KR20020008140A

KR20020008140A - 단일클론 항체, 항원 및 악성 질환의 진단 및 치료

Info

Publication number: KR20020008140A
Application number: KR1020017012384A
Authority: KR
Inventors: 하르디브리타; 노보그로드스키아브라함
Original assignee: 니나 피쉬먼; 모르-리서치 어플리케이션즈 리미티드
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2002-01-29
Also published as: BR9917218A; CN1346371A; EP1165616A1; CA2367901C; IL145535A0; US7695715B2; IL129299A0; JP2003500015A; DE69922261D1; AU776464C; US20060099209A1; CN1267452C; HUP0200537A2; AU5996599A; WO2000058363A1; US20030026800A1; IL145535A; CA2367901A1; ATE283289T1; ZA200106809B

Abstract

본 발명은 림프모구모양 세포에 대하여 생기는 단일클론 항체(mAb)의 신규한 DNA 및 아미노산 서열, 및 이 mAb가 결합하는 펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 악성 질환을 가질 높은 확률을 가지는 개체를 검출하기 위해, 그리고 때로는 특정한 악성 질환을 가지는 개체를 검출하기 위해 상기 항체 또는 펩티드를 사용하는 진단상의 분석에 관한 것이다. 더 이상으로, 본 발명은 여러가지 악성 질환의 치료에 사용되는 본 발명의 mAb 또는 펩티드를 포함하는 제약학적 조성물, 및 본 발명의 mAb 또는 펩티드를 사용하는 악성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

단일클론 항체, 항원 및 악성 질환의 진단 및 치료{MONOCLONAL ANTIBODIES, ANTIGENS AND DIAGNOSIS AND THERAPY OF MALIGNANT DISEASES}

공동 소유인 PCT 출원 공보 번호 WO 95/20605는 면역-자극성 단일클론 항체를 개시하고 있다. 이 PCT 출원의 항체는 B 림프모구모양 세포에 대하여 생기며, 면역-자극성 효과를 가진다고 알려져 있다. 종양을 가진 동물에게 주입될 때, 이들 항체는 또한 항-종양 효과를 유도한다고 밝혀졌다.

현재의 의학적 방법 하에서 암의 진단은 전형적으로 신체의 진찰, 여러가지 영상 기술의 사용, 여러가지 암 마아커의 사용 등을 수반하는 다단계 과정이다. 암의 검출 및, 또한 시험된 개체가 고통받고 있는 암 종류의 측정을 허용하는 암 진단 기술에 대한 본 분야의 오랜 요구가 있다.

본 발명은 단일클론 항체의 신규한 서열, 단일클론 항체가 결합하는 항원의 펩티드 서열, 및 단일클론 항체 및 펩티드를 사용한 진단상 및 치료상의 분석에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 mAb의 중쇄 가변 영역의 DNA 및 펩티드 서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 mAb의 Kappa 경쇄 가변 영역의 DNA 및 펩티드 서열을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 분석을 나타낸다("BAT"로 나타냄, "BAT"는 항체 V_H영역의 아미노산 서열을 규정하고, "VMS2"는 생식계통 VMS2/VGK4 생식계통 유전자의 아미노산 서열을 규정한다. BAT 서열 및 생식계통 서열이 동일한 경우 생식계통 서열은 점(.)으로 표시된다; 불일치는 차이를 일으키며, 생식계통 잔기를 나타낸다. 아래 표, 다음 페이지들의 서열은 어떤 아미노산이 Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 갖가지 마우스 중쇄 하위군(마우스 V_HMisc.) 내에 있고, 모든 공지된 마우스 V_H서열(모든 마우스 V_H)의 광범위한 데이타베이스에 걸친 특정한 잔기 위치에 보이는 빈도를 설명한다).

도 4는 본 발명의 항체의 kappa 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 분석을 나타낸다("BAT"로서 도에 나타냄). "마우스"는 BAT 항체 V_k영역의 아미노산 서열을 규정하고, "생식"은 생식계통 H4 생식계통 유전자의 아미노산 서열을 규정한다. BAT 서열 및 생식계통 서열이 동일한 경우 생식계통 서열은 점(.)으로 표시된다. 불일치는 차이를 일으키며, 생식계통 잔기를 나타낸다. 아래 표 및 다음 페이지들은 어떤 아미노산이 Kabat 마우스 중쇄 하위군 VI(Mouse V_κVI) 내에 있고, 모든 공지된 마우스 V_κ서열(모든 Mouse V_κ)의 광범위한 데이타베이스에 걸친 특정 잔기 위치에 보이는 빈도를 설명한다.

도 5는 본 발명의 키메라 항체의 Kappa 경쇄 가변 영역의 DNA 및 펩티드 서열을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 키메라 항체의 중쇄 가변 영역의 DNA 및 펩티드 서열을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 키메라 항체의 Kpaap 경쇄의 발현을 위해 사용된 pKN 110 포유류 발현 벡터의 도식적 표현이다.

도 8은 본 발명의 키메라 항체의 중쇄의 발현을 위해 사용된 pG1D 110 포유류 발현 벡터의 도식적 표현이다.

도 9는 Daude 세포에 대한 마우스 및 본 발명의 γl/Kappa 키메라 항체의 결합 특징을 측정한 ELISA 분석의 결과의 예의 특징을 그린 그래프이다.

도 10은 본 발명의 펩티드 1의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 11은 본 발명의 펩티드 2의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 12는 본 발명의 펩티드 3의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 13은 FACS 분석에 의해 측정된 바, 건강한 개체의 혈액 샘플에 있는 CD3+ 세포의 총수와 비교하여 본 발명의 mAb(BAT로 나타냄)를 결합시키는 CD3+ 세포의 퍼센트를 나타내는 도식적 표현이다.

도 14는 FACS 분석에 의해 측정된 바, 결장 암종을 가지고 있는 환자로부터 취한 혈액 샘플에 있는 CD3+ 세포의 총수와 비교하여 본 발명의 mAb("BAT"로 나타냄)를 결합시키는 CD3+ 세포의 퍼센트를 나타낸다.

도 15는 유방 암종을 가지고 있는 환자로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 CD3+ 세포의 총수와 비교하여 본 발명의 mAb(BAT로 나타냄)를 결합시키는 CD3+ 세포의 퍼센트를 나타낸다.

도 16은 전립선 암종을 가지고 있는 환자로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 CD3+ 세포의 총수와 비교하여 본 발명의 mAb(BAT로 나타냄)를 결합시키는 CD3+ 세포의 퍼센트를 나타낸다.

도 17은 유방 암종, 결장 암종 또는 전립선 암종을 가지고 있는 환자와 비교하여 건강한 개체에 있는 본 발명의 mAb(BAT로 나타냄)를 결합시키는 CD3+ 세포의 평균 퍼센트를 나타내는 도식적 표현이다.

도 18은 전립선암, 이비인후(ENT) 암종, 유방 암종을 가지고 있는 개체의 T-세포로부터, 또는 Daudi 세포의 멤브레인으로부터 얻어진 펩티드에 대한 웨스턴 블롯의 사진이다. 블롯은 본 발명의 mAb와 함께 인큐베이션되었고, 유방 암종을 가지고 있는 환자로부터 얻어진 T-세포에 있는 검출 불가능한 수준의 항체와 비교하여 전립선 암종을 가지고 있는 환자로부터 얻어진 T-세포에 있는 증가된 양의 항체를 나타낸다.

(발명의 일반적 설명)

본 발명은 림프모구모양 세포에 대한 단일클론 항체의 서열의 발견에 기초한다. 더 이상으로, 본 발명은 암을 가지고 있는 환자의 T-세포에 대한 이들 항체의 결합 수준이 건강한 개체의 T-세포에 대한 결합 수준과는 다르다 (보다 높거나 또는 보다 낮다)는 발견에 기초한다.

본 발명의 한 양태에 따라,

(a) 도 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(b) 도 2의 아미노산 서열을 포함하는 Kappa 경쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(c) 도 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 2의 아미노산 서열을 포함하는 Kappa 경쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(d) 도 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(e) 도 2의 서열에 대해 적어도 70%의 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체

로 구성되는 군으로부터 선택된 가변 영역을 가지는 단일클론 항체가 제공된다.

본 발명에 따라, 용어 "항체"는 클래스 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE 중 어느 것의 단일클론 항체로 간주한다. 용어는 전체 항체 또는 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 항체의 단편, 예컨대 본질적으로 Fc 부분 결핍 항체, 단쇄 항체, 항체의 가변 항원-결합 도메인만으로 구성된 아티클의 단편 등으로 간주한다.

여기에 더하여, 본 발명은 또한 상기 mAb 중 어느 한가지가 특이적으로 결합하는 항원에 결합하는 항체, 즉 상기 항체와의 교차 반응성을 가지는 항체에 관한 것이다.

본 발명의 한 구체예에 따라, 단일클론 항체는 키메라 인간-마우스 항체, 인간 기원으로부터 유도된 즉 불변 영역 및 마우스로부터 유도된 가변 영역을 가지는 mAb이다. 이 목적을 위해서, 본 발명의 mAb의 Kappa 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 PCR 클론했고, 그것들의 DNA를 서열화했다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따라서, 항체는 완전히 인간화된 항체이다. 즉, 그것의 가변 및 불변 영역 모두 인간 공급원으로부터 유도된다.

용어 "적어도 X%의 동일성을 가지는"은, 서열이 최적으로 정렬될 때, 2개의 비교 서열에서 동일한 아미노산 잔기의 %로 간주한다. 따라서, 70% 아미노산 서열 동일성은 2개 이상의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열에서 아미노산의 70%가 동일하다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일성은 적어도 80%, 가장 바람직하게는 90%이다.

본 발명의 추가의 양태에 따라, 본 발명의 mAb 중 어느 것을 생성하는 마우스 하이브리도마 셀라인이 제공된다. 하이브리도마는 본 분야에 공지된 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Kohler, G. and Milstein, C.,Nature,256:495-497, (1975)). 하이브리도마 셀라인의 상청액은 전형적으로 본 분야에 공지된 방법 중 어느 하나에 의해, 예컨대 효소결합면역흡착분석(ELISA) 또는 방사선면역분석(RIA)에 의해 항체 결합 활성에 대해 스크리닝된다. 상청액은 본 발명의펩티드(아래 설명된 바와 같은) 중 어느 것에 결합하거나, 또는 mAb가 결합하는 세포들, 예컨대 Daudi 세포 또는 T 림프구에 결합하는 mAb의 생성에 대해 스크리닝된다.

상기 mAb의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열 중 어느 것을 코드화하는 DNA 서열이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 당업자에게 의심할 여지없이 명백한 바와 같이, 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 복수의 핵산 서열이 도 1 또는 도 2에 나타낸 것들 이상으로 본 발명의 mAb에 대한 코드일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 DNA 서열을 가지고 있는 플라스미드와 같은 발현 벡터 및 이들 발현 벡터 중 하나 이상을 함유하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 본 발명의 mAb가 결합할 수 있는 B-세포 항원의 펩티드 서열이 제공된다. 비-중복 유전자 은행 데이타베이스에 대하여 연구가 수행되었고, EST Division으로 이들 펩티드 서열이 신규임을 결정했다.

본 발명의 이 추가의 양태에 따라,

(a) 도 10에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 펩티드;

(b) 도 11에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 펩티드;

(c) 도 12에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 펩티드;

(d) 상기 (a), (b) 및 (c)의 펩티드의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%의 동일성을 가지는 펩티드;

(e) 상기 (a) 내지 (d)의 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 단백질 또는 펩티드

로 구성되는 군으로부터 선택된 펩티드가 제공된다.

본 발명의 펩티드는 여러가지 진단상의 분석에, 예컨대 본 발명의 mAb의 T-세포상에 존재하는 그것의 음성 항원에 대한 결합의 수준이 측정되는 경쟁적 면역분석에 사용될 수 있다. 여기에 더하여, 펩티드는 면역화된 동물에서 항체의 생성에 사용될 수 있으며, 다음에 항체는 상술되고 아래 설명되는 효용 중 어느 하나를 위해 사용될 수 있다.

상기 모든 펩티드의 유사체가 또한 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열은 펩티드의 항체 결합성의 실질적인 변경 없이, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존성 또는 비보존성 치환에 의해 변경될 수 있다.

용어 "보존성 치환"은 동일한 클래스의 아미노산에 의한 어떤 클래스에 있는 아미노산의 치환으로 간주하며, 여기에서 클래스란 자연에서 발견된 동종 단백질에서의 공통의 물리화학적 아미노산 측쇄 성질 및 높은 치환 빈도에 의해 규정되며, 예를 들어 표준 데이호프 주파수 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정된다 [아미노산 측쇄의 6개의 일반적 클래스가 특성화되어 있으며, 클래스 I(Cys); 클래스 II(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 클래스 III(Asn, Asp, Gln, Glu); 클래스 IV(His, Arg, Lys); 클래스 V(Ile, Leu, Val, Met); 및 클래스 VI(Phe, Tyr, Trp)가 있다]. 예를 들어, Asn, Gln 또는 Glu와 같은 또 다른 클래스 III 잔기에 대한 Asp의 치환은 보존성 치환이다. 용어 "비보존성 치환"은 다른 클래스의 아미노산을 사용한 어떤 클래스에 있는 아미노산의 치환으로 간주하며, 예를 들어 Asp, Asn,Glu 또는 Gln과 같은 클래스 III 잔기로 클래스 II 잔기인 Ala을 치환하는 것이다.

특정 아미노산(aa)을 표시하기 위한 상기(및 이후) 사용된 문자들은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천된 1-문자 아미노산 기호를 따른다.

본 발명의 범위에 해당하는 상기 펩티드의 유사체는 도 10 내지 도 12에 도시된 펩티드와 본 발명의 mAb에 대한 실질적으로 동일한 결합 수준을 가지는 그러한 것이다. 결합 수준은 본 분야에 공지된 어떤 방식에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 펩티드 및 유사체는 또한 화학적으로 변형될 수 있고, 그러한 화학적으로 변형된 펩티드 및 유사체가 또한 본 발명의 한 부분을 형성한다. 용어 "화학적으로 변형된"은 단백질의 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 프로세싱 또는 다른 번역 후 변형과 같은 자연적 처리에 의하거나, 또는 본 분야에 잘 공지된 화학적 변형 기법에 의해 변형된 단백질로 간주한다. 다수의 공지된 전형적 변형의 비배타적인 예들로는 아세틸화, 아실화, 아미드화, ADP-리보실화, 글리코실화, GPI 닻 형성, 액상 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 메틸화, 미리스틸화, 페길화, 프레닐화, 포스포릴화, 유비큐틴화, 또는 어떤 유사한 처리가 있다.

본 발명이 기초로 하는 두번째 발견은, 본 발명의 mAb가 건강한 개체의 T-세포에 대한 동일한 mAb의 결합 정도와 비교하여 악성 질환을 가지고 있는 개체들로부터 얻어지는 T-세포에 대해 상이한 정도로 결합할 수 있다는 것이다.

따라서, 본 발명의 더 이상의 양태에 의해,

(a) 개체로부터 체액 샘플을 얻는 단계;

(b) 상기 샘플을 본 발명의 mAb 중 적어도 한가지와 접촉시키는 단계;

(c) 상기 샘플내에 있는 T-세포에 대한 상기 mAb의 결합 정도를 측정하는 단계; 그리고

(d) (c)의 정도와 건강한 개체로부터 얻어진 샘플에 있는 T-세포에 대한 본 발명의 mAb의 결합 정도를 비교하는 단계

를 포함하고, 상기 두 결합 정도의 상당한 차이가 상기 시험한 개체가 악성 질환을 가질 확률이 높은 것을 나타내는, 악성 질환을 가질 확률이 높은 시험한 개체를 확인하기 위한 분석법이 제공된다.

본 발명에 따라서, 시험되는 개체로부터 얻어진 샘플은 검출가능한 양의 T-세포를 함유하는 어떤 체액일 수 있다. 전형적으로, 체액 샘플은 혈액 또는 림프액 샘플이다. 바람직하게는, 본 발명의 mAb를 얻어진 샘플과 접촉시키기 전에, 샘플에 있는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 본 분야에 공지된 방법들 중 어느 한 방법, 예컨대 Ficoll Hypaque 비중 원심분리에 의해 분리되고, 다음에 분리된 세포가 시험되는 항체와 접촉된다.

본 발명에 따라서 용어 "악성 질환"은 그것의 단계들 중 어떤 단계에 있는 본 분야에 공지된 어떤 종류의 악성 질환으로서 이해된다.

이 용어는 또한 초기 단계이고, 임상적 증상이 아직 유발되지 않은 악성 질환을 포함한다. 바람직하게는, 이 용어는 고형 종양으로 간주한다.

용어 "건강한 개체"는 악성 질환을 가지지 않는 개체로 간주하며, 또한 몇몇 개체의 평균 수준 또는 몇몇 개체로부터의 체액을 함께 모음으로써 얻어진 수준으로 간주할 수 있다. 일단 건강한 개체의 표준 결합 정도가 수립되면, 매 시험에 대해 이런 표준이 재수립될 필요 없이 수립된 값이 계속해서 사용될 수 있음을 유념해야 한다. 본 발명에 따라서, 건강한 개체에서 CD3+ T-세포의 약 25%가 본 발명의 항체와 결합한다는 것이 발견되었다.

용어 "높은 확률"은 본 발명의 분석법이 악성 질환을 가질 것으로 의심되는 개체를 확인할 수 있는 초기 스크리닝 분석법임을 의미한다. 본 발명의 방법에 의해 검출된 개체가 악성 질환을 실제로 가진다는 사실이 본 분야에 공지된 추가의 기법을 이용함으로써 뒤에 입증되어야 할 것이다.

용어 "결합 정도"는 시험된 개체의 T-세포상에 존재하는 항원에 대한 항체의 결합 수준으로 간주하며, 이 정도는 항체의 결합 수준을 측정하는 본 분야에 공지된 방법 중 어느 방법, 예컨대 ELISA 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정될 수 있다. 결합 정도는 검출가능한 마아커에 결합된 항-마우스 면역글로불린 또는 그것의 단편과 같은, 어떤 검출 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 그러한 검출가능한 마아커의 예들로는 방사성기, 형광기, 검출가능한 생성물을 수득하는 반응(색반응과 같은)을 촉매할 수 있는 효소, 아비딘에 의해 검출될 수 있는 바이오틴기 등이 있다. 바람직한 구체예에 의해, T-세포에 대한 본 발명의 mAb의 결합 정도는 항 T-세포 항체(예를 들어, 항-CD3+ 항체)가 제 1 종류의 형광 마아커에 부착되고, 본 발명의 mAb가 제 2 종류의 형광 마아커에 부착되는 이중-표지화에 의해 실행된다. 다음에, 결합 정도가 형광체 활성화된 세포 선별기(FACS)를 사용하여 측정된다. 결합 정도의 정량은 본 발명의 mAb를 결합시키는 CD3+ T-세포(그것들의 항-CD3+ 항체의 결합에 의해 측정된)의 퍼센트를 측정함으로써 달성된다.

본 발명에 따라서, 악성 질환을 가지고 있는 개체의 혈액 샘플에 있는 CD3+ 세포의 총수는 건강한 개체로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 CD3+의 수와 유사하며, 따라서 악성 환자 및 건강한 개체에 있는 전체 CD3+ 결합 T-세포를 사용함에 의한 mAb 및 CD3+의 결합 정도의 표준화가 유효하다. 그러나, 악성 질환을 가지고 있는 개체에서 본 발명의 mAb를 결합시키는 CD3+ 결합 T-세포(이후, "CD3+ mAb 세포")의 퍼센트는 건강한 개체의 혈액에 있는 CD3+ mAb+ 세포의 퍼센트와는 상당히 차이가 있다. 악성 질환을 가지고 있는 개체에서 CD3+ mAb+ 세포의 퍼센트는 악성 질환의 종류에 따라, 건강한 개체에서의 CD3+ mAb+ 세포의 퍼센트 보다 상당히 높거나 또는 상당히 낮을 수 있다.

시험된 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 본 발명의 mAb의 결합 정도는, mAb의 결합의 차이가 본원에 언급된 실험적 방법에 의해 얻어진 결과와 관련하여 사용되는 본 분야에 공지된 통계적 방법 중 어느 방법(예를 들어, 스튜던트 T-테스트)에 의해 측정된 바 상당한 정도로 실질적으로 상이한 경우, 건강한 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 결합 정도와 "상당히 상이하다"고 간주될 것이다.

본 발명은 어떤 종류의 악성 질환을 가질 확률이 높은 개체를 확인할 수 있을뿐만 아니라(질환에 걸린 개체는 건강한 개체와 비교하여 본 발명의 mAb에 대한 T-세포의 상이한 결합 정도를 가진다), 상기 정도가 건강한 개체의 상응하는 정도 보다 높은지 또는 낮은지의 여부를 측정함으로써 특정한 종류의 암을 가지고 있는 개체를 확인하는 것을 도울 수 있다.

전형적으로, 건강한 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 본 발명의 mAb의 결합퍼센트는 약 25%, 즉 본 발명의 mAb를 결합시키는 CD3+ T-세포 마아커(세포에 대한 항-CD3+ 항체의 결합에 의해 측정된)를 발현하는 세포의 약 25%의 범위안에 있다.

본 발명에 따라서, 전립선암 환자로부터 얻어진 샘플에서 본 발명의 mAb가 결합하는 CD3+ T-세포의 퍼센트는 약 50%의 범위안에 있음이 알려져 있다.

CD3+ T-세포가 결장 또는 유방 암종 환자로부터 얻어진 샘플로부터 기원하는 경우, 본 발명의 mAb에 결합하는 세포의 퍼센트가 각각 약 7% 및 10%임이 더 알려졌다.

그러므로, 본 발명에 따라서, 체액 샘플에 존재하는 CD3+ 세포에 대한 본 발명의 mAb 결합 정도에 기초한 간단한 단일 분석법을 사용하여, 시험된 개체로부터 취해진 체액 샘플에서 특정한 종류의 암이 나타날 확률이 높은 측정하는 것이 가능하게 된다. 어떤 종류의 암을 가지고 있는 개체를 확인하기 위해 단지 한 종류의 mAb만 사용하는 본 발명의 진단적 분석법의 간단함은 어떤 집단의 광범위한 스크리닝에 매우 유용하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는

(a) 개체로부터 체액 샘플을 얻는 단계;

(b) 상기 샘플을 본 발명의 mAb와 접촉시키는 단계;

(c) 상기 샘플에 있는 T-세포에 대한 상기 mAb의 결합 정도를 측정하는 단계; 그리고

(d) 얻어진 (c)의 결합 정도와 건강한 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 mAb의 결합 정도를 비교하는 단계

를 포함하고, 결합 정도에 있어 상당한 차이의 존재가 시험한 개체가 악성 질환을 가질 확률이 높다는 것을 나타내며, 여기에서 상기 개체로부터의 T-세포에 대한 결합 정도가 건강한 개체의 T-세포에서의 mAb의 결합 정도 이상 또는 이하인지의 여부가 시험한 개체가 특정한 종류의 악성 질환을 가질 확률이 높다는 것을 나타내는, 특정한 악성 질환을 가질 확률이 높은 시험한 개체를 확인하기 위한 분석법을 제공한다.

특히, 본 발명의 mAb에 대한 결합 정도가 건강한 개체에서 보다 상당히 높은 경우, 시험된 개체는 전립선암을 가질 높은 확률을 가진다.

결합 정도가 건강한 개체 보다 상당히 낮은 경우, 시험된 개체는 결장 또는 유방암을 가질 높은 확률을 가진다.

본 발명의 진단적 양태에 따라서, 본 발명의 mAb를 포함하는 조성물이 악성 질환(일반적인)을 가질 확률이 높은 개체를 확인하기 위해, 또는 개체가 가지고 있을 것 같은 특정한 악성 질환을 확인하기 위해 진단용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 적합한 담체와 함께 상술된 항체 중 적어도 한가지에 속하는 mAb를 포함하는 진단용 조성물을 제공한다. 담체는 가용성 담체, 예컨대 본 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한가지(예를 들어, PBS) 또는 라텍스 비드와 같은 고체상 담체일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 mAb를 이용하고, 상기 개시된 진단 분석을 실행하는 키트, 예를 들어 진단 분석 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 진단 키트는 하나 이상의 용기에 있는 적어도 한가지의 상기 mAb, mAb에 대한 특이적 결합 파트너의 콘쥬게이트(예를 들어, 본 발명의 항원 또는 유사체), 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 및 그것의 사용을 위한 지시서를 통상 포함한다. 표지는 연역적으로 단일클론 항체에 결합될 수 있거나, 또는 달리 표지는 담체 분자에 결합된 후 mAb에 특이적으로 결합될 수 있다. 진단 시약조성물을 사용한 시험되는 샘플의 인큐베이션이 세포에 대한 단일클론 항체의 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 행해진다.

본 발명의 더 이상의 양태에 의해서, 본 발명의 mAb중 한가지 이상을 함께 활성 성분으로서 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 개체에 있는 다양한 악성 질환의 치료를 위한 제약학적 제제의 제조에 상기 mAb를 사용하는 것이 또한 본 발명의 범위내에 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 mAb의 치료적 유효량을 치료가 필요한 개체에게 투여함으로써 악성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 치료적 유효량이란 악성 질환의 증상을 완화하거나, 증상을 감소시키거나, 또는 증상을 완전히 제거할 수 있는 양이다.

또한, 본 발명의 펩티드를 포함하는 제약학적 조성물이 본 발명의 양태를 구성한다. 그러한 조성물은, 예를 들어 개체의 T-세포에 결합하여 개체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항체를 얻기 위한 개체의 능동 면역화에 사용될 수 있다.

(발명의 상세한 설명)

본 발명의 주요 양태가 때로 첨부된 도면을 참고하여 이제 설명될 것이다. 다음이 설명 및 도면에서, 용어 "BAT 항체"는 용어 "본 발명의 mAb"와 교환하여 사용될 수 있다.

I. MAB의 서열화

(A) 약자

태아 송아지 혈청 (FCS); 리보핵산 (RNA); 메신저 RNA (mRNA); 디옥시리보핵산 (DNA); 카피 DNA(cDNA); 중합효소 사슬 반응 (PCR); 분 (min); 초 (sec); 트리스-보레이트 완충액 (TBE)

(B) 물질

배지 성분 및 모든 다른 조직 배양 물질은 Life Technologies(UK)로부터 입수했다. RNA 분리 키트는 Stratagene(USA)로부터 입수했고, 1^st스트랜드 cDNA 합성 키트는 Pharmacia(UK)로부터 구입했다. AmpliTaqDNA 폴리머라제를 포함하여 PCR-반응용의 모든 구성요소 및 장치는 Perkin Elmer(USA)로부터 구입했다. TA Cloning키트는 Invitrogen(USA)로부터 입수했다. Thermo Sequences^TM사전-혼합 순환 서열화 키트 및 Vistra 725 DNA 서열화기는 모두 Amersham(UK)로부터 구입했다. 모든 다른 분자생물학적 제품은 New England Biolabs(USA)로부터 입수했다.

(c) 실험 기법: 마우스 BAT 항체 가변 영역 유전자의 PCR 클로닝 및 서열화

마우스 BAT 하이브리도마 셀라인 및 Daudi 셀라인을 MRC-CC로 성공적으로 전달했고, 두 셀라인을 10%(v/v) FCS, 100유니트/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI(글루타민 없음), 1mM 나트륨 피루베이트 및 12.5유니트/ml Nystatin을 사용하여 현탁액중에서 성장시켰다.

BAT 하이브리도마 셀라인의 생세포 대략 10⁸을 수확했고, 이 10⁸세포로부터 전체 RNA를 제조자의 지시에 따라서 RNA 분리 키트를 사용하여 분리했다. 키트는Chromczynski and Sacci, Anal. Biochem., 162:156, 1987에 의해 설명된 바와 같은 구아니디늄 티오시아네이트 페놀-클로로포름 단일 단계 추출 과정을 사용했다. 또한, 제조자의 지시에 따라서 1^st스트랜드 cDNA 합성 키트를 사용하여 키트에 공급된 NotI-(dT)₁₈프라이머를 사용하여 BAT 하이브리도마 mRNA의 단일-스트랜드 DNA 카피를 생성했다. 대략 5㎍의 전체 RNA를 각각 33㎕ 최종 반응 부피로 사용했다. 다음에, 완료된 반응 혼합물을 90℃로 5분간 가열하여 RNA-cDNA 이중체를 변성시키고, 얼음상에서 냉각하기 전에 역전사효소를 비활성화했다.

하이브리도마 셀라인으로부터 마우스 중쇄 가변 영역 유전자(V_H유전자) 및 마우스 Kappa 경쇄 가변 영역 유전자(V_κ유전자)를 PCR-증폭하기 위해, Jones and Bendig, Bio/Technology, 9:8, 1987에 의해 설명된 방법이 이어졌다. 필수적으로, 2개 시리즈의 축퇴 프라이머, 마우스 중쇄 유전자의 리더 서열로 복원하도록 디자인된 것(즉, MHV1-12; 표 1) 및 마우스 Kappa 경쇄 유전자의 리더 서열로 복원하도록 디자인 된 것(즉, MKV1-11; 표 2)을 뮤린 가변 영역 유전자를 PCR-클론하기 위해 적합한 불변 영역 유전자의 5'-단부로 복원하도록 디자인된 프라이머와 연계하여 사용했다.

개별적인 PCR-반응물을 교차-오염의 가능성을 최소화하도록 디자인된 특이적 프로토콜을 사용하여 특이적 PCR-룸에서 적합한 불변 영역 프라이머와 함께 각각의 축퇴 프라이머에 대해 제조했다. AmplitaqDNA 중합효소를 사용하여 모든 경우에서 템플레이트 cDNA를 증폭시켰다. PCR-반응 튜브를 Perkin Elmer 480 DNA 열순환기안에 로딩했고, 94℃에서 1분간, 그리고 72℃에서 1분간 25 사이클에 걸쳐 순환시켰다(94℃에서 1.5분간 초기 용융 후). 마지막 사이클의 완료시에, 반응물을 4℃로 냉각하기 전 72℃에서 10분간 최종 확장 단계를 실행했다.

각 PCR-반응물로부터 10㎕의 알리쿼트를 1% 아가로스/TBE(pH 8.8) 겔 상에 전개시켜 정확한 크기의 RCR-생성물이 생성되었는지 측정했다. 전-길이 가변 영역 유전자를 증폭하는 것으로 나타난 PCR-반응을 반복하여 독립적인 PCR-클론을 생성함으로써 PCR-에러의 영향을 최소화했다. 정확한 크기의 PCR-생성물의 1 내지 6㎕ 알리쿼트를 직접 TA Cloning키트에 의해 제공된 pCRII^TM벡터로 클론했고, 제조자의 지시에 설명된 바와 같이 INA αF' 수용성 세포로 형질전환했다. 정확한 크기의 삽입을 갖는, 플라스미드를 함유하는 콜로니들을 Gussow and Clackson, Nucleic Acids Res., 17:4000, 1989의 방법에 따라 아래 표 3에 설명된 pCRII Forward 및 pCRII Reverse 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 콜로니들을 PCR-스크리닝함으로써 확인했다.

확인된 이들 추정의 양성 클론들을 제조자의 지시에 설명된 바와 같이, Vistra DNA 서열화기 및 Thermo Sequenase^TM사전-혼합 순환 서열화 키트를 사용하여 이중-스트랜드 플라스미드 DNA 서열화했다.

실시예 1: BAT 항체의 중쇄 가변 영역의 클로닝 및 서열화

모든 인간화 프로젝트에 있어서, 엄격한 PCT-클로닝 및 서열화 프로토콜을따랐다. 이것은 BAT 하이브리도마 셀라인으로부터의 마우스 V_H가변 영역 유전자의 야생형 서열안에 에러가 도입될 가능성을 최소화하도록 행해졌다. 뮤린 BAT 항체를 발현하는 하이브리도마 셀라인으로부터의, 적어도 2개의 상이한 V_H유전자 클론으로부터 모든 DNA 서열 데이타가 완전히 일치하는 경우에만, 정확한 유전자 서열로서 인정되었다.

상이한 전체 RNA 제조 및 이어지는 제 1 스트랜드 cDNA 합성 반응으로부터 각각의 3개의 개별적인 PCR-생성물을 PCR-클론했고, 2개 스트랜드에 대해 DNA 서열화를 완료했다. 모든 12개 중쇄 프라이머를 시험했지만(표 1), 단지 MHV9 프라이머 (MHCG3과 연계하여-마우스 γ3 중쇄 유전자의 CH1 도메인으로 복원하도록 디자인된)만이 대략 460bp 생성물로 PCR-증폭되었다. 다음에 이것을 pCRII^TM클로닝 벡터로 TA-클론했다(데이타 나타내지 않음).

각각의 3개 PCR-생성물(각각 상이한 1^st스트랜드 합성 반응 및 이어지는 PCR-반응으로부터)로부터 몇몇 개체의 클론의 DNA 서열 분석으로 도 1에 설명된 바와 같은 BAT 항체 중쇄 가변 영역 서열을 결정했다. 이 서열을 연구된 3개 PCR-클론 모두에 대해 2개 DNA 스트랜드에 대해 확인했다.

실시예 2: BAT 항체의 Kappa 경쇄 가변 영역의 클로닝 및 서열화

1^st스트랜드 합성에 의하여 제공된 단일 스트랜드 cDNA 템플레이트를 Kappa 경쇄 축퇴 프라이머 시리즈를 사용하여 PCR-증폭했다(아래 표 2). 그러나, 이것은1개 이상의 가변 영역 유전자가 적어도 BAT 하이브리도마 셀라인에 의해 전사되었음을 암시하는, 1개 이상의 축퇴 프라이머로부터 다수의 PCR-생성물의 증폭을 가져왔다.

먼저, PCR-생성물은 MKV2 프라이머(이것은, 모든 MKV 시리즈의 프라이머와 같이, Kappa 경쇄 단일 펩티드의 DNA 서열의 5'-단부로 복원한다) 및 MKC(이것은 마우스 Kappa 불변 영역 유전자의 5'-단부에 복원하도록 디자인된다)를 함께 사용했을 때 보였다. 이전의 집단내 실험은 MKV2 프라이머가 이상 mRNA 전사를 PCT-증폭한다는 것을 우리에게 보여주었다. 이런 이상 위유전자는 원래의 MOPC-21 형질세포종 셀라인으로부터 유도된 모든 표준 융합 파트너들에 존재했고, MOPC-21n(Deyev, S. M., et al., Genetica, 85:45, 1991)으로서 공지되었다. NO-0은 MOPC-21 계통으로부터 유도된 셀라인이며, 이 계통을 융합 파트너로서 사용하여 BAT 하이브리도마를 생성했다. 결국, MKV2 프라이머를 사용했을 때 PCR-생성물이 보였다는 것이 놀라운 일은 아니었다. 이 생성물을 분석했고, 비-기능성 위유전자로 나타났다(데이타 나타내지 않음).

이상하게도, 관련된 셀라인 NS-1(Hamlyn, P. H., et al., Nucl. Acis Res., 9:4485, 1981)에 의해 분비된다고 이전에 확인된 다른 위유전자 및 MKC 프라이머와 연계하여 MKV7 프라이머를 사용한 경우의 정상적인 PCR-클론은 지금까지 분석된 PCR-생성물 중 어느 것에도 보이지 않았다. NS-1 및 NS-0 셀라인은 매우 밀접한 관련이 있으므로, 이것은 거의 놀랍지 않다. 그러나, 또한 BAT 셀라인에 존재하는 Kappa 경쇄 전사의 혼동 성질이 주목된다.

BAT 항체의 V_κ유전자임이 결국 판명된 또 다른 PCR-클론을 또한 프라이머 MKV5 및 MKC를 사용하여 BAT 하이브리도마 셀라인으로부터 성공적으로 PCR-증폭했다. 대략 450bp 생성물을 INVαF'로 형질전환한 후, 추정의 양성 형질전환체를 PCR-스크리닝 분석을 사용하여 확인하고, 다음에 DNA 서열화했다.

MKV5 생성물의 2개 개체의 클론(각각 상이한 1^st스트랜드 합성 반응 및 이어지는 PCR-반응으로부터)의 서열 분석으로부터, BAT 항체 Kappa 경쇄 가변 영역 유전자의 DNA 서열을 결정했다(도 2). 이 서열을 다시 각 클론에 대한 2개 DNA 스트랜드에 대해 확인했다.

실시예 3: 마우스 BAT 항체 가변 영역의 서열 분석

BAT V_κ및 V_H영역의 아미노산 서열을 Kabat(상기와 같음) 데이타베이스에 규정된 뮤린 가변 영역 하위군의 공통 서열과 비교했다. 이 분석으로부터, BAT V_H영역이 마우스 Kappa 하위군 VI의 공통 서열에 가장 가깝게 일치한다는 것을 발견했다. BAT V_H영역과 Kabat 데이타베이스의 유사한 비교는 그것이 "갖가지" 마우스 중쇄 하위군의 공통 서열에 가장 가까운 일치를 나타낸다는 것을 밝혔다.

상기 BAT 항체 가변 영역 서열과 뮤린 생식계통의 비교는 BAT V_H유전자에 가장 가까운 생식계통 유전자는 VMS/VGK4이고(도 3), BAT V_κ유전자에 가장 가까운 생식계통 유전자는 H4임을(도 4) 밝혔다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, BAT V_H유전자와 그것의 가까운 생식계통 유전자 간에 생긴 불일치는 놀랍지않게 CDR2 및 CDR3에 지배적으로 위치한다. 단지 3개의 프레임워크만이 변화하고, 이들 모두는 FR3에 위치했다. BAT V_κ유전자와 관련하여(도 4), 불일치의 대다수가 CDRs에 위치한다는 것도 모두 함께 놀라운 일은 아니었다. FRs에 위치한 4개의 차이는 FR3에서 위치 72에 있는 시스테인을 제외하고, 모두 고도로 보존된 변화였다. 중요한 정준 잔기(위치 71)에 바로 인접한 그것의 위치는 시스테인이 항원 결합에서 중요한 역할을 해왔을 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, 단지 Fv 도메인의 몰딩을 통해서만 그러한 추측이 명백하게 된다.

그럼에도 불구하고, 이들 분석으로 마우스 BAT 가변 영역의 V_H영역 및 V_κ영역 모두가 전형적인 마우스 가변 영역임이 명백함을 확인했다.

BAT 중쇄 가변 영역 유전자의 클로닝에 사용된 PCR-프라이머

^aMHV는 마우스 중쇄 가변 영역 유전자의 리더 서열에 혼성화하는 프라이머를 나타낸다.^bMHCG는 마우스 불변 영역 유전자에 혼성화하는 프라이머를 나타낸다.

BAT Kappa 경쇄 가변 영역 유전자의 클로닝에 사용된 PCR-프라이머

^aMKV는 마우스 Kappa 경쇄 가변 영역 유전자의 리더 서열에 혼성화하는 프라이머를 나타낸다.^bMKC는 마우스 Kappa 불변 영역 유전자에 혼성화하는 프라이머를 나타낸다.

형질전환된 콜로니의 PCR 스크리닝용 프라이머

II. 본 발명의 키메라 항체의 구성 및 발현

(A) 약자

다음의 비-SI 유니트 및 다른 약자를 사용했다:

중합효소 사슬 반응 (PCR); 디옥시리보핵산 (DNA); 카피 DNA (cDNA); Kappa 경쇄 가변 영역 (V_κ); 중쇄 가변 영역 (V_H); 분 (min); 트리스-보레이트 완충액 (TBE); 포스페이트 완충된 살린 (PBS); 실온 (RT); 소 혈청 알부민 (BSA); 염산 (HCl); 양고추냉이 과산화효소 (HRP); 저지방 우유 (LFM); 시간 (hr); 퍼센트 (%); O-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (OPO); 다중 클로닝 부위 (MCS).

(B) 물질

배지 성분 및 모든 다른 조직 배양 물질은 Life Technologies(UK)로부터 입수했다. AmpliTaqDNA 폴리머라제를 포함하여 PCR-반응용의 모든 구성요소는 Perkin Elmer(USA)로부터 구입했다. 그러나, TA Cloning키트 및 INVαF' 수용성 세포는 Invitrogen(USA)로부터 입수했다. DH5α 수용성 세포 및 아가로스 (UltraPure^TM)는 Life Technologies(UK)로부터 입수했다. Thermo Sequences^TM사전-혼합 순환 서열화 키트 및 Vistra 725 DNA 서열화기는 모두 Amersham(UK)로부터 구입했다. ABI Prism 310 Genetic Analyzer와 함께 사용되는 Big Dye^TMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit는 PE Applied Biosystems(UK)로부터 구입했다. 설명된 모든 다른 분자생물학적 제품은 New England Biolabs(USA) 또는 Promega(USA)로부터 입수했다. Nunc-Immuno Plate MaxiSorp^TM이뮤노플레이트는 Life Technologies(UK)로부터 구입했고, Corning 쉬운 세척 ELISA 플레이트는 Corning Laboratory Sciences Company(UK)로부터 입수했다. 염소 항-인간 IgG(Fc_γ단편 특이) 항체, 염소 항-인간 Kappa 경쇄/HRP 콘쥬게이트 및 Affinpure 염소 항-사람 IgG(Fc_γ단편 특이)/HRP 콘쥬게이트는 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(USA)로부터 입수했다. K-Blue TMB 기질 및 Red Stop 용액은 Neogen Inc.(USA)로부터 구입했다. ELISA 용의 모든 다른 제품은 Sigma(UK)로부터 입수했다. Microplate Manager데이타 분석 소프트웨어 패키지는 Bio-Rad(UK)로부터 구입했다. 미소-부피 교반 한외여과 세포 및 PM30 필터 멤브레인은 Amicon PLC(UK)로부터 입수했고, Immunopure(G) IgG 정제 키트는 Pierce PLC(UK)로부터 구입했다.

(C) 실험 기법

C1: 키메라 γ1/ _κ BAT 항체의 구성

이전에 분리된 마우스 Kappa 경쇄 가변 영역(V_κ) 유전자(도 1) 및 중쇄 가변 영역(V_H) 유전자(도 2)를 특이적으로 디자인된 PCR-프라이머(표 1)을 사용하여 5'- 및 3'-단부에서 변형시켜, 키메라 마우스-인간 항체의 부분으로서 포유류 세포에서 BAT 가변 영역 유전자를 발현할 수 있게 했다. 이런 분리를 달성하기 위해, PCR-반응물을 교차-오염의 가능성을 최소화하도록 디자인된 특이적 프로토콜을 사용하여 특이적 PCR-룸에서 각 가변 영역 유전자에 대해 제조했다. 플라스미드 BATV_H-pCR2.1 및 BATV_κ-pCR2.1을 템플레이트로서 사용했고, AmpliTaqDNA 중합효소를 이들 템플레이트를 증폭하는데 사용했다. 프라이머 B8814 및 B8815(표 4)를 BAT V_H유전자를 PCR-변형하는데 사용하고, C0224 및 C0225(표 4)를 BAT V_κ유전자를 PCR-돌연변이하는데 사용했다.

PCR-반응 튜브를 94℃에서 50초간, 72℃에서 1분 30초간 30 사이클에 걸쳐 순환시켰다(94℃에서 3분간 초기 용융 후). 마지막 사이클의 완료시에, 반응물을 얼음상에서 냉각하기 전 72℃에서 10분간 최종 확장 단계를 실행했다. 다음에, 각 PCR-반응물로부터 5㎕ 알리쿼트를 1.2% 아가로스/TBE(pH 8.8) 겔 상에 전개시켜 정확한 크기의 PCR-생성물이 생성되었는지 측정했다.

정확한 크기의 PCR-생성물의 1 내지 2㎕ 알리쿼트를 직접 TA Cloning키트에 의해 제공된 pCR2.1^TM벡터로 클론했고, 제조자의 지시에 설명된 바와 같이 INVαF' 수용성 세포로 형질전환했다. 정확한 크기의 삽입을 갖는, 플라스미드를 함유하는 콜로니들을 Gussow 및 Clackson(상기와 같음)의 방법에 따라 1212 및 1233 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 5)를 사용하여 콜로니들을 PCR-스크리닝함으로써 확인했다. 확인된 이들 추정의 양성 클론들을 Vistra DNA 서열화기 및 ABI Prism 310 Genetic Analyzer를 모두 사용하여 이중-스트랜드 플라스미드 DNA 서열화했다. Thermo Sequenase^TM사전-혼합 순환 서열화 키트 및 Big Dye^TMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 프라이머 1212 및 1233(표 5)와 함께 제조자의 지시에 설명된 바와 같이 사용했다.

정확하게 조정된 BAT V_κ및 V_H유전자(각각, 도 5 및 도 6)를 함유하는 이들 클론을 각각 발현 벡터 pKN110(도 7) 및 pG1D110(도 8)로HindIII-BamHi 단편으로서 서브클론하여 포유류 세포에서 키메라 경쇄 및 중쇄를 발현했다. 다음에, 리게이션된 발현 벡터(즉, pKN110-BATV_κ및 pG1D110-BATV_H)를 DH5α 수용성 세포로 형질전환했다. 정확하게 구성된 발현 벡터를 함유하는 양성 클론을 제한 소화 분석에 의해 최종적으로 확인했다.

C2: COS 세포에의 키메라 γ1/ _κ BAT 항체 벡터 DNA의 Co-트랜스펙션

Kettleborough et al.의 방법에 따라 COS 세포에의 포유류 발현 벡터를 트랜스펙트했다. 간단히 설명하면, DNA(Kappa 경쇄 발현 벡터 pKN110-BATV_κ및 중쇄 발현 벡터 pG1D110-BATV_H각 10㎍)를 PBS 중의 1×10⁷세포/ml의 0.70ml 알리쿼트에 가하고, Bio-Rad Cene Pulser 기기를 사용하여 1900V, 25㎌ 정전용량으로 펄스했다. 10분 회복 후, 실온 전기천공 세포를 5% FCS를 함유하는 DMEM 8ml에 가하고, 37℃에서 5% CO₂중에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 72시간 인큐베이션 후, 배지를 수집하고, 회전시켜 세포 잔해들을 제거하고, 키메라 BAT 항체 생성에 대해 ELISA로 분석했다.

C3: ELISA에 의한 키메라 γ1/ _κ 항체의 정량

96-웰 Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM 이뮤노플레이트의 각 웰을 PBS로 희석하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 사용하기 전에 제거한 0.4ng/㎕ 염소 항-인간 IgG(Fc_γ단편 특이) 항체의 100㎕ 알리쿼트로 먼저 코팅했다. 다음에, 실험 샘플(즉, 수확된 COS 세포 상청액 - 회전시켜 세포 잔해를 제거한다)의 100㎕/웰 알리쿼트 및 샘플-효소 콘쥬게이트 완충액(0.1M 트리스-HCl(pH 7.0), 0.1M NaCl, 0.02%(v/v) TWEEN-20 및 0.2%(w/v) BSA)으로 희석한 1:2 샘플 희석액을 이뮤노플레이트 위에 분배했다. 여기에 더하여, 표준으로서 사용되는 정제되고 연속하여 1:2로 희석된 인간 γ1/_κ항체(1000ng/㎕)를 이뮤노플레이트 위에 또한 로딩했다. 이뮤노플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세척 완충액(PBS/0.1%(v/v) TWEEN-20) 200㎕/웰로 3번 세척했다. 샘플-효소 콘쥬게이트 완충액으로 5000-배 희석된 염소 항-인간 Kappa 경쇄/양고추냉이 과산화효소 콘쥬게이트 100㎕를 각 웰에 가하고, 이어서 이뮤노플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 전과 같이 세척했다. 다음에, K-Blue 기질의 150㎕ 알리쿼트를 각 웰에 가하고, 이어서 이뮤노플레이트를 어두운 실온에서 10분간 인큐베이션했다. 최종적으로, 각 웰에 Red Stop 50㎕ 분배하여 반응을 정지시켰다. 다음에, 655nm에서의 광학 밀도를 Microplate Manager소프트웨어 패키지와 연계된 Bio-Red 3550 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정했다.

C4: 키메라 BAT 항체의 정제

키메라 BAT γ1/_κ항체를 2 단계로 COS 세포 상청액으로부터 정제했다. 먼저, PM30 필터 멤브레인을 갖는 미소-부피 교반 한외여과 세포를 제조자의 지시에 따라 사용하여 가공하지 않은 미-정제 상청액의 부피를 줄였다. 다음에, Immunopure(G) IgG 정제 키트를 또한 제조자의 지시에 따라 사용하여 농축된 상청액으로부터 키메라 BAT 항체를 친화성 정제했다.

C5: Daudi 세포 ELISA

세포 ELISA 분석을 또한 Dr. Hardy(Felsenstein Medical Research Center, Rabin Medical Center, Beilinson Campus, Petach Tikva, 49100, Israel)에 의해 원래의 스톡으로부터 배양된 Daudi 세포를 사용하여 실행했다. 마이너 변형을 마우스 또는 마우스-인간 키메라 BAT 항체가 분석되었는지의 여부에 의존하는 분석법에서 실행했다. 분석의 경우, 친화성 결합한 마우스 BAT 항체 염소 항-마우스IgG(Fab 특이)/HRP 콘쥬게이트(1:15000 희석)를 제 2 항체로 사용했다. 반대로, 측정의 경우, 친화성 키메라 BAT 항체 AffiniPure 염소 항-인간 IgG(Fc_γ단편 특이)/HRP 콘쥬게이트(1000-배 희석)을 사용했다.

Daudi 세포(2일 경과 후)를 96 웰 Corning 쉬운 세척 ELISA 플레이트에 10⁵세포/웰로 먼저 플레이트하고, 다음에 건조 인큐베이터에서 37℃에서 하룻밤 이큐베이션했다. 다음 날, 재수화 완충액(10% FCS 및 0.05% 아지드를 함유하는 PBS) 200㎕를 각 웰에 가한 후, 최소 1시간 동안 방치했다. 다음에, 재수화 완충액을 따라낸 후, 정제된 BAT 항체의 여러가지 1:2 연속 희석물의 50㎕ 알리쿼트를 플레이트의 웰들에 가했다. 플레이트를 하룻밤 다시 인큐베이션하고(4℃), 5% LFM을 함유하는 PBS 200㎕/웰로 2번 세척하고 건조했다. 다음에, HRP 콘쥬게이트된 제 2 항체 50㎕/웰을 가한 후, 6가지 상이한 일련의 세척(즉, 5% LFM을 함유하는 PBS로 1번 세척, 0.05% TWEEN-20으로 보충된 동일한 완충액으로 3번 세척, 이어서 PBS/LFM 완충액으로 2번 더 세척)을 실행했다. 다음에, 0.05M 시트레이트 완충액(pH 0.5) 중의 0.4mg/ml OPD 기질 및 60mg/ml 과산화수소 200㎕/웰을 가한 후, ELISA 플레이트를 어두운 실온에서 색이 전개될 때까지(보통 약 30분) 인큐베이션했다. 최종적으로, 2.5M 황산 50㎕/웰을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 490nm에서의 광학 밀도를 Microplate Manager소프트웨어 패키지와 연계된 Bio-Rad 3550 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정했다.

결과

실시예 4: 키메라 γ1/ _κ 항체의 구성

모든 프로젝트에 있어서, 엄격한 PCR-클로닝 및 서열화 프로토콜을 따랐다. 이것은 PCR-변형 단계 동안 마우스 가변 영역 유전자의 야생형 서열안에 에러가 도입될 가능성을 최소화하도록 행해졌다. 프라이머 C0224 및 C0225(표 1)을 사용하여, 마우스 BAT V_κ유전자(도 2)를 PCR 에 의하여 변형시켜 418bp 밴드(데이타 나타내지 않음)을 생성했다. 이 PCR-생성물을 pCR2.1 플라스미드로 리게이션하고, INVαF' 수용성 세포로 형질전환했다. 유사하게, 마우스 BAT V_H유전자(도 1)를 프라이머 B8814 및 B8815를 사용하여 PCR-돌연변이시켜 436bp 밴드(데이타 나타내지 않음)를 생성했다. 이 PCR-생성물을 또한 pCR2.1 플라스미드에 리게이션하고, INVαF' 수용성 세포로 형질전환했다.

다음에, 추정의 양성 형질전환체를 PCR-스크리닝 분석법을 사용하여 검출한 후(데이타 나타내지 않음), 최종적으로 ABI Prism 310 Genetic Analyzer 상에서 ds-DNA 서열화했다. 도 3 및 도 4는 키메라 BAT V_κ유전자 및 BAT V_H유전자의 이런 DNA 서열 분석의 결과를 나타낸다. 분석을 그것들의 성공적인 돌연변이 유발을 확인하고, 또한 유전자안에 도입되었을 수 있는 어떤 PCR-에러의 존재를 나타내기 위해 실행했다. 단지 1개의 PCR-반응만을 각 가변 영역 유전자에 대해 실제로 실행했고, 각각의 이들 PCR-반응으로부터의 단지 2개의 클론만을 결국 DNA 서열화하여 완료했다.

그럼에도 불구하고, 이것은 정확히 변형된 DNA 서열을 함유한 각 변형된 가변 영역 유전자에 대한 적어도 1개의 클론을 분리하기에는 충분함을 증명했다.

다음에, 돌연변이된 V_H및 V_κ유전자를hindIII/BamHI 단편으로서 적합한 발현 벡터로 서브클론하여 각각 pKN110-BATV_κ(7.88kb) 및 pG1D110-BATV_H(7.55kb)를 만들었다. 다음에, 구성된 발현 벡터의 적합도를 제한 효소 분석에 의하여 확인했다(데이타 나타내지 않음). 일단 COS 세포로 공통-트랜스펙션된 이들 벡터는 키메라 BAT 항체의 γ1/_κ버전의 일과적 발현을 허용한다.

여기에 더하여, BAT 항체 인간화 프로젝트에 대한 가외의 구성요소로서, BAT V_H유전자를 또한 pG3D110 및 pG4D110 중쇄 발현 벡터 모두로hindIII/BamHI 단편으로서 서브클론했다. 이들 벡터는 pG1D110과 동일했고, cDNA 카피 γ1 인간 불변 영역 유전자를 3γ 불변 영역 유전자(pG3D110의 경우)의 cDNA 카피 또는 γ3 불변 영역 유전자(pG3D110의 경우)의 cDNA 또는 γ4 불변 영역 유전자(pG3D110의 경우)의 cDNA로 대체하기 위해 저축되었다. COS 세포에 있는 키메라 BAT 항체의 γ3/_κ및 γ4/_κ버전 모두에 대해 이들 벡터(즉, pG3D110-BATV_κ)를 구성했다.

실시예 5: 키메라 γ1/ _κ BAT 항체의 일과적 발현

2개의 벡터 pKN110-BATV_κ및 pG1D110-BATV_H를 일련의 반복된 일과적 발현 실험에서 COS 세포에 공통-트랜스펙션했다. 72시간 동안 발현한 후, 마우스-인간 γ1/_κ키메라 BAT 항체를 γ1/_κELISA에 의하여 COS 세포 공통-트랜스펙션의 상청액에서 검출했다. 이들 분석으로부터, 배지에서 검출된 γ1/_κ키메라 BAT 항체의 평균 농도가 509±272ng/ml로 계산되었다.

흥미롭게도, 키메라 BAT 항체의 γ3/_κ및 γ4/_κ버전은 그것들의 COS 세포를 발현한 후, 상당히 더 큰 양의 항체를 생성하는 것이 명백하다. 구체적으로, pG3D110-BATV_H및 pKN110-BATV_κ를 COS 세포에 공통-트랜스펙션하고, 상청액의 초기 분석(섹션 4.3에 설명된 ELISA 법 및 표준으로서 인간 IgG3/Kappa 항체를 사용하여)으로 측정한 키메라 γ3/_κBAT 항체의 발현 수준은 6.7㎍/ml이었다. 더욱이, pG4D110-BATV_H및 pKN110-BATV_κ를 COS 세포로 발현했을 때, 동일한 ELISA(표준으로서 인간 IgG4/Kappa 항체를 사용)로 측정한 키메라 γ4/_κBAT 항체의 발현 수준은 8.2㎍/ml이었다.

실시예 6: 키메라 γ1/ _κ BAT 항체의 정제

공통-트랜스펙션 당 대략 8ml를 수확하여, 일련의 트랜스펙션을 COS 상청액 200ml가 수집될 때까지 실행했다. 다음에, PM30 필터 멤브레인(30kDa 분자량 컷오프를 갖는다)을 갖는 미소-부피 교반 한외여과 세포를 통해 상청액을 통과시켜 이 상청액의 부피를 15ml로 줄였다. Immunopure(G) IgG 정제 키트는 필수적으로 고정된 Protein G 칼럼의 2ml 칼럼으로 이루어진다. 항체를 용출 완충액 6ml를 사용하여 칼럼으로부터 용출시키고, 용출물을 1ml씩 나누어 수집했다. 다음에, 각 분액에서 키메라 γ1/_κBAT 항체의 농도를 섹션 C3에 설명된 ELISA 법을 사용하여 분석했다. 이 분석으로 키메라 항체가 분액 3(42.05㎍/ml) 및 분액 4(20.05㎍/ml)에 존재하는 것을 발견했고, 이것은 키메라 γ1/_κBAT 항체의 62.1㎍의 총 회수에 상응한다. 이것을 이어서 더 이상의 분석을 위해 Curetech에 전달될 때까지 -20℃에 저장했다.

실시예 7: 키메라 γ1/ _κ BAT 항체에 의해 결합한 Daudi 세포의 분석

Daudi 세포 ELISA를 사용하여, 정제된 γ1/_κBAT 항체가 Daudi 세포에 결합된다는 것이 분명하게 나타났다. 도 9는 한 실험의 전형적인 예를 나타낸다. 그러나, 유사한 농도의 마우스 BAT 항체의 결합은 동일한 ELISA에서 보다 덜 명확했으며, 이것은 키메라 항체 보다 낮음이 명백했다. 그럼에도 불구하고, Daudi 세포에 결합한 항체를 검출하기 위해 사용된 콘쥬게이트된 제 2 항체가 각 항체 구성물에 대해 상이하므로, 2개 버전의 결합에 대한 직접적인 비교를 합리적으로 할 수 없다.

포유류 세포에서 키메라 γ1/ _κ BAT 항체의 부분으로서 그것들의 발현을 허용하도록 마우스 BAT 항체 Kappa 경쇄 및 중쇄 가변 영역 유전자를 PCR-변형하는데 사용된 프라이머

형질전환된 콜로니를 PCR 스크리닝하고, BAT 항체의 PCR-변형된 가변 영역 유전자를 DNA 서열화하는데 사용된 프라이머

IV. 본 발명의 mAb가 결합하는 Daudi B-세포 림프모구모양 셀라인 항원으로부터 취해진 3개 펩티드의 아미노산 서열

본 발명의 mAb가 결합하는 Daudi B 림프모구모양 세포의 항원 에피토프에 포함된 3개 펩티드를 서열화했다. 그것들의 서열을 도 10, 11 및 12에 도시했다.

비-중복 유전자 은행 데이타베이스에 대하여 연구를 수행했고, 3개 펩티드를 10의 EXPECT 값 및 매트릭스 BLOSUM 62를 사용하는 TBLASTN 알고리듬(버전 2)를 사용하는 질문으로서 돌렸을 경우, EST Division을 히트 없이 얻었다.

그러나, 펩티드가 작은 펩티드이므로, 그것들을 다시 더 높은 EXPECT 값에 제시하여 보다 덜 엄격한 연구를 실행했다. 또한, 블라스트 통계가 그것들의 쌍을 이루는 방식의 정렬에 대한 특이성을 반영하는 영역을 남기는, 블라스트 보고서로부터 혼동 일치(예를 들어, 프롤린-부화 영역 또는 프롤리-A 꼬리에 대한 히트)를 잠재적으로 제거할 수 있는 낮은 복합성을 위해 필터를 드러냈다. 본 발명의 3개 펩티드는 매우 낮은 엄격도에서조차 유전자 은행 및 EST Division 데이타베이스와의 어떤 히트도 없었다.

따라서, 상기 결과에 따라, 상기 3개 펩티드는 신규한 펩티드인 것 같다.

IV. 본 발명의 mAb를 사용한 환자에 있는 악성 질환의 진단

시험된 개체로부터의 말초 혈액 림프구를 항-CD3 항체 및 본 발명의 mAb 중 하나를 사용하여 이중-표지했다. 본 발명의 mAb를 결합시키는 CD3+ 세포의 퍼센트를 측정했다. 본 발명에 따라서, 악성 질환을 가지는 개체에 있는 CD3+mAb+의 수가 건강한 개체로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 이들 세포의 퍼센트와 상이하다는 것이 나타났다. 악성 질환을 가지는 개체에서 CD3+ 세포 퍼센트의 상당한 차이가 존재한다는 사실, 및 그 차이가 건강한 개체로부터 얻어진 CD3+mAb+ 세포 퍼센트 이상 또는 이하인지의 여부는 개체가 악성 질환을 가지는지의 여부 뿐만 아니라 시험된 개체가 가질 수 있는 특정한 종류의 악성 질환을 높은 확률로서 측정할 수 있게 한다.

전형적으로, 인간 말초 혈액 림프구를 건강한 개체 또는 암환자의 혈액 20ml으로부터 Ficoll Hypaque 비중 원심분리에 의해 얻었다. 세포를 세척하고, 0.5% BAS 및 산 0.05%를 함유하는 PBS 중에 현탁했다. 0.5×10⁶세포를 함유하는 샘플을 FACS 분석을 위해 사용했다. 먼저, 세포를 본 발명의 mAb의 포화량으로 0℃에서 45분간 인큐베이션하고, 이어서 그것들을 FITC와 콘쥬게이트된 항-마우스 mAb로 30분간 인큐베이션했다. 2번 세척한 후 1200rpm에서 원심분리하고, 세포를 PE 항체와 콘쥬게이트된 항-인간 CD3로 얼음상에서 30분간 인큐베이션했다. 이 인큐베이션 후 세포를 2번 세척하고, 샘플을 FACS 스캔(Bectan Dickinson)에 의해 분석했다. 결과를 도 13 내지 도 17에 나타낸다.

도 13 뿐만 아니라 도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 건강한 개체로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 CD3+BAT+ 세포의 퍼센트(총 CD3+ 세포와 비교한 바)는 약 25%의 범위안에 있다. 도 14에 보인 바와 같이. 결장 암종을 가지는 환자로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 CD3+BAT+ 세포의 퍼센트는 약 7%의 범위로 건강한 개체와 비교하여 실질적으로 더 낮다. 유사하게도, 유방 암종을 가지는 환자로부터 얻어진혈액 샘플에 있는 CD3+BAT+ 세포의 퍼센트는 약 10%의 범위안에 있었다(도 15). 이들 결과는 결장 및 유방 암종이 CD3+BAT+ 세포의 퍼센트가 건강한 개체와 비교하여 더 낮다는 사실에 의해 확인될 수 있다는 것을 분명히 나타낸다.

전립선 암종 환자로부터 얻어진 혈액 샘플에 있는 CD3+BAT+ 세포의 퍼센트는 도 16에 보인 바와 같이 건강한 개체의 혈액 샘플에서의 퍼센트 보다 상당히 높으며, 약 50%의 범위안에 있다. 이들 결과는 전립선 암종이 CD3+BAT+ 세포의 퍼센트가 건강한 개체와 비교하여 더 높다는 사실에 의해 확인될 수 있다는 사실을 분명히 나타낸다. 도 18에 보인 바와 같이, 유방 암종의 환자로부터 얻어진 T-세포에 있는 항원은 검출할 수 없는 반면, 전립선 암종 환자로부터 얻어진 T-세포에서 발견된 본 발명의 mAb가 결합하는 항원의 양은 매우 높다.

상기 결과는 본 발명의 mAb가 어떤 종류의 악성 질환으로 고통받고 있는 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 혈액 샘플이 시험된 개체로부터 얻어지고, 샘플에 있는 CD3+ 세포에 대한 본 발명의 mAb의 결합 정도가 상당히 높다면(약 50%의 범위), 시험된 개체가 전립선암으로 고통받고 있을 확률이 매우 높다. 이에 대하여, 샘플에 있는 CD3+ 세포의 퍼센트가 건강한 개체와 비교하여 상당히 낮다면(약 7% 또는 10%의 범위), 시험된 개체가 유방 또는 결장 암종으로 고통받고 있을 확률이 높다. 명백하게도, 시험된 개체가 남성 개체라면, 결장 암종으로 고통받고 있을 확률이 높다.

상기 실시예들은 제한으로서 구성될 수 없으며, 본 발명의 mAb를 결합시키는 CD3+ 세포의 퍼센트와 다른 악성 질환 사이의 추가의 상호관계 또한 본 발명의 범위내에 있다.

Claims

(a) 도 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(b) 도 2의 아미노산 서열을 포함하는 Kappa 경쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(c) 도 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 2의 아미노산 서열을 포함하는 Kappa 경쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(d) 도 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체;

(e) 도 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역을 가지는 단일클론 항체

로 구성되는 군으로부터 선택된 가변 영역을 가지는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서, 도 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서, 도 2의 아미노산 서열을 포함하는 Kappa 경쇄 가변 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서, 도 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 2의 아미노산 서열을 포함하는 Kappa 경쇄 가변 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서, 도 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서, 도 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 mAb가 특이적으로 결합하는 항원에 결합하는 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 인간-마우스 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 mAb의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열.
제 9 항의 핵산 서열을 가지는 발현 벡터.
제 10 항에 있어서, 플라스미드 pKN110으로 나타내지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 10 항에 있어서, 플라스미드 pG1D110으로 나타내지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 mAb를 생성하는 하이브리도마 셀라인.
도 10에 도시된 펩티드의 아미노산 서열을 가지는 펩티드.
도 11에 도시된 펩티드의 아미노산 서열을 가지는 펩티드.
도 12에 도시된 펩티드의 아미노산 서열을 가지는 펩티드.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 펩티드의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 동일성을 가지는 펩티드.
제 12 항 내지 제 15 항의 펩티드 중 한가지 이상을 포함하는 단백질 또는 펩티드.
제 1 항의 mAb 중 어느 하나에 대해 실질적으로 동일한 결합 수준을 가지는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 펩티드의 유사체.
(a) 개체로부터 체액 샘플을 얻는 단계;

(b) 상기 샘플을 제 1 항 내지 제 8 항의 mAb 중 적어도 한가지와 접촉시키는 단계;

(c) 상기 샘플내에 있는 T-세포에 대한 상기 mAb의 결합 정도를 측정하는 단계; 그리고

(d) (c)의 정도와 건강한 개체로부터 얻어진 샘플에 있는 T-세포에 대한 mAb의 결합 정도를 비교하는 단계

를 포함하고, 상기 두 결합 정도간의 상당한 차이가 상기 시험한 개체가 악성 질환을 가질 확률이 높은 것을 나타내는, 악성 질환을 가질 확률이 높은 시험한 개체를 확인하는 분석법.
제 21 항에 있어서, 단계 (b) 전에, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고, 다음에 상기 분리된 PBMC를 제 1 항 내지 제 8 항의 상기 적어도 한가지 mAb와 단계 (c)에서 접촉시키는 것을 특징으로 하는 분석법.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 체액이 혈액인 것을 특징으로 하는 분석법.
(a) 개체로부터 체액 샘플을 얻는 단계;

(b) 상기 샘플을 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 mAb와 접촉시키는 단계;

(c) 상기 샘플내에 있는 T-세포에 대한 상기 mAb의 결합 정도를 측정하는 단계; 그리고

(d) (c)의 정도와 건강한 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 mAb의 결합 정도를 비교하는 단계

를 포함하고, 결합 정도에서 상당한 차이의 존재가 시험한 개체가 악성 질환을 가질 확률이 높다는 것을 나타내며, 여기에서 상기 개체의 T-세포에 대한 결합 정도가 건강한 개체의 T-세포에서의 mAb의 결합 수준 이상 또는 이하인지의 여부가 시험한 개체가 특정한 종류의 악성 질환을 가질 확률이 높다는 것을 나타내는, 특정한 악성 질환을 가질 확률이 높은 시험한 개체를 확인하는 분석법.
제 24 항에 있어서, 단계 (b) 전에, PBMC를 상기 샘플로부터 분리하고, 다음에 상기 PBMC를 상기 mAb와 단계 (c)에서 접촉시키는 것을 특징으로 하는 분석법.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 시험한 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 mAb의 결합 정도가 건강한 개체의 T-세포에 대한 동일한 mAb의 결합 정도 보다 높은 것을 특징으로 하는 분석법.
제 26 항에 있어서, 상기 특정한 악성 질환이 전립선 암종인 것을 특징으로 하는 분석법.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 시험한 개체로부터 얻어진 T-세포에 대한 mAb의 결합 정도가 건강한 개체의 T-세포에 대한 동일한 mAb의 결합 정도 보다 낮은 것을 특징으로 하는 분석법.
제 28 항에 있어서, 상기 특정한 악성 질환이 유방 암종인 것을 특징으로 하는 분석법.
제 28 항에 있어서, 상기 특정한 악성 질환이 결장 암종인 것을 특징으로 하는 분석법.
제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 1 항 내지 제 8 항의 mAb 중 한가지 이상을 포함하는 제약학적 조성물.
상기 mAb에 대한 특이적 결합 파트너의 콘쥬게이트, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 및 키트의 사용을 위한 지시서와 함께, 제 1 항 내지 제 8 항의 mAb 중 한가지 이상을 포함하는 키트.
제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 1 항 내지 제 8 항의 mAb 중 한가지 이상을 활성 성분으로서 포함하는 제약학적 조성물.
제 33 항에 있어서, 암 치료용인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
개체에서 악성 질환의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 mAb의 사용.
제 1 항 내지 제 8 항의 mAb 중 한가지 이상을 치료적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 악성 질환의 치료 방법.
제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 15 항 내지 제 20 항의 펩티드 중 한가지 이상을 활성 성분으로서 포함하는 조성물.
면역학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 15 항 내지 제 20 항의 펩티드 중한가지 이상을 활성 성분으로서 포함하는 악성 질환에 대하여 면역시키기 위한 백신 제제.
악성 질환의 치료를 위한 제약학적 제제의 제조를 위한 제 15 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 펩티드의 사용.
제 15 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 펩티드를 치료적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 악성 질환의 치료 방법.
제 34 항에 있어서, 상기 암이 고형 종양인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 41 항에 있어서, 상기 고형 종양이 전립선 암종인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 41 항에 있어서, 상기 고형 종양이 유방 암종인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 42 항에 있어서, 상기 고형 종양이 결장 암종인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 40 항에 있어서, 상기 악성 질환이 고형 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 고형 종양이 전립선 암종인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 고형 종양이 유방 암종인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 고형 종양이 결장 암종인 것을 특징으로 하는 방법.