DE2517219B2 - Verfahren zur gewinnung eines hypothyreoten kontrollserums, danach hergestelltes hypothreotes kontrollserum und verwendung desselben - Google Patents

Verfahren zur gewinnung eines hypothyreoten kontrollserums, danach hergestelltes hypothreotes kontrollserum und verwendung desselben

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DE2517219B2 DE19752517219 DE2517219A DE2517219B2 DE 2517219 B2 DE2517219 B2 DE 2517219B2 DE 19752517219 DE19752517219 DE 19752517219 DE 2517219 A DE2517219 A DE 2517219A DE 2517219 B2 DE2517219 B2 DE 2517219B2
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Description

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- stellen, die etwa 20 Mikrogramm T4 pro 100 ml Norzeichnet, daß man als Serum Tierblutserum ver- malserum äquivalent sind, sehr schnell durch eine gewendet, ringe Zunahme der T4-Konzentration gesättigt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 3° Bei Hyperthyroidismus sind die Bindungsstellen an zeichnet, daß man als Serum Humanblutserum den TBG-Molekülcn mit T3 und T4 nahezu gesättigt, verwendet. Bei Hypothyroidismus sind die Bindungsstellen hoch
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ungesättigt, d. h., es ist eine erhöhte Fähigkeit zur zeichnet, daß man als Serum Rinderblutserum ver- T3-Aufnähme durch das TBG-Molekül im Serum gewendet. 35 geben.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- Die Triosorb-Untersuchung und andere ähnliche zeichnet, daß das Serum T4-euthyreot, -hypothyreot Tests für die T3-Aufnahme arbeiten auf dem Prinzip oder -hyperthyreot und T3-euthyreot oder -hypo- konkurrierender Proteinbindung. Serum-T3 und -T4 thyreot ist. werden vornehmlich an die Bindungsstellen am TBG-
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn- 40 Molekül gebunden. Die Anzahl an nicht besetzten Binzeichnet, daß das Serum T3-hypothyreot ist. dungssteilen wird durch Zugabe von radioaktivem T3
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn- (T3*) zu Serum in Gegenwart eines Adsorptionsmittels zeichnet, daß das Serum T4-euthyreot und T3-euthy- bestimmt. Wenn Serum mit T3* versetzt wird, wird reot ist. jeder T3*-Überschuß, der nicht an die Bindungsstellen
9. Hypothyreotes Kontrollserum, hergestellt 45 des TBG-Moleküls im Serum gebunden ist, an das nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 zugesetzte Adsorptionsmittel adsorbiert. Für den bis 8. Triosorb-Test werden als Adsorptionsmittel Kunst-
10. Verwendung eines Kontrollserums gemäß harz- bzw. Kunststoffschwämme verwendet. Bei Hy-Anspruch 9 als einziges Vergleichskontrollserum perthyroidismus sind beispielsweise die meisten der bei klinisch-chemischen Verfahren zur Bestim- 5° TBG-Bindungsstellen von T3 und T1 besetzt, so daß mung der Serumtrijodthyroninaufnahmewerte und zugesetztes T3* von den endogenen TBG-Molekülen Thyroxinkonzentrationen von Patienten. nicht aufgenommen, sondern vielmehr an das Testadsorptionsmittel adsorbiert wird. Bei Hypothyroidismus liegen die umgekehrten Verhältnisse vor. So spie-
55 gelt die Menge an vom Adsorptionsmittel gebundenem
radioaktiven T3 direkt den Schilddrüsenstatus eines Patienten wieder.
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines hypo- Die Tetrasorb-Untersuchung auf T4 beruht eben-
thyreoten Kontrollserums unter Verwendung von falls auf dem Prinzip konkurrierender Proteinbindung. Normalserum und von Serum mit einem erhöhten 60 Zur Bestimmung der T4-Konzentration wird das T4 Gehalt an thyroxinbindendem Globulin. Das Kontroll- aus dem Serum extrahiert, wobei es von seinem Binserum ergibt bei klinischen Tests, bei denen die Trijod- dungsprotein TBG freigegeben wird. Der Serumthyroninaufnahme und die Thyroxinkonzentration be- extrakt wird dann zu einer Lösung mit einer begrenzten stimmt werden, Hypothyroidwerte. Menge von exogenem TBG, an das radioaktives T4
Zur Diagnose einer Schilddrüsenmißfunktion und 65 (T4*) gebunden ist, zugegeben. Hierbei findet eine zur Bewertung der Schilddrüsentherapie bedienen sich Austauschreaktion statt, wobei das T4 im Extrakt das die Kliniker Tests, mit deren Hilfe bei Patienten deren T4* aus dem exogenen TBG verdrängt. Das ver-Serumtrijodthyronin(T3)aufnahme ermittelt bzw. die drängte T4* wird dann an den als Adsorptionsmittel
verwendeten Kunststoff- bzw. Kunstharzschwamm adsorbiert. Je mehr T4 zugesetzt wird, desto mehr T4* wird aus dem TBG verdrängt. Die Menge an aus dem TBG verdrängten T4* ist folglich direkt proportional zur Menge an im Serumextrakt enthaltenen T4. Bei 5 Hyperthyroidismus steht im Serumextrakt zur Verdrängung von T4* aus exogenem TBG mehr T4 zur Verfugung als bei Euthyroidismus oder Hypothyroidismus.
Wenn im Serum normale Gehalte an TBG vornanden sind, spiegeln die geschilderten Arten von Schilddriisenfunktionstests den tatsächlichen Status des Patienten wieder. Wenn die TBG- und T4-Spiegel eihöht sind, wie dies bei einer Schwangerschaft oder im Anschluß an eine östrogenaufnahme in Form von oralen Kontrazeptiva der Fall ist, zeigen die T3-Aufnahmetests, daß bei dem Patienten eine Schilddrüsenuntertunktion vorliegen muß. Tests, bei denen das gesamte T4 bestimmt wird, weisen jedoch auf einen euthyreoten oder manchmal hyperthyreoten Zustand hin. Einfach ausgedrückt, führen eine Schwangerschaft oder eine Östrogeneinnahme zu einer Erhöhung der Anzahl an TBG-Molekülen und einer dadurch bedingten Zunahme an Hormonbindungsstellen mit gleichzeitigem Anstieg im Schilddrüsenhormonspiegel. Mit diesen Sera zu diesem Zeitpunkt durchgeführte Schilddrüsenfunktionstests zeigen eine erhöhte ^-Aufnahme, was auf eine hypothyreote Funktion hindeutet, und einen erhöhten T4-Spiegel, was auf eine hyperthyreote Funktion hinweist.
Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein aus diesen Arten von Sera und Normalserum zubereitetes Kontrollserum zu schaffen, das sich als Kontrollserum für Schilddrüsenunterfunktion sowohl bei T4-Tests als auch bei T3-Aufnahmetests eignet.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung eines hypothyreoten Kontrollserums, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) Blutserum mit neutraler entfärbender Kohle in einer Menge von etwa 5 bis 20 Gew.- %, bezogen auf das Serumvolumen, versetzt,
b) di: erhaltene Mischung 3 bis 30 h bei einer Temr ratur von etwa 4° C durchmischt, gegebenenfalls
c) die erhaltene Aufschlämmung zweimal bei einer Temperatur von etwa 4°C mit einer Zentrifugalkraft von 34 800 χ g zentrifugiert,
d) die hierbei gewonnene überstehende Flüssigkeit abfiltriert und
e) die abfiltrierte überstehende Flüssigkeit lyophilisiert.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein nach dem geschilderten Verfahren hergestelltes hypothyreotes Kontrollserum.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich noch die Verwendung dieses hypothyreoten Kontrollserums als einziges Vergleichskontrollserum bei klinisch-chemischen Verfahren zur Bestimmung der Serumtrijodthyroninaufnahmewerte und Thyroxinkonzentrationen von Patienten.
Unter Normalserum ist ein Serum mit normalen T3- und T4-Werten zu verstehen, wobei es sich um Human-, Rinder-, Schaf-, Ziegen- oder ein sonstiges Tierserum handeln kann. Lediglich Pferdeserum hat sich als unbrauchbar erwiesen.
Ein Serum ist nach den Tetrasorb- und Triosorb-Tests als hyperthyreot zu bezeichnen, wenn die prozentuale T3-Aufnahme größer als 35 und die T4-Konzentration pro 100 ml Serum größer als 14,5 meg ist. Ein Serum ist euthyreot, wenn die prozentuale ^-Aufnahme zwischen 25 und 35 liegt und die ^-Konzentration pro 100 ml Serum 5,3 bis 14,5 meg beträgt, hin hypothyreotes Serum besitzt eine T3-A ufnähme unter 25 % und enthält weniger als 5 mcg T4 pro 100 ml Serum.
Beim Entfernen von T3 und T4 aus Normalserum oder Serum mit erhöhtem TBG-Gehalt, beispielsweise nach den im folgenden geschilderten Verfahrensmaßnahmen, erhält man ein nach beiden Verfahren, nach denen die T4-Konzentration und die T3-Aufnahme bestimmt werden, als hypothyreot angesehenes Serum.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Beispiel 1
Bestandteile
Menge für 990 ml (420 Phiolen)
A. Frisches Normalserum 2700 ml
B. Handelsübliche Entfärbungskohle 480 g
(pharmazeutisch rein)
C. Gereinigtes Wasser 560 ml
Verfahren:
1. Der Bestandteil B wird in 2400 ml des in einem 4-1-Erlenmeyer-Kolben befindlichen BestandteilsA eingetragen (etwa 20% Kohlegewicht auf das Serumvolumen);
2. der Kolbeninhalt wird bei Raumtemperatur leicht gerührt, bis die Kohleteilchen in der Flüssigsigkeit dispergiert sind;
3. der Kolbeninhalt wird auf eine Temperatur von 4°C gebracht und dann bei dieser Temperatur etwa 24 h sehr schwach gerührt;
4. nach Beendigung des 24stündigen Rührens wird der Kolbeninhalt in einer gekühlten Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert
(34 800 xg);
5. die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert, worauf erneut in der bei Stufe 4 geschilderten Weise zentrifugiert wird;
6. nach dem zweifen Zentrifugieren wird tie überstehende Flüssigkeit erneut abriekantiert und durch ein Milliporfilter vakuumfiltriert;
7. das Filtrat (1200 ml) wird dann in ein zur Gefriertrocknung geeignetes Glasgefäß gegossen und lyophilisiert;
8. das lyophilisierte bzw. gefriergetrocknete Material wird dann in einen 2 1 fassenden Erlenmeyer-Kolben überführt und mit dem Bestandteil C versetzt;
9. der Kolbeninhalt wird 30 min lang stehen gelassen, worauf der Lösungsprozeß durch schwaches Durchwirbeln unterstützt wird;
10. das inVerfahrensstufe 9 erhaltene Serumgemisch wird dann mit 300 ml Bestandteil A versetzt;
11. jeweils 2,14 cm3 des in Verfahrensstufe 10 erhaltenen Gemischs werden in 2 ml fassende Phiolen gefüllt und darin gefriergetrocknet.
Die Phiolen werden mit 2,0 ml entionisiertem destillierten Wasser wieder aufbereitet. Dieses Serum wird zur hypothyreoten Kontrolle in Verbindung mit sämtlichen Schilddrüsenfunktionstests verwendet, d.h.
das erhaltene Kontrollserum sollte eine T3-Aufnahme von unter 25% bei der Triosorb-Methode und eine T4-Konzentration von weniger als 5,3 mcg/100 ml bei der Tetrasorb-Methode aufweisen.
Es sind selbstverständlich Modifizierungen des geschilderten Verfahrensablau/s möglich. So kann man auf ein Zentrifugieren (Verfahrensstufe 4 und 5) verzichten, das in Verfahrensstufe 6 verwendete Milliporfilter kann selbstverständlich aus einem Ertel-Apparat bestehen, das verwendete Serum kann Humanserum oder Tierserum sein. Das Erfordernis eines Einfüllens der Mischung in Phiolen (Verfahrensstufe 11) kann selbstverständlich modifiziert oder vollständig weggelassen werden. Die Mischdauer (Verfahrensstufe 3) kann innerhalb eines Bereichs von 3 bis 30 h verkürzt oder verlängert werden. Die prozentuale Menge an zugesetzter Kohle kann zweckmäßigerweise im Bereich von 5 bis 20, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 20%, gehalten werden.
Bei diesem Verfahren werden aus dem Ausgangs- ao serum über 99 % T3 und T4 entfernt, wobei man in der Tat ein T3- und T4-freies Serum erhält. Hierbei sind die Gesamtproteinkonzentration, der pH-Wert und die T4-Eiadefähigkeit des Serums nicht merklich beeinträchtigt.
Das folgende Beispiel erläutert das zur Entfernung von T3 und T4 aus einem Serum mit erhöhtem TBG-Spiegel angewandte Verfahren. Selbstverständlich kann auch dieses Verfahren in der bei Reispiel 1 geschilderten Weise modifiziert werden.
Beispiel 2
Bestandteile
Menge für 900 ml (420 Phiolen)
A. Serum mit einer hohen thyroxin- 1100 ml
bindenden Globulinkonzentration
B. Neutrale entfärbende Kohle 220 g
(pharmazeutisch rein)
C. Frisches normales Serum 300 ml
30
35
40
Verfahren:
1. Der Bestandteil B wird zu dem in einem 21 fassenden Erlenmeyer-Kolben befindlichen Be-
5.
standteil A zugesetzt (etwa 20% Kohlegewicht auf das Serumvolumen);
2. es wird 1 min schwach bei Raumtemperatur gerührt, so daß die Holzkohleteilchen in der Flüssigkeit dispergiert werden;
3. die Mischung^wird auf eine Temperatur von 40C gebracht undfttwa 24 h sehr schwach gerührt;
4. nach 24stündigem Rühren wird das Gemisch in einer gekühlten Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert (34 800 χ g );
die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und erneut wie in Verfahrensstufe 4 zentrifugiert ·
6. nach dem zweiten Zentrifugieren wird erneut die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und durch ein gesintertes Glasfilter vakuumfiltriert;
7. 600 ml des in Verfahrensstufe 6 erhaltenen Serums werden mit 300 ml des Bestandteils C versetzt, worauf die Mischung schwach gerührt wird;
8. jeweils 2,14 cm3 der in Verfahrensstufe 7 erhaltenen Mischung werden in 2 ml fassende Phiolen abgefüllt und lyophilisiert.
Die Phiolen werden mit 2,0 ml entionisiertem destillierten Wasser wieder aufbereitet. Das erhaltene Serum wurde als hypothyreotes Kontrollserum in Verbindung mit sämtlichen Schilddrüsenfunktionstests verwendet.
Die nach dem Wiederaufbereiten in den Phiolen enthaltene Lösung enthält etwa 7% Protein. Das fertiee Kontrollserum sollte eine T3-Aufnahme von weniaer als 25% nach der Triosorb-Methode und eine T4-Konzentration von weniger als 5,3 μg% nach der Tetrasorb-Methode aufweisen. Das im vorliegenden Beispiel verwendete Serum erhält man beispielsweise von schwangeren Frauen oder Frauen, die unter östrogentherapie stehen.
Es wurde eine Reihe von vier getrennten Versuchen durchgeführt, um den Effekt auf Sera nach einer Behandlung entsprechend den Beispielen 1 und 2 zu zeigen. Die erhaltenen Sera wurden nach den üblichen Triosorb- und Tetrasorb-Versuchsprotokollen untersucht. Die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß erfindungsgemäß behandeltes Serum als hypothyreotes Kontrollserum für in klinischen Laboratorien durchgeführte Untersuchungen verwendet werden kann.
Versuch
Nr.
Serum
o/ /a
Tj-Aut'nahme
Ti meg %
I Vereinigtes Normalhumanserum (NHS)
Vereinigtes Normalhumanserum nach einer Behandlung gemäß Beispiel 1 (HCS)*) .
II Gesammeltes Normalhumanserum (NHS)
Gesammeltes Normalhumanserum nach einer Behandlung gemäß Beispiel 1 (HCS)*)
2 HCS: INHS**)
III Gesammeltes Normalrinderserum (NBS)
Gesammeltes Normalrinderserum nach einer Behandlung gemäß Beispiel 1 (HBS)
2 HBS: INBS**)
IV Gesammeltes Serum von schwangeren Frauen Gesammeltes Serum von schwangeren Frauen nach einer Behandlung gemäß Beispiel 2
*) Hierbei handelt es sich um das nach Verfahrensstiife 9 von Beispiel 1 erhaltene Serum. ♦*) Hierbei handelt es sich um das nach Verfahrensstufe 10 von Beispiel 1 erhaltene Serum.
27,1
15,1		 7,4
0,8
31,9
18,3		 8,6
0,5
21,2
29,3
17,8		 3,3
11,4
0,4
19,3
17,6
13,6		 2,4
13,0
0,3
Die Ergebnisse von Versuch Nr. I zeigen, daß das gesammelte Normalserum bei beiden Tests euthyreot war. Nach einer Behandlung war das Serum hypothyreot, und zwar sowohl für die Tj-Aufnahme als auch bezüglich der Τ,-Konzentration.
Die Ergebnisse von Versuch Nr. II zeigen, daß die hypothyreoten Werte durch Vermischen von Serum vor der Behandlung und Serum nach der Behandlung (beim vorliegenden Versuch im Mischungsverhältnis 2:1) erhöht werden können.
Versuch Nr. III wurde mit Rinderserum zum Nachweis der Brauchbarkeit von Tiersera durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß bei gesammeltem Normalrinderserum sowohl die T3-Auf nähme als auch die T4-Konzentration im euthyreoten Bereich lagen. Nach der
Behandlung verhielt sich dieses Serum ähnlich dem Humanserum, und zwar hinsichtlich Τ,-Aufnahme und T4-Konzentration im hypothyreoten Bereich. Wie bei Humanserum lassen sich die T3- und T4-Werte durch Vermischen verschiedener Verhältnisse Normalrinderserum mit dem hergestellten hypothyreoten Rinderserum erhöhen.
Versuch Nr. IV zeigt die erwartete hypothyreote T3-Aufnahme und euthyreote T4-Konzentration für
ίο von schwangeren Frauen gesammeltes und vereinigtes Serum. Nach der gemäß Beispiel 2 durchgeführten Behandlung wurde jedoch das Serum sowohl für die T3-Aufnahme als auch die T4-Konzentration hypothyreot.

Claims (2)

1 2 ThyroxinCQkonzentration quantitativ ermittelt wird. Patentansprüche: Die T3-Aufnahme wird im Serum mittels T3-Auf- nahmetests (z.B. Triosorb) bestimmt. Die Serum-
1. Verfahren zur Gewinnung eines hypothyreoten T4-Gehalte werden mit HiUe von Tests quantitativ er-Kontrollserums, dadurch gekennzeich- 5 mittelt, bei denen die Gesamtserum-Ti-Konzentration net, daß man gemessen wird (beispielsweise T4-Radioimmunounter-
. _, . ^1 ^- . j τ, .ι suchung, Tetrasorb). Tests, bei denen das Gesamt-
a) Blutserum mit neutraler entfärbender Kohle _* en wifd hä en von der im Serum
in einer Menge von etwa 5 bis 20 Gew.-%, be- toteäcy4%orhandenenThyroidhonnonkonzentration
zogen au das Serumvolumen, versetzt, w denen die T3.Aufnahme bestimmt wird,
b) die erhaltene Mischung 3 bis 30 h be. einer ^ ω yon def im Serum vorhandenen Kon. Temperatur von etwa 4°C durchmischt, gege- ^J800n an thyroxinbindendem Protein (TBP) als Deneniaus der Konzentration an Thyroidhoimon ab.
c) die erhaltene Aufschlämmung zweimal bei sind zum klaren Verständnis des Schildemer Temperatur von etwa 4°C mit einer drüsenstatus von Patienten von wesentlicher Bedeu-Zentnfugalkraft von 34 800 χ g zentrifugiert, 5 "ruiCUSUUU!>
d) die hierbei gewonnene überstehende Flüssig- ^kllKereildes J3 und zirkulierendes T4 werden an
λ λ* tin ■ Ü-u . u α τ?.-· · ι, -*ι ι.· verschiedene Blutbestandteile gebunden. Von diesen
e) die abfiltnerte überstehende Flüssigkeit lyophi- Su S t C bestandteijen entMlt die thyroxinbindende GIo-
1 ao buJin(TBG)-Fraktion die HauptbindesteHen, die hin-
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekerm- sichtlich ihrer Zahl festliegen. Die Bindung von T3 und zeichnet, daß man der in Verfahrensstufe d) abfil- T4 an das TBG-Molekül stellt einen konkurrierenden trierten überstehenden Flüssigkeit unbehandeltes Proteinbindungsvorgang dar, d. h. ungebundenes T4 Normalserum in einer Menge von etwa 10 bis etwa ersetzt T3 und T4 befindet sich bereits am Molekül.
35 % des in Verfahrensstufe a) eingesetzten Serum- as Da pro 100 ml Normalserum lediglich 1 bis 2 mg
volumens zusetzt. TBG vorhanden ist (sind), werden die Bindungs-
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