tipo celular específico y por ejemplo, de receptores amplificados específicos tumorales, (por ejemplo, los receptores Her2, TGF\beta RI, o CD20), esto puede obtenerse haciendo que los fragmentos de unión de EGF, y TGF\beta o Fv o los fragmentos de inmunoglobulinas Fv (scFv) de cadena única se integren en el dominio auxiliar. En una forma de realización particular, la enzima de restricción se utiliza en su forma dimérica original, mientras que al extremo N de la primera proteína se une un fragmento inmunoglobulínico específico de cadena ligera que incluye las regiones funcionales CDRL, y al extremo N de la otra proteína del homodímero, se une la proteína inmunoglobulínica variable de cadena pesada que incluye las regiones funcionales CDR1-3H. Estas proteínas quiméricas pueden dimerizarse mediante dimerización de la cadena pesada y de la cadena ligera y mediante la dimerización del dominio de la enzima de restricción. De este modo, éste puede dirigir una unión selectiva específica a ciertos tipos celulares y conducir a un aumento intenso en la captación preferida de las proteínas quiméricas de la invención en las células seleccionadas. Es evidente que estos dominios auxiliares pueden ser múltiples. Por ejemplo, pueden añadirse secuencias adicionales para una diana específica de ADN intracelular no cromosómico tal como ADN mitocondrial o parasitario (por ejemplo, virus, invertebrados, y células infectadas por bacterias). En otra forma de realización, pueden añadirse elementos potenciadores de los suministradores.

Una forma de realización particularmente preferida para una molécula química de la invención, se presenta mediante la SEC ID nº:2, en la que la enzima de restricción PvuII con las dos subunidades conectadas como una proteína de cadena única (SCPVU), representa el dominio o región para la afinidad de unión al ADN y la actividad modificadora del ADN mediante la actividad endonucleolítica, conteniendo además el péptido SYGRKKR-RQRRRGGS de Tat la subunidad intercitoplásmica de suministro.

Una de las formas de realización ventajosas de las proteínas quiméricas de la invención es su estabilidad también en el medio de cultivo celular en presencia de suero. Esta estabilidad puede finalmente aumentarse mediante sustituciones de aminoácidos con configuración L por aminoácidos D, o con aminoácidos no naturales pues es técnicamente posible en la técnica. Estas variantes de la proteína quimérica, como en el caso de las mutaciones puntuales, muestran idéntica actividad enzimática de las enzimas de restricción preferidas, o en ellas desaparece la misma actividad nucleolítica en las moléculas utilizadas para control, y de esta forma, forman parte de la presente invención.

Se incluyen asimismo en la presente invención polinucleótidos aislados que codifican las moléculas quiméricas de la invención y como tales, son entera o parcialmente de naturaleza recombinante y comprenden SEC ID nº:1 que codifica la versión quimérica de cadena única de la enzima PvuII para la cual la región de suministro proteico corresponde a SEC ID nº:4 y es codificada por los nucleótidos SEC ID nº:3. La forma de realización preferida contiene además una muesca polihistidínica, que permite la purificación fácil de la proteína quimérica mediante cromatografía de afinidad de níquel NTA.

La invención contiene además todas las secuencias polinucleótidas que codifican cualquiera de las formas posibles en las que la molécula quimérica es un polipéptido y puede obtenerse mediante tecnología del ADN recombinante con procedimientos que resultan evidentes para los expertos en la materia, tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook y Maniatis, 1989, CHS ed. De acuerdo con estos procedimientos, y también como se describe, por ejemplo, para otras enzimas de restricción, para los péptidos que se utilizan como engarces sintéticos o para los péptidos que se utilizan para la purificación por afinidad, las técnicas son capaces de obtener formas que no muestran diferencias esenciales para la purificación de las proteínas quiméricas mediante la cromatografía de afinidad de níquel NTA.

La invención contiene además todas las secuencias polinucleótidas que codifican cualquiera de las formas posibles en las que la molécula quimérica es un polipéptido y puede obtenerse mediante tecnología del ADN recombinante con procedimientos familiares para los expertos en la técnica, tal como se describe de acuerdo con estos procedimientos, por ejemplo, en Sambrook y Maniatis, 1989, CHS ed.. De acuerdo con estos procedimientos y como se describe asimismo, por ejemplo, para otras enzimas de restricción, para los péptidos que se utilizan como engarces sintéticos o para los péptidos que se utilizan para la purificación por afinidad, las técnicas son capaces de obtener formas que no muestran diferencias esenciales con las formas de la presente invención, incluyéndose de esta forma en las últimas.

Se incluye asimismo en la presente invención una forma de realización ventajosa particular para las moléculas quiméricas de la invención, y en particular para las moléculas quiméricas que se unen al ADN pero con una actividad nucleásica afectada, así como para las moléculas quiméricas que se unen al ARN. En esta forma de realización, la actividad de unión Al ADN o al ARN de las moléculas quiméricas puede utilizarse como una molécula que hace diana en un ácido nucleico específico en una célula. Esto permite el suministro de compuestos como una carga al ADN o al ARN de una célula. Con este fin, compuestos específicos se unen covalente o no covalentemente a estas moléculas quiméricas mediante técnicas recombinantes o acoplamiento químico. Como demostración pero no como exclusión, estos compuestos incluyen: nanopartículas, compuestos orgánicos o inorgánicos y sus combinaciones, tales para demostración pero no como exclusión compuestos radioactivos, quimioterapéuticos como doxorrubicina, bleomicina, vincristina, etopósido, cisplatino, y otros agentes radiomiméticos e inductores de DSB, anticuerpos y sus fragmentos, compuestos coloreados como moléculas fluorescentes, ácidos nucleicos naturales y no naturales, péptidos o polipéptidos que contengan o no actividades enzimáticas. El acoplamiento químico puede alcanzarse con procedimientos conocidos en la técnica, como la unión de compuestos activados con maleimida a cisteínas reducidas en las moléculas quiméricas. Para el caso de moléculas quiméricas de la invención que no contengan una cisteína natural, como por ejemplo PvuII, puede introducirse una cisteína mediante procedimientos sintéticos o recombinantes bien conocidos en la técnica. Como otro ejemplo puede utilizarse la unión de bromo-cian a grupos aminos libres. Una unión particularmente atractiva puede obtenerse mediante corte y empalme proteico y unión a proteínas con compuestos seleccionados. Las moléculas pueden unirse asimismo a los diversos marcadores que se fusionan con las proteínas para la purificación, como por ejemplo, un marcador polihistidínico, un marcador GST o un marcador proteína A, un marcador myc, un marcador HA, biotina, que permite una unión a anticuerpos (como ejemplo pero no como exclusión), fragmentos de anticuerpos o compuestos que contengan glutatión. Las moléculas que se unen de esta forma a las proteínas de la invención pueden o no entrecruzarse con reactivos químicos y UV. Como ejemplo pero no como exclusión, para estos procedimientos de unión, un sitio de atracción particular en las moléculas quiméricas es presentado por las partes terminales N o C.
En el caso de versiones de cadena única, puede utilizarse también ventajosamente el engarce entre las dos subunidades.

Además, existen asimismo los vectores incluidos que contienen las secuencias polinucleótidas anteriormente descritas, y en particular, vectores para la expresión en procariotas que son generalmente más factibles para una expresión de grandes cantidades de proteínas recombinantes.

La utilización de las moléculas quiméricas preferidas de la invención (en las que la enzima modificadora del ADN es una enzima de restricción de tipo II), permite su aplicación en el aspecto principal de la invención, que consiste en un procedimiento para provocar, inducir o generar roturas del ADN bicatenario, en los sitios palindrómicos que son sitios relacionados para una enzima dada, y, por tanto, ventajosamente para las secuencias CAG/CTG (PvuII), GAT/ATC (EcoRV) o G/ANTC (HinfI), que se encuentran al azar en el genoma con una frecuencia estadística de aproximadamente 6.000 pares de bases (EcoRV y PvuII) o 400-500 pares de bases (HinfI).

El efecto inducido de las células en cultivo, después del tratamiento con la proteína quimérica de la invención, se detecta mediante el análisis de la distribución del ciclo celular, mediante análisis FACS, o directamente a partir del genoma mediante transferencia Southern. Todos los procedimientos, el ensayo TUNEL, el marcaje con bromodesoxiuridina (BrdU) y el realizado mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos o derivados proteicos verde-fluorescentes y sus derivados coloreados, pueden utilizarse rutinariamente. Además, la determinación de actividades clonogénicas y la capacidad de proliferación de las células tratadas con las proteínas de la presente invención, representan un indicador de la funcionalidad de los controles de la proliferación, de los controles del ciclo celular y de la reparación del ADN.

La cinética de la actividad de la forma de realización preferida de las proteínas de la invención, medida, por ejemplo, mediante el ensayo TUNEL, es lineal en el intervalo entre 0,001 nM y 100 \muM, más preferentemente entre 0,1 nM y 1 \muM, y más preferentemente, incluso, entre 1 y 500 nM. Esta linearidad representa una de las ventajas de las moléculas quiméricas de la presente invención, y en particular de SCPVUTAT, además de la actividad monoespecífica y de su característica para penetrar en todas las células. Además, eventos que son causados por las moléculas químicas, no tienen que seleccionarse con agentes selectivos específicos y a su vez amplifica ventajosa y notablemente la utilización de la última.

Los efectos que se observan después del tratamiento con las proteínas quiméricas de la invención, y en particular, con la forma preferida de la invención, se reasumen de manera no limitada de la siguiente manera:

-: aumento del porcentaje de las células en fases específicas del ciclo celular, tal como G0-G1/S-S-G2-G2/M-M o en apoptosis o poliploidia. La calidad de estos cambios es específica del tipo celular y esta especificidad representa una comprensión diagnóstica posterior de dicho procedimiento de la invención, y permite detectar cambios y/o mutaciones genéticas o cambios epigenéticos/somáticos en una muestra desconocida, comparada con uno o más controles, por ejemplo, progenies celulares que contienen defectos genéticos bien descritos o también células normales. Por ejemplo, el tratamiento de células que contienen un defecto específico para el control del ciclo celular en el paso G1/S, como mutantes en el gen para p21^{CIP/WAF1} con dichas proteínas de la invención, muestra un aumento del número de células en G2 con respecto a la distribución apreciada después de tratar células normales con dichas proteínas de la invención. En el caso de las células p21^{CIP/WAF1}, las células no se detienen en G1/S, pero todavía muestran un punto de control (punto de comprobación) G2/M parcialmente funcional, y así muestran un aumento relativo del máximo nivel (pico) en fase G2/M, como puede apreciarse en experimentos en los que la distribución del contenido de ADN se analiza mediante FACS y se comparan a células normales de control. Pueden obtenerse resultados similares a partir de experimentos de mutantes en genes, para productos génicos que están implicados en los controles de punto de comprobación para la reparación del ADN, tales como ATM y Nbs.

Tal como se mostró anteriormente, la importancia del procedimiento contiene la comparación de la distribución o la comparación del comportamiento de las células, con respecto a las células de control (células normales o de
control).

-: cambios en los niveles de equilibrio de las proteínas clave que están implicadas en la regulación del ciclo celular y de la reparación. Como un cambio en el nivel de equilibrio de una proteína, se miden las variaciones en la cantidad de proteínas, pudiendo provenir este cambio de variaciones en los niveles de expresión, o en cambios en la estabilidad del ARNm, o cambios en modificaciones proteicas tales como proteolisis, fosforilación, ubiquitinilación u otras modificaciones postraduccionales.

Sobre el nivel de fosforilación de las proteínas que son centrales en la vía de control ATM/ATR/ADN/PK_{CS} y muestran cambios después del tratamiento con dichas proteínas de la invención. Las proteínas que muestran cambios en la fosforilación se describen mejor en la parte experimental siguiente, pero se enumeran en la presente memoria de manera no limitada: ATM (proteína mutada de la Ataxia-Teleangectasia), ATR (proteína relacionada con la Ataxia-Teleangectasia), ADN-PK_{CS} (subunidad catalítica de la Proteína-Quinasa dependiente del ADN), y sus sustratos directos o indirectos tales como Chk1 (Quinasa 1 "comprobadora de vigilancia"), Chk2 (Quinasa 2 "comprobadora de vigilancia"), Brca1 (Susceptibilidad-1 al cáncer de mama), Brca2 (Susceptibilidad-2 al cáncer de mama), Mre11 (proteína 11 de Recombinación meiótica), Rad50 (proteína de reparación de la rotura bicatenaria debida a la radiación 50), Nbs 1 (síndrome Nijemegen de rotura), Rad51 (proteína de reparación de la rotura bicatenaria debida a la radiación 51), FANC-A, C, D2, E, F y G (proteínas de complemento de la anemia de Fanconi), histonas, helicasas, BLM (mutación del síndrome de Bloom), WRN (mutación del síndrome de Werner), p53, etc. En particular, se prefieren los marcadores moleculares y bioquímicos: Nbs, Mer11, Rad51, p53, Chk2, Brca1.

En una forma de realización específica particular de la invención, se representan las variaciones inducidas en p53 y en las dianas transcripcionales de p53 tales como p21^{CIP/WAF1} o 14-3-3 sigma. El análisis de los cambios en los niveles de estas proteínas o de los cambios en la actividad y/o en el estado de fosforilación de las proteínas después del tratamiento con las proteínas de la invención, representa un aspecto importante de la invención y es de particular interés para los diagnósticos. Estas mediciones pueden utilizarse como es bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante procedimientos inmunológicos (por ejemplo, trasferencias Western) con anticuerpos específicos, por ejemplo, para la forma fosforilada de las proteínas como en el caso de un aumento en la forma fosforilada de p53, tal como se detecta con antip53-S15P. Como se demuestra con mayor detalle en la parte experimental siguiente, el tratamiento de distintas progenies celulares con las proteínas de la invención, conduce a un aumento de la proteína p53 y/o en los niveles de fosforilación.

-: cambios de las distribuciones celulares de complejos en los que son importantes proteínas para los controles del ciclo celular o para los controles en la respuesta al estrés en la reparación del ADN. Estas variaciones pueden observarse a partir de la respuesta celular en los focos nucleares en los se localiza el complejo Rad/Mre11/Nbs (Zhong Q. et al, 1999, Science 285: 747-750), la fosforilación de Thr68 de Chk2, la fosforilación de ATM, la fosforilación de la Histona 2AX-Ser135, tal como se analiza con los procedimientos inmunológicos.

Alternativamente, es posible realizar un seguimiento de las variaciones de las distribuciones citoplasmáticas/nu-
cleares de los complejos Cdc2/ciclina B1, Cdc25C, p21^{CIP/WAF1} y 14-3 Sigma, comparando las variaciones de células mutantes con respecto a las normales en respuesta al tratamiento con las proteínas de la invención. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante marcaje fluorescente específico para uno de estos componentes y el análisis con el microscopio, tal como se describe en el ejemplo experimental 12;

-: apoptosis que puede medirse con procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante análisis FACS, mediante la liberación del citocromo C o las actividades de la caspasa o mediante marcaje con anticuerpos específicos para la Anexina V. Un aumento en la apoptosis, por ejemplo, puede detectarse mediante análisis FACS como un aumento en el contenido de sub G1 ADN en neuroblastomas después del tratamiento de las células con proteínas de la invención.

-: Los efectos que son inducidos a partir del tratamiento con las proteínas de la invención, pueden analizarse asimismo midiendo las actividades clonogénicas o las capacidades proliferativas con reacciones colorimétricas bien conocidas en la técnica. Alternativamente, pueden determinarse efectos de las proteínas a largo plazo, por ejemplo, mediante la actividad tumorigénica o el poder invasor en los sistemas de modelos animales.

Las selecciones de las composiciones capaces de modular las alteraciones genómicas de las proteínas de la presente invención, pueden analizarse mediante intercambio de cromátidas hermanas (SCE), análisis de ploidía, amplificaciones genéticas, pérdida de heterocigosidad y otros ensayos bien conocidos en la técnica.

Finalmente, la invención se aplica a un procedimiento para evaluar las predisposiciones genéticas para el desarrollo de tumores o de sensibilidad genotóxica (por ejemplo, sensibilidad a la radiación o a los agentes de intercalación), cuyo procedimiento se ensaya en células obtenidas de muestras desconocidas (por ejemplo, a partir de biopsias), que incluye esencialmente tratamientos con proteínas de la invención, preferentemente en paralelo con células control, y la medición sucesiva de los niveles de expresión o activación de oncogenes tales como, por ejemplo, myc, ras; o de genes supresores tumorales, tales como, por ejemplo, ARF, p16, p53, Brca1, mediante reactivos de ensayo específicos que incluyen procedimientos inmunoenzimáticos.

Mientras las mutaciones de los componentes en el sistema de control del ciclo celular ("comprobador de vigilancia"), conducen a un aumento para la susceptibilidad tumoral, los defectos genéticos en genes que codifican los factores que están implicados en la reparación de las roturas del ADN bicatenario, muestran una penetración inferior, aunque si la combinación de estos defectos con otros factores de riesgo, que pueden ser, por ejemplo, un aumento de los niveles de tipos reactivos de oxígeno (ROS) o factores de inflamación crónica, pueden determinar una mayor incidencia en los tumores.

En síntesis, la invención se refiere a ciertos procedimientos diferentes, que están caracterizados porque utilizan los polipéptidos de la invención en células in vivo, ex vivo o in vitro. En particular, los procedimientos según la invención contienen técnicas diagnósticas para evaluar una alteración genética complicada en los controles del ciclo celular y en la reparación del ADN, y también procedimientos para seleccionar compuestos con una actividad biológica que pueda modular estas actividades de control. Algunos aspectos diversos de la invención se basan en la actividad biológica de los polipéptidos quiméricos de la invención que, debido a la inducción de una rotura del ADN bicatenario con la especificidad anteriormente descrita, activan vías de control para el ciclo celular y para la reparación del ADN ("comprobación de vigilancia").

Como se observa y describe con mayor detalle mediante los ejemplos, y como consecuencia de la inducción de las roturas monoespecíficas del ADN bicatenario, los polipéptidos de la invención muestran actividad terapéutica, y en particular, antiproliferativa y antitumorigénica. La actividad representa, por tanto, otro objeto de la invención. Así, la invención incluye composiciones farmacéuticas que contienen como principio activo los polipéptidos o los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, tal como se describe en la invención. Además, la invención incluye la utilización de los polipéptidos quiméricos de la invención y/o de los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, para la preparación de especialidades farmacéuticas para la prevención, terapia o el diagnóstico de enfermedades neoplásicas o la predisposición a éstas.

Otra forma de realización de la invención incluye la utilización diagnóstica de los polipéptidos o de los polinucleótidos de la invención en el diagnóstico de las patologías tumorales o para el diagnóstico de una predisposición para estas enfermedades, tal como se describe con mayor detalle mediante los ejemplos.

Como una forma de realización preferida, el tratamiento de las células con las proteínas de la presente invención, por ejemplo, para su utilización diagnóstica y utilizándolo tal como se ha descrito anteriormente, se aplica a las muestras de ensayo y en paralelo a las progenies celulares que no contienen la mutación putativa (control). En una forma de realización incluso más preferida del ensayo, se incluyen tratamientos adicionales de control en los proteínas quiméricas de la invención, utilizando progenies celulares de ensayo que contengan, por ejemplo, mutaciones en etapas seleccionadas de las vías de reparación del ADN que permite por comparación, una excelente elaboración de mapas de los cambios genéticos respectivos.

Después de un período de tiempo más largo, tal como después de 24 horas después de la administración de las proteínas de la invención, es posible detectar un efecto diferencial que depende de si las células pueden reparar la alteración genética (rotura del ADN bicatenario, DSB) que fue inducido por las proteínas de la invención y si en tal caso, la distribución de las poblaciones celulares en las diversas etapas del ciclo celular, vuelve a ser normal o no. En células con mutaciones del gen que codifica ATM o o, por ejemplo, en otros genes que codifican productos que están implicados en la vía NHEJ (Unión del Extremo No Homólogo) de reparación del ADN, la apoptosis no puede observarse inmediatamente, pero constituye un efecto indirecto de baja incidencia. Por el contrario, en las células del neuroblastoma, la apoptosis de las células es inmediatamente inducida de forma directa. En otra forma de realización, la totalidad de la invención incluye la utilización de las proteínas quiméricas y de los polinucleótidos que codifican estas proteínas para inducir la apoptosis en las células de origen neuronal, y preferentemente para el neuroblastoma, y de este modo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores de origen neuronal.

La inducción de la apoptosis en los neuroblastomas se correlaciona con la deleción de 1p36 en combinación con la amplificación en dos minutos (DM) del oncogen myc-N. Esta hipersensibilidad no se correlaciona con la presencia de la translocación 17q15. Las amplificaciones de myc-N DM constituyen conjuntos episómicos myc-N, conocidas como las formas más agresivas de myc-N NB y que poseen un pronóstico extremadamente baja. Gran parte de las NB malignas agresivas muestran este tipo de amplificación oncogénica. A título de ejemplo no limitativo, en otra forma de realización particular, también se incluye el tratamiento de tumores mamarios y prostáticos que contienen DM como otros tumores que contienen amplificaciones DM de oncogenes. En general, las moléculas quiméricas que se unen a dichos compuestos pueden utilizarse para la preparación de una especialidad farmacéutica para el tratamiento de tumores seleccionados.

La respuesta celular a un tratamiento con las proteínas de la invención es diferente de las células que presentan una mutación en las vías de reparación del ADN o en las que muestran cambios en los componentes que son responsables del control de estas vías para el ciclo celular y/o de la reparación ("comprobación de vigilancia"). Por tanto, la presente invención contiene una serie de procedimientos, caracterizados en su totalidad sustancialmente porque utilizan la inducción de DSB en el genoma de una célula-prueba, aplicando la forma de realización preferida de las moléculas quiméricas según la invención y el análisis de las respuestas con ensayos tales como los que se describen anteriormente, y comparando preferentemente los resultados de la muestra de ensayo con las células estándares de naturaleza lo más posible isogénica.

Los efectos de las proteínas de la invención en el ciclo celular y en los mecanismos para la reparación del ADN se sinergizan en presencia de inductores de radicales libres (ROS), pudiendo ser éste, por ejemplo, H_{2}O_{2}. El efecto sinérgico se observa asimismo a concentraciones muy bajas de las proteínas quimérica, preferentemente inferiores a 10 nm de la proteína SCPVUTAT e inferiores a 10 \muM de H_{2}O_{2}. Por tanto, la invención contiene un procedimiento para la inducción de DSB en el genoma, que se caracteriza por el hecho de que las proteínas de la invención se utilizan en combinación con productores de oxígeno reactivo (ROS), por ejemplo, H_{2}O_{2}. Este procedimiento puede también utilizarse para una selección de compuestos antagonistas o sinérgicos.

La inducción de DSB en una célula in vivo activa una respuesta molecular y celular similar a las inducidas por las radiaciones ionizantes que se utilizan frecuentemente para la terapia antitumoral; pero comparada con éstas, muestra efectos colaterales reducidos. Por lo tanto, otra forma de realización de la invención contiene la utilización de los polipéptidos quiméricos de la invención para la preparación de especialidades farmacéuticas con actividad antitumoral o para terapia, diagnóstico o prevención de enfermedades genéticas que, a su vez, definen la predisposición de un individuo para desarrollar enfermedades causadas por la alteración de la regulación de la actividad proliferativa de una célula y en particular de la patología neoplásica, que incluye productos génicos esenciales para los mecanismos del control de la reparación del ADN.

Basándose en este aspecto, la invención comprende un procedimiento terapéutico que se basa esencialmente en la administración in vivo o ex-vivo de los polipéptidos quiméricos de la invención tal como se definieron anteriormente, en el que se requiere un efecto antiproliferativo, preferentemente antitumorigénico.

Otra forma de realización de la invención contiene un procedimiento para el diagnóstico in vitro de un defecto somático o genético en la reparación del ADN, o en defectos de regulación del ciclo celular, a partir de células aisladas obtenidas a partir de una muestra biológica, consistiendo esencialmente en lo siguiente:

a): Crecimiento de células aisladas en cultivo, a partir del cual se tiene la intención de medir la eficiencia de o la alteración en las vías de reparación del ADN o en la vía del ciclo celular.

b): Incubación de estas células con la molécula preferida de la invención, en la que la enzima modificadora es una endonucleasa de tipo II, y más preferentemente la versión de cadena única de la enzima PvuII (SCPVU). Ventajosamente, en paralelo se lleva a cabo asimismo un tratamiento de las células con un polipéptido de control que muestra una actividad de unión específica al ADN, pero adolece de falta de actividad nucleasa como, por ejemplo, SC34. Opcionalmente, puede realizarse además un tratamiento paralelo de progenies celulares factibles que hayan mutado y/o que sean defectuosas en la reparación del ADN, en los controles de la reparación de ADN y/o del ciclo celular, prefiriéndose que estas progenies sean de naturaleza isogénica;

c): Caracterización y evaluación de las respuestas celulares;

d): Comparación opcional con una progenie celular de control.

"Dos o más progenies celulares isogénicas" significa que muestren antecedentes lo más posiblemente similares, como por ejemplo las progenies celulares: MRC-5 y AT-5; CHO-K1 y KU70 o MO59K y MO59J, tal como se describe y utiliza en los ejemplos experimentales que siguen a continuación. La progenie celular estándar de control puede también ser una progenie celular normal sin cambios en las vías de control del ciclo celular y de la reparación del ADN, y será lo más isogénica posible con respecto a la muestra de prueba, o una progenie celular con un cambio genético bien caracterizado.

En una forma de realización preferida del procedimiento de la invención, las células de ensayo y las de control se desarrollan conjuntamente y bajo condiciones idénticas. Por tanto, se conservan y comparan de forma directa las diferencias en marcadores del cultivo, por ejemplo: capacidad clonogénica, porcentaje de células en apoptosis o en estado de envejecimiento, midiéndose, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad proliferativa con coloraciones de la célula viva, o midiendo marcadores bioquímicos de los descritos anteriormente. Un ejemplo para este tipo de ensayo se describe en Torrence C.J. et al., 2001, Nature Biotechnology, 19, 940-945.

En una forma de realización preferida para la caracterización de la respuesta que se describe en c), se utiliza una medición de la actividad clonogénica, tal como se conoce bien en la técnica, por ejemplo, mediante el crecimiento de las células en cultivo o en agar blando, o mediante análisis FACS después de la tinción del ADN.

Una forma de realización particularmente útil que se describe en la invención y de particular utilidad para el diagnóstico y/o el pronóstico para evaluar: la predisposición genética para el desarrollo de enfermedades neoplásicas, la sensibilidad en la terapia tumoral, en particular la intolerancia con respecto a los tratamientos antitumorales radio o quimioterapéuticos de un paciente, o también la sensibilidad del tejido tumoral en comparación con el tejido sano por razones pronósticas.

La invención contiene asimismo además kits para llevar a cabo los procedimientos de la invención, preferentemente equipos para diagnóstico o investigación.

Algunas formas de realización preferidas del kit contienen:

1): un tubo que contiene el polipéptido quimérico, preferentemente la endonucleasa quimérica seleccionada de entre EcoRV, PvuII o HinfI como una versión de cadena única fusionada con el péptido Tat de suministro, o un vector de expresión que contiene los polinucleótidos que codifican las proteínas quiméricas, en combinación con un tubo (de ensayo) que contiene el polipéptido de control, una proteína quimérica que muestra una unión específica al ADN pero que está impedida en su actividad endonucleásica, o un vector de expresión que contiene los polinucleótidos que codifican esta proteína quimérica. En una forma de realización preferida, el kit está formado por un tubo que contiene la proteína quimérica SCPVUTAT y de otro tubo que contiene ventajosamente la proteína quimérica SC34 en forma liofilizada o en solución acuosa;

2): el kit contiene opcionalmente un tubo con un anticuerpo contra la totalidad o parte del polipéptido quimérico, preferentemente un anticuerpo antiSCPVUTAT;

3): el kit contiene opcionalmente un tubo o un matraz que contiene células de control tal como se han definido anteriormente, por ejemplo, células que son hipersensibles a DSB o células que contienen mutaciones bien caracterizadas en genes que codifican proteínas que están implicadas en la reparación del ADN y en las vías del ciclo celular y sus controles (punto de comprobación). Dichas células podrían estar almacenadas de forma congelada o en matraces adaptados para transporte;

4): el kit contiene opcionalmente reactivos quimioterapéuticos como agentes de intercalación, radiomiméticos, u otros tipos de sustancias químicas, incluyendo fármacos para la determinación y la comparación de los efectos cualitativos y cuantitativos.

Como otra forma de realización importante basada en las actividades de los polipéptidos quiméricos preferidos, la invención contiene un procedimiento para seleccionar las composiciones que modulan, son sinérgicas, antagonistas, o no cambian la actividad reparadora del ADN y/o de los controles del genoma y de la estabilidad de éste en un sistema celular, utilizando cribados de alto rendimiento, basados en las células, que incluyen esencialmente:

a): incubación de células de ensayo con las proteínas quiméricas de la invención, preferentemente en presencia de un apropiado polipéptido de control (en el caso específico de una molécula quimérica que contenga una actividad de unión específica al ADN pero adolezca de actividad endonucleásica, tal como el polipéptido quimérico SC34), opcional también en presencia de sustancias sinérgicas como por ejemplo, H_{2}O_{2} o de otros productores de radicales (libres) y/o de otras sustancias modulantes o antagónicas;

b): opcionalmente, la incubación se lleva a cabo en paralelo con otras células control que sean lo más posiblemente isogénicas con las células de ensayo, por ejemplo, las mismas células que contienen un gen informador. Para los expertos en la materia, resultan conocidos varios genes informadores, entre ellos, por ejemplo, las proteínas EGFP y sus mutantes, tal como se describe, por ejemplo, en Torrance et al., 2001, Nature Biotechnology, 19, 940-945; u otros tipos de informadores que muestran una lectura automática eficiente del ensayo;

c): adición de composiciones que se supone deben ensayarse con respecto a una actividad potencial o a su ausencia: entre ellas, por ejemplo, moléculas únicas o bibliotecas químicas o conjuntos de sustancias químicas, péptidos u otras, o conjuntos de muestras biológicas;

d): la lectura de la respuesta celular se lleva a cabo de modo automático, y preferentemente, con instalaciones de cribado de alto rendimiento (HTS). Ejemplos de esto son sistemas que se basan en la medición de las variaciones de un fenotipo morfológico, como una señal fluorescente inducida como respuesta para controlar sustancias y sustancias positivas al ensayo que muestren actividad biológica en una célula. La respuesta celular puede consistir en cualquier señal celular o señal que provenga de marcadores bioquímicos incluidos, o también de la detección de parámetros celulares, tales como, por ejemplo, el flujo de calcio, el flujo de radicales, el cambio en el citocromo C, combinado con un sistema que permita la detección automática.

Durante este procedimiento de la invención, el orden de las etapas b) y c) puede invertirse.

Este ensayo permite la selección de composiciones que contienen importantes actividades biológicas para el control del ciclo celular, vías de reparación del ADN, inducción de apoptosis, inducción del envejecimiento, o para interrumpir una vía que, a su vez, cause la activación de otra.

Otros ciclos de selección puede aplicarse después de la modificación ventajosa de los compuestos aislados a partir de las primeras tandas de un cribado, para obtener finalmente composiciones que constituyan fármacos más adaptados, o asimismo, para seleccionar características ventajosas adicionales, tales como, por ejemplo, biocompatibilidad o estabilidad del producto.

Además de los aspectos derivados de lo que se ha descrito anteriormente, la invención contiene un procedimiento para inducir bloqueos del ciclo celular o, alternativamente, inducir la apoptosis, preferentemente en células de origen neuronal o, alternativamente, inducir la reparación del ADN en célula aisladas, basándose en la utilización de las moléculas quiméricas de la invención, representadas preferentemente por las endonucleasas de restricción de clase II, e incluso más preferentemente como una versión de cadena única, o incluso, más preferentemente, mediante la enzima SCPVUTAT, así como por polinucleótidos que codifican estas moléculas, y en la que este efecto es sinergizado en presencia de composiciones tales como por ejemplo, loa productores de radicales libres. Estos procedimientos se basan esencial y principalmente en inducir roturas en el ADN bicatenario mediante los polipéptidos quiméricos de la invención.

Otra forma de realización de la invención contiene un procedimiento para la selección de nuevas secuencias de penetración y la selección de las secuencias auxiliares. En esta forma de realización, las secuencias de penetración o auxiliares no están formadas por un compuesto único, sino que se utilizan moléculas de la biblioteca de compuestos para seleccionar dominios putativos auxiliares o de penetración. Estos procedimientos se aplican bien con cribados de alto rendimiento que permiten el análisis de muchas muestras distintas. Los principios que se describen en la invención para el diagnóstico, constituyen asimismo la base para procedimientos de cribado que permiten el descubrimiento de nuevas secuencias auxiliares y de penetración, básicamente para cualquier tipo celular u organismo. Dispositivos automáticos y robóticos permiten cumplir con las etapas que mencionan a continuación con capacidades de alto rendimiento. Esto puede llevarse a cabo pipeteando y leyendo unidades conocidas en la técnica. Como ilustración pero no como exclusión, un cribado de secuencias específicas auxiliares o de penetración está esencialmente constituido por las siguientes etapas:

1.: Para las secuencias auxiliares específicas la secuencia de penetración es constante, y las bibliotecas de las proteínas quiméricas de la invención se construyen con procedimientos de la técnica. Por ejemplo, los extremos N de las proteínas quiméricas de la invención, se fusionan con varios fragmentos funcionales CDRL y de cadena ligera que se mezclan entonces con las mismas proteínas de la invención que están fusionadas a proteínas inmunoglobulínicas variables de cadena pesada que incluyen regiones funcionales CDR1-3H. Esto se obtiene mediante técnicas recombinantes en un sistema de expresión biplasmídico, preferentemente en E. coli. En general, las bibliotecas de inmunoglobulinas o de sus fragmentos, o de proteínas que se unen a receptores o de bibliotecas al azar producidas a partir orígenes naturales o sintéticos, pueden unirse a las proteínas de la invención mediante técnicas recombinantes u otros procedimientos de acoplamiento, tal como se describe también anteriormente. Por ejemplo, las bibliotecas de fragmentos de anticuerpos pueden unirse a las proteínas de la invención haciéndolo a la proteína A contenida en las moléculas de la invención.

2.: Para el caso de una secuencia de penetración, las bibliotecas de cribado pueden obtenerse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, estas bibliotecas se consiguen a partir de orígenes naturales o sintéticos, que incluyen compuestos de cualquier tipo. Para una forma de realización ventajosa particular, las secuencias de penetración bacteriana se criban a partir de fragmentos al azar de ADN de las mismas o distintas especies.

3.: Las bacterias que expresan proteínas de la biblioteca son cultivadas e inducidas para la producción proteica. Estas proteínas pueden aislarse a partir de sobrenadantes de sistemas secretores, pero también a partir de lisis celular seguida por la preparación de una afinidad de alto rendimiento de las proteínas quiméricas, utilizando, por ejemplo, varios marcadores de afinidad, como, por ejemplo, un marcador polihistidínico, un marcador GST, un marcador de proteína A, un marcador myc , un marcador HA, o biotina.

4.: Estas proteínas se utilizan para analizar la función o la función diferencial de una molécula dada procedente de la biblioteca. Si las secuencias son funcionales, las proteínas quiméricas son funcionales. Este es el caso cuando son capaces de cruzar las membranas celulares, y eventualmente, las nucleares, y unirse al ADN y, ocasionalmente, introducir DSB. O para el cribado auxiliar, cuando la función puede detectarse en células seleccionadas. La detección puede llevarse a cabo tal como se ha descrito anteriormente.

5.: Las células o el tejido de ensayo pueden ser de cualquier origen, incluyendo a las células procarióticas en las que la función de las proteínas quiméricas de la invención puede detectarse de una forma, por ejemplo, que se ha descrito anteriormente.

6.: En una forma de realización particularmente útil, las células de ensayo son transfectadas establemente con EGFP (proteína verde fluorescente potenciada) para una fácil lectura.

7.: En otra forma de realización particularmente útil, las células de control son transfectadas establemente de forma diferencial, por ejemplo, con EYFP (proteína fluorescente amarilla potenciada);

8.: Las células de ensayo y de control son cultivadas por separado, o mezcladas en dispositivos multipocillos o en membranas específicas. Las células pueden ser muy similares, con sólo cambios sencillos (por ejemplo, utilizadas para descubrir secuencias auxiliares, tales como células tumorales o no tumorales del mismo origen), o muy diversos (por ejemplo, las células de ensayo es donde deberá tener lugar el suministro, pero en las células de control no deberá producirse éste); esto incluye también células de distintos tipos, tales como células de ensayo como bacterias y células de control de origen humano). La selección de las células permite cualquier combinación técnicamente posible.

9.: Se añaden proteínas a los sobrenadantes de las células y se incuban;

10.: La lectura será para (evaluar) la función de las moléculas quiméricas tal como se describe en los ejemplos anteriores. En un ejemplo ventajoso particular, la detección se lleva a cabo con respecto a las células verdes y amarillas preparadas tal como se ha indicado anteriormente. Las proteínas que producen células amarillas más significativas que las células verdes, se aíslan posteriormente como clones únicos, mediante retrocribado y análisis con procedimientos recombinantes y de espectro de masas bien conocidos en la técnica. En una aplicación preferida en la que las moléculas quiméricas introducen alteraciones en el ADN, después de penetrar en las células, pudiendo realizarse este ensayo todavía de forma más sensible. Las células de ensayo (es decir, las células tumorales) y las células de control (es decir, comparables con las no tumorigénicas) se vuelven hipersensibles a la introducción de DSB mediante interrupción génica o silenciación génica, o introduciendo el aumento dominante o negativo de mutantes funcionales. Esto se obtiene mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como mediante la cotransfección con ARNsi, mediante vectores que expresen ARNsi, vectores diana para interrupciones génicas o mutagénesis, vectores para expresión de mutantes o sobreproducción de proteínas que inhiben importantes funciones en la reparación del ADN y muestran hipersensibilidad a DSB, inhibidores o activadores químicos. Esto permite una lectura más rápida y diferenciada a concentraciones bajas. Por ejemplo, la inhibición ARNsi de Ku70, Ku80, ADNPK_{CS}, ATM, XRCC4 y Ligasa IV, Bc12. Pero también puede introducirse la inhibición de ATM por los compuestos químicos tales como cafeína, P53 u otros factores reguladores de la apoptosis.

11.: Para llevar a cabo otra vez una confirmación final posterior de las secuencias del cribado, se utilizan automática y preferentemente las etapas siguientes:

-: se confirman los clones con proteínas puras

-: se titulan las concentraciones

-: se ensayan las secuencias seleccionadas en las versiones en las que falta la actividad nucleásica.

-: ensayo de otras células

-: ensayos de toxicidad en ratones

La presente invención se describe además mediante los ejemplos siguientes y figuras a título no limitativo.

Figura 1 Purificación de SCPVUTAT de E. coli Expresión y purificación de SCPVUTAT

Las células de E. coli que contienen el plásmido de expresión de SCPVUTAT se indujeron para la expresión de la proteína, llevándose a cabo la purificación tal como se describe en la parte experimental. NI y I representan, respectivamente, los extractos celulares totales de E. coli, no inducidos o inducidos. H1 y H2 son fracciones máximas (que muestran un pico) obtenidas a partir de la purificación en columna de agarosa Hi Trap de Ni^{++} quelante; S1 y S2 las fracciones pico obtenidas a partir de la purificación en una columna de SP-Sepharosa; M representa marcadores de peso molecular (desde la parte superior a la inferior en kDa: 94, 67, 43, 33, 20, 14); SCPVU representa la proteína que no contiene la secuencia TAT y que se purificó de forma similar.

Figura 2 Análisis inmunológico de los extractos proteicos de las células U20S después de la transducción proteica

Las proteínas analizadas fueron: concentraciones en aumento de SCPVUTAT (1, 19, 50, 100, 200 nM; carriles 2-6), SCPVU (200 nM, no contiene la secuencia TAT, carril 7), SC34 (200 nM, derivado de SCPVUTAT que no muestra actividad enzimática, carril 8), control (no se añaden proteínas a las células, carril 1). Diez minutos después de añadir las proteínas a los sobrenadantes de los cultivos celulares, se prepararon los extractos después de un intenso lavado con PBS, se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos monoespecíficos para PvuII (cuadro inferior, IMPORT). Para llevar a cabo una comparación, partes alícuotas de los sobrenadantes de los cultivos celulares, tomadas antes de la preparación del extracto, se incluyeron en el análisis (cuadro superior, SUPERNATANT).

Figura 3 Análisis inmunofluorescente mediante microscopía confocal

Después de 30 minutos de transducción proteica con SCPVUTAT, las células se lavaron, se fijaron con PFA al 3%, se marcaron con anticuerpos monoespecíficos PvuII, y se tiñeron con FITC conjugado con anticuerpos secundarios, para llevar a cabo un análisis confocal inmunofluorescente (verde, cuadro inferior). Además, el contenido en ADN se obtuvo con propidio J^{-} después de digestión de ARNasa A (rojo, cuadro superior).

Figura 4 Análisis TUNEL para la detección de DSB a nivel de célula única

Las células U20S se trataron con SCPVUTAT y se analizaron las DSB con la microscopía confocal de inmunofluorescencia después de marcado con TdT en presencia de dUTP-FITC (TUNEL). El tratamiento fue con 100 nM de SCPVUTAT para los tiempos indicados.

Figura 5 Retrasos del ciclo celular dependiente de la nucleasa inducidos por SCPVUTAT

La distribución de las diversas fases del ciclo celular de las células transducidas con la proteína, se analizó mediante FACS. Se detectó la distribución del contenido de ADN de las poblaciones celulares. 2n representa un equivalente del ADN diploide (que no ha sufrido replicación; fase G1), 4n representa el equivalente del ADN tetraploide (ha sufrido la replicación; fase G2/M). Para el análisis FACS, las células se separaron utilizando el modo DDM que permite estimar el contenido de ADN de una célula única. Las células U20S se hicieron crecer durante 24 (fila superior) o 48 horas (fila inferior) en presencia de cantidades crecientes de SCPVUTAT (10 nM, 50 nM, 100 nM), tal como se indica y con sólo una adición de proteínas; células no tratadas (control); células tratadas con un derivado de SCPVUTAT sin actividad nucleásica (SC34, 100 nM). Todos los histogramas que se muestran representan una medida del contenido de ADN con respecto al número de células, tal como se indica sólo en el cuadro superior derecho.

Figura 6 Actividades quinásicas inducidas por SCPVUTAT

Determinación de la actividad de la ciclina B1 quinasa utilizando la histona H1 como sustrato y los inmunoprecipitados específicos de ciclina B1 a partir de los extractos proteicos obtenidos del cultivo de las células U20S, no tratados o tratados con SCPVUTAT (100 nM), o tratados con nocodazol (0,2 \mug/ml) durante 30 horas. Los inmunoprecipitados específicos de la ciclina B1 se incubaron con la histona H1 en presencia de Y^{32}P-ATP y las mezclas reactivas se separaron en SDS-PAGE y se analizaron mediante autoradiografía. Los números en la parte baja indican las actividades relativas determinadas mediante análisis del fosfosensor de imágenes.

Figura 7 Marcadores bioquímicos para la detención del ciclo celular después de tratamiento con SCPVUTAT

A): Inducción de p53 mediante DSB con extremos romos conteniendo 3'-OH y 5'-fosfato. Las células U20S (carriles 1-7) y HCT116 (carriles 8-14) se trataron con SCPVUTAT (100 nM, SC) o con adriamicina (doxorubicina, 0,02 pg/ml, AD) durante el período de tiempo que se indica; las células no tratadas se utilizaron como un control (carril 0). Se prepararon extractos, separados en SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos para p53 (cuadro superior, p53) o para PARP (cuadro inferior, PARP).

B): Respuesta de reparación de la proteína mutada (ATM) de la Ataxia telangectasia a SCPVUTAT. Ser^{15} fosforilación de p53 dependiente de SCPVUTAT. La progenie celular MRC5 positiva a ATM se trató con SCPVUTAT (100 nM, SC) o con hidroxiurea (1mM, HU) durante los períodos de tiempo indicados; como control se utilizaron células no tratadas (0). Se prepararon los extractos, se separaron en SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos para p53 Ser^{15} (cuadros superiores, Ser15,p53) o para la actina (cuadro inferior, actina).

C): Respuesta de reparación de la proteína (ATM) mutada de la Ataxia -telangiectasia a SCPVUTAT.

Sensibilidad a la cafeína de la Ser^{15} fosforilación de p53 dependiente de SCPVUTAT. Las células AT-5, negativas para ATM, se trataron con SCPVUTAT (100 nM, SC) o con hidroxiurea (1 mM, HU) en presencia de cafeína (2 mM) durante 4 horas; se utilizaron como controles células que no recibieron tratamiento y células sólo con un tratamiento de cafeína. Los extractos se prepararon, separaron en SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos para p53, para p53 Ser^{15} (cuadro superior, Ser15, p53) o para actina (cuadro inferior, actina).

Figura 8 Inducción del bloqueo del ciclo celular y de la actividad clonogénica de células mutadas para ATM (A-5) mediante SCPVUTAT, en comparación con células no mutadas (MRC-5)

a): Distribución del contenido de ADN durante el ciclo celular detectado mediante análisis FACS de células AT-5 después de 36 horas de tratamiento con SCPVUTAT (25 nM, 100 nM) o con adriamicina (0,02 \mug/ml; ADRIAMICINA), o con SC34 (100 nM), y cono control, células no tratadas. Los histogramas representan el contenido de ADN con respecto al número de células; el cuadro a la derecha indica el porcentaje de las distribuciones correspondientes de las diversas etapas del ciclo celular, calculadas con el paquete de programas MODFIT^{TM}.

b): Ensayo formador de colonias con progenies celulares mutadas para ATM e inducidas mediante SCPVUTAT para alterar el ADN. Varias diluciones de AT-5 o MRC-5 (sirve como un control positivo de ATM), se trataron durante 60 minutos con SCPVUTAT (25 nM, barras grises; 100 nM, barras en negro) o no tratadas (barras blancas); las células se lavaron y se cultivaron entonces durante 7-10 días, se tiñeron con GIEMSA y se contaron las colonias. Un sumario de los resultados se muestra mediante los histogramas y representa el promedio de tres experimentos independientes con desviaciones estándar en el intervalo comprendido entre el 10% y 15%, tal como se muestra. Las células no tratadas se mantuvieron al 100%, la barra en negro para las células AT-5 se cerró al 0%, y por tanto, no se indicó.

Figura 9 Comparación de las actividades clonogénicas de células con mutaciones seleccionadas en proteínas únicas implicadas en la vía NHEJ

Ensayo clonogénico de las células CHO que mutaron las proteínas implicadas en la vía de reparación de NHEJ, tratadas con SCIPVUTAT. La progenies celulares que se utilizaron son AA8 (progenie parental), V3 (ADN-PC_{CS}(-/-)) xrss(KU80^{(-/-}) y XR-1 (XRCC4^{(-/-)}). HlS P1.13-11 (KU^{70(-/-)}) y la progenie celular parental correspondiente CHO-K1. Varias diluciones de las células CHO conteniendo las mutaciones NHEJ, tal como se indica, se trataron durante 24 horas con SCPVUTAT (25 nM, barras grises; 100 nM, barras en negro) o no se trataron (barras en blanco), las células se lavaron y entonces se cultivaron durante 7-10 días, se tiñeron con GIEMSA y se contaron las colonias. Se muestra un sumario de los resultados como histograma y representa el promedio de tres experimentos independientes con desviaciones estándar en el intervalo comprendido entre 10% y 15%, tal como se muestra. Las células no tratadas se mantuvieron al 100%, y las barras en negro para las células V3 (ADN-PC_{CS}^{(-/-)} son inferiores al 1% y por tanto, no se ha indicado.

Fig 10

Inducción diferencial de apoptosis en células de neuroblastoma después del tratamiento con SCPVUTAT

Análisis FACS del contenido de ADN teñido con propidio J^{-} de las células del neuroblastoma GI-LIN después del tratamiento con SCPVUTAT (10 nM, cuadro C, 100 nM cuadro B). El tratamiento de las muestras se realizó durante 30 horas. Se utilizaron muestras de control tratadas con SC34 (100 nM, cuadro D) o no tratadas (cuadro A). En la parte inferior de cada cuadro se indica el porcentaje representativo de las distribuciones obtenidas en la fase del ciclo celular (G1/S/G2-M). (A) indica células apoptósicas.

Figura 11 Efectos sinérgicos de concentraciones bajas de SCPVUTAT y de concentraciones subletales de H_{2}O_{2}

Las células U20S se incubaron con SCPVUTAT (10 nM, cuadro B), o con H_{2}O_{2} (10 \muM, cuadro C), o ambos (SCPVU-TAT, 10 nM; H_{2}O_{2}, 10 \mum; cuadro D) o sin agente como control (cuadro A). Posteriormente, las células tratadas se analizaron en FACS con respecto al contenido de ADN; el porcentaje de las distintas etapas del ciclo celular se indica en la parte inferior de los histogramas individuales.

Figura 12 Análisis microscópico de la fosforilación de la histona 2AXSer-139 y la inhibición de este efecto por el inhibidor Wortmanin de la quinasa P13/ATM

Las células U20S se trataron con SCPVUTAT (100 nM, columna central) durante 60 minutos, llevándose a cabo además el tratamiento con Wortmanin (50 \muM, WM, columna derecha) o sin agente como control (columna izquierda). Después del tratamiento, las células se tiñeron con anticuerpos específicos para la H2AX-Ser-139 fosforilada (roja) o para la Histona 2B (que sirve como control, verde), y se analizaron a un nivel celular único mediante microscopía de fluorescencia.

Figura 13 Determinación de la hipersensibilidad de las células mutadas con respecto a la subunidad catalítica de la proteínquinasa dependiente del ADN (ADN-PK_{CS}), mediante análisis automático

A): La capacidad proliferativa de las células mutadas y de las células normales comparables se evaluó con un dispositivo sensor de imágenes Versadoc-4 (BioRad) utilizando células coloreadas.

: Se llevó a cabo el análisis estadístico de los resultados y se representa como un histograma.

: Ensayo de formación colonial con las progenies celulares (MO59J (ADN-PK_{CS}^{(-/-)} de glioblastoma, comparadas con las células MO59K (ADN- PK_{CS}^{(+/+)} después de tratamiento con SCPVUTAT. Se muestra un ejemplo del ensayo de formación colonial. El ensayo se llevó a cabo utilizando varias concentraciones de células del orden de tres magnitudes (desde las filas superiores a las inferiores), 1 x 10^{4}, 2 x 10^{3}, 4 x 10^{2}, 8 x 10). En B), a la derecha, se muestran los histogramas de los resultados del ensayo formador de colonias de las progenies celulares MO59J, comparados con MO59K. Los ensayos se llevaron a cabo como en la Figura 9, pero se analizaron con la ayuda del sistema Versadoc 4 (BioRad). Barras en blanco; muestras no tratadas; barras grises: 25 nM SCPVUTAT; barras en negro: 100 nM SCPVUTAT.

Figura 14 Distribución intracelular de las proteínas de control del ciclo celular después de un tratamiento con SCPVUTAT

Análisis microscópico de las células HCT116 (p53^{(+/+)}) no tratadas, o tratadas con SCPVUTAT (100 nM) durante 30 horas, o con taxol (0,2 \mug/ml). El análisis de inmunofluorescencia se llevó a cabo con anticuerpos primarios específicos para la ciclina B1 o específicos para Cdc25C, coloreándose con conjugados secundarios de FITC (verde, ciclina B1) o TRITC (rojo, Cdc25C).

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción del vector para la expresión de las proteínas recombinantes

Para los experimentos que se describen en los ejemplos siguientes, se produjo la siguiente proteína recombinante utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia: SCPVU, una variante de cadena única de la enzima endonucleásica homodimérica PvuII, ya descrita en Simoncsits et al., 2001. Al extremo C de este constructo se le añadió la secuencia que codifica GSYGRKKRRQRRRGGSHHHHHH que contiene parte de la proteína HIV Tat y que es seguida por un marcador de seis histidinas. La proteína de fusión recombinante que se obtiene de esta forma se denomina SCPVUTAT. Esto da lugar a un polipéptido compuesto por los aminoácidos 1-157 de la enzima PvuII, seguidos por un engarce con la secuencia -GSGG que conecta la primera subunidad a la segunda de la enzima PvuII (aminoácidos 2-157), y seguido por la secuencia GSYGRKKRRQRRRGGS-HHHHHH (péptido tat + 6 marcadores de histidina). Además, la variante SC34 de la endonucleasa PvuII (Simoncsits et al., 2001), se produce como un polipéptido de cadena única. Este derivado muestra la actividad de unión específica al ADN de PvuII, pero falla en la activi-
dad endonucleásica debido a una mutación (Asp34/Gly34) en posición 34 en ambas subunidades de la enzima PvuII.

Ejemplo 2 Expresión de las proteínas recombinantes y su purificación

La expresión de SCPVUTAT se llevó a cabo en la cepa XL1 MRF' de E. coli (Simoncsits et al, 2001), purificándose primero la proteína en una columna de afinidad Quelante de Alto Atrapamiento (5 ml, Amersham Pharmacia Biotech), y entonces otra vez posteriormente en SP Sepharose (5ml en columna SP HP de Alto Atrapamiento, Amersham Pharmacia Biotech). En la columna de SP Sepharose las proteínas se eluyeron entre 0,63 M y 0,67 M NaCl. El rendimiento fue de aproximadamente 10 mg de proteínas purificadas a partir de 1,5 l de medio. La proteína original PvuII (no como una versión de cadena única), fusionada a la secuencia TAT, se preparó de forma similar. En este caso, la elución a partir de SP-Sepharose se llevó a cabo entre 0,81 M y 0,85 M NaCl. Todas las proteínas que se expresaron se purificaron hasta homogeneidad, tal como se apreció mediante electroforesis en gel sobre SDS-PAGE al 15%, confirmándose la masa teórica mediante espectrometría de masas con API 150 EX (Perkin Elmer). Las actividades enzimáticas de los derivados endonucleásicos obtenidos, fueron comparables con las enzimas nativas, tal como se comprobó utilizando \lambdaADN como sustrato.

Ejemplo 3 Producción de anticuerpos y análisis inmunológico

Se produjeron y utilizaron anticuerpos contra las proteínas recombinantes mediante procedimientos estándar, tal como se describe, por ejemplo, en "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow, y David Lane; CSH Press, New York, 1999, ISBN 0-87969-544-7, "Cells: A Laboratory Manual", David L. Spector, Robert D. Goldman, Leslie A. Leinwand, CSH Press New York, 1998, ISBN 0-87969-521-8. Los anticuerpos se obtuvieron de la inmunización de conejos blancos New Zealand con antígenos apropiados, y los sueros se purificaron contra los antígenos correspondientes que se inmovilizaron a BrCN-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). Los extractos celulares para inmunotransferencia se obtuvieron lisando las células en 20 mM Tris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, que contenía inhibidores proteásicos como por ejemplo 20 \muM TPCK y 20 \muM TLCK, inhibidores de la fosfatasa como 60 mM 4-nitrofenil fosfato, o mediante lisis directa en tampón SDS cargado con la muestra. Se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, después de fijación de las células en paraformaldehído al 3% o la fijación en una mezcla 1:1 de acetona y metanol. Se realizó el análisis después de la tinción de los anticuerpos utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 100M unido a una unidad confocal LSM510.

Ejemplo 4 Transducción proteica de las proteínas quiméricas en las progenies celulares eucarióticas

Para los ejemplos 4-11, se utilizaron las siguientes progenies celulares:

Las progenies celulares defectuosas en la vía de reparación NHEJ: las progenies CHO: Xrss5 (KU80^{(-/-)}), Xr-1 (XRCC4^{(-/-)}), V3 (ADN- PK_{CS}^{(-/-)}) y las progenies celulares parentales correspondientesAA8 (ATCC CRL 1859) y asimismo, la progenie celular HIS P1.13-11 (KU70^{(-/-)}) y la progenie celular parental correspondiente CHO-K1 (ATCC CRL61). Estas progenies se hicieron crecer en medio DMEM que contenía suero fetal de ternera al 10% (FCS). Se utilizaron además las progenies celulares del glioma humano MO59J (ADN- PK_{CS}^{(-/-)}) y las progenies parentales correspondientes M059K (tipo salvaje para ADN- PK_{CS}) (Less-Miller SP. et al, Science 1995, 267(5201): 1183-5) que se hicieron crecer en medio DMEM/NUT.MIX-F12 1:1 con FCS al 10%.

La progenie AT-5 se deriva de un individuo con una ATM defectuosa (proteína mutada de la ataxia-teleangectasia), utilizándose como progenie celular parental correspondiente MRC-5 (Raj K, et al, Nature. 2001, 412 (6850):914-7), cultivándose ambas en DMEM que contenía FCS al 10%.

Las progenies celulares de neuroblastoma IMR32 (ATCC CCL-127), GI-LIN y LAN-5 (Panarello et al C. Cancer Genet. Cytogenet., 2000,116:124-132) se hicieron crecer en medio RPMl + Hepes 25 mM que contenía aminoácidos esenciales y FCS al 10%.

La progenie celular de osteosarcoma humano U20S (ATCC HTB96) y los fibroblastos primarios IMR90 (pases tempranos) se hicieron crecer en medio DMEM que contenía FCS al 10%.

La progenie celular de carcinoma de colon HCT-116 (defectuosa para la proteína génica humana MLH1 de reparación de los errores de emparejamiento (Raj K, et al., Nature. 2001, 412 (6850):914-7)) se hizo crecer en medio de McCoy que contenía FCS al 10%.

La capacidad de transducción de las proteínas quiméricas se ensayó en células de osteosarcoma U20S y en las células fibroblásticas primarias lMR90. Las células se hicieron crecer en medio DMEM que contenía FCS al 10%, y se trataron con las proteínas de la invención en el mismo medio, en general en presencia de antibióticos. Después de 10 minutos de incubación de las células con cantidades crecientes de la proteína de fusión SCPVUTAT (1,10, 50, 100, 200 nM) y con la proteína SCPVU (PvlI de cadena única sin TAT), y SC34 como control (preparado tal como se ha descrito para SCPVUTAT, a excepción de que la enzima PvuII contiene un mutante en posición 34), se prepararon extractos celulares, se separaron en SDS-PAGE y se ensayaron mediante análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo monoespecífico para PvuII. Además, se ensayó la captación después de 30 minutos de incubación mediante el análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de PvuII y el contenido nuclear con yoduro de propidio. Los datos demuestran, en conjunto, que la proteína SCPVUTAT se enriqueció en las células y en particular en el núcleo, y que la captación se llevó a cabo en casi el 100% de las células analizadas, tal como se aprecia en la Figura 2. Al contrario, la proteína de fusión que no contiene las secuencias tat (SCPVU), no fue importada. Estos enriquecimientos no dependieron de la desnaturalización de la proteína, ya que las proteínas utilizadas eran solubles y se prepararon bajo condiciones originales y no desnaturalizantes. De hecho, las proteínas que resultaron producidas mediante los procedimientos descritos y bajo condiciones originales fueron más efectivas en la transducción proteica y superiores a los procedimientos de desnaturalización que se han descrito recientemente para otras proteínas en la patente US nº 6.221.335 de Dowdy.

Ejemplo 5 Confirmación mediante el ensayo TUNEL de la inducción de DSB después del tratamiento in vivo con las proteínas recombinantes de la invención

Después de un tratamiento breve de las células con SCPVUTAT, se ensayó la función de las proteínas con la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT)dUTP-FITC, en una reacción TUNEL (equipo de detección in situ de la muerte celular, Roche Diagnostic, Mannheim Germany), que señala las DSB in vivo. El ensayo se llevó a cabo después de la fijación de las células con paraformaldehído al 4% en PBS y Triton al 0,1%. Después de la reacción TUNEL, las células se trataron con tinción de contraste de propidio J. La utilización de derivados con la actividad nucleásica afectada, como el constructo SC34 como control negativo, permitió evaluar las actividades anteriores. En un tiempo tan corto como 10 minutos después del tratamiento con la proteína de fusión SCPVUTAT, todas las células ensayadas mostraron (en un 90-100%) una reacción TUNEL positiva. Entre las células ensayadas se encuentran progenies humanas o murinas incluyendo células epiteliales (HEK-293, MCF-7, y una progenie celular de carcinoma de colon, HCT116, que muestra un defecto en el gen hMLH1 reparador del desemparejamiento), fibroblastos primarios (Wl83, IMR90, Fibroblastos Embrionales Murinos, MEF). Esto confirma además el suministro eficiente de las proteínas de fusión de la invención a los núcleos celulares que exhiben actividad endonucleolítica in vivo, en todos los tipos celulares ensayados. De hecho, algunos minutos de tratamiento con SCPVUTAT y concentraciones proteicas tan bajas como 10nM en el sobrenadante de los cultivos celulares, produjeron una actividad TUNEL significativa en la mayoría de las células, demostrando de este modo una funcionalidad rápida y directa de las proteínas quiméricas in vivo. Este aspecto hace que el sistema que se describe en la invención resulte más eficiente cuando se compara con las endonucleasas inducidas a partir de las unidades transcripcionales o cuando se compara con cualquiera de los otros tipos de transfección proteica como la electroporación, o las precipitaciones con fosfato cálcico o derivados lipídicos, por ejemplo, lipofectina. Esta actividad fue independiente de la fase del ciclo celular y en la mayoría de las células no se correlacionó con la apoptosis, como se demostró por la pérdida de marcadores positivos para la apoptosis (es decir, la liberación del citocromo C o la tinción positiva de la Anexina V.)

En la Figura 4 se muestran los resultados obtenidos a partir de un ensayo TUNEL de células U20S después de un tratamiento durante 30 minutos con SCPVUTAT o SC34, demostrando estos tipos de ensayo la funcionalidad de un constructo SCPVUTAT.

Ejemplo 6 Evaluación del efecto de un tratamiento con las proteínas de la invención sobre el ciclo celular

Finalmente, para confirmar que los DSB que se producen in vivo inducen asimismo perturbaciones en el ciclo celular, se analizó mediante Clasificación Celular Activada por Flurescencia (FACS), después de la transducción de las proteínas de la invención, el contenido de ADN en las diversas fases del ciclo celular. Después del tratamiento con distintas proteínas a varias concentraciones y durante distintos tiempos, las células se fijaron en etanol al 70%, se trataron con ARNasa A y se tiñeron con propidio J.

El análisis FACS se llevó a cabo utilizando un dispositivo FACSCalibur^{TM} (Becton Dickinson). Los datos obtenidos se evaluaron con el paquete de programas CellQuest^{TM} de software. Se analizaron en modo DDM, por lo menos, 3 x 10^{4} eventos únicos para cada muestra. El análisis estadístico de la distribución del contenido de ADN durante el ciclo celular se llevó a cabo con el paquete de programas MODFITLT^{TM} de software. Un contenido 2N diploide de ADN corresponde a células en la fase G1 del ciclo celular, 4N representa un contenido tetraploide relativo de ADN y corresponde a la fase G2 y/o M del ciclo celular. Un contenido de ADN intermedio representa la fase S que corresponde a una población de ADN que se replica activamente durante el ciclo celular y un contenido que es inferior al 2N diploide representa células apoptósicas.

En la Figura 5 se muestra que una incubación durante 24 horas con 10 nM de la proteína SCPVUTAT es suficiente para inducir un aumento en la población tetraploide de las células U20S. La dilución de la proteína SCPVUTAT con el medio recién preparado provoca la reentrada de las células hacia una población de ciclado normal durante 24 horas, mientras que la adición sucesiva de SCPVUTAT (cada 12 horas) da lugar a un retraso del ciclo celular establemente inducido, en la mayoría de las células que fueron analizadas sin ninguna inducción apoptósica. Tratamientos similares con las proteínas SC34 y SCPVU (sin dominio TAT) no mostraron ningún cambio en las distribuciones del ciclo celular.

Otros procedimientos pueden ayudar para discriminar finalmente entre la fase G2 y la fase M de una población detectada como tetraploide en un análisis FACS (4N); es decir, en células HCT116 y U20S que contenían 4N ADN que fueron tratadas con 100 nM de SCPVUTAT, los núcleos permanecen grandes y no muestran ninguna estructura mitótica o ninguna rotura de la envuelta nuclear que indiquen que las células permanecen en la fase G2 y no muestran ninguna progresión a la fase M del ciclo celular, exhibiendo por lo tanto un bloqueo del ciclo celular en G2. Puede utilizarse un análisis bioquímico posterior para demostrar la actividad quinásica del complejo Cdc2-ciclina B. Además, la iniciación de la mitosis, es decir, inducida con los agentes Nocodazol o Taxol bloqueantes de los microtúbulos, puede detectarse mediante la actividad nuclear de la Cdc2 quinasa y asimismo, mediante la localización nuclear de Cdc25C. Estos ensayos permiten analizar el punto exacto de la detención del ciclo celular después del tratamiento con SCPVUTAT, permitiendo así además detectar posteriormente alteraciones en esta fase del ciclo celular respecto a un control positivo. Experimentos similares son bien conocidos en la técnica también para otras fases del ciclo celular. El ensayo que se muestra en la Figura 7A y el análisis de inmunofluorescencia que se muestra en la Figura 14 muestran ejemplos para estos tipos de experimentos. Tal como se muestran los experimentos, indican que en la progenie celular HCT116 después del tratamiento con la proteína de fusión SCPVUTAT, se indujeron DSB, y subsiguientemente, un bloqueo reversible en la fase del ciclo celular que corresponde a la última S/G2.

Ejemplo 7 Efectos de las proteínas para las células con mutaciones en ATM/ATR

La proteína mutada (ATM) de la Ataxia telangiectasia y y la proteína mutada (ATR) relacionada con la Ataxia telangiectasia representan los elementos centrales señalizadores durante la activación del punto de comprobación en respuesta a la alteración del ADN. Estas vías coordinan la progresión del ciclo celular y las maquinarias de reparación del ADN. Estos controles aseguran que el orden apropiado de eventos en el caso de una alteración celular, es decir, las células no progresan a las fases sucesivas del ciclo celular, si el ADNO no es reparado. Esto implica controles en la maquinaria del ciclo celular mediante inhibición de las quinasas del ciclo celular y la inducción concomitante de reguladores negativos, entre ellos los supresores tumorales como p53 y sus conocidas dianas transcripcionales (es decir:p21, 14-3-3 sigma), proteínas que a su vez inducen un bloqueo del ciclo celular que es importante para una función precisa o para la fidelidad asegurada de las proteínas efectoras responsables de la reparación del ADN. Es importante tener en cuenta que las mutaciones en muchas de estas proteínas reguladoras muestran una fuerte predisposición para el cáncer.

El tratamiento de las células U20S con 2 mM de cafeína, un derivado de la metilxantina (IC_{50} <1 mM), induce un retraso moderado en la fase G1 del ciclo celular y además, el efecto inhibidor sensibiliza las células a la alteración del ADN (Sarkaria et al., 1999). Se mostró que la cafeína inhibe la actividad catalítica de por lo menos tres elementos del tipo de la fosfoinositol 3 quinasa (Pl3), conteniendo todos ellos una región homóloga serina/treonina quinasa (PlKK), ATM, ATR y TOR. Las células U20S que se hicieron crecer durante 30 horas en un medio con 100 nM de SCPVUTAT en combinación con 2 mM de cafeína, no muestran la característica detención del ciclo celular de SCPVUTAT, pero sin embargo, induce un moderado retraso de G1. Esto demuestra que la cafeína es antagonista del efecto de SCPVUTAT in vivo. Experimentos finales demuestran que la cafeína ni inhibe a SCPVUTAT in vitro, ni influye en la capacidad de transducción de la proteína. Los mismos argumentos utilizados para estos experimentos se aplican a una selección de composiciones antagónicas para SCPVUTAT que son activas "in vivo" y constituyen composiciones generales o compuestos de plomo, activos como inhibidores de la vía de ATM y/o de ATM/ATR. La especificidad para ATM/ATR o para cualquier otra proteína implicada en esta vía puede entonces analizarse finalmente utilizando progenies celulares mutantes apropiadas. Debido a la inmediata actividad bien caracterizada y monoespecífica de SCPVUTAT, estas moléculas se pueden utilizar ventajosamente en estos ensayos. La fácil utilización de la presente invención permite asimismo la aplicación a gran escala en estos tipos de ensayos, aplicación tal como la alta producción, combinada ventajosamente con la aplicación de la química combinatoria y/o la biología molecular combinatoria.

En otra forma de realización, SCPVUTAT se utiliza para controlar los eventos que dependen de una activación de ATM/ATR. ATM funciona como una serina/treoninquinasa en muchos sustratos implicados en la "comprobación de vigilancia" que es activada por el daño en el ADN. La fosforilación de los sustratos puede o no influenciar la activación de una respuesta de la "comprobación de vigilancia". Los sustratos de ATM o de las quinasas dependientes de ATM conocidas in vivo incluyen: Nbs1, SMC1 (Mantenimiento Estructural de los Cromosomas), MDC1 (Mediador de la Alteración del ADN), H2AX (Histona 2Ax), p53.

Se analizó la inducción in vivo de ATM/ATR sobre el sustrato de p53-ser^{15} en respuesta a SCPVUTAT. La fosforilación de p53 sobre Ser^{15} regula la estabilidad proteica y la actividad transcripcional de p53 y es esencial, por tanto, para la respuesta transcripcional de p53.

En progenies celulares ATM positivas o negativas (MRC-5 y AT-5, respectivamente) se ensayó la fosforilación de p53 sobre Ser^{15} en respuesta al tratamiento con SCPVUTAT. Se llevaron a cabo experimentos paralelos con hidroxiurea (HU) para comparación. HU funciona como un inhibidor de la ribonucleotidil-reductasa y provoca un atascamiento de la horquilla de replicación del ADN durante la fase S, dando lugar a DSB. Para esto, con extractos y después del tratamiento, se llevaron a cabo experimentos de inmunotransferencia, utilizando anticuerpos específicos para una Ser^{15} fosforilada en p53, para obtener una detección específica. Tal como se muestra en la Figura 7, la fosforilación específica de p53-Ser^{15} se obtuvo después de tratamiento con SCPVUTAT en progenies celulares ATM positivas MRC-5 (Figura 7B), así como para las progenies celulares ATM negativas AT-5. Se encontró lo mismo para un tratamiento con HU que induce la fosforilación de p53-Ser^{15} de una forma comparable, aunque sin embargo consistentemente más intensa. Esta fosforilación in vivo es sensible para la cafeína inhibidora de ATM/ATR; las células AT-5 incubadas con 2 mM de cafeína, y que se trataron con SCPVUTAT o HU, no exhibieron una fosforilación significativa de p53-Ser^{15} (Fig 7C). Como otro ejemplo para la fosforilación de un sustrato de ATM en respuesta al objeto de la invención, se analizó la fosforilación de la histona H2AXSer^{139}. Se mostró que ATM fosforila a la histona H2AXSer^{139} como una respuesta inmediata a la alteración del ADN inducida por la radiación durante la fase S y G2 del ciclo celular. Las células U20S se trataron durante 60 minutos con SCPVUTAT, se fijaron y se analizaron con respecto a la fosforilación de la histona H2AX Ser^{139}. Las células se analizaron con un antisuero específico para la fosfo-Ser^{139} en la histona H2AX y se analizaron al microscopio de una forma única celular. Se analizó la histona 2B como control. Los resultados demuestran que el tratamiento con SCPVUTAT induce rápidamente la fosforilación de la histona H2AX Ser^{139}, pudiéndose detectar esta actividad específicamente en la localizada en los núcleos de las células tratadas pero no en los de las células no tratadas (Figura 12). Además, el inhibidor Wortmanin de la quinasa ARM (50 \muM) es antagonista para esta reacción. La concentración de Wortmanin utilizada es específica para ATM, pero no inhibe la ATR, representando por lo tanto un simple ensayo para distinguir entre estas dos quinasas. Estos tipos de experimentos, en los que se analizan sustratos de la vía ATM, ayudan a definir las dianas moleculares y bioquímicas inducidas por las DSB inducidas por SCPVUTAT. El análisis bioquímico y/o inmunológico de los sustratos de la ATM quinasa mediante transferencia Western, análisis de inmunofluorescencia o análisis enzimático en las células o a partir de los extractos celulares tratados con la presente invención, es útil para interpretar in vivo el estado de una respuesta de un punto de comprobación en una célula particular, en comparación con una inducción normal de la vía respectiva.

Además, estos ensayos pueden utilizarse ventajosamente con la presente invención en cribados automáticos. La naturaleza exacta y bien definida de la alteración inducida en el ADN mediante la presente invención, hace que ésta sea superior con respecto a cualquier otro producto utilizado previamente en tipos similares de ensayos. La utilización de la presente invención en ensayos únicos o en cribados de alto rendimiento, muestra escasa necesidad de considerar efectos secundarios o pleotrópicos, un prerrequisito esencial para el éxito de un cribado complejo. Los datos obtenidos en estos tipos de experimentos pueden considerarse como equivalentes a los efectos inducidos por un DSB. Además, la disponibilidad de derivados proteicos mutados que no muestran actividad nucleásica como SC34, garantizan controles importantes para estos ensayos.

Ejemplo 8 Dependencia de ATM y p53 del efecto inducido por SCPVUTAT

En general, en el caso de las alteraciones del ADN, las mutaciones en los componentes del mecanismo correspondiente de control ("comprobación de vigilancia") muestran cambios en las características de la detención del ciclo celular y muchas de estas mutaciones determinan predisposición al cáncer.

Al contrario, proteínas que están implicadas como moléculas efectoras para la reparación del ADN, muestran en general características normales de la detención del ciclo celular e inducen una progresión tumoral sólo principalmente en combinación con defectos en los componentes del punto de comprobación, mostrando frecuentemente sinergismo en una predisposición para los tumores. Las mutaciones en las moléculas efectoras exhiben una hipersensibilidad particular hacia DSB, una característica que es significativamente menos pronunciada en el caso de las mutaciones del punto de comprobación. Debido al hecho de que las proteínas de la invención son monoespecíficas, es posible interpretar la sensibilidad para DSB y los efectos en el ciclo celular como una consecuencia simple de la alteración inducida. De hecho, es posible evaluar si los defectos se encuentran en los componentes de los mecanismos de control (puntos de comprobación) o en la maquinaria de reparación.

Las respuestas del ciclo celular a los DSB inducidos por el tratamiento con SCPVUTAT se analizaron en células positivas o negativas para p53. Mientras que las células que eran positivas para p53 mostraban un comportamiento de detención del ciclo celular en G1 y G2, con valores bajos de la fase S, las células negativas para p53 no muestran características de detención del ciclo celular. Además, el tipo de resultado se mantuvo también para los elementos corriente abajo de p53 en los que las mutaciones en p21 muestran un comportamiento comparable con las células p53 negativas, y las mutaciones en 14-3-3 sigma muestran una detención en G1, confirmando que esta proteína se solapa parcialmente con p53 y controla sólo la fase G2 del ciclo celular. Como se demuestra finalmente en la Figura 8A, los mutantes AT-5 se analizaron después de tratamiento con SCPVUTAT. La incubación durante 36 horas de las progenies celulares mutadas para ATM (AT-5) con SCPVUTAT dio lugar a un retraso transitorio del ciclo celular, tal como se determinó mediante un análisis FACS del contenido de ADN. Las células AT-5 muestran un fuerte aumento en un contenido 4N G2 ADN y no muestran ningún retraso de G1, indicando esto un defecto del complejo en la "comprobación de vigilancia" de G1 (Fig. 8). Significativamente, el retraso en G2 no es liberado y la reentrada en el ciclo celular no se observa después de 24 horas, al contrario que en las progenies celulares ATM positivas (véase la Figura 5). Una adición única de SCPVUTAT durante 60 minutos a las células AT-5 fue suficiente para inducir la detención del ciclo celular después de 24 horas (Figura 8A), y que condujo finalmente a la muerte celular, obtenida a partir de un ADN no correctamente unido, siendo la actividad clonogénica, en consecuencia, inferior al 0,02% para las células AT-5, después de un tratamiento único con SCPVUTAT durante 60 minutos. En estos ensayos, la progenie celular ATM de control positivo, MRC-5, fue menos sensible a un tratamiento con SCPVUTAT (Figura 8B). Además, las células se incubaron con adriamicina como control. Estos efectos se debieron a la actividad endonucleásica de SCPVUTAT, porque se formaron colonias con eficiencia comparable a una falta de tratamiento después del tratamiento con versiones nucleásicas mutadas. Estos ejemplos demuestran que varias células mutadas muestran distintos perfiles de ciclo celular en respuesta al tratamiento con SCPVUTAT, y que esto esta característica puede utilizarse para el diagnóstico de los efectos del ciclo celular después de que se produzcan los DSB.

Ejemplo 9 Evaluación de la capacidad diagnóstica de la proteína SCPVUTAT sobre las células defectuosas en la vía de reparación NHEJ (Unión del Extremo No Homólogo)

La NHEJ representa el mecanismo principal para una reparación de la rotura del ADN bicatenario en los eucariotas superiores, contrariamente a los eucariotas inferiores, en los que se encuentra más presente una reparación mediante recombinación homóloga. Las proteínas implicadas en este sistema están asimismo implicadas en las fases finales de la recombinación inmunoglobulínica V(D)J, para confirmar si las proteínas de la invención activan también las enzimas de la NHEJ de una forma específica, se analizaron progenies celulares murinas que contenían mutaciones individuales en uno de los factores esenciales de esta vía.

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Un ensayo de formación de colonias que se sumariza en las Figuras 9 y 13, confirma que un tratamiento único con la proteína de la invención SCPVUTAT es suficiente para reducir fuertemente la actividad de formación de las colonias en todas las progenies celulares mutadas en la NHEJ.

Para demostrar la especificidad de la reparación de las DSB de la presente invención, se utilizaron células de roedores conteniendo la pérdida homocigótica de las mutaciones funcionales en uno de los factores esenciales implicado en la reparación NHEJ para DSB: el dominio catalítico de la subunidad PIKK que contiene la subunidad reguladora de la protein-quinasa dependiente del ADN (ADN- PK_{CS}; progenies celulares V3, que corresponden a la progenie celular parental AA8), la subunidad reguladora de la protein-quinasa Ku70 dependiente del ADN (HlS P1. 13-11; que corresponde a la progenie celular parental CHO-K1), la subunidad Ku80 (xrss5: que corresponde a la progenie celular parental AA8), y la subunidad reguladora XRCC4 de la ADN ligasa lV (progenies celulares XR-1 que corresponden a la progenie celular parental AA8). Estas progenies celulares se analizaron en los ensayos de actividad nucleásica con SCPVUTAT in vivo y se compararon a las progenies celulares parentales, tal como se ha indicado. Además, estas células mutantes NHEJ se ensayaron con SCPVUTAT en ensayos clonogénicos, de brotes coloniales, que se ensayaron después de una única adición de SCPVUTAT durante 12 horas a una concentración de 10 nM (barras grises) o a una concentración de 75 nM (barras negras) o sin tratamiento proteico (no tratados, barras blancas). De siete a diez días después de la adición, se analizó el crecimiento celular mediante tinción con azul GIEMSA y cuantificación de diversas concentraciones celulares. Los resultados obtenidos a partir de un experimento representativo se sumarizan en la Figura 9. Las células que son mutantes para la subunidad XRCC4 de la ADN ligasa IV, son hipersensibles para los DSB de extremos romos inducidos por SCPVUTAT, y más interesante, todas las células que contienen mutantes en el ADN-PK ensayado, incluyendo las mutaciones de la subunidad catalítica, muestran asimismo una intensa reducción en el ensayo de formación colonial. Al contrario que en las células parentales, a las células que contienen defectos conocidos en la vía de reparación de la pérdida de emparejamiento, como HCT116 que muestra una mutación homocigótica en el gen que codifica la proteína hMLH1, no muestran ningún aumento en la sensibilidad a un tratamiento con SCPVUTAT en ensayos similares. En otro ejemplo, las progenies celulares del glioblastoma humano que son defectuosas en ADN- PK_{CS} (M0059J), se trataron con SCPVUTAT y se enfrentaron a las progenies celulares parentales M059K. Análogamente, el crecimiento celular se cuantificó después de un tratamiento único con SCPVUTAT durante 12 horas (10 nM, barras grises; 75 nM, barras negras; no tratadas, barras blancas). Otra vez, también las células mutantes humanas ADN- PK_{CS} muestran un aumento diferencial significativo en sensibilidad en la respuesta al tratamiento con SCPVUTAT, Figura 13A, B). Estas células se sembraron en placas multipocillos de microtitulación a distintas concentraciones, y se trataron con SCPVUTAT tal como se ha indicado, tiñéndose con azul GIEMSA. Las placas multipocillo de microtitulación (para ejemplo, véase la Fig. 13A), se escanearon utilizando el sistema de imagen VersaDOC^{R} (BioRad), cuantificándose automáticamente el crecimiento con el empaquetamiento de programa Quantify One^{R} para el análisis de las placas de microtitulación (programa de escaneo de las placas de microtitulación). Los datos obtenidos se sumarizaron posteriormente en un histograma, tal como se expresa en la Fig. 13. Concordando con los resultados obtenidos a partir de las progenies celulares de los roedores que mutaron para ADN- PK_{CS}, las progenies celulares humanas demostraron asimismo hipersensibilidad después del tratamiento con SCPVUTAT, confirmando así la alta especificidad de SCPVUTAT para la introducción de las DSB. Estos experimentos demuestran la viabilidad del sistema utilizado incluyendo las aplicaciones en los ensayos totalmente o semiautomáticos.

Ejemplo 10 Ensayo para el cribado de compuestos candidatos como sinérgicos o antagonistas para el estrés inducido por DSB

Las células U20S se incubaron con 10 nM de SCPVUTAT y con 10 \muM de H_{2}O_{2}, solos o en combinación, y se analizó el perfil del ciclo celular mediante FACS. La incubación simultánea de las células con los dos compuestos provocó un cambio diferencial muy aumentado del perfil del ciclo celular, con un aumento intenso del pico de la fase G2 correspondiente, desde un 20% a un 45% (Figura 11A, comparada con la Figura 11D), en comparación con ningún aumento en G2 con 10 \muM H_{2}O_{2} solo (Figura 11C), y con un aumento menor del 20 al 28% en G2 (Figura 11A, comparado con la Figura 11B) en el caso de 10 nM SCPVUTAT solo. Basándose en los resultados de las incubaciones con los componentes solos, la incubación con ambos componentes muestra de modo simultáneo, claramente, un efecto sinérgico para una perturbación del ciclo celular.

En un experimento similar que se llevó a cabo a continuación, en el que la proteína SCPVUTAT se incubó conjuntamente con afidicoloina (un agente de intercalamiento del ADN e inhibidor de la topoisomerasa II), no se observó un efecto sinérgico y ambos componentes muestran sólo un comportamiento aditivo. Este ejemplo, demuestra otra vez la simplicidad del ensayo, que puede utilizarse para la detección del sinergismo o del antagonismo para el estrés celular que es inducido por las DSB de extremos romos a partir de las proteínas de la invención. Tal como se ha expuesto anteriormente, la ventaja del ensayo procede de la alteración monoespecífica inducida en el ADN, de la posibilidad de medir los antecedentes del sistema con la proteína nucleásica SC34 dañada, y la utilización extremadamente rápida y fácil del ensayo, en virtualmente cualquier célula y cualquier fase del ciclo celular. Esto no se ha descrito anteriormente para ningún otro reactivo capaz de inducir DSB in vivo. Por lo tanto, este tipo de ensayo que se muestra para los radicales y la cafeína (Figura 7C), puede utilizarse para cada tipo de cribado para las composiciones que interfieren con la vía de reparación del ADN y de sus controles.

Ejemplo 11 Inducción de apoptosis en el neuroblastoma, a partir del tratamiento con SCPVUTAT

Mientras que muchas de las células analizadas de origen tanto epitelial como mesenquimático, no mostraron apoptosis después del tratamiento con SCPVUTAT, en algunas progenies celulares de neuroblastoma (IMR32, LAN5, GI-LIN,), pero también en varios aislamientos celulares de neuroblastomas primarios a partir de casos clínicos, se indujo una cuantía significativa de apoptosis. La Figura 10 demuestra un ejemplo de una inducción de apoptosis mediante las proteínas de la invención en estas células. Para el análisis, se ensayó el contenido de ADN con FACS después de llevar a cabo la tinción celular con propidio 5. Las células apoptósicas (A) se detectaron como células que mostraban un contenido de ADN inferior a 2N. Las regiones calculadas se indican en la parte superior de cada histograma con flechas para las áreas correspondientes. Mientras que 10nM de SCPVUTAT inducen rápidamente un 18% de células apoptósicas en 30 horas (Figura 10B), y la adición de 100 nM de SCPVUTAT induce a más del 29% de las células apoptósicas en el mismo tiempo (figura 10C), la versión SC34 nucleásica dañada no induce este efecto. Estos experimentos demuestran una inducción altamente específica de la apoptosis en las células del neuroblastoma, y las proteínas de la invención se perfilan como primeras candidatas para un tratamiento terapéutico de estos tipos de tumores.

Además, en combinación con sistemas tisulares específicos de suministro, las secuencias que constituyen el objeto de la presente invención pueden contener suficiente especificidad como substancias candidatas para la terapia del neuroblastoma. De hecho, a su vez, constituye una implicación válida que la presente invención se aplique como una plataforma tecnológica para el cribado de secuencias de suministro tisular específico.

Además, como ya se ha anticipado en ejemplos anteriores (Ejemplo 8), la presente invención puede utilizarse asimismo para investigar compuestos específicos de plomo o combinaciones específicas de moléculas que pueden inducir apoptosis diferenciales específicas en células diana, ventajosamente, en células malignas tumorales, pero no en células normales mucho menos extendidas del mismo individuo.

Ejemplo 12 Localización celular de proteínas del ciclo celular después del tratamiento con SCPVUTAT mediante análisis inmunomicroscópico

HCT116 (p53^{(+/+)}) no tratadas, o tratadas durante 30 horas con SCPVUTAT (100 nM), o con Taxol (0,2 \mug/ml) se fijaron con PFA al 3% y se trataron con anticuerpos específicos para la ciclina B1 o para Cd-c25C. La inmunofluorescencia se analizó con el microscopio (véase la Figura 14) con anticuerpos primarios específicos para la ciclina B1 conjugada a anticuerpos secundarios marcados con FITC (verdes) o con anticuerpos específicos primarios para Cd-c25C conjugado a anticuerpos secundarios marcados con TRITC (rojos). La distribución citoplásmica de los marcadores del ciclo celular Cdc25C y Ciclina B obtenida de las células con un contenido 4N ADN después del tratamiento con SCPVUTAT, demuestra una detención en la fase G2 y que las células tratadas no progresaron hacia la fase M del ciclo celular.

Este resultado es distinto a los resultados obtenidos con Taxol, en los que la localización nuclear prevalente indica una detención en la fase M del ciclo celular.

El cambio de la distribución especial de las dos proteínas marcadoras -es decir, citoplásmico, que corresponde a una ciclina B quinasa inactiva, al contrario que la localización nuclear que corresponde a una ciclina B quinasa activa y a una progresión posterior del ciclo celular a la anafase- y a una activación sucesiva de la cdc2/ciclina B quinasa mediante defosforilación con la fosfatasa Cdc25C (después de la liberación de la proteína 14-3-3 de Cdc25C y activación posterior de la fosfatasa), constituye un distintivo para la transición G2/M. De hecho, esta vía sustituye a la etapa limitativa de la velocidad en esta fase del ciclo celular.

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<110> International Center for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB)

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<120> Polipéptidos quiméricos y su utilización

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<130> 3916

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<160> 4

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1020

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<212> ADN

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<213> Proteus vulgaris

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1020)

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<223> 1...471: PvuII 472...483: engarce 484...951: PvuII 952...999: TAT 1000...1020: 6 his

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 339

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<212> PRT

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<213> Proteus vulgaris

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<400> 2

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3

4

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<210> 3

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Virus de inmunodeficiencia humana

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<220> <221> CDS

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<222> (1)..(48)

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<223> 4..36 Suministrador correspondiente a los residuos 45-47 de la proteína Tat

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<400> 3

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5

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<210> 4

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humana

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<400> 4

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\sa{Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser}

Claims

1. Polipéptido quimérico que puede penetrar membranas biológicas que comprende:

b.: una enzima que modifica el ADN.

c.: una región con una actividad de suministro que cruza la membrana celular,

en el que la enzima que modifica el ADN es una endonucleasa de restricción del tipo de clase II o sus subunidades o fragmentos funcionales y las regiones a., b., y c, están unidas covalentemente entre ellas.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que la región con actividad de suministro que cruza la membrana celular es seleccionada de entre el grupo constituido por péptidos y polipéptidos.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que la actividad del polipéptido a y del polipéptido b están contenidas en la misma molécula.

4. Polipéptido según las reivindicaciones 1 y 3, en el que el polipéptido con la actividad específica de unión al nucleótido y el polipéptido que contiene la actividad enzimática modificante del ADN, son endonucleasas de restricción o sus subunidades o fragmentos funcionales.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la endonucleasa de restricción es seleccionada de entre el grupo constituido por EcoRV, PvuII, HinfI y sus subunidades y fragmentos funcionales.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la actividad endonucleásica es modificada, pero la especificidad de unión al ácido nucleico, es comparable a la enzima nativa.

7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la región para la actividad del suministro que cruza la membrana celular comprende por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo constituido por VP22 del Virus del Herpes Simplex, Tat del HIV-1, Rev de Hiv-1, el homeodominio de Antennapedia y sus fragmentos.

8. Polipéptido según la reivindicación 7 derivado de la proteína HIV-1 Tat que comprende el péptido YGRKKRRQ
RRR o las mutaciones puntuales o las mutaciones funcionales del mismo.

9. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el polipéptido provisto de una afinidad específica de unión al nucleótido y la enzima modificante del ADN están representados por un polipéptido único que codifica una endonucleasa de restricción de clase II seleccionada de entre EcoRV, PvuII, e HinfI o sus subunidades o fragmentos funcionales, y la función de suministro que cruza la membrana celular es un péptido contenido en la secuencia aminoácida de HIV-1 tat.

10. Polipéptido según la reivindicación 9, en el que las subunidades de la endonucleasa de restricción están conectadas covalentemente como una proteína de cadena única.

11. Polipéptido según la reivindicación 10, que comprende la SEC ID nº:2.

12. Polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene aminoácidos no naturales.

13. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido comprendido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y que comprende la SEC ID nº:1.

14. Vector que comprende la secuencia polinucleótida según la reivindicación 13.

15. Células huésped que son transformadas con los vectores según la reivindicación 14.

16. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, polinucleótidos según la reivindicación 13, vectores según la reivindicación 14, células según la reivindicación 15, para una utilización terapéutica.

17. Composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como principio activo, en combinación con excipientes, emulsionantes o diluyentes apropiados.

18. Utilización de las moléculas quiméricas, los polinucleótidos, los vectores, las células según la reivindicación 16, para la preparación de preparaciones farmacéuticas para la prevención, la cura o el diagnóstico de una enfermedad neoplásica o de la predisposición a esta enfermedad.

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19. Procedimiento para la modificación en sitios específicos en el genoma de una célula aislada que comprende esencialmente el tratamiento de estas células con un polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, basado en la utilización de los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y en el que las modificaciones introducidas en sitios específicos en el genoma de las células aisladas, son roturas del ADN bicatenario.

21. Procedimiento para el cribado de composiciones que pueden modular las actividades de reparación genómica, o modular el control del ciclo celular y las actividades de punto de comprobación en un sistema celular que contiene esencialmente las etapas siguientes:

i): incubar las células aisladas con los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,

ii): añadir composiciones o colecciones de composiciones opcionalmente, en presencia de sustancias que producen radicales,

iii): caracterizar y/o medir la respuesta celular.

22. Procedimiento para la activación de la reparación del ADN y de los mecanismos de punto de comprobación in vitro, utilizando el procedimiento según las reivindicaciones 19 y 20 o la utilización de los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

23. Procedimiento para el diagnóstico de un defecto genético en la reparación del ADN y en el control del ciclo celular y en las vías del punto de comprobación in vitro, que comprende las etapas siguientes:

a): cultivar opcionalmente las células aisladas de una muestra de ensayo.

b): incubar estas células con los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, opcional en paralelo con progenies celulares apropiadas de referencia,

c): caracterizar y/o medir las respuestas celulares.

24. Procedimiento según las reivindicaciones 21 y 23, en el que respectivamente en el punto iii) y c), la respuesta celular se selecciona de entre: actividad clonogénica, estado de fosforilación o nivel de expresión del marcador bioquímico constituido por proteínas intracelulares, las localizaciones de estas proteínas a nivel citoplásmico o nuclear, el contenido total de ADN de la población celular, y la proliferación celular.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que estas proteínas intracelulares son seleccionadas de entre el grupo constituido por p53, ATM, Chk1, Chk2, BRCA-1, BRCA-2, Nbs1, Mre11, Rad50, Rad51 e histonas.

26. Procedimiento según las reivindicaciones 24 y 25 para el diagnóstico in vitro de una predisposición genética a tumores o para el diagnóstico de sensibilidad a la radiación.

27. Utilización de moléculas quiméricas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la introducción de un bloqueo del ciclo celular en células aisladas.

28. Utilización de moléculas quiméricas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la inducción de apoptosis en células aisladas que provienen de un neuroblastoma.

29. Kit para el diagnóstico de un defecto genético en el sistema de reparación del ADN o en el sistema de control para el ciclo celular (puntos de comprobación) en una célula aislada que contiene el polipéptido quimérico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en combinación con un tubo que contiene un polipéptido quimérico para el control, en el que el polipéptido muestra una actividad específica de unión al ADN, pero está alterado en la actividad nucleásica.

30. Kit según la reivindicación 29, en el que el polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 presenta la SEC ID nº:2 y el polipéptido para el control es el polipéptido SC34.

31. Kit según la reivindicación 30, para el diagnóstico in vitro de defectos genéticos que determinan la predisposición a tumores en células aisladas.

32. Kit según la reivindicación 31 para el diagnóstico de la radiosensibilidad de un tumor.