JPH08140688A - Ｅｃｄｎ蛋白質およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ステロイドホルモン受容体様蛋白質をコ
ードするＤＮＡ、該遺伝子がコードする蛋白質（ＥＣＤ
Ｎ蛋白質）およびＥＣＤＮ小分子蛋白質の提供。 【解決手段】 ヒト胎児肺のｃＤＮＡライブラリーか
ら、新規なステロイドホルモン受容体様蛋白質をコード
するＤＮＡの構造を決定した。さらに、各種癌細胞中に
はＥＣＤＮ小分子蛋白質が発現していることが判明し
た。 【効果】 被検組織中の、ＥＣＤＮ蛋白質およびＥＣＤ
Ｎ小分子蛋白質の遺伝子発現を解析することにより、癌
の診断、治療への応用が期待される。また本受容体蛋白
質に特異的に結合する天然および合成化合物を解析する
ことにより、新たな医薬の開発が期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なステロイドホ
ルモンレセプター様蛋白質であるＥＣＤＮ蛋白質、それ
をコードするＤＮＡならびに本蛋白質の製造方法および
使用方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来ステロイドホルモンレセプター様蛋
白質として、アミノ酸配列上相同性を持つ蛋白質群がこ
れまで発見同定され、それらはステロイドホルモン類の
他に甲状腺ホルモン、ビタミンＤ代謝物およびその天然
ならびに合成誘導体、レチノイン酸およびその天然なら
びに合成誘導体、ビタミンＡ代謝物などの脂溶性ビタミ
ンの誘導体に対して応答性を有する。これらリガンド依
存性の転写調節蛋白質群は、スーパーファミリーを構成
しており、ホルモンやリガンド刺激に対してＤＮＡの特
異的な応答エレメントに直接結合することにより、特定
の遺伝子発現を調節することができる。これらレセプタ
ー蛋白質は、ホルモンやビタミン類をリガンドとして特
定の遺伝子の発現を調節する転写調節因子として発生や
分化、生体の恒常性の維持にきわめて重要な機能を果た
していることが明らかとされ、従来よりこれらレセプタ
ーに結合し、リガンドとして機能しうる天然ならびに合
成誘導体は、広く医学、薬学、農学の分野で研究応用さ
れてきている。ステロイドホルモンレセプター蛋白質の
スーパーファミリーに属すると考えられている蛋白質群
の中には、スーパーファミリーに共通なＤＮＡ結合ドメ
インの相同性に注目し、緊縛条件を緩和させた条件で分
子クローニングされてきた蛋白質群が数多く含有され、
これらの蛋白質群の中にはこれまで特異的なリガンドが
未同定であるオーファンレセプターと呼ばれる一群の蛋
白質が存在する。オーファンレセプターの特異的リガン
ドの同定や転写調節因子として果たす機能に関する研究
は、医学生物学に新たな知見を提供し、医薬や農学に対
する応用が期待される重要な研究として位置づけられて
いる。例えばレチノイドＸ受容体(RXR) は、従来オーフ
ァンレセプターの一つと位置づけられていたが、そのリ
ガンドが9-シス−レチノイン酸と判明し、転写調節に重
要な機能を担う受容体であることが明らかにされた。ヒ
トに於けるリガンド依存性転写調節機構に関わる蛋白質
にはさらに多くの未知受容体があるものと考えられ、こ
れらを単離同定することは医学・薬学への応用という観
点でも重要な意義がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ステロイド
／サイロイドホルモン レセプター スーパーファミリ
ーに属する新規なヒト由来レセプター蛋白質、それをコ
ードする遺伝子、さらにそれらを用いたレセプター機能
の解析法やリガンドの探索法等を提供し、その応用分野
を広げることを目的、課題とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】ステロイドホルモン受容
体様蛋白質群としてスーパーファミリーを構成する蛋白
質群の構造上の比較、および遺伝子改変による変異レセ
プターを用いた機能解析の研究から、これら蛋白質群が
機能的なドメインより構成されていることが、これまで
の研究から明らかにされてきた。なかでもアミノ酸66個
から68個よりなり２個の亜鉛フィンガーを持つドメイン
は、スーパーファミリー内の蛋白質群間で、もっとも相
同性が高くＤＮＡに結合するドメインであり、Ｃ末側約
250 個のアミノ酸よりなるドメインは、リガンド結合ド
メインとしてリガンド依存性に関与することが明らかと
されつつある。これらステロイドホルモンレセプター様
蛋白質は、哺乳類のみならず昆虫においても発見同定さ
れており、代表的には昆虫の変態を司るエクジソンと呼
ばれるステロイドホルモンに対する受容体も本スーパー
ファミリーの一員である。本発明者らは、ヒト胎児肺よ
り作成したｃＤＮＡライブラリーよりクローンをランダ
ムに選び各クローンの5'側の塩基配列を決定し、それよ
り演繹されるアミノ酸配列を検索したところ、昆虫の脂
肪体より単離同定されたエクジソン受容体に相同性が高
いクローンを見出した。このクローンは全長ｃＤＮＡを
含んでいなかったので、再度このクローンをプローブと
してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果ヒ
ト乳腺ライブラリーより全長ｃＤＮＡを含むクローンを
得た。このｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列
は、エクジソン受容体、ヒトやマウスのレチノイン酸受
容体、ならびに甲状腺ホルモン受容体に高い相同性が認
められた。特にＤＮＡ結合ドメインに相当すると思われ
る部位には２箇所の亜鉛フィンガーを含む領域が高い相
同性を持って保持されていた。またリガンド結合領域に
相当する領域は上述のエクジソン受容体やレチノイン酸
受容体との相同性が高くステロイドホルモン受容体様蛋
白質に特徴的なドメイン構造を持ち、かつこれまで報告
のない新規な受容体蛋白質であることが確認された（Ｅ
ＣＤＮ蛋白質と命名）。

【０００５】本受容体蛋白質をコードするｃＤＮＡを大
腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳類細胞などの宿主に導入し
た形質転換体を作成することによって、本受容体蛋白質
を分離精製し、結合しているリガンドを構造決定するこ
とが可能となるほか、精製蛋白質を用いた結合試験によ
って本受容体に結合する新たな合成リガンドや応答エレ
メントの検索に用いることができる。本受容体蛋白質を
コードするｃＤＮＡをさらに応答エレメントとレポータ
ー遺伝子を含むプラスミドとともに共形質変換体を作成
することにより、本受容体の転写活性に及ぼす作用につ
いて詳細に検討することが可能となる。

【０００６】本発明は、例えば本蛋白質の結合するＤＮ
Ａ応答エレメントや他の転写調節因子等との相互作用、
特異的なリガンドの検索を行うことによって、転写調節
因子としての機能を解析し、新たな医療用医薬品、診断
薬、予防薬の発見等に研究の広がりを提供し、この分野
の知見を飛躍的に進歩させ得るという点できわめて重要
である。さらに本発明者らは抗ＥＣＤＮ蛋白質モノクロ
ーナル抗体を作成し、各種細胞の本蛋白質の発現を解析
したところ、驚くべきことに、癌細胞において約50kDa
のＥＣＤＮ蛋白質のほかに約40kDa の小分子のＥＣＤＮ
蛋白質が癌特異的に発現していることが確認された。次
いで、この小分子ＥＣＤＮ蛋白質の構造を確認したとこ
ろ、291 個の塩基が欠失し97個のアミノ酸が欠失したＥ
ＣＤＮ小分子蛋白質であることが確認された。これらの
事実から、本発明のＥＣＤＮ小分子蛋白質は癌の診断、
治療などに広く利用し得るユニークな蛋白質であること
が判明した。

【０００７】すなわち本発明は（１）配列番号１および
２に記載のＤＮＡ、およびそれらがコードするＥＣＤＮ
蛋白質およびＥＣＤＮ小分子蛋白質、（２）該ＤＮＡを
含有するベクター、および該ベクターとそれに応答ＤＮ
Ａを含むレポーターベクターを保持する共形質転換体、
（３）該蛋白質に結合する抗体、（４）該ＤＮＡの一部
を含むプローブまたはプライマーを用いるＥＣＤＮ蛋白
質またはＥＣＤＮ小分子蛋白質の遺伝子解析方法および
細胞検査方法からなる。

【０００８】本発明のＤＮＡは、その一部をプライマー
またはプローブとして用いることにより、ＥＣＤＮ蛋白
質またはＥＣＤＮ小分子蛋白質の遺伝子解析や遺伝子の
発現の解析に利用することができる。「一部」とは、プ
ライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオ
チドが本発明のＤＮＡ配列をもとに少なくとも８個の対
応する塩基配列からなり、好ましくは少なくとも１０個
の塩基配列、さらに好ましくは少なくとも約１５〜２５
個の塩基配列からなる対応するポリヌクレオチドを意味
する。このＤＮＡがコードするＥＣＤＮ蛋白質またはＥ
ＣＤＮ小分子蛋白質の全部または一部をエピトープとし
て用い、抗体の作成、およびその抗体を用いる研究用、
診断用試薬として利用することができる。「エピトー
プ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に
少なくとも６個のアミノ酸で構成され、６個のアミノ酸
で構成されるポリペプチドが抗体と結合することは公知
である（公表特許公報60-500684 号）。ＥＣＤＮ蛋白質
の一部とは、本発明のＥＣＤＮ蛋白質のアミノ酸配列に
基づいて、連続してなる少なくとも６個のアミノ酸、好
ましくは少なくとも８個のアミノ酸、さらに好ましくは
少なくとも約１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少な
くとも約１５〜２５個のアミノ酸からなるポリペプチド
を意味する。配列番号１または２に記載のＤＮＡがコー
ドするＥＣＤＮ蛋白質およびその一部からなるものにお
いて、その配列のうち、１もしくは複数個のアミノ酸
が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有す
る蛋白質も本発明に含まれる。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を詳細
に説明する。 （１）ｃＤＮＡクローンの単離 常法により、ヒト胎児肺ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡを合
成し、一定方向にクローニングされたｃＤＮＡ挿入体を
有するｃＤＮＡライブラリーを作製する。このライブラ
リーよりランダムにクローンを選び、5'側より塩基配列
を決定し、蚊の脂肪体組織よりクローニングされたエク
ジソン受容体と相同性を有する一つのクローンを選択す
る。全長ｃＤＮＡを含んでいない場合は、当該クローン
のｃＤＮＡをプローブとして種々のｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、目的とする全長ｃＤＮＡを含む
クローンを得ることができる。

【００１０】（２）遺伝子の全構造の確認 上記の方法により得られるｃＤＮＡは、配列番号１に記
載の新規なＤＮＡ配列であることが確認され、それがコ
ードする新規な蛋白質をＥＣＤＮ蛋白質と命名した。

【００１１】（３）組換え発現ベクターとその形質転換
体 上記記載の方法により得られたヒトＥＣＤＮ蛋白質をコ
ードする遺伝子ＤＮＡあるいはその断片を適切なベクタ
ーに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入する
ことにより形質転換体を得ることができる。これを常法
により培養し培養物よりヒトＥＣＤＮ蛋白質を大量に生
産することができる。さらに具体的には、ヒトＥＣＤＮ
蛋白質をコードするＤＮＡまたはその断片を、その発現
に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮ
Ａリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組換え
発現ベクターを作成することができる。使用できるベク
ターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミドpRB322、
pUC18、枯草菌由来のプラスミド pUB110,酵母菌由来のプ
ラスミド pRB15, バクテリオファージλgt 10 ，λgt 1
1 あるいはSV40などが挙げられるが宿主内で複製、増幅
可能なベクターであれば特に限定されない。プロモータ
ーおよびターミネーターに関してもヒトＥＣＤＮ蛋白質
をコードするＤＮＡ塩基配列の発現に用いられる宿主に
対応したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適
切な組み合わせも可能である。用いるＤＮＡはヒトＥＣ
ＤＮ蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れでも良く、
配列番号１記載の塩基配列に限定されるものではなく、
意図的であるか否かにかかわらず塩基配列の一部が置
換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩基
配列を有するＤＮＡであってもよい。また化学合成によ
って合成されたものでも良い。このようにして得られた
組換え発現ベクターはコンピテント細胞法（J. Mol.Bio
l., 53, 154, 1970）、プロトプラスト法（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978）、リン酸カルシウ
ム法（Science, 221, 551, 1983)、インビトロパッケー
ジング法（Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 197
5)、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）など
により宿主に導入し、形質転換体が作製される。宿主と
しては大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞
などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じ
た適切な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、
pH５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌が行
われる。形質転換は、本蛋白質の組換え発現ベクター単
独に限定されることはなく、たとえばこのＥＣＤＮ蛋白
質が結合しうるＤＮＡ応答エレメントを含むレポーター
プラスミドと共に共形質転換体を作製することができ
る。

【００１２】（４）組換え蛋白質の分離・精製 培養物からのＥＣＤＮ蛋白質の分離・精製は公知の分離
・精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの
公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲルろ過
法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどが挙げられる。

【００１３】（５）抗体の作成 抗体は、ＥＣＤＮ蛋白質の全部あるいは一部分を抗原と
して、通常の方法で作成することができる。例えば、ポ
リクローナル抗体はマウス、モルモット、ウサギ等の動
物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分に
免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離して作製す
る。なお、市販のアジュバントも使用できる。モノクロ
ーナル抗体は、例えば、ＥＣＤＮ蛋白質で免疫したマウ
スの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合
により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリド
ーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水
から調製することができる。抗原とするＥＣＤＮ蛋白質
は必ずしも全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構
造を有するペプチド、その変異体、誘導体、あるいは他
のペプチドとの融合ペプチドであってもよく、調製法は
生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。また、Ｅ
ＣＤＮ蛋白質およびＥＣＤＮ小分子蛋白質の個別分析を
目的とするならば、両蛋白質の共通部分、欠失部分また
は新しく生じたペプチド部分など適宜エピトープを選択
することで可能となる。これら抗体はヒト生体試料中の
ＥＣＤＮ蛋白質の同定や定量用の試薬として使用でき
る。本発明の抗体は、必要に応じて F(ab')2, Fab', Fa
b などのフラグメントおよびそれらの誘導体として使用
することも可能であり、さらにキメラ抗体、ヒト化抗
体、ヒト抗体としての応用も可能で、これらすべて本発
明に含まれる。ＥＣＤＮ蛋白質の免疫学的測定法は、公
知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝
集反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施
できる。

【００１４】（６）遺伝子および発現の解析 本発明により提供されるヒトＥＣＤＮ蛋白質およびＥＣ
ＤＮ小分子蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの制限酵素
断片をプローブとして、または該遺伝子ＤＮＡの中から
適切な位置の塩基配列を適宜選択しその合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとして、用いることにより該遺伝
子の変異の有無を解析することができる。また、試料中
の該遺伝子における挿入、欠失などの異常もこれらの解
析により検知することができる。なお、このＥＣＤＮ蛋
白質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドを保有
するEscherichia coli DH5α/pFATSR は通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM BP- 476
9 として平成６年８月４日寄託された。

【００１５】（７）リガンド結合物質および応答ＤＮＡ
の解析 （３）で作製した形質転換体を一定期間培養した後、形
質転換細胞より発現しているＥＣＤＮ蛋白質を分離・回
収し、その画分に結合しているリガンドを公知の抽出
法、HPLC、マススペクトロメトリー、核磁気共鳴法など
を組合わせることにより培養条件下で結合しているリガ
ンドの構造を決定できる。リガンドの構造を明らかとし
た後、形質転換体からの粗抽出物もしくは単離精製した
ＥＣＤＮ蛋白質を用いて標識リガンドと共にレセプター
結合試験を行い、ＥＣＤＮ蛋白質に結合しうる天然もし
くは合成誘導体をスクリーニングすることができる。Ｅ
ＣＤＮ蛋白質が結合する応答ＤＮＡの解析には、形質転
換体からの粗抽出物もしくは単離精製したＥＣＤＮ蛋白
質を用いて、同位体もしくはビオチンなどの非同位体標
識されたＤＮＡ配列とともにゲル・シフト法などの公知
のＤＮＡ結合能試験によって解析することができる。

【００１６】（８）レポータープラスミドとの共形質転
換体を用いた転写調節作用の解析 ＥＣＤＮ蛋白質もしくは公知で類縁のステロイドホルモ
ン受容体様蛋白質群の結合するＤＮＡ配列を、例えばSV
40やサイトメガロウイルス由来のプロモータや酵母の発
現プロモーター上流に組み込み、プロモーターの下流に
は例えばクロラムフェニコール・アセチルトランスフェ
ラーゼ、胎盤型アルカリ・フォスファターゼ、ルシフェ
ラーゼ、もしくはLacZなどのレポーター遺伝子を挿入し
たレポータープラスミドを構築する。ＥＣＤＮ蛋白質発
現ベクター、またはＥＣＤＮ蛋白質のＤＮＡ結合ドメイ
ンを公知のステロイドホルモン受容体様蛋白質のＤＮＡ
結合ドメインと置換したキメラＥＣＤＮ蛋白質発現ベク
ターを、レポータープラスミドあるいは他のステロイド
・ホルモン受容体様蛋白質発現ベクターとともに酵母、
昆虫細胞、もしくは動物細胞に導入し、共形質転換体を
作製する。このような形質転換体内で発現したＥＣＤＮ
蛋白質は、ＥＣＤＮ蛋白質そのものあるいはその複合体
が、同時に発現させた他の受容体蛋白質もしくは細胞内
の蛋白質と相互作用し、その結果レポータープラスミド
に結合してレポーター遺伝子の転写に作用を及ぼすこと
ができる。レポーター遺伝子の転写を介した発現は、レ
ポーター遺伝子産物に特異的な反応によって検出可能で
ある。こうした転写調節能を解析する方法を用いて、例
えばＥＣＤＮ蛋白質を介して転写調節に作用する物質を
スクリーニングすることが可能となる。

【００１７】（９）癌細胞におけるＥＣＤＮ小分子蛋白
質の発現 実施例９以下に示されるごとく、坑ＥＣＤＮ抗体を用い
るウエスタンブロッティング法による解析およびRT-PCR
法による解析の結果、各種癌細胞株および癌組織におい
て、約40kDa のＥＣＤＮ小分子蛋白質が癌特異的に発現
していることを見いだした。この小分子蛋白質の構造を
確認した結果、配列番号１記載の塩基番号387 〜677 部
分が欠失したものであることが判明した。さらに、この
小分子蛋白質が細胞の核小体に蓄積していることが、免
疫組織染色により確認された。このことは癌の進展とＥ
ＣＤＮ小分子蛋白質の生成が非常に強い相関性を有する
ことを示唆し、被検細胞または組織でのＥＣＤＮ蛋白質
および小分子蛋白質の遺伝子発現解析や細胞内分布を検
査することにより、正常細胞と癌細胞の識別を可能とし
た。遺伝子解析はＥＣＤＮ蛋白質をコードするＤＮＡの
一部をプローブまたはプライマーとして用い被検組織の
ＤＮＡまたはｍＲＮＡを測定すれば良い。プライマーは
欠失部位を考慮して目的に応じて適宜選択することがで
きる。いずれの手法も公知の方法に準じて実施すること
ができる。ＥＣＤＮ蛋白質および小分子蛋白質の測定に
抗体を使用することも可能である。抗体作成用の抗原と
しては、両蛋白質の共通部分、欠失部位または欠失後の
小分子蛋白質の結合部位（配列番号２に記載のアミノ酸
番号61位付近を含む部分）など適宜選択して各抗体を使
い分けることも可能である。

【００１８】（１０）医学への応用 ＥＣＤＮ蛋白質を会して転写調節に作用する物質の中に
は、前骨髄球性白血病におけるall-trans retinoic aci
d のように、ＥＣＤＮ蛋白質の正常の機能を刺激するこ
とにより、小分子ＥＣＤＮ蛋白質を発現する腫瘍細胞の
正常細胞への文化や異常増殖の抑制をもたらす物質が見
いだされることが期待できる。また、小分子ＥＣＤＮｍ
ＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）やリボザイムを用いて、腫瘍に
おけるＥＣＤＮ小分子蛋白質の発現を抑制することによ
り、主要の異常増殖を抑制することが期待できる。ま
た、小分子ＥＣＤＮｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズ
するアンチセンスＲＮＡやリボザイムを発現する遺伝子
構築物を腫瘍に導入することによっても同様の効果が期
待できる。小分子ＥＣＤＮｍＲＮＡに特異的にハイブリ
ダイズする部位としては、ＥＣＤＮ塩基欠失後結合した
部位、すなわち配列番号２に記載のＥＣＤＮ小分子蛋白
質をコードする塩基番号387 位付近を含む部分が掲げら
れる。また、小分子ＥＣＤＮｍＲＮＡもしくは小分子Ｅ
ＣＤＮ蛋白質の発現を適当なプライマー、プローブまた
は抗体を用いて検出することにより、正常組織では見ら
れないＥＣＤＮ小分子蛋白質の発現を抑制する物質をス
クリーニングすることができる。

【００１９】

【発明の効果】本発明の、ヒトＥＣＤＮ蛋白質および該
蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの、全部またはその一
部を含むものを用いて、本受容体の転写調節因子として
の機能や遺伝子そのものの解析、本受容体蛋白質に特異
的に結合する天然および合成化合物を解析することによ
り、新たな治療薬、診断薬、予防薬の発明へと広がりを
期待できる。さらに、被検組織のＥＣＤＮ蛋白質および
ＥＣＤＮ小分子蛋白質の発現、遺伝子解析により癌の診
断、治療への応用が期待される。

【００２０】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例１）ヒトｃＤＮＡライブラリーの作製 ヒト胎児肺および乳腺ｍＲＮＡ (Clontech社より購入)
をもとにｃＤＮＡを合成し、Uni-ZAP XRベクターキット
(Stratagene社より購入) を用いて一定方向にクローニ
ングされたｃＤＮＡ挿入体を有するｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。

【００２１】（実施例２）クローンの選択 実施例１によって作製されたヒト胎児肺ｃＤＮＡライブ
ラリーよりランダムにクローンを選び、5'側より塩基配
列を決定した。これらの塩基配列をFASTA アルゴリズム
を用いてデータ・ベース中の既知の塩基配列と比較した
ところ、昆虫のエクジソン受容体と相同性を有する一つ
のクローンL1-1793 を見出した。

【００２２】（実施例３）全長ｃＤＮＡのクローニング L1-1793 は、全長ｃＤＮＡを含んでいなかったのでL1-1
793 の挿入体ｃＤＮＡをランダムプライムラベリング法
（Feinberg et al.,Anal. Biochem., 132, 6,1983) に
より標識してプローブとし、ハイブリダイゼーションに
より種々のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。その結果、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーより、全
長ｃＤＮＡを含むクローンを得た。構造解析の結果、こ
のｃＤＮＡクローンは1979ｂｐよりなり、205 ｂｐの
５′非翻訳領域、1386ｂｐのコーディング領域、388 ｂ
ｐの３′非翻訳領域を含む新規なＤＮＡ塩基配列である
ことを確認した（配列番号１）。このｃＤＮＡ配列に含
まれるオープンリーディングフレームは、461 アミノ酸
よりなる新規な蛋白質（ＥＣＤＮ蛋白質）をコードして
いた。

【００２３】（実施例４）ＥＣＤＮ蛋白質遺伝子の各種
ヒト組織での発現 実施例３で得たｃＤＮＡクローン（配列番号１）の挿入
ＤＮＡを³²Ｐで標識してプローブとし、各種ヒト組織ｍ
ＲＮＡのノーザンブロット(Clontech 社より購入) 解析
を行った。検討したすべての組織( 脳、心臓、腎臓、肝
臓、肺、膵臓、胎盤、骨格筋、大腸、末梢血白血球、卵
巣、前立腺、小腸、脾臓、睾丸、胸腺)において約２Kb
のｍＲＮＡの発現が認められた。

【００２４】（実施例５）ＥＣＤＮ蛋白質の構造上の特
徴 ＥＣＤＮ蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載さ
れた塩基配列の206 番から1591番までのオープンリーデ
ィングフレームから演繹されたものであり、461 アミノ
酸よりなる新規な蛋白質である。配列中の87番目から15
2 番目の75残基からなるアミノ酸配列は、ステロイドホ
ルモンレセプター様蛋白質群に特徴的な二つの亜鉛フィ
ンガーがエクジソン、レチノイン酸、甲状腺ホルモン等
の受容体蛋白のＤＮＡ結合ドメインと高い相同性を持っ
て保持されている。アミノ酸配列中の243 番のアミノ酸
よりＣ末端の461 番のアミノ酸までの218 残基は、エク
ジソン受容体ならびにレチノイン酸受容体のＣ末端側に
存在するリガンド結合ドメインと相同性が高く、本蛋白
質のリガンド結合部位を形成していた。

【００２５】（実施例６）組換えＥＣＤＮ蛋白質発現ベ
クターの構築 配列番号１に記載されたＥＣＤＮ蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを鋳型とし、PCR 法によって翻訳領域を含む部分
配列を増幅した。 プライマー1; 5'-GACGGATCCATGTCCTCTCCTACCACGAGTT-3'
（コーディング鎖、配列番号１の塩基番号206 番から22
7 番に相当、配列番号３に記載） プライマー2; 5'-CTAGAATTCGGAGGGTGGTCAGGCAAGGC-3'
(アンチセンス鎖、配列番号１の塩基番号1634番から逆
向きに1615番までのアンチセンス鎖に相当、配列番号４
に記載) プライマー1 の5'端にはBamHI 切断部位、プライマー2
の5'端にはEcoRI 切断部位が付加してある。PCR産物をB
amHIおよびEcoRIで切断し、予めBamHI とEcoRIで切断し
た発現ベクターpGEX-2T (Pharmacia社より購入) に挿入
し、発現プラスミドpGST-FATSRを構築した。pGST-FATSR
プラスミドを用いて、E.coli DH5αを形質転換させアン
ピシリン耐性で選択することにより、グルタチオン-S-
トランスフェラーゼとＥＣＤＮ蛋白質の融合蛋白を発現
する形質転換体を得た。

【００２６】（実施例７）組換えＥＣＤＮ蛋白質の発現
と精製 実施例６で得られた形質転換体を培養し、培養物より、
組換えＥＣＤＮ融合蛋白質を抽出・精製した。すなわ
ち、形質転換体を100ml のLB培地(1% peptone, 0.5% ye
ast extract, 1%NaCl)で37℃一夜振とう培養した。培養
液を予め37℃に加温したLB培地で10倍に希釈した上、さ
らに30〜90分培養して対数増殖期の培養物を得た。培養
物１リットルにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) を
終濃度1mM となるように添加して３〜４時間培養した。
培養物から遠心分離により菌体を集めた。発現ベクター
pGST-FATSRによる形質転換体は、菌体に10mlのカラム・
バッファー(150mM NaCl,16mM Na₂HPO₄, 4mM NaH₂PO₄, p
H7.3) を加え超音波によって破砕した。菌体破砕上清可
溶画分をグルタチオン・セファロース4Bカラム(Pharmac
ia社より購入) にかけ、カラムバッファーで洗浄後5mM
の還元型グルタチオンを含む溶出液で溶出した。溶出画
分はSDS ポリアクリルアミド電気泳動法で解析して分画
した。この結果、プラスミドpGST-FATSRによる形質転換
体から、期待される約75,000KDa のGST 融合蛋白質が主
要バンドとして検出される画分が得られた。

【００２７】（実施例８）モノクローナルおよびポリク
ローナル抗体の作成 実施例７で得られた組換えGST 融合蛋白質を免疫抗原、
抗体精製・スクリーニング用抗原、測定用標準抗原とし
て用いた。抗ＥＣＤＮ蛋白質特異的モノクローナル抗体
は GST融合蛋白質をマウスに免疫して作製した。すなわ
ち、 GST融合蛋白質のＰＢＳ溶液（ 500-1000 μg/ml）
を完全アジュバントと１：１の割合で混合しマウスの腹
腔内に100 μg ／匹にて２週間隔で３回免疫を行った。
免疫終了後、P3U1細胞とＢ細胞とのハイブリドーマをPE
G15000を用いて作製し、培養上清中の抗体価をモニター
し、抗ＥＣＤＮ蛋白質特異的抗体を産生するハイブリド
ーマの選択を行った。抗体価の測定は、実施例７で得た
GST 融合蛋白質を固相化（１μg /ml ）したポリスチレ
ン製カップに培養上清100 μl を加え第一反応を行い、
洗浄後、抗マウスIgG-HRP( Horse-raddish peroxidase
）を加え第二反応を行った。洗浄後、酵素基質溶液
（過酸化水素水およびABTS（２，２’−アジノ−ビス−
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）混合
液）を添加し、発色反応（第三反応）を行いモニターし
た。ハイブリドーマを９６ウエルマルチプレートにて培
養し、ＨＡＴ選択を行い、約２週間後に培養上清中の抗
体価を測定し抗原と特異的に反応するクローンを選択し
た。さらに、クローニング操作を行い、１クローン（ F
1D5 ）を抗体産生ハイブリドーマとして樹立した。各ハ
イブリドーマ細胞300 万個を、予め約１週間前に0.5ml
のプリスタンを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウス
の腹腔内に接種し、８〜１０日後に腹水を採取した。各
腹水よりプロテインＧカラムによるアフィニティークロ
マトグラフィーで抗体を精製した。

【００２８】ポリクローナル抗体の作製はＥＣＤＮ蛋白
質アミノ酸配列のうち、245-260 位を選択し化学合成し
たペプチドを抗原とした（配列番号５）。Key Halle Li
mpetとの複合体とした後、Complete adjuvant とともに
ウサギのフットパッドに約２週間おきに４回免疫し、抗
体を作製した。採血した血清の抗体力価の測定はELISA
法にて実施した。即ち、抗原ペプチドをコートしたマイ
クロプレートに血清を添加し、室温２時間反応させ洗浄
後、ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギIgG
抗体を添加、室温１時間反応、洗浄後、酵素基質液を加
え発色反応を行い、吸光度（A405-490）を測定した。そ
の結果、血清10000 倍希釈液において、吸光度が0.097
〜0.398 を示す抗血清５ロットを得た。

【００２９】（実施例９）ウエスタンブロッティング 実施例８で作製したモノクローナル抗体を用いて、各種
組織におけるＥＣＤＮ蛋白質の存在形態を、常法に従い
ウエスタンブロッティング法にて解析した。正常組織で
は約50kDalton(kDal) の正常のＥＣＤＮ蛋白質が認めら
れるのに対し、大腸癌細胞株、食道癌細胞株およびHela
細胞株では約40kDa のＥＣＤＮ小分子蛋白質のオーバー
エクスプレッションが認められた。次いで、乳癌組織、
大腸癌組織およびそれらの患者の正常組織で検討した結
果、大腸癌の７例中３例、乳癌の９例中６例において約
40kDa の小分子蛋白質が癌特異的に発現しており、正常
蛋白質の発現が減少しているのが認められた（図１）。
これらの結果は分子量の小さいＥＣＤＮ蛋白質が癌の進
展（pregression)とともに生成されることを示唆し、抗
体によるこの異常蛋白質（ＥＣＤＮ小分子蛋白質）の検
出が癌細胞の検査に応用できることを示している。

【００３０】（実施例１０）ＲＴ−ＰＣＲ実験 このようなＥＣＤＮ小分子蛋白質が生成するメカニズム
を調べるために、５種類の大腸癌細胞株および６種類の
食道癌細胞株からｍＲＮＡを分離してRT-PCR実験を行っ
た。常法に従ってｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成
し、３組のプライマーセット（それぞれ配列番号６と
７、配列番号８と９、配列番号１０と１１：配列番号１
に記載の塩基番号に基づいて、配列番号６は塩基番号 2
06〜 227 のセンスＤＮＡ、配列番号７は塩基番号 733
〜 753のアンチセンスＤＮＡ、配列番号８は塩基番号 7
00〜725 のセンスＤＮＡ、配列番号９は塩基番号1226〜
1244のアンチセンスＤＮＡ、配列番号１０は塩基番号12
05〜1226のセンスＤＮＡ、配列番号１１は塩基番号1615
〜1634のアンチセンスＤＮＡに相当する。）を用いてコ
ーディング領域の互いに重なり合う３つのセグメントを
ＰＣＲで増幅した。その結果、５’側のセグメントおよ
び３’側のセグメントはいずれの癌細胞株でも正常組織
とのサイズの違いは認められなかった。しかしながら、
中央部のセグメントを増幅した時には、正常サイズの増
幅産物の他に、正常組織では認められない、より短い増
副産物が１１種すべての癌細胞株に認められた（図
２）。この短くなった増幅産物のＤＮＡ配列を決定した
ところ、第７エクソンの291個の塩基が欠損して短くな
っていることが判明した（配列番号１の塩基番号 387〜
677に相当する部分）。この結果、癌細胞特異的なバリ
アントｍＲＮＡはＤＮＡ結合ドメインの97アミノ酸を失
った約40kDa の蛋白質をコードしているものと推察され
た。このことより、RT-PCR、ハイブリダイゼーションな
どの手法を用い、上記バリアントｍＲＮＡを検出するこ
とにより、癌細胞の検出できることが期待される。

【００３１】（実施例１１）免疫組織化学分析 RT-PCRの実験結果とウエスタンブロッティングの比較か
ら、ＤＮＡ結合ドメインを欠くＥＣＤＮ小分子蛋白質が
癌細胞株には蓄積しているものと予想された。この異常
蛋白質が細胞質に存在するか、または核に存在するかを
検討するため、モノクローナル抗体を用いて各種細胞株
の免疫染色を行った。正常組織では細胞全体にわずかな
染色が認められるのに対し、癌細胞株では核小体（nucl
eoli）に大量の抗ＥＣＤＮ抗体と反応する蛋白質の蓄積
が認められた。実施例９のウエスタンブロッティングの
結果から、癌細胞株では大量の約40kDa ＥＣＤＮ蛋白質
を発現していることから、この核小体蓄積蛋白質はＥＣ
ＤＮ小分子蛋白質と予測された。以上のことから、抗体
を用いて異常蛋白質（ＥＣＤＮ小分子蛋白質）の核小体
への蓄積の有無を検査することによって正常細胞と癌細
胞の同定を行いえることが期待される。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２０６．．１５９１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTTTGAGGGT ATTTGAGTAG CGGCGGTGTG TCAGGGGCTA AAGAGGAGGA CGAAGAAAAG 60 CAGAGCAAGG GAACCCAGGG CAACAGGAGT AGTTCACTCC GCGAGAGGCC GTCCACGAGA 120 CCCCCGCGCG CAGCCATGAG CCCCGCCCCC CGCTGTTGCT TGGAGAGGGG CGGGACCTGG 180 AGAGAGGCTG CTCCGTGACC CCACC ATG TCC TCT CCT ACC ACG AGT TCC CTG 232 Met Ser Ser Pro Thr Thr Ser Ser Leu 1 5 GAT ACC CCC CTG CCT GGA AAT GGC CCC CCT CAG CCT GGC GCC CCT TCT 280 Asp Thr Pro Leu Pro Gly Asn Gly Pro Pro Gln Pro Gly Ala Pro Ser 10 15 20 25 TCT TCA CCC ACT GTA AAG GAG GAG GGT CCG GAG CCG TGG CCC GGG GGT 328 Ser Ser Pro Thr Val Lys Glu Glu Gly Pro Glu Pro Trp Pro Gly Gly 30 35 40 CCG GAC CCT GAT GTC CCA GGC ACT GAT GAG GCC AGC TCA GCC TGC AGC 376 Pro Asp Pro Asp Val Pro Gly Thr Asp Glu Ala Ser Ser Ala Cys Ser 45 50 55 ACA GAC TGG GTC ATC CCA GAT CCC GAA GAG GAA CCA GAG CGC AAG CGA 424 Thr Asp Trp Val Ile Pro Asp Pro Glu Glu Glu Pro Glu Arg Lys Arg 60 65 70 AAG AAG GGC CCA GCC CCG AAG ATG CTG GGC CAC GAG CTT TGC CGT GTC 472 Lys Lys Gly Pro Ala Pro Lys Met Leu Gly His Glu Leu Cys Arg Val 75 80 85 TGT GGG GAC AAG GCC TCC GGC TTC CAC TAC AAC GTG CTC AGC TGC GAA 520 Cys Gly Asp Lys Ala Ser Gly Phe His Tyr Asn Val Leu Ser Cys Glu 90 95 100 105 GGC TGC AAG GGC TTC TTC CGG CGC AGT GTG GTC CGT GGT GGG GCC AGG 568 Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val Val Arg Gly Gly Ala Arg 110 115 120 CGC TAT GCC TGC CGG GGT GGC GGA ACC TGC CAG ATG GAC GCT TTC ATG 616 Arg Tyr Ala Cys Arg Gly Gly Gly Thr Cys Gln Met Asp Ala Phe Met 125 130 135 CGG CGC AAG TGC CAG CAG TGC CGG CTG CGC AAG TGC AAG GAG GCA GGG 664 Arg Arg Lys Cys Gln Gln Cys Arg Leu Arg Lys Cys Lys Glu Ala Gly 140 145 150 ATG AGG GAG CAG TGC GTC CTT TCT GAA GAA CAG ATC CGG AAG AAG AAG 712 Met Arg Glu Gln Cys Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Arg Lys Lys Lys 155 160 165 ATT CGG AAA CAG CAG CAG CAG GAG TCA CAG TCA CAG TCG CAG TCA CCT 760 Ile Arg Lys Gln Gln Gln Gln Glu Ser Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro 170 175 180 185 GTG GGG CCG CAG GGC AGC AGC AGC TCA GCC TCT GGG CCT GGG GCT TCC 808 Val Gly Pro Gln Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Gly Pro Gly Ala Ser 190 195 200 CCT GGT GGA TCT GAG GCA GGC AGC CAG GGC TCC GGG GAA GGC GAG GGT 856 Pro Gly Gly Ser Glu Ala Gly Ser Gln Gly Ser Gly Glu Gly Glu Gly 205 210 215 GTC CAG CTA ACA GCG GCT CAA GAA CTA ATG ATC CAG CAG TTG GTG GCG 904 Val Gln Leu Thr Ala Ala Gln Glu Leu Met Ile Gln Gln Leu Val Ala 220 225 230 GCC CAA CTG CAG TGC AAC AAA CGC TCC TTC TCC GAC CAG CCC AAA GTC 952 Ala Gln Leu Gln Cys Asn Lys Arg Ser Phe Ser Asp Gln Pro Lys Val 235 240 245 ACG CCC TGG CCC CTG GGC GCA GAC CCC CAG TCC CGA GAT GCC CGC CAG 1000 Thr Pro Trp Pro Leu Gly Ala Asp Pro Gln Ser Arg Asp Ala Arg Gln 250 255 260 265 CAA CGC TTT GCC CAC TTC ACG GAG CTG GCC ATC ATC TCA GTC CAG GAG 1048 Gln Arg Phe Ala His Phe Thr Glu Leu Ala Ile Ile Ser Val Gln Glu 270 275 280 ATC GTG GAC TTC GCT AAG CAA GTG CCT GGT TTC CTG CAG CTG GGC CGG 1096 Ile Val Asp Phe Ala Lys Gln Val Pro Gly Phe Leu Gln Leu Gly Arg 285 290 295 GAG GAC CAG ATC GCC CTC CTG AAG GCA TCC ACT ATC GAG ATC ATG CTG 1144 Glu Asp Gln Ile Ala Leu Leu Lys Ala Ser Thr Ile Glu Ile Met Leu 300 305 310 CTA GAG ACA GCC AGG CGC TAC AAC CAC GAG ACA GAG TGT ATC ACC TTC 1192 Leu Glu Thr Ala Arg Arg Tyr Asn His Glu Thr Glu Cys Ile Thr Phe 315 320 325 TTG AAG GAC TTC ACC TAC AGC AAG GAC GAC TTC CAC CGT GCA GGC CTG 1240 Leu Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Lys Asp Asp Phe His Arg Ala Gly Leu 330 335 340 345 CAG GTG GAG TTC ATC AAC CCC ATC TTC GAG TTC TCG CGG GCC ATG CGG 1288 Gln Val Glu Phe Ile Asn Pro Ile Phe Glu Phe Ser Arg Ala Met Arg 350 355 360 CGG CTG GGC CTG GAC GAC GCT GAG TAC GCC CTG CTC ATC GCC ATC AAC 1336 Arg Leu Gly Leu Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Leu Leu Ile Ala Ile Asn 365 370 375 ATC TTC TCG GCC GAC CGG CCC AAC GTG CAG GAG CCG GGC CGC GTG GAG 1384 Ile Phe Ser Ala Asp Arg Pro Asn Val Gln Glu Pro Gly Arg Val Glu 380 385 390 GCG TTG CAG CAG CCC TAC GTG GAG GCG CTG CTG TCC TAC ACG CGC ATC 1432 Ala Leu Gln Gln Pro Tyr Val Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Arg Ile 395 400 405 AAG AGG CCG CAG GAC CAG CTG CGC TTC CCG CGC ATG CTC ATG AAG CTG 1480 Lys Arg Pro Gln Asp Gln Leu Arg Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Leu 410 415 420 425 GTG AGC CTG CGC ACG CTG AGC TCT GTG CAC TCG GAG CAG GTC TTC GCC 1528 Val Ser Leu Arg Thr Leu Ser Ser Val His Ser Glu Gln Val Phe Ala 430 435 440 TTG CGG CTC CAG GAC AAG AAG CTG CCG CCT CTG CTG TCG GAG ATC TGG 1576 Leu Arg Leu Gln Asp Lys Lys Leu Pro Pro Leu Leu Ser Glu Ile Trp 445 450 455 GAC GTC CAC GAG TGAGGGGCTG GCCACCCAGC CCCACAGCCT TGCCTGACCA 1628 Asp Val His Glu 460 CCCTCCAGCA GATAGACGCC GGCACCCCTT CCTCTTCCTA GGGTGGAAGG GGCCCTGGGC 1688 CGAGCCTGTA GACCTATCGG CTCTCATCCC TTGGGATAAG CCCCAGTCCA GGTCCAGGAG 1748 GCTCCCTCCC TGCCCAGCGA GTCTTCCAGA AGGGGTGAAA GGGTTGCAGG TCCCGACCAC 1808 TGACCCTTCC CGGCTGCCCT CCCTCCCCAG CTTACACCTC AAGCCCAGCA CGCAGTGCAC 1868 CTTGAACAGA GGGAGGGGAG GACCCATGGC TCTCCCCCCT AGCCCGGGAG ACCAGGGGCC 1928 TTCCTCTTCC TCTGCTTTTA TTTAATAAAA ACTAAAAACA GAAAAAAAAA A 1979。

【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：１６８８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ホモサピエンス 配列 TTTTGAGGGT ATTTGAGTAG CGGCGGTGTG TCAGGGGCTA AAGAGGAGGA CGAAGAAAAG 60 CAGAGCAAGG GAACCCAGGG CAACAGGAGT AGTTCACTCC GCGAGAGGCC GTCCACGAGA 120 CCCCCGCGCG CAGCCATGAG CCCCGCCCCC CGCTGTTGCT TGGAGAGGGG CGGGACCTGG 180 AGAGAGGCTG CTCCGTGACC CCACC ATG TCC TCT CCT ACC ACG AGT TCC CTG 232 Met Ser Ser Pro Thr Thr Ser Ser Leu 1 5 GAT ACC CCC CTG CCT GGA AAT GGC CCC CCT CAG CCT GGC GCC CCT TCT 280 Asp Thr Pro Leu Pro Gly Asn Gly Pro Pro Gln Pro Gly Ala Pro Ser 10 15 20 25 TCT TCA CCC ACT GTA AAG GAG GAG GGT CCG GAG CCG TGG CCC GGG GGT 328 Ser Ser Pro Thr Val Lys Glu Glu Gly Pro Glu Pro Trp Pro Gly Gly 30 35 40 CCG GAC CCT GAT GTC CCA GGC ACT GAT GAG GCC AGC TCA GCC TGC AGC 376 Pro Asp Pro Asp Val Pro Gly Thr Asp Glu Ala Ser Ser Ala Cys Ser 45 50 55 ACA GAC TGG GGC GTC CTT TCT GAA GAA CAG ATC CGG AAG AAG AAG ATT 424 Thr Asp Trp Gly Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Arg Lys Lys Lys Ile 60 65 70 CGG AAA CAG CAG CAG CAG GAG TCA CAG TCA CAG TCG CAG TCA CCT GTG 472 Arg Lys Gln Gln Gln Gln Glu Ser Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro Val 75 80 85 GGG CCG CAG GGC AGC AGC AGC TCA GCC TCT GGG CCT GGG GCT TCC CCT 520 Gly Pro Gln Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Gly Pro Gly Ala Ser Pro 90 95 100 105 GGT GGA TCT GAG GCA GGC AGC CAG GGC TCC GGG GAA GGC GAG GGT GTC 568 Gly Gly Ser Glu Ala Gly Ser Gln Gly Ser Gly Glu Gly Glu Gly Val 110 115 120 CAG CTA ACA GCG GCT CAA GAA CTA ATG ATC CAG CAG TTG GTG GCG GCC 616 Gln Leu Thr Ala Ala Gln Glu Leu Met Ile Gln Gln Leu Val Ala Ala 125 130 135 CAA CTG CAG TGC AAC AAA CGC TCC TTC TCC GAC CAG CCC AAA GTC ACG 664 Gln Leu Gln Cys Asn Lys Arg Ser Phe Ser Asp Gln Pro Lys Val Thr 140 145 150 CCC TGG CCC CTG GGC GCA GAC CCC CAG TCC CGA GAT GCC CGC CAG CAA 712 Pro Trp Pro Leu Gly Ala Asp Pro Gln Ser Arg Asp Ala Arg Gln Gln 155 160 165 CGC TTT GCC CAC TTC ACG GAG CTG GCC ATC ATC TCA GTC CAG GAG ATC 760 Arg Phe Ala His Phe Thr Glu Leu Ala Ile Ile Ser Val Gln Glu Ile 170 175 180 185 GTG GAC TTC GCT AAG CAA GTG CCT GGT TTC CTG CAG CTG GGC CGG GAG 808 Val Asp Phe Ala Lys Gln Val Pro Gly Phe Leu Gln Leu Gly Arg Glu 190 195 200 GAC CAG ATC GCC CTC CTG AAG GCA TCC ACT ATC GAG ATC ATG CTG CTA 856 Asp Gln Ile Ala Leu Leu Lys Ala Ser Thr Ile Glu Ile Met Leu Leu 205 210 215 GAG ACA GCC AGG CGC TAC AAC CAC GAG ACA GAG TGT ATC ACC TTC TTG 904 Glu Thr Ala Arg Arg Tyr Asn His Glu Thr Glu Cys Ile Thr Phe Leu 220 225 230 AAG GAC TTC ACC TAC AGC AAG GAC GAC TTC CAC CGT GCA GGC CTG CAG 952 Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Lys Asp Asp Phe His Arg Ala Gly Leu Gln 235 240 245 GTG GAG TTC ATC AAC CCC ATC TTC GAG TTC TCG CGG GCC ATG CGG CGG 1000 Val Glu Phe Ile Asn Pro Ile Phe Glu Phe Ser Arg Ala Met Arg Arg 250 255 260 265 CTG GGC CTG GAC GAC GCT GAG TAC GCC CTG CTC ATC GCC ATC AAC ATC 1048 Leu Gly Leu Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Leu Leu Ile Ala Ile Asn Ile 270 275 280 TTC TCG GCC GAC CGG CCC AAC GTG CAG GAG CCG GGC CGC GTG GAG GCG 1096 Phe Ser Ala Asp Arg Pro Asn Val Gln Glu Pro Gly Arg Val Glu Ala 285 290 295 TTG CAG CAG CCC TAC GTG GAG GCG CTG CTG TCC TAC ACG CGC ATC AAG 1144 Leu Gln Gln Pro Tyr Val Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Arg Ile Lys 300 305 310 AGG CCG CAG GAC CAG CTG CGC TTC CCG CGC ATG CTC ATG AAG CTG GTG 1192 Arg Pro Gln Asp Gln Leu Arg Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Leu Val 315 320 325 AGC CTG CGC ACG CTG AGC TCT GTG CAC TCG GAG CAG GTC TTC GCC TTG 1240 Ser Leu Arg Thr Leu Ser Ser Val His Ser Glu Gln Val Phe Ala Leu 330 335 340 345 CGG CTC CAG GAC AAG AAG CTG CCG CCT CTG CTG TCG GAG ATC TGG GAC 1288 Arg Leu Gln Asp Lys Lys Leu Pro Pro Leu Leu Ser Glu Ile Trp Asp 350 355 360 GTC CAC GAG TGAGGGGCTG GCCACCCAGC CCCACAGCCT TGCCTGACCA 1337 Val His Glu 364 CCCTCCAGCA GATAGACGCC GGCACCCCTT CCTCTTCCTA GGGTGGAAGG GGCCCTGGGC 1397 CGAGCCTGTA GACCTATCGG CTCTCATCCC TTGGGATAAG CCCCAGTCCA GGTCCAGGAG 1457 GCTCCCTCCC TGCCCAGCGA GTCTTCCAGA AGGGGTGAAA GGGTTGCAGG TCCCGACCAC 1517 TGACCCTTCC CGGCTGCCCT CCCTCCCCAG CTTACACCTC AAGCCCAGCA CGCAGTGCAC 1577 CTTGAACAGA GGGAGGGGAG GACCCATGGC TCTCCCCCCT AGCCCGGGAG ACCAGGGGCC 1637 TTCCTCTTCC TCTGCTTTTA TTTAATAAAA ACTAAAAACA GAAAAAAAAA A 1688。

【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GACGGATCCA TGTCCTCTCC TACCACGAGT T 31。

【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTAGAATTCG GAGGGTGGTC AGGCAAGGC 29。

【００３６】配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Gln Pro Lys Val Thr Pro Trp Pro Leu Gly Ala Asp Pro Gln Ser 1 5 10 15 。

【００３７】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATGTCCTCTC CTACCACGAG TT 22。

【００３８】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCTCAGTGTC AGTGTCAGCG T 21。

【００３９】配列番号：８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCGGAAGAAG AAGATTCGGA AACAGC 26。

【００４０】配列番号：９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTGGCACGTC CGGACGTCC 19。

【００４１】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACCTACAGCA AGGACGACTT CC 22。

【００４２】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGGAACGGAC TGGTGGGAGG 20。

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸癌および乳癌組織（Ｔ）、およびそれら
の正常組織（Ｎ）のウエスタンブロッティング法による
解析結果を示す図である。

【図２】 配列番号６と７をプライマーとして使用し
た、正常組織および癌細胞株のＲＴ−ＰＣＲ実験結果を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｙ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のＤＮＡがコードする
   アミノ酸配列の全部または一部を含むＥＣＤＮ蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載のＤＮＡがコードする
   アミノ酸配列のうち、１もしくは複数個のアミノ酸が、
   付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列の全部また
   は一部を含むＥＣＤＮ蛋白質。
3. 【請求項３】 配列番号１に記載のＤＮＡの塩基番号38
   7 〜677 の塩基が欠失したＤＮＡ（配列番号２）がコー
   ドするＥＣＤＮ小分子蛋白質。
4. 【請求項４】 ＥＣＤＮ蛋白質をコードする、配列番号
   １に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 ＥＣＤＮ小分子蛋白質をコードする、配
   列番号２に記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項４または５に記載のＤＮＡを含有
   するベクター。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを保持する形
   質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の形質転換体を培養し、
   発現産物を回収することを含む請求項１または３に記載
   の蛋白質の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項４に記載の、ＥＣＤＮ蛋白質をコ
   ードするＤＮＡを含有するベクターとそれに応答ＤＮＡ
   を含むレポーターベクターを保持する共形質転換体。
10. 【請求項１０】 ＥＣＤＮ蛋白質のＤＮＡ結合ドメイン
    を、他の公知のステロイドホルモン受容体様蛋白質のＤ
    ＮＡ結合ドメインと置換したキメラＥＣＤＮ蛋白質をコ
    ードするＤＮＡを含有するベクターとそれに応答するＤ
    ＮＡを含むレポーターベクターを保持する共形質転換
    体。
11. 【請求項１１】 請求項９または１０に記載の共形質転
    換体を用いることを特徴とする、共形質転換体に作用す
    る化合物のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のＥＣＤＮ蛋白質を用
    いることを特徴とする、該蛋白質と結合性を有する化合
    物のスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】 請求項４または５に記載のＤＮＡ配列
    の全部または一部を含むＤＮＡからなるプローブ。
14. 【請求項１４】 請求項４または５に記載のＤＮＡ配列
    の一部を含むＤＮＡからなるプライマー。
15. 【請求項１５】 ＤＮＡの一部が、連続してなる少なく
    とも１０個の塩基からなる、請求項１３または１４記載
    のプローブまたはプライマー。
16. 【請求項１６】 請求項１３または１４に記載のプロー
    ブまたはプライマーを被検ＤＮＡとハイブリダイズさせ
    ることを特徴とするＥＣＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小分
    子蛋白質の遺伝子解析方法。
17. 【請求項１７】 請求項１３または１４に記載のプロー
    ブまたはプライマーを用い、被検組織または被検細胞中
    のＥＣＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小分子蛋白質のｍＲＮ
    Ａを測定することを特徴とする細胞検査方法。
18. 【請求項１８】 請求項１３に記載のプローブを被検Ｄ
    ＮＡとハイブリダイズさせ、ＥＣＤＮ蛋白質またはＥＣ
    ＤＮ小分子蛋白質の遺伝子を測定することを特徴とする
    細胞検査方法。
19. 【請求項１９】 請求項１５に記載のプライマーを用い
    て、被検ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅させ、ＥＣ
    ＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小分子蛋白質の遺伝子発現を
    測定することを特徴とする細胞検査方法。
20. 【請求項２０】 配列番号６および配列番号７に記載の
    プライマーを用いて、被検ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法に
    て増幅させ、ＥＣＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小分子蛋白
    質の遺伝子発現を測定することを特徴とする細胞検査方
    法。
21. 【請求項２１】 請求項１に記載のＥＣＤＮ蛋白質また
    は請求項３に記載のＥＣＤＮ小分子蛋白質と結合するポ
    リクローナル抗体またはモノクローナル抗体。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の抗体を用いること
    を特徴とするＥＣＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小分子蛋白
    質の免疫化学的測定方法。
23. 【請求項２３】 請求項２１に記載の抗体を用い、被検
    組織または被検細胞の免疫化学的組織染色を行い、ＥＣ
    ＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小分子蛋白質の細胞内分布を
    測定することを特徴とする細胞検査方法。
24. 【請求項２４】 請求項２１に記載の抗体を用い、被検
    組織または被検細胞のＥＣＤＮ蛋白質またはＥＣＤＮ小
    分子蛋白質の発現量を測定することを特徴とする細胞検
    査方法。
25. 【請求項２５】 請求項１または３に記載のＥＣＤＮ蛋
    白質またはＥＣＤＮ小分子蛋白質のアミノ酸配列のう
    ち、連続してなる少なくとも８個のアミノ酸からなるペ
    プチド。
26. 【請求項２６】 配列番号５に記載のペプチドを含むも
    のからなる、請求項２５に記載のペプチド。
27. 【請求項２７】 小分子ＥＣＤＮｍＲＮＡに特異的にハ
    イブリダイズするアンチセンス核酸（ＤＮＡまたはＲＮ
    Ａ）。
28. 【請求項２８】 小分子ＥＣＤＮｍＲＮＡを特異的に切
    断するリボザイム。
29. 【請求項２９】 請求項２７記載のアンチセンス核酸ま
    たは請求項２８に記載のリボザイムを発現する遺伝子構
    築物を有効成分とする遺伝子治療用薬剤。