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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Überziehen einer Testeinrichtung zur Verwendung in der direkten Radioimmunobestimmung von Antigenen oder ihren Antikörpern. Die erfindungsgemäss hergestellte Testeinrichtung ermöglicht insbesondere eine direkte Methode zur Bestimmung hepatitisassoziierter Antigene oder ihere Antikörper.
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oder freie Protein, welches das zu bestimmende Material ist, und das markierte Protein mit den verfügbaren Bindungsstellen des Antikörpers, der auf der Oberfläche eines Röhrchens abgeschieden ist, in Konkurrenz treten.
Die Durchführung einer solchen Methode setzt die Aufnahme einer Eichkurve voraus, aus der die Menge des in der unbekannten Probe enthaltenen Proteins abgelesen werden kann. Bei einer solchen Methode wird die Innenfläche eines Teströhrchens mit einem Antikörper gegen das zu bestimmende Protein überzogen und eine Probe, die das zu bestimmende Protein enthält, wird zusammen mit dem gleichen Protein, das radioaktiv markiert ist, zugesetzt. Auf diese Weise werden das freie Antigen, das das zu bestimmende Material darstellt, und das markierte Antigen mit den Bindungsstellen des aufgebrachten Antikörpers in eine Konkurrenzreaktion treten.
Diese Verfahrensweise ist daher nicht für die direkte Ablesung geeignet, vielmehr sind die erhaltenen Werte relativ.
Aus der österr. Patentschrift Nr. 288593 ist ein Verfahren zur Bestimmung von gegen bestimmte Allergene wirkenden Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wässerigen Testproben bekannt, bei welchem man die Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit wie Blutserum oder Blutplasma in vitro mit einem wasserunlöslichen Polymeren, welches vorzugsweise in Teilchenform vorliegt und an welches ein Testallergen gebunden ist, zusammenbringt, worauf man das Polymere mit dem Testallergen und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven Atom bzw.
einer radioaktiven Gruppe markiert sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe markiert ist, zusammenbringt, anschliessend das unlösliche Polymere mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schliesslich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymere mit den daran befindlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung die von der abgetrennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, misst oder die Wirkung derselben untersucht. Bei diesem Bestimmungsverfahren zur in vitro-Bestimmung von allergischer Überempfindlichkeit wird somit ebenfalls eine Konkurrenz-Bindungsmethode angewendet.
Die österr. Patentschrift Nr. 288593 beschreibt zwar ein Verfahren, das als direkte Radioimmunobestimmung angesprochen werden kann. Dieses Verfahren wird jedoch zum Testen von Allergenen verwendet.
Aber selbst wenn man Allergene als Antigene ansieht, so liegt doch bei dem in der vorgenannten Patentschrift beschriebenen Verfahren das Allergen gebunden an das Polymere vor. Radioaktiv markierter Antikörper wird dann an das Reagin-Ig gebunden. Die Reaktionsfolge ist somit Allergen (Antigen) : Reagin-Ig (Antikörper) : markierter Antikörper.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, eine Testeinrichtung für ein diagnostisches Verfahren herzustellen, das eine direkte Ablesung ermöglicht. Die erfindungsgemäss erhältliche Testeinrichtung kann so ausgebildet werden, dass der Antikörper als Überzug auf einer geeigneten Oberfläche aufgebracht ist, wobei die zu testende Probe, die ein Antigen enthalten kann, der Testeinrichtung zugesetzt wird, so dass etwa vorliegendes Antigen den Antikörper bindet. Die Reaktionsfolge ist dann Antikörper : Antigen : markierter Antikörper.
In analoger Weise kann das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer Testeinrichtung benutzt werden, die dazu dient, das Vorliegen von Antikörpern in einem Serum zu bestimmen. Dabei wird die Testeinrichtung mit dem entsprechenden Antigen überzogen und die zu prüfende Probe, wie Blutserum, wird zugesetzt. Falls Antikörper zu dem Antigen vorhanden ist, wird dieser an das Antigen gebunden. Nach dem Waschen, der Oberfläche wird markiertes Antigen zugesetzt, das vom Antikörper gebunden wird und nach Messung der Radioaktivität kann die Menge an Antikörper bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform liegt die Reaktionsfolge Antigen : Antikörper : markiertes Antigen vor.
Obgleich Methoden zur Bestimmung des Vorliegens von antigenaktiven Makromolekülen, wie intakten Viren. Viruscapsiden, Virusuntereinheiten, Bakterien, Membranen, Zellwänden, Hormonen usw., zur Verfügung stehen, besteht ein Mangel an einer einfachen und dennoch empfindlichen Einrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit dieser Materialien. Virale Hepatitis einschliesslich der sogenannten Serumhepatitis, welche eine relativ häufige Krankheit ist, konnte bisher nicht unter Anwendung eines empfindlichen Tests ermittelt werden, der sowohl spezifisch als auch reproduzierbar für eine rasche Bestimmung ist, bei der ermittelt werden soll, ob Sera eines Patienten oder eines Donors hepatitisassozüerte Antigene oder Antikörper enthalten oder nicht.
Ausserdem sind Radioimmunountersuchungsmethoden für verschiedene Antigen-Antigenkörper-Materialien entwickelt worden : diese Radioimmunountersuchungsmethoden, wie sie von Kevin Catt und Mitarb. im Journal of Biochemistry, Bd. 100 [1966], S. 31c und 33c und in Science, Bd. 158 [1967], S. 1570 beschrieben worden sind, stellen eine direkte Radioimmunountersuchungsmethode dar, worin die Menge des vorliegenden Antigens annähernd umgekehrt proportional der Menge an Strahlung ist, die durch das Tracermaterial emittiert wird. Diese Verfahrensweisen erfordern die Anwendung von Korrelationstabellen und andern Materialien, die im allgemeinen die Ergebnisse alles andere als reproduzierbar und exakt machen.
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Es wurde nun gefunden, dass die oben angegebenen Schwierigkeiten, d. h. der Mangel an Reproduzierbarkeit und Exaktheit, vermieden werden können, indem eine erfindungsgemäss überzogene Testeinrichtung angewendet wird. Die erfindungsgemäss überzogene Testeinrichtung ermöglicht es, eine unbekannte Serumprobe einem diagnostischen Verfahren zu unterwerfen, bei dem diese unbekannte Serumprobe mit der überzogenen Testeinrichtung in Berührung gebracht, die Testeinrichtung und das Serum während eines Zeitraumes von 0, 5 bis 42 h bebrütet, abgesaugt und gewaschen, ein Jod-125 markierter Antikörper mit dem Serum und der überzogenen Testeinrichtung in Berührung gebracht und 1 bis 6 h bebrütet, abgesaugt und gewaschen und die Jod-125 Gammastrahlung der Probe gezählt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Überziehen einer Testeinrichtung zur Verwendung in der direkten Radioimmunobestimmung von Antigenen oder ihren Antikörpern besteht in seinem Wesen darin, dass man eine Lösung eines Antigens oder seines Antikörpers in einer Puffermischung bildet, die Testeinrichtung mit der Lösung in Berührung bringt, die Testeinrichtung während 6 bis 72 h bebrütet und die bebrütete Testeinrichtung mit der Puffermischung wäscht.
Die erfindungsgemäss hergestellte Testeinrichtung ermöglicht eine rasche und genaue Bestimmung des Vorliegens von hepatitisassoziierten Antigenen oder Antikörpern in Seren.
Weitere Einzelheiten der Erfindung und der Methode zum überziehen von Testeinrichtungen sowie Vorteile der unter Anwendung der erfindungsgemäss überzogenen Testeinrichtung durchgeführten diagnostischen Methode für direkte Radioimmunountersuchung gehen aus der nachstehenden Beschreibung und der Zeichnung hervor.
Die Zeichnung stellt eine Ansicht, teilweise im Schnitt, einer überzogenen Testeinrichtung dar.
Die Zeichnung zeigt eine dem Proberöhrchen seiner Form nach angepasste Testeinrichtung-l-mit einem überzogenen Teil-2--. Der überzogene Teil-2-hat einen Überzug aus einem Antigen oder seinem Antikörper, der vorzugsweise wie dargestellt angeordnet ist, d. h. am Boden des Röhrchens. Die Zeichnung zeigt lediglich eine bevorzugte Testeinrichtung ; die Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Der überzogene Teil--2--ist entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper in Abhängigkeit von dem zu testenden Material überzogen. Da die Methode in bezug auf fast alle Antigene und Antikörper ähnlich ist, wird das Verfahren zum überziehen dieser Röhrchen unter Bezugnahme auf einen speziellen hepatitisassoziierten Antikörper, d. h. Anti-Australiaantigen, beschrieben. Eine Lösung von Anti-Australiaantigen mit einer Konzentration von etwa 1 bis 100 jug Protein/rnl wird aus einem Anti-Australiaantigenserum in etwa 0, 005 bis etwa 0, 02molarem Tris-HCI-Puffer, d. h. 2-Amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propandiol-HCI-Puffer, hergestellt. Das Tris-HCI puffert die Lösung auf einen PH-Wert von etwa 7, 1 bis etwa 9, 5 gemeinsam mit etwa 0, 01 bis etwa 0, 05% Natriumazid.
Diese Anti-Australiaantigenlösung wird dann auf die Röhrchenoberflächen als Überzug aufgebracht und es erfolgt ein Bebrüten bei Zimmertemperatur während 6 bis 72 h und vorzugsweise während 12 bis 48 h. Die überzogenen Röhrchen werden dann mit etwa 0, 005 bis etwa 0, 02molarem
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bis sie zur Verwendung bei der Radioimmunobestimmung benötigt werden.
Es wird bevorzugt, eine 0, 01molare Lösung von Tris-Cl und 0, 02% Natriumazid, die auf einen pH-Wert von 7, 1 gepuffert ist, sowohl für das Bebrütungsmedium als auch das Waschmedium zu verwenden.
Die Menge des Antikörpers oder Antigens, der (das) als Überzug in den Röhrchen vorliegt, ist nicht kritisch, da der Test immer im Vergleich mit wenigstens einem Leertest vorgenommen wird. Es sind keine Standardkurven oder-karten für die Durchführung des Tests mit den gemäss der Erfindung überzogenen Testeinrichtungen notwendig ; daher ist keine spezielle Menge an Antikörper oder Antigen im Überzug notwendig, solange als zwei ähnliche Röhrchen verwendet werden.
Obgleich die Uberzugsbildungsmethode unter Bezugnahme auf ein überzogenes Röhrchen beschrieben worden ist, kann die Überzugsmethode auch benutzt werden, um einen überzogenen Einsatzteil zur Verwendung in Behältern usw. durch Eintauchen des Einsatzteiles in die Antigen- oder Antikörperlösung und Durchführung der restlichen Behandlung herzustellen.
Antigene und Antikörper, die mittels der erfindungsgemäss überzogenen Testeinrichtung bestimmt werden können, umfassen : Verschiedene intakte Viren, Viruscapside, Virusuntereinheiten, Bakterien, Membranen, Zellwände, verschiedene Hormone, Gammaglobuline usw. Das einzige Erfordernis im Hinblick auf die obigen Materialien besteht darin, dass die Materialien mindestens zwei antigenaktive Stellen aufweisen. Ferner sind Antigene und Antikörper, die mehrfache Vereinigungsstellen aufweisen, selbst in Gegenwart ihrer betreffenden Antikörper und Antigene feststellbar, vorausgesetzt, dass mindestens zwei freie Kombinationsstellen verfügbar bleiben.
Obgleich die Radioimmunobestimmungsmethode unter Verwendung der erfindungsgemäss überzogenen Testeinrichtung für die Feststellung der obigen Klasse von Materialien brauchbar ist, ist sie besonders gut-und dies stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar-für die Bestimmung des Vorliegens von hepatitisassoziierten Antigen und Antikörpern, wie Australiaantigen und Anti-Australiaantigen, geeignet.
Während vorstehend die Radioimmunobestimmungsmethode kurz beschrieben worden ist, wird die Methode nun unter Bezugnahme auf die spezifischen Materialien und Stufen beschrieben, die zur Ausführung der
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direkten Radioimmunobestimmungsmethode für die Ermittlung des Vorliegendes des hepatitisassoziierten Antigens Australiaantigen erforderlich sind.
Zuerst wird eine gemessene Probe von Plasma oder Blut, das auf hepatitisassoziiertes Antigen zu prüfen ist, in ein mit Anti-Australiaantigen überzogenes Röhrchen gebracht. Das Material wird während eines Zeitraumes von 0, 5 bis 42 h bei Zimmertemperatur bebrütet und vorzugsweise während 12 bis 24 h. Das überzogene Material wird mit dem Puffergemisch, d. h. Tris-HCI und Natriumazid, gewaschen. Eine gemessene Menge gereinigtes, mit Jod-125 markiertes Anti-Australiaantigen, wird dann dem Röhrchen oder Probenbehälter zugesetzt und das Röhrchen oder der damit in Berührung stehende Einsatz wird während weiterer 1 bis 24 h bei Zimmertemperatur und vorzugsweise 1, 5 bis 6 h bebrütet.
Im Anschluss an diese Bebrütung werden die Inhalte gewaschen, wobei das Puffergemisch verwendet wird, und das Röhrchen wird in den Raum einer Zählvorrichtung eingebracht, die zur Zählung von Gammastrahlen geeignet ist. Duplikatkontrollen werden gleichzeitig vorgenommen, wobei ein normales Plasma an Stelle des getesteten Plasmas benutzt wird und der Test wird in gleicher Weise vorgenommen. Falls das unbekannte Plasma bei der Zählung einen höheren Hintergrundwert als die Vergleichsproben gibt, ist der Test hinsichtlich hepatitisassoziiertem Antigen positiv.
Im allgemeinen wird es bevorzugt, eine Zählzeit von 1 min anzuwenden ; falls jedoch eine Probe sehr nahe an der oberen Grenze des Vergleichs liegt, so kann eine längere Zählzeit bis zu 10 min angewendet werden, um genaue Zählergebnisse zu erhalten.
Wie oben angegeben, werden die Bebrütungen im allgemeinen bei Zimmertemperatur ausgeführt, obgleich eine schwache Erwärmung bis zu etwa 350C Verwendung finden kann, um die Bebrütungszeit abzukürzen.
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Im allgemeinen lässt man die Tests unter Verwendung von unverdünntem Blutserum oder Plasma ablaufen, obgleich, falls die Proben begrenzt sind, eine geeignete Verdünnung der Probe in normalem Serum oder Plasma, wie Rinderserumalbumin, oder in einer Puffermischung, wie einer Mischung aus Tris-Cl und Natriumazid, einer Mischung aus Tris-HCI, Natriumazid und 1% Rinderserumalbumin usw. verwendet werden kann.
Obgleich das diagnostische Verfahren unter Bezugnahme auf Jod-125 markierte Antigene oder Antikörper, d. h. mit dem bevorzugten radioaktiven Material markierte Antigene oder Antikörper, beschrieben worden ist, können beliebige Radioisotope, wie sie allgemein für die Kennzeichnung oder Markierung von Antigenen oder Antikörpern im Radioimmunobestimmungsverfahren verwendet werden, benutzt werden.
Das unter Verwendung einer erfindungsgemässen Testeinrichtung durchgeführte Bestimmungsverfahren beinhaltet die Anwendung einer direkten Radioimmunobestimmungsmethode für die Ermittlung verschiedener Antigene und ihrer Antikörper, insbesondere hepatitisassoziiertem Antigen oder seines Antikörpers. Wenn ferner eine quantitative Bestimmung von hepatitisassoziiertem Antigen erwünscht ist, kann eine standardisierte Kurve benutzt werden, die unmittelbar die Beziehung zwischen dem Zählwert/min und der Menge an hepatitisassoziiertem Antigen angibt.
Die Anwendung einer erfindungsgemäss überzogenen Testeinrichtung wird nachstehend durch das spezielle Beispiel erläutert, das lediglich der Veranschaulichung dient und nicht beschränkend ist. Im folgenden Beispiel bedeuten alle Angaben betreffend Teile und Prozentsätze Gewichtsteile und Gewichtsprozenten und alle Temperaturangaben sind in C.
Beispiel : Ein Röhrchen, wie es in der Zeichnung dargestellt ist und das aus Polystyrol geformt ist, wird mit einem gereinigten, hepatitisassoziierten Antikörper überzogen. Dieser überzug wird aufgebracht, indem die Oberfläche des Röhrchens mit einer verdünnten Lösung des hepatitisassoziierten Antikörpers in 0,01molarem Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7, 1 und 0, 02 Gew. -% Natriumazid aufgebracht wird und das überzogene Röhrchen einen Tag bei Zimmertemperatur stehen gelassen wird. Das Röhrchen wird dann mit aliquoten Anteilen von 0, 01molarem Tris-HCl plus 0, 02 Gew.-% Natriumazid gewaschen. Diese Röhrchen können bei 40C bis zur Verwendung gelagert werden.
Drei Plasmaproben zu 100 pi werden je in drei gesonderte überzogene Röhrchen gebracht, wobei jedes Röhrchen mit hepatitisassoziiertem Antikörper überzogen ist. Eine dieser Plasmaproben ist die unbekannte Probe, die andern beiden sind gegenüber hepatitisassoziiertem Antigen negativ. Jede Stufe der Behandlung wird mit jeder der drei Proben vorgenommen. Die beiden negativen Proben liefern die Hintergrundstrahlung, mit der die unbekannte Probe schliesslich verglichen wird. Diese Proben werden dann beiseite gestellt und 18 h bei Raumtemperatur bebrütet. Am Ende dieses Zeitraumes werden die überzogenen Röhrchen mit aliquoten Anteilen der Inkubationspuffermischung gewaschen. Zu diesem Zeitpunkt werden 2, 5 ng des gereinigten Jod-125 markierten, hepatitisassoziierten Antikörpers in einem Volumen von 0, 1 ml in jedes überzogene Röhrchen gebracht.
Die Röhrchen werden erneut beiseite gestellt und 2 h bebrütet, nach welcher Zeit das Röhrchen wieder mit aliquoten Anteilen der bebrüteten Puffermischung gewaschen wird. Jede der negativen Plasmaproben wird ausgezählt, wobei eine übliche Strahlenzählvorrichtung verwendet wird, die einen Schacht aufweist und zur Bestimmung von Gammastrahlung geeignet ist. Die negativen Proben werden während 1 min ausgezählt und es wird die mittlere Zahl der Zählimpulse/min ermittelt ; in diesem Fall waren es 200 Zählimpulse/min. Die unbekannte Probe wird dann in gleicher Weise ausgezählt und mit dem Mittelwert der
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Zählimpulse/min der negativen Plasmaprobe plus einem Korrekturfaktor entsprechend 50% der Zählimpulse/min der negativen Probe verglichen.
Das unbekannte Plasma ergab in diesem Fall 400 Zählimpulse/min, welche Zahl oberhalb 300 liegt, d. h. 200 plus 50% von 200 = 300, welche Zahl das Maximum für einen negativen Test darstellt.
Der oben beschriebene Test liefert somit einen einfachen Ja-Nein-Test für die Ermittlung, ob hepatitisassozäertes Antigen in einer unbekannten Probe von Blut oder Plasma vorliegt oder abwesend ist. Obgleich ein gewisser Korrekturfaktor erforderlich ist, ist der Test völlig schlüssig und reproduzierbar und hat einen hohen Grad an Genauigkeit.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum Überziehen einer Testeinrichtung zur Verwendung in der direkten Radioimmuno-
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