CN1184310C - 一种联合缺失19Kda、55KDA E1B编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5)的基因组中定点缺失(delete)19kDa E1B、55kDa E1B编码序列的构建方案，以及获得的重组腺病毒构建体在肿瘤治疗、诊断中的具体用途。用PCR扩增、酶切、连接、亚克隆、转染、重组腺病毒单克隆纯化等技术，缺失19kDa E1B的编码区(1713-2243nt)和E1B55kDa(2018-3328nt)序列，筛选出不能表达19kDa E1B与E1B 55kDa功能蛋白的重组腺病毒构建体。该构建体能选择性地在携带p53基因突变表型的肿瘤细胞内复制增殖，从而特异性裂解杀灭肿瘤细胞，但对正常细胞却无毒性效应。该重组腺病毒构建体在用于肿瘤治疗药物、诊断试剂的制备中具有良好的实用价值，同时也是一种良好的基因治疗载体。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种在人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5)的基因组中定点缺失(delete)19kDa E1B、55kDa E1B编码序列的构建方案，以及通过该方案得到的具有肿瘤治疗、诊断作用的腺病毒构建体，属于医学基因工程技术领域。
二、背景技术
恶性肿瘤的死亡率在国内已经成为仅次于心脑血管疾病的第二位致死病因，全社会对恶性肿瘤诊断和治疗的需求极大。目前在临床治疗中占主导地位的肿瘤化疗、放疗、手术治疗，经过多年的发展和完善，已经形成了比较成熟的治疗体系，取得了较好的临床疗效。然而，这些经典治疗方法，建立和成熟于对肿瘤细胞生物学深刻认识之前，其作用靶点无选择性，难以避免毒副作用强以及宿主与肿瘤之间治疗窗小的缺点，要进一步提高疗效乃至达到治愈的目的，其发展潜力有限，因此，亟待研究并开发出新的更高效的治疗方法。
近年肿瘤细胞生物学、基因工程技术的快速发展，已经为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中基因治疗方法在肿瘤治疗的临床试用中，已经显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底，美国生物制品评价和研究中心(Center for Biologics Evaluationsand Research，CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项，其中约有70％的项目为肿瘤基因治疗，部分已经进入III期临床试验，取得较好疗效，如以单纯疱疹病毒胸苷酸激酶(HSV-TK)基因及胞苷脱氧酶(CD)基因为代表的“自杀”基因治疗，部分临床试验结果令人振奋。
目前肿瘤基因治疗临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒，进入肿瘤病灶后，对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗腺病毒的输入，距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。在第21届美国肿瘤研究年会上，来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明：局部注射后，复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限，在一定程度上影响了疗效的发挥，与此形成鲜明的对比，能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015，通过在肿瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年来研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒，其构建特点是在野生型人类5型腺病毒(wild-type)的基因组上，部分缺失(delete)E1B 55kDa的编码序列，并加入翻译终止信号，但保留19kDa E1B的编码序列。在正常情况下，野生型腺病毒在细胞内的复制增殖依赖于E1B 55kDa蛋白对p53蛋白功能的灭活。在携带正常p53基因的正常细胞，ONYX-015由于缺乏E1B 55kDa，不能在细胞内复制增殖。相反，由于恶性肿瘤患者p53基因的失活率高达50-70％，ONYX-015因而能在肿瘤细胞中增殖复制最终裂解细胞，因而ONYX-015具有杀灭肿瘤细胞的高度选择性，而对正常细胞无杀伤效应。
ONYX-015在1996年进入临床试验以来，已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效，国际著名的医学期刊《The Lancet》在以“基因治疗的新希望”为题的述评中，高度评价了ONYX-015的临床应用前景，国际最著名的医学期刊如《Science》《Nature Medicine》发表了临床试验结果及评论性文章。目前，美国辉瑞(pfzer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买了专利，并已对多种肿瘤进行临床期试验，其中，对复发性、难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验，已取得非常满意的疗效，对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中，同时，ONYX已经获得了以ONYX-015为载体的一些相关的基因治疗重组腺病毒载体(如插入治疗基因TK，CD)的专利，正从临床期试验向临床期试验过渡。可以预见，ONYX-015及其相关的基因治疗产品在不久的将来，在美国将正式进入临床应用，在癌症基因治疗的临床开发产品中显示出非常良好的临床应用前景。国内已有两例与ONYX-015类似原理的专利申请，其中专利申请99124030.8(一种缺陷型病毒及其构建方法)通过缺失E1B 55kDa位于2809-3329bp编码序列，并在缺失部位插入终止码的方法得到E1B 55kDa部分缺失的构建体。专利申请98113494.7(缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用)部分缺失E1B55kDa编码序列，并在该缺失部位插入标志基因LacZ，得到E1B 55kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体，该构建体的另一特点是有E3区的缺失。
现有的国内外发明均有一个共同的特点，即用不同方法缺失(delete)E1B 55kDa的编码序列的同时，仍保留了19kDa E1B完整的编码序列，重组腺病毒构建体均能产生有功能的19kDa E1B蛋白。19kDa E1B的编码区(1713-2243nt)与E1B 55kDa(2018-3508nt)的编码区有部分重叠。19kDa E1B蛋白相当于人类抗细胞凋亡基因bcl-2，具有显著的抗细胞凋亡效应，阻碍了杀灭肿瘤细胞的最大治疗效应的发挥，成为现有方法的不足之处。
三、发明内容：
为克服以上技术的不足之处，本发明解决的关键问题在于构建不能表达19kDa E1B与E1B 55kDa功能蛋白的重组腺病毒构建体，这种构建体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，同时没有抗细胞凋亡效应，以获取一种能裂解杀灭肿瘤细胞、同时具有诊断p53基因突变的重组腺病毒构建体。
为实现以上目的，采用的技术方案是：pCX1质粒载体包含腺病毒-21nt至-5790nt序列。用PCR扩增、酶切、连接等技术，缺失pCX1质粒中19kDa E1B的编码区(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3328nt)片段，组成新的载体pCX1-E1B，该载体包含病毒包装信号(packaging signal，194-358)，与包含腺病毒全部基因组的载体(缺失病毒包装信号)pBHGE3共转染293细胞，筛选出不能表达19kDa E1B与E1B 55kDa功能蛋白的重组腺病毒构建体ADV/dE1B。
与现有的重组腺病毒构建体相比，采用本发明达到了以下效果：
(1)该重组腺病毒构建体缺失了19kDa E1B的全部编码区(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3328nt)编码序列，由于缺失了55kDaE1B编码序列5′-侧翼非翻译区的启动子序列和翻译起始点ATGE1B蛋白编码功能完全丧失。
(2)对携带正常或异常p53基因表型的肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞无杀伤效应，而对携带异常p53基因表型肿瘤细胞具有非常显著的杀灭作用，对携带正常p53基因表型肿瘤细胞杀灭作用不明显，当与顺铂等一线化疗药物联用时，增效作用极其显著。
(3)对正常细胞、肿瘤细胞携带正常或异常p53基因表型的肿瘤细胞系体外实验结果表明，该重组病毒构建体对正常细胞、携带正常p53基因表型的肿瘤细胞系活性无明显影响，而携带异常p53基因表型肿瘤细胞转染腺病毒后96小时内开始出现部分细胞裂解死亡，因此该重组腺病毒构建体有较可靠的诊断携带异常p53基因表型的肿瘤的价值。
(4)本发明所用的技术方法和流程构建的重组腺病毒构建体，是一种新型的基因治疗重组腺病毒载体。
四、附图说明：
附图1为质粒pCX1的结构示意图。该载体全长9905bp，包含腺腺病毒-21nt至-5790nt序列。
附图2构建缺失19Kda E1B，55Kda E1B蛋白编码序列(1711-3081nt)的穿梭载体pCX1-E1B(8.6kb)。
附图3.pBHGE3的结构示意图，该质粒包含人类5型腺腺病毒除包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，全长37436bp。
附图4.缺失1711-3081nt E1B蛋白编码序列的重组腺病毒载体ADV/dE1B的构建。
五、具体实施方式：
实施例(技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司)例1：缺失19kDa E1B的全部编码区(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3328nt)编码序列
pCX1购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号：PD-01-03)，该质粒包含人类5型腺腺病毒21-5790nt序列，含19kDa E1B的编码区(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3328nt)片段及病毒包装信号(packaging signal，194-358nt，)其质粒结构图见附图1。将该载体用Xba I酶切，得到的7.9kb的片段，常规电泳分离纯化后用于连接反应。
PCR反应引物为：
引物1＝5′-CCG C
TC TAG AGA GAA TGC AAT AGT AGT AC-3′(1338-1364nt，下标横线为XbaI酶切位点)；
引物2＝5′-CTC C
AG ATC TTC ATG GTC ATG TCA AAC AC-3′(3332-3307nt，下标横线为XbaI/Bgl II酶切位点)；
引物3＝5′-GGG
AAT TCG AGG TCA GAT GTA ACC AAG AT-3′(1671nt-1651nt，下标横线为EcoRI酶切位点)；
引物4＝5′-GGG AAT TCG CCT CTC AGA TGC TGA CCTGCTCG-3′(3081nt-3100nt，下标横线为EcoRI酶切位点)；
以pCX1为模板，用引物1及引物3或引物2及引物4进行PCR反应。
反应体系总体为50μl，包括：5×PCR缓冲液10μl；50mM MgCl22μl；10mM dNTP 1μl；10μM引物1或3 1μl；10μM引物2或4 1μl；pCX1 10ng；Taq 2.5u；加水至50μl。
反应条件为：95℃ 30秒；94℃ 30秒、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟共25次循环；72℃延伸7分钟。
用引物1及引物3得到PCR片段1，用引物2及引物4得到PCR片段2，PCR片段1或2分别用Xba I和EcoR I双酶切，常规电泳分离纯化后用于连接反应(附图2)。用DNA T4连接酶连接7.9kb的pCX1、片段1、片段2。转入DH5a感受态细菌，用Xba I酶切鉴定筛选阳性克隆，得到包含缺失19kDa E1B的全部编码区(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3083nt)编码序列的质粒pCX1-E1B(附图2)。
例2：缺失19kDa E1B的全部编码(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3328nt)编码序列重组腺病毒构建体的构建。
pBHGE3购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号：PD-01-12)，该质粒包含人类5型腺病毒除包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，其结构见附图3。293细胞系是经剪切的人类5型腺病毒(AdV5)DNA转化人胚胎肾细胞，获取永久传代细胞系，购自ATCC(American typical culturecollection，ATCC，USA，目录号：ATCC CRL-1573，1972年公开)。获取时，细胞传代次数为32代。293细胞为贴壁细胞，低三倍体，其中30％细胞有64条染色体，4.2％细胞有更高倍体。将pBHGE3和pCX1-E1B共转染293细胞，在细胞内发生同源重组，当包含人类5型腺病毒包装信号的pCX1-E1B置换整合入pBHGE3时，即产生在293细胞内有增殖能力的重组腺病毒构建体，该构建体缺失19kDa E1B的全部编码区(1713-2243nt)和E1B 55kDa(2018-3328nt)编码序列，得到重组ADV5腺病毒构建体，称为ADV/dE1B(附图4)。腺病毒经过复制，包装产生腺病毒颗粒。通过挑取噬菌斑(plaques)，获取多个单克隆的重组腺病毒构建体，经过PCR扩增，结合DNA测序，得到重组腺病毒构建体阳性克隆，经过常规的腺病毒扩增、纯化，得到高浓度的重组ADV5腺病毒构建体ADV/dE1B。
例3：重组腺病毒构建体选择性杀灭肿瘤细胞的体内外实验。
选取以下细胞系作为实验对象：
U-2OS(ATCC，HTB96)P53+，RB-人成骨细胞瘤细胞系；
HS700T(ATCC，HTB147)P53-，RB-，人转移性腺瘤细胞系；
DLD-1(ATCC，CCL221)P53-，RB-，人结肠癌细胞系；
IMR90(ATCC，CCL186)P653+，RB+，人肺成纤维细胞系；
293(ATCC，CRL1573)P53+，RB+，人胚肾细胞系，为腺病毒的转代细胞。
细胞在10％ FBS DMEM、37℃、5％ CO2条件下培养于6孔板，每孔5×105细胞。
用于实验的腺病毒：野生型人腺病毒5；重组ADV/dE1B腺病毒；重组E1、E3缺失重组腺病毒作为对照。
用于腺病毒转染的腺病毒感染指数(MOI)为10，将腺病毒悬浮于1ml PBS中，在10％ FBS DMEM，37℃，CO2条件下转染1小时，转染后，将细胞置于标准培养条件下培养。分别在4，8，12天用0.5％的龙胆紫/20％甲醇溶液染色，死细胞悬浮被冲出培养皿，活细胞染色保留在培养皿中。
实验结果表明，阳性对照腺病毒野生型人腺腺病毒5无选择性地裂解肿瘤细胞；复制缺陷型腺病毒(重组E1、E3缺失重组腺病毒，中国专利号98124960.4)只裂解腺病毒生产293细胞系。重组E1B全缺失腺病毒载体选择性地裂解p53-细胞系HS700T和DLD-1，对正常对照细胞系IMR90，及p53+细胞系U-2OS无杀伤作用。因此，重组E1B全缺失腺病毒载体具有选择性杀灭p53-肿瘤细胞的作用，其效应见下表：
| 野生型人腺病毒5 | 重组E1B全缺失腺病毒 | 重组E1、E3缺失腺病毒 | |
| U-2OS细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 1％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 2％ | 2％ |
| 第十二天 | 4％ | 4％ | |
| HS700T细胞杀伤率 |
| 第四天 | 70％ | 10％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 25％ | 2％ |
| 第十二天 | 90％ | 3％ | |
| DLD-1细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 10％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 25％ | 2％ |
| 第十二天 | 90％ | 4％ | |
| IMR90细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 1％ | 1％ |
| 第八天 | 100％ | 2％ | 2％ |
| 第十二天 | 3％ | 1％ | |
| 293细胞杀伤率 | |||
| 第四天 | 50％ | 50％ | 50％ |
| 第八天 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 第十二天 |
进一步用化疗药物顺铂联用以上腺病毒的实验结果表明，重组E1B全缺失腺病毒载体选择性地显著增强p53-细胞系HS700T和DLD-1对顺铂的敏感性，而对正常对照细胞系IMR90，及p53+细胞系U-2OS无明显的增效作用。因此，重组E1B全缺失腺病毒载体具有选择性增强顺铂杀灭p53-肿瘤细胞的作用，其作用见下表：
| 野生型人腺病毒5- + | 重组E1B全缺失腺病毒- + | 重组E1、E3缺失腺病毒- + | |
| U-2OS细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 25％ 90％ | 25％ 30％ | 25％ 30％ |
| HS700T细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 15％ 95％ | 15％ 95％ | 15％ 25％ |
| DLD-1细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 18％ 92％ | 18％ 96％ | 18％ 25％ |
| IMR90细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 5％ 80％ | 5％ 8％ | 5％ 6％ |
| 293细胞杀伤率 | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) | 顺铂(0.2μg/ml) |
| 第四天 | 15％ 95％ | 15％ 93％ | 15％ 95％ |
Claims (5)
1、一种重组人类5型腺病毒构建体，其特征在于该重组病毒构建体缺失了E1B蛋白的编码区1713nt-3328nt，19kDa、55kDa E1B蛋白编码功能丧失，除此之外，包含人类5型腺病毒全部基因组序列。
2、构建权利要求1的重组人类5型腺病毒构建体的方法，其特征在于用PCR扩增、酶切、连接等技术，缺失包含腺病毒-21nt至-5790nt序列的pCX1质粒中E1B的编码区1713nt-3328nt，组成新的载体pCX1-E1B，该载体包含病毒包装信号-194至-358nt，与除缺失病毒包装信号外，包含腺病毒全部基因组的载体pBHGE3共转染293细胞，筛选出不能表达E1B功能蛋白的重组腺病毒构建体ADV/dE1B，及扩增、纯化重组病毒构建体ADV/dE1B。
3、权利要求1所述的重组人类5型腺病毒构建体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
4、权利要求1所述的重组人类5型腺病毒构建体在制备肿瘤诊断的试剂中的应用。
5、权利要求1所述的重组人类5型腺病毒构建体在制备基因治疗载体中的用途。
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