CN109824771A - 一种降糖肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降糖肽及其应用，通过对胰岛素进行结构改造得到其长效化的衍生物。还公开了一种新的修饰用化合物及其制备方法，本发明的降糖肽通过正交保护策略固相合成，合成方法简单，合成速度快，且降糖肽的降糖效果显著，作用时间长。

Description

一种降糖肽及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物化学领域，具体的涉及糖尿病治疗领域的一类新型长效化降糖肽的设计及其应用。

背景技术

糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，但是注射胰岛素会有低血糖的风险。治疗效果更是受到剂量、注射部位、注射途径等因素的影响，且个体差异较大，使胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠促降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中常存在的低血糖危险。因此，GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具有广阔的开发前景。

天然GLP-1在治疗糖尿病上具有诸多优点，其促进胰岛素分泌的作用依赖于较高葡萄糖水平，在正常和较低葡萄糖水平下，其促进胰岛素分泌和抑制高血糖素分泌的作用很弱，并且其可以保护β细胞，启动β细胞的再生。但是，它在体内易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)快速降解，其体内半衰期仅5min左右。目前普遍使用的延长GLP-1体内半衰期的修饰策略主要是对8位进行修饰，使得GLP-1能抵抗DPP-IV酶的降解，另外，将GLP-1肽链N端8位和9位的氨基酸互换也可以达到此目的。

艾塞那肽((Exendin-4))是减少DPP-IV酶代谢的典型短效GLP-1受体激动剂。其由39个氨基酸残基组成，与GLP-1有53％的同源性。与天然GLP-1相比，艾塞那肽具有较强的二肽基酶抗性(血浆半衰期为60～90min)，可以在体内更持续，稳定的发挥GLP-1样效应。但是其仍需一天用药2次，与天然GLP-1类结构类似，其同样存在半衰期短、顺应差的问题。

EP 894095中披露了胰岛素衍生物，其中B-链的N-末端基团和/或B28、B29或B30位上Lys的ε-氨基带有通式-CO-W-COOH的取代基，其中W可以为长链烃基。这些胰岛素衍生物具有延长的作用特性且在生理pH值下可溶。

德谷胰岛素为一类小分子嵌合的人胰岛素，具有更长的作用特性且同时在生理pH值下可溶、并且功效与人胰岛素相当。但是其作用效果不稳定，存在一定的使用局限性。

发明内容

本发明涉及一种降糖肽，其特征在于，氨基酸序为：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa1-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Xaa2)q-NH₂。

其中Xaa1为Lys或Cys-AA1-(AA2)_m-AA3；

Xaa2为Cys-AA1-(AA2)_m-AA3；

AA1为

AA2为亚甲基，其中AA2与AA1的N端相连；

AA3为

其中，q为0或者1；m为1-11之间的任意整数；

其中，当Xaa1为Lys时，q不为0。

在一些实施方案中，当Xaa1为Cys-AA1-(AA2)_m-AA3，q为0。

在一些实施方案中，m优选为5-11，更优选m为11。

在一些实施方案中，Cys-AA1-(AA2)_m-AA3具有如下所示的结构：

在一些实施方案中，所述降糖肽具有如下所示的结构：

另一方面，本发明提供式X的化合物，具体结构如下

其中n＝1-11之间任意的整数。

在一些实施方案中，优选n＝5-11之间任意的整数。

在一些实施方案中，更优选n为11。

进一步的，本发明还提供了一种式X的制备方法，其具有如下所示的制备路线：

其中，P为载体树脂。

其中n＝1-11之间任意的整数。

在一些实施方案中，优选n＝5-11之间任意的整数。

在一些实施方案中，更优选n为11。

其中，具体制备方法如下：

a)将Fmoc-Glu(otBu)-OH、非亲核性有机碱在有机溶剂中溶解，与溶胀的载体树脂结合；

b)加入脱保护剂；

c)将2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基取代的碳链烷酸溶解在有机溶剂后加入步骤b)反应后的载体树脂中，在催化剂的存在下反应；

d)洗脱树脂收集滤液；

e)将步骤d)中的产物溶解在有机溶剂中，加酸，反应。

其中，步骤a)所述的树脂为2-CTC树脂、HMBA-AM树脂、Novasyn-KB树脂、溴化Wang树脂或溴化PPOA树脂中的一种；其中优选2-CTC树脂。

步骤a)中溶胀的载体树脂的溶胀方法为：用有机溶剂进行溶胀，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲亚砜；其中优选二氯甲烷。

步骤a)中所述非亲核性有机碱为N,N-二异丙基乙基胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯或2,6-二叔丁基吡啶中的一种；其中优选N,N-二异丙基乙基胺。

步骤a)中所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或两种的任意混合物；其中优选二氯甲烷。

步骤b)中所述的脱保护试剂为哌啶、乙醇胺、环已胺或吡咯烷酮中的一种；其中优选哌啶。

步骤c)所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺二甲亚砜；其中优选二氯甲烷。其中所述催化剂为EDC/NHS、EDC/HOBt或EDC/DMAP中的一种；其中优选EDC/NHS。

步骤d)中所述的洗脱树脂的方法为用酸的有机溶剂进行洗脱，其中酸选自盐酸、硫酸、三氟乙酸或乙酸中的一种，有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种；其中优选三氟乙酸的二氯甲烷溶液。

步骤e)所述的酸选自盐酸、硫酸、三氟乙酸或乙酸中的一种；其中优选三氟乙酸；有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种；其中优选二氯甲烷。

其中，进一步地，具体的制备方法如下：

a-1)将Fmoc-Glu(otBu)-OH和DIPEA溶解于二氯甲烷中，倒入用二氯甲烷溶胀的载体树脂中，常温反应；

b-1)分别用DMF和二氯甲烷依次清洗上述载体树脂，加入哌啶的二氯甲烷溶液，常温反应；

c-1)分别用DMF和二氯甲烷依次清洗步骤b-1)反应后的载体树脂，将2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基取代的碳链烷酸、EDC、NHS于二氯甲烷中溶解，然后加入到清洗后的载体树脂中，常温反应；

d-1)分别用甲醇和二氯甲烷依次清洗步骤c-1)反应后的载体树脂，加入三氟乙酸的二氯甲烷溶液，常温震荡，洗脱树脂收集滤液；

e-1)将步骤d-1)中的产物溶解在二氯甲烷中，加三氟乙酸，反应，减压蒸馏去除溶剂，加入氢氧化钠的水溶液，得白色固体。

其中，进一步具体的制备方法如下：

a-2)将Fmoc-Glu(otBu)-OH和DIPEA溶解于二氯甲烷中，倒入用二氯甲烷溶胀的载体树脂中，常温反应，氮气鼓泡；

b-2)分别用DMF和二氯甲烷依次清洗上述载体树脂，加入哌啶的二氯甲烷溶液，常温反应，氮气鼓泡；

c-2)分别用DMF和二氯甲烷依次清洗步骤b-2)反应后的载体树脂，将2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基取代的碳链烷酸、EDC、NHS于二氯甲烷中溶解，然后加入到清洗后的载体树脂中，常温反应，氮气鼓泡；

d-2)分别用甲醇和二氯甲烷依次清洗c-2)步反应后的载体树脂，加入TFA的二氯甲烷溶液，常温震荡，洗脱树脂，收集滤液，重复本步骤2次，合并滤液，减压蒸馏去除溶剂；

e-2)将步骤d-2)的产物溶解在二氯甲烷中，缓慢滴加三氟乙酸，反应，减压蒸馏去除溶剂，加入氢氧化钠水溶液，有白色固体析出，离心，收集沉淀。

其中，2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基取代的碳链烷酸的具体结构如下：

其中n＝1-11之间任意的整数。

在一些实施方案中，优选n＝5-11之间任意的整数。

在一些实施方案中，更优选n为11。

进一步地，本发明提供了式X化合物用于制备降糖肽的用途。

进一步地，本发明还提供了上述降糖肽的制备方法，其特征在于，由多肽链与式X的小分子在有机溶剂中反应缀合。

进一步地，在一些实施方案中，由多肽链与式X的小分子在有机溶剂中反应缀合后，经制备液相纯化。

上述多肽链可以由固相合成的方法制备得到；其中，所述固相合成方法具体包括多肽链的合成、切割和纯化。

本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述降糖肽。

在一些实施方案中，所述药物组合物还进一步地包含药学上可接受的载体。

本发明中，除非特别说明，所述治疗有效量，是指能够有效实现其治疗目的活性成分的含量。对具体应用有效的实际用量会取决于所治疗的状况，等等。例如，当在治疗糖尿病的方法中施用时，这类组合物会含有能够有效实现期望结果(例如降低受试者中的空腹血液葡萄糖)的活性成分量。

施用的化合物的剂量和频率(单剂或多剂)可以随着多种因素而变化，所述因素包括但不限于施用途径、接受者的状况(例如体格、年龄、性别、健康、体重、体重指数、和饮食)、所治疗疾病症状的性质和程度、存在其它疾病或其它健康相关问题、同时治疗的种类和来自任何疾病或治疗方案的并发症。可以与本发明的方法和化合物联合使用其它治疗方案或药剂。

可以从动物模型中确定人用的治疗有效量。例如，可以将人用剂量配制为达到已经发现在动物中有效的浓度。可以通过监测一种或多种生理学参数，包括但不限于血液葡萄糖和体重，并将该剂量向上或向下调节来调节人用剂量，如上文所描述的且本领域中已知的。

如本文中使用的，术语“药学可接受载体”指药用赋形剂，例如适合于肠或胃肠外应用的药学、生理学可接受的有机或无机载体物质，其不与活性剂起反应。合适的药学可接受载体包括水、盐溶液(例如林格(Ringer)氏溶液等)、醇、油、明胶、和碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、和聚乙烯吡咯烷。可以将这类制剂灭菌，并且在期望时与不与本发明的化合物有害地起反应的辅助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、染料、和/或芳香物质等混合。

进一步的话，也可以存在其它张力调节剂如氯化钠以及其它已知的赋形剂。在一些情况下，这类赋形剂可用于维持化合物的总体张力。可以以各种浓度将赋形剂包含在目前描述的配制剂中。例如，可以以下列浓度范围包含赋形剂：约0.02％至约20％w/w，优选地约0.02％和0.5％w/w之间，约0.02％至约10％w/v，或约1％至约20％w/w。另外，与目前制剂自身类似，可以以固态(包括粉末的)、液态、半固态或凝胶形式包含赋形剂。

所述药物组合物可以以各种形式呈现，例如固体、液体、半固体或液体构成。如本文中使用的，术语“固体”意指涵盖此术语的所有正常使用，例如，粉末或冻干配制剂。

术语缓冲剂，由弱酸和该弱酸的盐、或弱碱或该弱碱的盐组成的溶液体系构成，其具有在添加酸或碱后、或用溶剂稀释后对抗pH变化的能力。例如可以为醋酸-醋酸钠、乳酸-乳酸钠、醋酸－醋酸铵等

所述药物组合物是任何一种药剂学上的片剂、胶囊、注射剂、散剂、颗粒剂、吸入剂或膜剂。

本发明进一步提供了上述降糖肽或其药物组合物在制备用于预防和治疗糖尿病的药物中的应用。

在本说明书全文采用以下缩写：

His:组氨酸；Gly：甘氨酸；Glu：谷氨酰；Thr：苏氨酸；Phe：苯丙氨酸；Ser：丝氨酸；Asp：天门冬氨酸；Leu：亮氨酸；Cys：半胱氨酸；Gln：谷氨酰胺；Met：甲硫氨酸；Ala：丙氨酸；Val：缬氨酸；Arg：精氨酸；Leu：亮氨酸；Ile：异亮氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Asn：天冬酰胺；Pro：脯氨酸。

N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸GAMMA-叔丁酯：Fmoc-Glu(otBu)-OH；2-氯三苯甲基氯树脂：2-CTC树脂；二氯甲烷：DCM；氯仿：TCM；四氢呋喃：THF；乙腈：ACN；二甲基甲酰胺：DMF；二甲亚砜：DMSO；N,N-二异丙基乙基胺：DIPEA；1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯：DBU；EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；HOBt：1-羟基-苯并三氮唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；三氟乙酸：TFA。

本发明提供的上述降糖肽具有显著的降糖效果，而且化学性质稳定，半衰期长达39个小时，较内源性GLP-1(半衰期2-3分钟)或上市药物艾塞那肽(半衰期2.4小时)有了显著的提高。

附图说明

图1：实施例6血浆稳定性实验数据图；

图2：实施例7正常小鼠腹腔注射糖耐量实验数据图；

图3：实施例8正常小鼠腹腔注射长效化糖耐量实验数据图。

具体实施方式

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1：2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基取代的碳链烷酸的合成，

方式1.1：12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酸的合成

称取12-氨基十二酸(2151.9mg)用乙酸溶解于三颈瓶中，称取顺丁烯二酸酐(980.6mg)用乙酸溶解后，使用恒压滴液漏斗缓慢滴加至上述溶液中，120℃加热回流6h，减压蒸馏去除溶剂，碱性氧化铝柱层析(乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱)纯化后，得到白色粉末状固体，产率81.9％。

¹H-NMR(DMSO-d₆,300MHz):δppm:12.42(s,1H,-COOH),7.50(s,2H,-COCH＝CHCO-),3.88(t,2H,J＝7.0Hz,-NCH₂-),2.68(t,J＝7.3Hz,2H,-CH₂ COOH),2.00-1.96(m,4H,-NCH₂CH₂ (CH₂)₇CH₂ ),1.73(s,14H,-NCH₂CH₂(CH₂)₇ CH₂).MS(ESI,m/z):294.1[M-H]^-,m.p.91-92℃.

方式1.2：10-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十烷酸的合成

合成方法参照方式1.1，以氨基壬酸为起始物料合成。

方式1.3：4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁烷酸的合成

合成方法参照方式1.1，以β-丙氨酸为起始物料合成。

实施例2：化合物X的制备方法

反应路线如下：

方式2.1：12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酰基)-L-谷氨酸的合成

a)2-CTC树脂的溶胀

称取2-CTC树脂(363.6mg，取代度0.55mmol/g)置于多肽反应管中，二氯甲烷溶胀30min，再用二氯甲烷清洗树脂3-5次，滤干备用。

b)X-1的合成

取Fmoc-Glu(otBu)-OH(255.3mg)和DIPEA(1.6mmol,264μL)用约7mL二氯甲烷溶解，将溶液倒入上述的树脂中，常温反应，氮气鼓泡4h，甲醇/DIPEA＝9：1封头30min。

c)X-2的合成

用DMF和二氯甲烷分别清洗上述树脂3次，向反应器中加约10mL脱保护剂，常温反应，氮气鼓泡30min，滤干溶剂。重新加入10mL脱保护剂，常温反应，氮气鼓泡60min。

d)X-3的合成

用DMF和二氯甲烷分别清洗上述树脂3次，称量12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酸(882mg)，EDC(690mg)，NHS(414mg)，用约7mL二氯甲烷溶解，将溶液倒入上述的树脂中，常温反应，氮气鼓泡过夜。

e)X-4的合成

用甲醇和二氯甲烷分别清洗上述树脂3次，最后一次用二氯甲烷清洗。在反应器中加入0.5％TFA的二氯甲烷溶液，常温震荡30min，收集滤液，重复本步骤2次，合并滤液，减压蒸馏去除溶剂。

f)X的合成

用2mL二氯甲烷复溶X-4，缓慢滴加1ml TFA，反应3h，减压蒸馏去除溶剂。加入5mL1M NaOH水溶液，有白色固体析出，离心，收集沉淀，得白色粉末状纯品，产率94.2％。

方式2.2：12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酰基)-L-谷氨酸的合成

a)2-CTC树脂的溶胀

称取2-CTC树脂(363.6mg，取代度0.55mmol/g)置于多肽反应管中，二氯甲烷溶胀30min，再用二氯甲烷清洗树脂3-5次，滤干备用。

b)X-1的合成

取Fmoc-Glu(otBu)-OH(255.3mg)和DBU(1.6mmol,264μL)用约7mL二氯甲烷溶解，将溶液倒入上述的树脂中，常温反应，氮气鼓泡4h，甲醇/DIPEA＝9：1封头30min。

c)X-2的合成

用DMF和二氯甲烷分别清洗上述树脂3次，向反应器中加约10mL脱保护剂，常温反应，氮气鼓泡30min，滤干溶剂。重新加入10mL脱保护剂，常温反应，氮气鼓泡60min。

d)X-3的合成

用DMF和二氯甲烷分别清洗上述树脂3次，称量12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酸(882mg)，EDC(690mg),HOBt(121.5mg)，用约7mL二氯甲烷溶解，将溶液倒入上述的树脂中，常温反应，氮气鼓泡过夜。

e)X-4的合成

用甲醇和二氯甲烷分别清洗上述树脂3次，最后一次用二氯甲烷清洗。在反应器中加入0.5％TFA的二氯甲烷溶液，常温震荡30min，收集滤液，重复本步骤2次，合并滤液，减压蒸馏去除溶剂。

f)X的合成

用2mL二氯甲烷复溶X-4，缓慢滴加1ml TFA，反应3h，减压蒸馏去除溶剂。加入5mL1M NaOH水溶液，有白色固体析出，离心，收集沉淀，得白色粉末状纯品。

方式2.3：10-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十烷酰基)-L-谷氨酸的合成

参照方式2.1，将步骤的d)中的12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酸替换为10-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十烷酸即可。

方式2.4：4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁烷酰基)-L-谷氨酸的合成

参照方式2.1，将步骤的d)中的12-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)十二烷酸替换为4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁烷酸即可。

实施例3多肽链合成

3.1His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Cys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

a)树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA树脂(18.2g，取代度0.55mmol/g)置于多肽反应管中，二氯甲烷溶胀30min后，用甲醇和二氯甲烷分别清洗3次，放置备用。

b)9-笏甲氧羰基(Fmoc)的脱除

脱保护剂的配制：称取HOBt(6.75g)，用DMF 400mL溶解后，加入哌啶100mL，混匀。脱保护分两次进行。第一次，加入脱保护剂约50mL，氮气鼓泡，使树脂与脱保护剂充分接触，脱保护30min后，滤去脱保护剂，重新加入新的脱保护剂约50mL，第二次脱保护60min。脱保护完成后，用DMF和二氯甲烷交替清洗树脂3次，取少量树脂用1％溴酚蓝/乙醇溶液检测，若树脂为蓝色且溶液为黄色澄清液体，则进入下一步，否则重新进行脱保护操作。

c)Fmoc保护基的氨基酸的耦合

称取Fmoc保护的氨基酸25mmol和HOBt(4.05g)用DMF：DCM＝1：1的混合溶剂充分溶解，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加35％的DIC/乙醇溶液，继续搅拌10min，待有白色不溶物出现，将上述氨基酸溶液倒入盛有树脂的多肽反应器中。氮气鼓泡4h，反应结束后，用DMF和二氯甲烷轮换清洗2次，取小量树脂用1％溴酚蓝/酒精溶液检测，若树脂为白色透明，则耦合成功，进入下一个循环，否则重新进行氨基酸耦合操作。

d)多肽的合成

根据氨基酸序列，重复上述的耦合和脱保护步骤，依次耦合相应的氨基酸，直到多肽链耦合完毕，获得缀有多肽链的树脂。

e)多肽的切割

将缀有多肽链的树脂置于多肽反应器中，用二氯甲烷和甲醇交替清洗树脂5次，最后一次用二氯甲烷清洗树脂。若是干燥的树脂，用二氯甲烷溶胀30min后，使用二氯甲烷和甲醇轮换洗涤树脂5次。向反应器中加入切割剂Reagent K(TFA/thioanisole/water/phenol/EDT 82.5:5:5:2.5)，4℃震荡1h后，常温震荡3h，抽滤，收集滤液。将滤液倒入5倍体积的冰乙醚中，-20℃静置1h，4℃离心(5000rpm*5min)，弃置上清，用冰乙醚清洗沉淀5-6次，真空干燥。

f)多肽的纯化

采用制备液相的方法。进行多肽的纯化。使用Shimadzu 6A制备型高效液相，色谱条件：色谱柱：C18反相制备柱(5μm，340mm*28mm，Shimadzu)，流动相A：1‰三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：1‰三氟醋酸/乙腈(V/V)，波长：214nm，流速：5mL/min，梯度洗脱，样品的配制：将待检测多肽用50％乙腈/水(V/V)溶解，配制成10mg/mL的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样。

3.2

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-NH₂肽链的合成

参照3.1的方式合成。

实施例4降糖肽的合成

4.1降糖肽B-1

称取100mg实施例3.1合成的多肽用DMSO 3mL充分溶解，称取4mg小分子X(实施例2，方式2.1合成的小分子)用DMSO 200μL充分溶解，二者混匀，搅拌，室温反应过夜。用UPLC-MS检测反应完成后，将反应液倾入30％乙腈/水溶液(含1‰三氟醋酸)15mL中，立即震荡混匀。样品采用0.45μm滤膜过滤，经制备液相进行纯化。使用日本Shimadzu公司制备型反相高效液相色谱，色谱条件：色谱柱：C18反相制备柱(5μm,340mm*28mm,Shimadzu)，流动相A：1‰三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：1‰三氟醋酸/乙腈(V/V)，波长：214nm，流速：5mL/min，梯度洗脱，B 30％～90％30min，90％～90％10min。

使用LC-MS液质联用仪检测多肽分子量，色谱条件：色谱柱：C18反相柱(CSH,1.7μm,2.1×50mm,Waters)，进样量：3.000μL，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸/水(V/V)，流动相B：乙腈，波长：214nm，流速：0.3mL/min，梯度洗脱：B 10％～90％3min，90％～90％1min。

样品的配制：将待检测多肽用50％乙腈/水(V/V)溶解，配制成0.5mg/mL的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

具体的质谱数据如下

4.2降糖肽B-2

称取100mg实施例3.2合成的多肽用DMSO 3mL充分溶解，称取4mg小分子X(实施例2，方式2.1合成的小分子)用DMSO 200μL充分溶解，二者混匀，搅拌，室温反应过夜。用UPLC-MS检测反应完成后，将反应液倾入30％乙腈/水溶液(含1‰三氟醋酸)15mL中，立即震荡混匀。样品采用0.45μm滤膜过滤，经制备液相进行纯化。使用日本Shimadzu公司制备型反相高效液相色谱，色谱条件：色谱柱：C18反相制备柱(5μm,340mm*28mm,Shimadzu)，流动相A：1‰三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：1‰三氟醋酸/乙腈(V/V)，波长：214nm，流速：5mL/min，梯度洗脱，B 30％～90％30min，90％～90％10min。

使用LC-MS液质联用仪检测多肽分子量，色谱条件：色谱柱：C18反相柱(CSH,1.7μm,2.1×50mm,Waters)，进样量：3.000μL，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸/水(V/V)，流动相B：乙腈，波长：214nm，流速：0.3mL/min，梯度洗脱：B 10％～90％3min，90％～90％1min。

样品的配制：将待检测多肽用50％乙腈/水(V/V)溶解，配制成0.5mg/mL的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

具体的质谱数据如下

其它降糖肽可以参照上述方法合成，只需更改特定的化合物X的结构即可。

实施例5受体激动活性实验

GLP-1受体激动剂主要通过激动GLP-1R发挥各种生理活性。早期通过转染技术，成功地构建了高表达GLP-1R的HEK293细胞，当受体被激活后，细胞内第二信使cAMP含量升高，关闭K_ATP和电压门控型钾离子通道，引起细胞膜去极化，激活电压依赖性的L型Ca²⁺通道，增加胞外Ca²⁺内流，增加胰岛素释放。使用cAMP检测试剂盒，通过竞争ELISA实验测定化合物激活受体产生的cAMP的量来评估化合物的受体激动活性。

具体方式如下：HEK293细胞共转染编码GLP-1R的cDNA，细胞系表达并利用WesternBlot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R的蛋白水平，以考察是否建立了稳定高表达的GLP-R-HEK293细胞株。受体激动活性实验中，首先，将细胞种于96孔板中，2h后，化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的GLP-1R-HEK293细胞中。孵育20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒检测相应的cAMP值，非线性回归后计算降糖肽B-1、B-2、艾塞那肽、利拉鲁肽的EC₅₀数值。

表1受体激动活性

结果为平均值±SD,**P<0.01vs艾塞那肽,##P<0.01vs利拉鲁肽.

如表1所示，所有长效化降糖肽对GLP-1R的激动活性都得到保留，与上市药物利拉鲁肽相比，化合物对GLP-1R的激动活性均有明显提高，且有显著的改善，活性提高了6倍以上。

实施例6血浆稳定性实验

称取降糖肽B-1、B-2以及作为对照的艾塞那肽、利拉鲁肽，用Tris-HCl缓冲液溶解，配制为1000ng/mL母液，取400μL衍生物溶液和400μL大鼠血浆，用混匀仪混匀，置于37℃水浴中，孵育0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48和72h，每个时间点取出50μL混合液，加100μL乙腈(含0.1％TFA)沉淀蛋白，使用混匀仪涡旋30min，离心14000rpm*15min，取上清，再次离心14000rpm*10min，使用UPLC-MS/MS分析，对质谱峰面积进行积分，绘制降解曲线，得到目标化合

物的血浆半衰期。具体情况详见图1。

根据图1的数据可知，降糖肽B-1以及B-2的半衰期明显延长，优于艾塞那肽、利拉鲁肽。

实施例7正常小鼠腹腔注射糖耐量实验

雄性ICR小鼠(18-22g)，按体重随机分组，每组6只，适应性喂养1周后进行实验。开始实验前，禁食12h，不禁水，腹腔注射待测降糖肽B-1、B-2(25nmol/kg)，阳性对照为艾塞那肽(25nmol/kg)，阴性对照为生理盐水(saline)。30min后测量血糖，注射18mmol/kg葡萄糖，将注射葡萄糖时间规定为时间点0min，分别测量15min、30min、60min、120min和180min的血糖水平，并绘制血糖-时间曲线，详见图2。

降血糖实验结果表明，本发明中涉及的长效化降糖肽，体内降血糖效果与艾塞那肽相当。

实施例8正常小鼠腹腔注射长效化糖耐量实验

为了检测目标降糖肽B-1、B-2的长效化降糖水平，进行正常小鼠腹腔单次注射给药，多次糖耐量检测实验。首日腹腔注射生理盐水(saline)、艾塞那肽(25nmol/kg)、降糖肽B-1(25nmol/kg)或降糖肽B-2(25nmol/kg)，30min后检测糖耐量水平，然后自由饮食12小时，随后禁食不禁水12小时；之后(即次日)腹腔注射葡萄糖(18mmol/kg)，再次检测糖耐量水平；重复上述的“自由饮食-禁食-糖耐量”循环，从而探究化合物的长效化降糖水平。

雄性ICR小鼠(18-22g)，按体重随机分组，每组6只，12h交替昼夜，适应性喂养1周后进行实验。腹腔注射降糖肽B-1(25nmol/kg)或降糖肽B-2(25nmol/kg)，阳性对照为艾塞那肽(25nmol/kg)，阴性对照为生理盐水(saline)，注射待测化合物后30min，腹腔注射18mmol/kg葡萄糖，分别测量15min、30min、60min、120min和180min的血糖水平，然后自由饮食12小时，再禁食不禁水12小时，再次检测糖耐量，监测给糖后的血糖变化情况，重复上述的“自由饮食-禁食-糖耐量”循环，绘制血糖-时间曲线，从而探究化合物的长效化降糖水平。具体情况详见图3。由图3可知，降糖肽B-2稳定血糖的时间均可达到26h，远高于艾塞那肽的2h，降糖效果稳定持续。

即本发明提供的降糖肽，在保证效果的同时，有效的延长了其半衰期以及作用时间。

序列表

<110> 中国药科大学；南京正大天晴制药有限公司

<120> 一种降糖肽及其应用

<130> 01

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Xaa Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa

35 40

Claims (10)

1.一种降糖肽，其特征在于，氨基酸序列为：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa1-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Xaa2)q-NH2。

其中Xaa1为Lys或Cys-AA1-(AA2)_m-AA3；

Xaa2为Cys-AA1-(AA2)_m-AA3；

AA1为

AA2为亚甲基，其中AA2与AA1的N端相连；

AA3为

其中，q为0或者1；m为1-11之间的任意整数；

其中，当Xaa1为Lys时，q不为0。

2.根据权利要求1所述的一种降糖肽，其特征在于，当Xaa1为Cys-AA1-(AA2)_m-AA3，q为0。

3.根据权利要求1所述的一种降糖肽，其特征在于，m为5-11之间的任一整数，优选m为11。

4.根据权利要求1所述的一种降糖肽，其特征在于，Cys-AA1-(AA2)_m-AA3的具体结构如下：

5.根据权利要求1所述的一种降糖肽，其特征在于，具有如下结构：

6.一种式X的化合物，其特征，具体结构如下：

其中n＝1-11之间任意的整数，优选n＝5-11之间的整数，更优选n为11。

7.一种式X化合物的制备方法，其特征在于，反应路线如下：

其中，P为载体树脂；

其中n＝1-11之间任意的整数。

8.根据权利要求6所述的一种式X化合物，其用于制备权利要求1-5任一所述的降糖肽的用途。

9.根据权利要求1-5任一所述的一种降糖肽或其药物组合物在制备用于预防和治疗糖尿病的药物中的应用。

10.根据权利要求1-5任一所述的降糖肽所制备的药物组合物，所述药物组合物是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、注射剂、散剂、颗粒剂、吸入剂或膜剂。