CN1169949C - 一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途 - Google Patents
一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1169949C CN1169949C CNB011446285A CN01144628A CN1169949C CN 1169949 C CN1169949 C CN 1169949C CN B011446285 A CNB011446285 A CN B011446285A CN 01144628 A CN01144628 A CN 01144628A CN 1169949 C CN1169949 C CN 1169949C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- construction body
- adenovirus
- recombinant adenovirus
- adenovirus construction
- recombination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 79
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims description 30
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims description 30
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 5
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 31
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 12
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 5
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 abstract 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 19
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 5
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 4
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004179 Oral Leukoplakia Diseases 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 201000008557 oral mucosa leukoplakia Diseases 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102100033270 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 101000944380 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000405217 Viola <butterfly> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 101150010855 cma gene Proteins 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- GDPJWJXLKPPEKK-SJAYXVESSA-N dT4 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)[C@@H](O)C1 GDPJWJXLKPPEKK-SJAYXVESSA-N 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种在人类5型腺病毒(Human adenovirus type5)的基因组中定点缺失(delete)E1A编码序列的构建方案，以及获得的重组腺病毒构建体在肿瘤治疗、诊断中的具体用途。用定点突变、PCR扩增、酶切、连接、亚克隆、转染、重组腺病毒单克隆纯化等技术，缺失E1A(382-1630nt)序列，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体。该构建体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，从而特异性裂解杀灭肿瘤细胞，并对顺铂等一线化疗药物对肿瘤细胞的杀灭有显著的增效效应，另一方面该重组腺病毒构建体在正常细胞内不能复制增殖，因而对正常细胞无毒性效应。该重组腺病毒构建体在用于肿瘤治疗药物、诊断试剂的制备中具有良好的实用价值，同时也是一种良好的基因治疗载体。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种在人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5)的基因组中定点缺失(delete)E1A编码序列的构建方案，以及通过该方案得到的具有肿瘤治疗、诊断作用的腺病毒构建体，属于医学基因工程技术领域。
二、背景技术
恶性肿瘤的死亡率在国内已经成为仅次于心脑血管疾病的第二位致死病因，全社会对恶性肿瘤诊断和治疗的需求极大。目前在临床治疗中占主导地位的肿瘤化疗、放疗、手术治疗经过多年的发展和完善已经形成了比较成熟的治疗体系，取得了较好的临床疗效，然而，这些经典治疗方法，建立并成熟于对肿瘤细胞生物学的深刻认识之前，其作用靶点无选择性，难以避免毒、副作用强以及宿主与肿瘤之间治疗窗小的缺点，要进一步提高疗效乃至达到治愈的目的，其发展潜力有限，因此，亟待研究开发出新的高效治疗方法。
近年肿瘤细胞生物学、基因工程技术的快速发展，已经为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中基因治疗方法在肿瘤治疗的临床试用中，已经显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底，美国生物制品评价和研究中心(Center for Biologics Evaluationsand Research，CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项，其中约有70％的项目为肿瘤基因治疗，部分已经进入III期临床试验，取得了较好的疗效，如以单纯疱疹病毒胸苷酸激酶(HSV-TK)基因及胞苷脱氧酶(CD)基因为代表的“自杀”基因治疗，部分临床试验结果令人振奋。
目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒，进入肿瘤病灶后，对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗腺病毒的输入，距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此，近年来，出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体(conditionally replicative adenovirus)转化的新的发展趋势，所谓条件性复制腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，将肿瘤细胞作为生产腺病毒的场所，最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的，肿瘤细胞裂解释放出高浓度的腺病毒后，可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞，形成新一轮的感染波，周而复始形成一种正反馈，达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制，因此对正常细胞无任何杀伤效应，某些权威医学杂志通俗地将之比喻为杀灭肿瘤的“聪明炸弹”(smart bomb)。在实际应用中，已经取得了较好的预期效果，在第21届美国肿瘤研究年会上，来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明：局部注射后，复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限，在一定程度上影响了疗效的发挥，与此形成鲜明的对比，能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015，通过在肿瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒，其构建特点是在野生型人类5型腺病毒(wild-type)的基因组上，部分缺失(delete)E1B55kDa的编码序列，并加入翻译终止信号，但保留19kDaE1B的编码序列。在正常情况下，野生型腺病毒在细胞内的复制增殖依赖于E1B55kDa蛋白对p53蛋白功能的灭活。在携带正常p53基因的正常细胞，ONYX-015由于缺乏E1B55kDa，不能在细胞内复制增殖。相反，由于恶性肿瘤患者p53基因的失活率高达50-70％，ONYX-015因而能在肿瘤细胞中增殖复制最终裂解细胞，因而ONYX-015具有杀灭肿瘤细胞的高度选择性，而对正常细胞无杀伤效应。
作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来，已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效，国际著名的医学期刊《The Lancet》在以“基因治疗的新希望”为题的述评中，高度评价ONYX-015的临床应用前景，国际最著名的医学期刊如《Science》《Nature Medicine》发表了临床试验结果及评论性文章。目前，美国辉瑞(pfzer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买了专利，并已对多种肿瘤进行临床期试验，其中，对复发性、难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验，已取得非常满意的疗效，对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中，同时，ONYX已经获得以ONYX-015为载体的一些相关的基因治疗重组腺病毒载体(如插入治疗基因TK，CD)的专利，正从临床前期试验向临床期试验过渡。可以预见，ONYX-015及其相关的基因治疗产品在不久的将来，在美国将正式进入临床应用，在癌症基因治疗的临床开发产品中显示出非常良好的临床应用前景。国内已有两例与ONYX-015类似原理的专利申请，其中专利申请99124030.8(一种缺陷型病毒及其构建方法)通过缺失E1B55kDa位于2809-3329bp编码序列，并在缺失部位插入终止码的方法得到E1B55kDa部分缺失的构建体。专利申请98113494.7(缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用)部分缺失E1B55kDa编码序列，并在该缺失部位插入标志基因LacZ，得到E1B55kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体，该构建体的另一特点是有E3区的缺失。
现有的国内外发明均有一个共同的特点，即用不同方法缺失(delete)E1B55kDa的编码序列，该重组腺病毒构建体只能在携带异常p53基因的肿瘤细胞中增殖复制，而对具有正常p53基因表型的肿瘤细胞治疗效应较弱，在某些大病种肿瘤，如急性白血病p53基因的突变率很低，成为ONYX-015及其相关产品临床应用的不足之处。
三、发明内容
为克服以上技术的不足之处，本发明解决的关键问题在于构建不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体，这种构建体不能在正常细胞内复制增殖，而能选择性地在具有视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)调控通路异常表型的肿瘤细胞内复制增殖，以获取一种能选择性裂解杀灭肿瘤细胞、同时具有肿瘤诊断价值的重组腺病毒构建体。由于肿瘤细胞本质上是一种细胞周期性疾病，Rb基因本身的失活以及其他因素(如抑癌基因p15，p16，p27，p21/WAF1、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶等等)间接引起Rb基因本身的失活在肿瘤中是一个非常普遍的特征，本发明构建的重组腺病毒构建体将克服ONYX-015及其相关产品的不足之处。
为实现以上目的，采用的技术方案是：用定点突变、PCR扩增、酶切、连接等技术，缺失pCX1质粒(该载体包含腺腺病毒-21nt至-5790nt序列)中E1A的编码区(382-1630nt)，组成新的载体pCX1-E1A，该载体包含腺病毒包装信号(packaging signal)(-194至-358nt)，与除缺失病毒包装信号外，包含腺病毒全部基因组的载体pBHGE3共转染293细胞，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体。
与现有的重组腺病毒构建体相比，采用本发明达到了以下效果：(1)该重组腺病毒构建体缺失了E1A蛋白的全部编码区(382-1630nt)，E1A蛋白编码功能完全丧失，除此之外，包含AD5的全部基因组序列。
(2)对携带异常Rb基因表型的肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞无杀伤效应，而对携带异常Rb基因表型肿瘤细胞具有非常显著的杀灭作用，当与顺铂等一线化疗药物联用时，增效作用极其显著。初步结果表明，该重组腺病毒构建体是一种可用于制备肿瘤临床治疗药物的工具。
(3)对正常细胞、肿瘤细胞系体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞系活性无明显影响，而肿瘤细胞系转染腺病毒后96小时内出现部分细胞裂解死亡，因此该重组腺病毒构建体有较可靠的诊断肿瘤细胞的价值。
(4)本发明所用的技术方法和流程获得的重组腺病毒构建体，是一种新型的可选择性在肿瘤细胞内增殖复制的基因治疗重组腺病毒载体。
四、附图说明
附图1为质粒pCX1的结构示意图。该载体全长9905bp，包含腺病毒-21nt至-5790nt序列。
附图2为用定点突变技术在质粒pCX1的378nt-381nt中引入酶切位点。
附图3为构建缺失382-1630nt E1A蛋白编码序列的质粒pCX1-E1A。
附图4为pBHGE3的结构示意图，该质粒包含人类5型腺病毒除包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，全长37436bp。
附图5为缺失382-1630nt E1A蛋白编码序列的重组腺病毒载体AD5/dE1A的构建。
五、具体实施方式
实施例(除特别注明外，本技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司)。
例1：用定点突变技术在pCX1质粒的376-381nt中引入XbaI酶切位点。
pCX1购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号：PD-01-03)，该质粒包含人类5型腺病毒21-5790nt序列，其质粒结构图见附图1。用定点突变试剂盒QuikChangeTM Site-DirectedMutagenesis Kit(Strategene，U.S.A.)在pCX1质粒的376-381nt中引入XbaI酶切位点，即将TGG AGA突变为TCT AGA，具体操作参照Strategene提供的说明书进行(附图2)。
用于突变的PCR引物为：
引物1＝5′-GGG ACT TTG ACC GTT TAC GTC TAG ACTCGC CCA GGT GTT TT-3′(-358nt至-398nt)；
引物2＝5′-C ACC TGG GCG AGT CTA GAC GTA AAC GGTCAA AGT CCC CGC GGC-3′(-394nt至-352nt)(下标横线为突变位点)。
PCR反应的条件为：95℃30秒；95℃30秒、55℃1分钟、68℃20分钟共15次循环；68℃延伸20分钟。
用XbaI酶切鉴定、筛选阳性克隆，即得到在376-381nt中引入XbaI酶切位的pCX1新质粒，将该载体用XbaI酶切，得到的6.6kb的片段，常规电泳分离纯化后用于连接反应(附图3)。
例2：构建缺失382-1630nt E1A蛋白编码序列的质粒pCX1-E1A。
PCR反应引物为：
引物3＝5′-CCG CTC TAG AIA ACT TGC ATG GCG TGTTAA-3′(-382nt至-401nt，下标横线为引入的酶切位点XbaI)；
引物4＝5′-CCG CTC TAG ATC ATG GTC ATG TCA AACACC-3′(-1630nt至-1610nt，下标横线为引入的酶切位点XbaI)；
以pCX1为模板，用引物3及引物4进行PCR反应。
反应体系总体为50μl，包括：5×PCR缓冲液10μl；50mMMgCl22μl；10mM dNTP 1μl；10μM引物3 1μl；10μM引物4 1μl；pCX1 10ng；Taq2.5u；加水至50μl。
反应条件为：95℃30秒；94℃30秒、55℃1分钟、72℃1分钟共25次循环；72℃延伸7分钟。
PCR产物为1.7Kb片段，用XbaI酶切，常规电泳分离纯化后用于连接反应。
用DNA T4连接酶连接6.6kb的pCX1、1.7Kb片段，转入DH5a感受态细菌，用DNA测序鉴定筛选阳性克隆，得到包含缺失E1A的全部编码区(382-1630nt)的质粒pCX1-E1A(附图3)。
例3：缺失E1A的全部编码序列(382-1630nt)重组腺病毒构建体的构建。
pBHGE3购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号：PD-01-12)，该质粒包含人类5型腺病毒除包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，其结构见附图4。293细胞系是经剪切的人类5型腺病毒(Ad 5)DNA转化人胚胎肾细胞，获取的永久传代细胞系，购自ATCC(American typical culturecollection，ATCC，U.S.A.，目录号：ATCC CRL-1573，1972年公开)。获取时，细胞的传代次数为32代。293细胞为贴壁细胞，低三倍体，其中30％细胞有64条染色体，4.2％细胞有更高倍体。将pBHGE3和pCX1-E1A共转染293细胞，在细胞内发生同源重组，当包含人类5型腺病毒包装信号的pCX1-E1A(20nt-381nt及1631nt-5790nt)置换整合入pBHGE3时，即产生在293细胞内有增殖能力的重组腺病毒构建体，该构建体缺失E1A的全部编码序列(382-1630nt)，命名为AD5/dE1A，其结构见附图5。腺病毒经过复制，包装产生腺病毒颗粒。通过挑取噬菌斑(plaques)，获取多个单克隆的重组腺病毒构建体，经过DNA测序，得到重组腺病毒构建体阳性克隆，经过常规的腺病毒扩增、纯化，得到高浓度的重组腺病毒构建体AD5/dE1A。
例4：重组腺病毒构建体选择性杀灭肿瘤细胞的体内外实验。
选取以下细胞系作为实验对象：
U-2OS(ATCC，HTB96)P53+，RB-人成骨细胞瘤细胞系；
HS700T(ATCC，HTB147)P53-，RB-，人转移性腺瘤细胞系；
DLD-1(ATCC，CCL221)P53-，RB-，人结肠癌细胞系；
IMR90(ATCC，CCL186)P53+，RB+，人肺成纤维细胞系；
293(ATCC，CRL1573)P53+，RB+，人胚肾细胞系，为腺病毒的转代细胞。
细胞在10％FBS DMEM、37℃、5％CO2条件下培养于6孔板，每孔5×105细胞。
用于实验的腺病毒：野生型人类腺病毒5；重组腺病毒构建体AD5/dE1A；重组E1、E3缺失重组腺病毒作为对照。
用于腺病毒转染的腺病毒感染指数(MOI)为10，将腺病毒悬浮于1mlPBS中，在10％FBS DMEM，37℃，CO2条件下转染1小时，转染后，将细胞置于标准培养条件下培养。分别在4，8，12天用0.5％的龙胆紫/20％甲醇溶液染色，死细胞悬浮被冲出培养皿，活细胞染色保留在培养皿中。
实验结果表明，阳性对照腺病毒野生型人腺病毒5无选择性地裂解肿瘤细胞；复制缺陷型腺病毒(重组E1、E3缺失重组腺病毒)只裂解病毒生产293细胞系。重组腺病毒构建体AD5/dE1A选择性地裂解细胞系U-2OS、HS700T、DLD-1，对正常对照细胞系IMR90无明显影响。因此，重组腺病毒构建体AD5/dE1A能选择性杀灭肿瘤细胞，其作用见下表：
| 野生型人腺病毒5 | AD5/dE1A | 重组E1、E3缺失腺病毒 | |
| U-2OS细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 25％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 40％ | 2％ |
| 第十二天 | 90％ | 4％ | |
| HS700T细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 70％ | 18％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 30％ | 2％ |
| 第十二天 | 90％ | 3％ | |
| DLD-1细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 20％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 45％ | 2％ |
| 第十二天 | 95％ | 4％ |
| IMR90细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 1％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 2％ | 2％ |
| 第十二天 | 3％ | 1％ | |
| 293细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 50％ | 50％ |
| 第八天 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 第十二天 |
进一步用化疗药物顺铂联用以上腺病毒的实验结果表明，重组AD5/dE1A腺病毒载体选择性地显著增强肿瘤细胞系U-2OS、HS700T和DLD-1对顺铂的敏感性，而对正常对照细胞系IMR90无明显的增效作用。因此，重组AD5/dE1A腺病毒载体具有选择性增强顺铂杀灭肿瘤细胞的作用，其效应见下表。
| 野生型人腺病毒5- + | AD5/dE1A- + | 重组E1、E3缺失腺病毒- + | |
| U-2OS细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 25％ 90％ | 25％ 93％ | 25％ 30％ |
| HS700T细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 15％ 95％ | 15％ 95％ | 15％ 25％ |
| DLD-1细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 18％ 92％ | 18％ 96％ | 18％ 25％ |
| IMR90细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 5％ 80％ | 5％ 6％ | 5％ 6％ |
| 293细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 15％ 95％ | 15％ 93％ | 15％ 95％ |
Claims (5)
1、一种重组腺病毒构建体，其特征在于该重组腺病毒构建体缺失了人类5型腺病毒E1A蛋白的全部编码区，其序列位于382-1630nt，E1A蛋白编码功能丧失，除此之外，包含人类5型腺病毒的全部基因组序列。
2、构建权利要求1的重组腺病毒构建体的方法，其特征在于用定点突变、PCR扩增、酶切、连接等技术，缺失包含腺病毒-21nt至-5790nt序列的pCX1质粒中E1A的编码区382nt-1630nt组成新的载体pCX1-E1A，该载体包含病毒包装信号-194至-358nt，与除缺失病毒包装信号外，包含腺病毒全部基因组的载体pBHGE3共转染293细胞，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体AD5/dE1A，及扩增、纯化重组腺病毒构建体AD5/dE1A。
3、权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
4、权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备肿瘤诊断的试剂中的应用。
5、权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备基因治疗载体中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB011446285A CN1169949C (zh) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | 一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB011446285A CN1169949C (zh) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | 一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1427075A CN1427075A (zh) | 2003-07-02 |
| CN1169949C true CN1169949C (zh) | 2004-10-06 |
Family
ID=4677721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB011446285A Expired - Lifetime CN1169949C (zh) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | 一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1169949C (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102220292B (zh) * | 2010-04-15 | 2014-08-27 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | 重组ii型单纯疱疹病毒、其制备方法及应用和肿瘤诊断试剂盒 |
-
2001
- 2001-12-21 CN CNB011446285A patent/CN1169949C/zh not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1427075A (zh) | 2003-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2019528691A (ja) | ゲノム編集エンハンサー | |
| CN100390292C (zh) | 甲胎蛋白表达细胞的腺病毒载体及其使用方法 | |
| US5677178A (en) | Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia | |
| CN104263703B (zh) | 用于治疗癌症的嵌合腺病毒 | |
| US8273344B2 (en) | Recombinant adeno-associated virus expressing human antisense gene CyP2J2 and its preparation methods | |
| DE69726759T2 (de) | Cytopatische viren zur therapie und prophylaxe der neoplasie | |
| CN102548584A (zh) | 用于治疗癌症的溶瘤腺病毒 | |
| CN107208093A (zh) | 用于治疗血红蛋白病的球蛋白基因治疗 | |
| CA3076285A1 (en) | Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells | |
| HUE026386T2 (en) | Tumor-selective adenovirus E1A and E1B mutants | |
| JP2008283982A (ja) | 混在した細胞性組成物からの新生物細胞のウイルスクリアランス | |
| EP1326839A2 (en) | Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells | |
| Brücher et al. | iMATCH: an integrated modular assembly system for therapeutic combination high-capacity adenovirus gene therapy | |
| AU2003281310B2 (en) | Tumor-lysing virus growing selectively in tumor cells | |
| CN101921769A (zh) | 一种重组腺病毒及其制备方法和应用 | |
| CN114317606B (zh) | 靶向人nk细胞的腺病毒载体及其应用 | |
| DE602004011487T2 (de) | Modifizierter tert-promotor mit verbesserter tumorspezifität und stärke sowie diesen enthaltender rekombinanter vektor | |
| CN1169949C (zh) | 一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途 | |
| CN1184310C (zh) | 一种联合缺失19Kda、55KDA E1B编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途 | |
| CN1328372C (zh) | 肿瘤靶向基因－病毒zd55－il－24及其构建方法和应用 | |
| CN102399777B (zh) | 一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒 | |
| Sunila | OF SARCOMA IN THE SOFTSHELL, Mya arenaria | |
| CN1053700C (zh) | 家蚕基因工程生产重组人巨噬细胞集落刺激因子 | |
| TWI320056B (en) | Virus clearance of neoplastic cells from mixed cellular compositions | |
| CN1379109A (zh) | 特异杀伤原发肝癌细胞的腺病毒载体及使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHENZHEN TIANDAKANG GENE ENGINEERING CO., LTD Free format text: FORMER OWNER: ZHOU JIANFENG Effective date: 20030604 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20030604 Applicant after: Shenzhen Tiandakang Genetic Engineering Co.,Ltd. Applicant before: Zhou Jianfeng |
|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20041006 |
|
| CX01 | Expiry of patent term | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Shenzhen Tiandakang Genetic Engineering Co.,Ltd. Document name: Notice of expiration and termination of patent right |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |