DE2221924C3 - Verfahren zur Bestimmung der Aufnahme von Schilddrüsenhormon - Google Patents

Description

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war, daß klinisch reproduzierbare Resultate nur auf liehen Aufnahme ändert sich die Steigung einer Auf-

diese Weise erhalten werden konnten. Ferner war nach nahmekurve, die man zeichnen kann, so rasch, daß

Einstellung des Gleichgewichts eine Trennung des eine annehmbare Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

Absorptionsmittels von der flüssigen Phase notwendig, nicht erwartet werden kann. Dennoch wurde gefunden,

um die prozentuale Aufnahme durch das Absorptions- S daß das vorliegende Verfahren Resultate ergibt, die

mittel zu bestimmen. Es mußte während der Misch- vergleichbar oder besser als die nach den ansatzweise

periode zwischen den Testproben und den Kontroll- arbeitenden Verfahren erhaltenen sind. Zum Beispiel

proben Übereinstimmung erzielt werden, um brauch- wurden 17 Anteile der gleichen Serumprobe nach dem

bare Ergebnisse zu erhalten. vorliegenden Verfahren durch eine Kolonne geleitet,

Ein Kolonnenverfahren der eingangs genannten Art, io wobei der Fehler bei 2,5% lag. Dieser Fehler ist

bei dem die flüssige Serumprobe und das kompetitiv geringer als bei den meisten bekannten Verfahren und

bindende IonenaustauEcherharz nur vernältnismäßig durchaus annehmbar für klinisch-diagnostische Zwek-

kurze Zeit miteinander in Berührung stehen, ist aus ke. Außerdem wurde das vorliegende Verfahren mit

der US-Patentschrift 34 51 777 bekannt. Hierbei muß dem bekannten Verfahren verglichen, bei dem Ansätze

zunächst eine mit dem Harz in Berührung stehende 15 ins Gleichgewicht gebracht wurden, wobei eine gerad-

Pufferlösung von der Probenlösung verarängt werden, linige Korrelation zwischen den beiden Verfahren fest-

was innerhalb eines gemessenen Zeitraums geschehen gestellt wurde. In nur 2% der getesteten Fälle erhielt

soll, worauf der Auslauf der Kolonne zur Zählung man nach dem vorliegenden Verfahren ein Ergebnis,

der Radioaktivität über ein bestimmtes Intervall ver- das sich von dem bekannten, ansatzweise arbeitenden

schlossen werden muß. Während dieser Zeitintervalle 20 Verfahren unterschied.

bleibt die Probenlösung stationär in der Kolonne, Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver-

wobei infolge des Harzüberschusses eine weitgehende fahrens liegt, abgesehen von seiner Einfachheit und

Gleichgewichtseinstellung erfolgen dürfte. Wenn dies der Zeitersparnis, darin, daß es eine Messung erlaubt,

nicht der Fall ist, so müssen sowohl die beiden ge- die mit der Dissoziationsgeschwindigkeit des T-3 von

nannten Zeitintervalle als auch das Zeitintervall bis zur 25 seinen Proteinbindestellen in Beziehung steht. Bei dem

Verdrängung der Pufferlösung sowie das Zeitintervall bekannten Verfahren wurden die Bedingungen darauf-

für die nachfolgende Waschung genau bestimmt wer- hin abgestellt, daß ein Gleichgewichtszustand oder

den. Durch die große Anzahl von Zeitmessungen wird annäherndes Gleichgewicht erhalten wurde. Diese Er-

das Verfahren kompliziert und durch Fehlerquellen, gebnisse sagen nur etwas über die Bindungsfähigkeit

die durch die den Test durchführende Person bedingt 30 der Bindestellen unter Gleichgewichtsbedingungen aus.

sind, beeinträchtigt. Insbesondere kann eine Person Bei Anwendung des vorliegenden Verfahrens auf die

keine Reihentests durchführen. T-3-Aufnahme beziehen sich die Ergebnisse in erster

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Linie auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt

schnelles, einfaches und reproduzierbares Verfahren der Dissoziation des T-3 von den bindenden Proteinen,

zur Bestimmung der Aufnahme von Schilddrüsen- 35 Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-

hormon durch ein kompetitiv bindendes Ionenaustau- fahrens kann jedes beliebige lonenaustauscherharz

scherhirz aus einer flüssigen Probe, die Schilddrüsen- verwendet werden, das unter den Bedingungen des

hormon enthält, das durch Schilddrüsenhormon bin- Tests etwa 10 bis 90 Gewichtsprozent des Schild-

dende Proteine gebunden ist, zu schaffen. drüsenhormons in der Testprobe absorbiert. Vorzugs-

Die Lösung dieser Aufgabe besteht ausgehend von 40 weise werden das Ionenaustauscherharz und die an-

einem Verfahren der eingangs genannten Art darin, deren Testbedingungen so ausgewählt, daß von einer

daß man die verdünnte flüssige Probe, deren Volumen Serumprobe eines euthyroiden Patienten etwa 40 bis

größer ist als das Volumen des Ionenaustauscher- 60 Gewichtsprozent des Schilddrüsenhormons ab-

harzes, in einem einzigen Durchgang in nicht mehr als sorbiert werden. Eine bevorzugte Klasse von erfin-

5 Minuten durch das lonenaustauscherharz, das wäh- 45 dungsgemäß verwendbaren Ioaenaustauscherharzen

rend des Durchganges, ohne daß sich ein Gleich- sind stark basische Anionenaustauscherharze, die bei

gewicht zwischen der flüssigen Probe und dem Ionen- Verwendung von radioaktiv markiertem Schilddrüsen-

austauscherharz einstellt, 10 bis 90% des in der Probe hormon radioaktive Abbauprodukte entfernen, die

enthaltenen gebundenen Schilddrüsenhormons korn- sonst die Testresultate beeinträchtigen könnten,

petitiv bindet und zurückhält, hindurchfließen läßt. 50 Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Ver-

Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert als fahrens wird eine bestimmte Menge an radioaktiv

Kontaktzeit zwischen der Probe und Austauscherharz markiertem T-3 oder T-4 in die Serumprobe einge-

vorzugsweise nicht mehr als etwa 3 Minuten. Danach bracht. Nachdem das Gleichgewicht hergestellt ist,

wird die flüssige Phase direkt als Kolonnenausfluß, wird die Probe durch die Kolonne geleitet, und die

getrennt von dem in fester Phase vorliegenden Ionen- 55 Menge an radioaktiv markiertem T-3 oder T-4 wird

austauscherharz, erhalten. Obwohl die V';rweilzeit vorzugsweise im Ausfluß in üblicher Weise gemessen,

relativ kurz ist, werden vergleichbare oder bessere Aus den Werten, die man für die Aufnahme von

Resultate als bei den bekannten Verfahren erzielt. Bei radioaktiv markiertem Hormon erhält, kann die

dem vorliegenden Verfahren, gibt es keinen Gleich- Schilddrüsenfunktion unter Bezugnahme auf Werte

gewichtszustand zwischen lonenaustauscherharz und 60 von bekannten Seren, die unter vergleichbaren Bedin-

Lösung. Statt dessen herrscht während des Durch- gungen behandelt wurden, bestimmt werden,

leitens der Lösung durch das Harz in der Kolonne ein Damit das lonenaustauscherharz eine Retention

ständig wechselndes Verhältnis zwischen Harz und von 10 bis 90 Gewichtsprozent des Hormons in der

Lösung. In gewissem Sinne entstehen die Ergebnisse Probe erreicht, ist eine Anzahl von Variablen zu

des vorliegenden Verfahrens aus einer Reihe von 65 berücksichtigen, z. B. der VerneUungsgrad, das Vo-

anfänglichen Aufnahmen von Schilddrüsenhormon lumen und die Teilchengröße des Harzes sowie die

durch aufeinanderfolgende Mangen an Harz, während Dimensionen der Kolonne, vor allem der Dürch-

die Lösung durch die Kolonne fließt. Bei jeder anfäng- messer. Wie das folgende Beispiel zeigt, erhält man

die gewünschte Retention des Schilddrüsenhormons innerhalb einer Verweilzeit von nicht mehr als etwa 3 Minuten mit 1,2 ml (Teilchenvolumen) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, das zu 8 Gewichtsprozent vernetzt ist und ein; Teilcher größe von 0,075 bis 0,15 mm hat, wobei eine Kolonne mit einem Durchmesser von etwa 0,75 cm verwendet wird. Vorzugsweise enthält die zu testende flüssige Probe bis zu 1 ml, vorzugsweise etwa 0,5 ml Bljtseruu. Zur Verdünnung der Probe wird zweckmäßig in an sich bekannter Weise eine Pufferlösung, die vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 5 hat, verwendet. Das nachstehende Beispiel veranschaulicht die ausgezeichneten Ergebnisse des Verfahrens gemäß der Erfindung.

Beispiel

0,5 ml des Patientenserums werden mit 2,5 ml 0,4normalem Natriumacetatpuffer, der Spurenmengen von radioaktiv markiertem Trijodthyronin enthält, bei einem pH-Wert von 5 gemischt. Diese Mischung läßt man 20 Minuten stehtn, um eine statistische Verteilung des radioaktiven T-3 zwischen dem Serum und der Lösung zu gewährleisten. Diese Mischung wird dann durch eine Kolonne mit 1,2 ml eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Chloridform mit 8 % Vernetzung und einer Teilchengröße von etwa 0,075 bis 0,15 mm geleitet. Der Innendurchmesser der Kolonne beträgt etwa 0,75 cm. Der Ausfluß aus der Kolonne wird in einem Zählrohr gesammelt und die

ίο Radioaktivität des Röhreninhalts gemessen. Durch Vergleich mit einer Kontrollsubstanz, wie z. B. normales Sammelserum oder im Handel erhältliches Kontrollserum von bekanntem Wert, kann der Anteil der unbesetzten serumproteinbindenden Stellen bestimmt werden.

Die erste Zeile in der nachstehenden Tabelle zeigt die Ergebnisse, die mit den im vorstehenden Absatz beschriebenen Substanzen erhalten wurden. Die in Zeilen 2 bis 5 der Tabelle angegebenen Werte wurden nach demselben Verfahren, jedoch mit anderen ionenaustauscherharzen und Volumen ermittelt.

Einfluß verschiedener Harzarten

Ionenaustauscherharz

Harzvolumcn Fließgeschwindigkeit Normales Anormales TBl'

Kontrollserum Kontrollserum
Eluierungsgrad Eluierungsgrad

Stark basisch, zu 8 % vernetzt (0,075 bis 0,15 mm)	1,2 ml	1,0 ml /mi n	43,4	30,0	0,69
Stark basisch, zu 4% vernetzt (0,075 bis 0,15 mm)	1,2 ml	1,0 ml/min	34,5	23,5	0,68
Stark basisch, zu 2% vernetzt (0,075 bis 0,15 mm)	1,2 ml	1,0 ml/min	36,0	24,4	0,68
Stark sauer, zu 8 % vernetzt (0,075 bis 0,15 mm)	2,0 ml	—	40,0	23,4	0,59
Stark sauer, zu 2 % vernetzt (0,075 bis 0,15 mm)	2,0 ml	—	36,7	24,4	0,67

* TBI = Thyroidbindungsindex.

Nach dem bekannten ansatzweise arbeitenden Verfahren wurde der TBI-Wert für anormales Serum aus Tabellenwerten zu 0,68 errechnet.

Claims (9)

durch ein kompetitiv bindendes Ionenaustauschcrhaii Patentansnrüche- gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1. Patentansprüche. s _ ^ u_t—tWeR Thyroxin (T_4) und Tryod.

1. Verfahren zur Bestimmung der Aufnahme von thyronin (T-3) im Plasma A^™™*" ^ßin" Schilddrüsenhormon durch ein kompetifiv bin- 5 düngen an spezifische ^P"^.«!^~ ^sul.^d· dendes Ionenaustauscherharz aus einer flüssigen die man unter dem Sammelbegriff. Jjyroxmbmdcmie Probe, die Schilddrüsenhormon enthält, das durch Proteine zusammenfaßL ^ Satügungsgrad der Schilddrüsenhormon bindende Proteine gebunden Serumproteine an Schilddrüsenhormon wechselt je ist, wobei die flüssige Probe, die bei Verwendung nach dem Zustand der Schüddrusenfunküon Be. von radioaktiv markiertem Schilddrüsenhormon io Hyperthyreose sind die Serumproteine η größerem als Nachweissubstanz mit diesem ins Gleich- Ausmaß an Schilddrusenhormonen gesattigt, weshalb gewicht gebracht worden ist, durch eine Kolonne die Anzahl der verfugbaren BindesteUen in den Serummit dem Ionenaustauscherharz geleitet wird und proteinen (ungesättigte Schilddrusenhormon-Bmwobei die Menge des in der Kolonne zurück- dungsfähigkeit) vermindert ist. Bei Hypothyreose ist gehaltenen Schilddrüsenhormons im Verhältnis zur »5 das Gegenteil der Fall. Da Thyroxin starker als Tnjod-Menge im Ausfluß gemessen und die Aufnahme tbyronin an die Serumproteine gebunden ist, hangt des Schilddrüsenhormons aus der Prob: durch die Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen an den Vergleich mit einer Kontrollprobe bestimmt wird, Serumproteinen hauptsächlich von der Konzentration dadurch gekennzeichnet, daß man von Thyroxin im Plasma ab. „„„-,
«lie verdünnte flüssige Probe, deren Volumen grö- »° H a m ο 1 s k ι et al., J. Clin Endocr., 17, 33 (1957), ßer ist als das Volumen des Ionenaustauscher- beschreiben die Aufnahme von mit J-131 markiertem harzes, in einem einzigen Durchgang in nicht mehr Trijodthyronin durch rote Blutkörperchen im ganzen »ls 5 Minuten durch das Ionenaustauscherharz, das Blut als Methode zur Bestimmung der Sauigung während des Durchganges, ohne daß sich ein schilddrüsenbindender Proteine Sie fanden daß nach Gleichgewicht zwischen der flüssigen Probe und *5 Inkubation von mit J-131 markiertem Trijodthyronin dem Ionenaustauscherharz einstellt, 10 bis 90% mit Plasma von Hyperthyreose-Patienten, die £rydes in der Probe enthaltenen gebundenen Schild- throcyten im Vergleich zu euthyroiden Patienten, eine drüsenhormons kompetitiv bindet und zurückhält, geringere Menge an absorbierter Radioaktivität aufhindurchfließen läßt. wiesen. Diese Methode hat sich als wertvoll fur die

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 30 Diagnose von Schilddrüsenkrankheiten, Abnormalizeichnet, daß man als radioaktiv markiertes Schild- täten bei Thyroxin transportierendem Protein und in drüsenhormon radioaktiv markiertes Tirijodthy- der Bewertung der Schilddrüsentherapie erwiesen. Da ronin oder Thyroxin verwendet. die Messungen unter Zuhilfenahme eines radioaktiv

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch markierten Hormons durchgeführt werden, sind Stögekennzeichnet, daß man die Probe mit einem 35 rungen durch serumoriinische Jodkontaminierung auf Puffer verdünnt. ein Minimum herabgesetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, Im allgemeinen werden diese T-3-Aufnahmetests dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaus- durch Herstellung eines Gleichgewichts zwischen tauscherharz ein stark basisches Anionenaustau- Spurenmengen, von radioaktiv markiertem T-3 mit scherharz verwendet. ♦<> einer Probe des Serums des Patienten durchgeführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- Diese Kombination wird dann mit einem zweiten zeichnet, daß man ein Ionenaustauscherharz mit Bindematerial, z. B. mit roten Blutkörperchen, ins einem Vernetzungsgrad von etwa 8 % verwendet. Gleichgewicht gebracht. Das zweite Absorptionsmittel

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, hat eine gewisse Affinität zu T-3, so daß etwas T-3 dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kolonne 45 durch dieses zweite Bindemittel absorbiert wird. Wenn mit Ionenaustauscherharz verwendet, das etwa das Absorptionsmittel eine bestimmte Affinität für 40 bis 60 Gewichtsprozent Schilddrüsenhormon T-3 hat, hängt die Verteilung des radioaktiven T-3 aus einer Serumprobe eines euthyroiden Patienten zwischen dem Absorptionsmittel und den Serumabsorbiert, proteinen von der Anzahl der vertügbaren Binde-

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn- 5° stellen in den Serumproteinen ab.

zeichnet, daß man ein lonenaustauscherharz mit Auf Grund der verschiedenen naturgegebenen einer Teilchengröße von etwa 0,075 bis 0,15 mm Schwierigkeiten bei der Verwendung von roten Blutin einem Bettvolumen von etwa 1,2 ml bei einem körperchen wurden auch schon andere Absorptions-Kolonnendurchmesser von etwa 0,75 cm verwen- mittel, z. B. Ionenaustauscherharze mit stark basischem det und daß man die Verweilzeit der Probe in der 55 Anion, die in einen Schwamm eingebettet oder als Kolonne auf nicht mehr als etwa 3 Minuten ein- Membran ausgebildet waren, oder Hämoglobin, das stellt. an Knochenkohle absorbiert war, verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn- Es ist ferner aus »Medizinische Klinik«, 58, 1963, zeichnet, daß man eine Probe mit bis zu etwa 1 ml S. 192 bis 196, bekannt, statt lonenaustauscherharzen Blutserum verwendet. 6o ein Dextrangel (Sephadex) als Absorptionsmittel zu

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn- verwenden und die mit radioaktivem T-3 markierte zeichnet, daß man eine Probe mit etwa 0,5 ml Serumprobe durch eine damit gefüllte Kolonne zu Blutserum verwendet. ieiten. Aus dem Flüssigkeitsvolumen und der Tropfgeschwindigkeit errechnet sich die Dauer eines Tests

6s zu etwa einer Stunde.

Bei allen diesen Verfahren wurde eine Gleich-

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur gewichtseinstellung zwischen der Serumprobe und dem

Bestimmung der Aufnahme von Schilddrüsenhormon Absorptionsmittel angestrebt, da man der Ansicht