JP2014521929A - 低い非特異的結合性を有するアフィニティアッセイのための磁性粒子における分子構造 - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、本発明の特定の実施形態において、検出分子、好ましくは抗体、又はその断片又は誘導体は、検出、可視化及び定量化できる種々のマーカと結合又はラベル化されても良い。これは、当業者に知られる如何なる適切な技術又は方法を使用して、検出分子に結合され得る、如何なる適切なラベルを使用して、達成することができる。適切なラベルの例は、蛍光色素又は金属(例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン)、色素体染料(例えば、ロドプシン)、化学発光法による化合物(例えば、ルミナール、イミダゾール)及び生物発光タンパク質(例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、その誘導体)を含む。検出分子は更に、6−FAM, HEX, TET, ROX, Cy3, Cy5, Texas Redのような蛍光ラベルで、及び/又は同時に、TAMRA, Dabcyl, Black Hole Quencher, BHQ−1又はBHQ−2のようなクエンチラベルでラベル化されても良い。種々の他の有用な蛍光体又は発色体は、Stryer, 1968, Science, 162:526−533で述べられる。検出分子は、また、好ましくは、発光、蛍光又は電気化学的信号を発生する酵素又は酵素ドメインでラベル化され得る。係る酵素の特に好ましい例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβラクタマーゼを含む。更なる実施形態において、検出分子は、放射性同位体(例えば、3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb, 68Ga又は18F)又は粒子(例えば、金)でラベル化され得る。種々のタイプのラベルが、種々の化学的性質、例えば、アミン反応又はチオール反応、を使用して、検出分子に結合され得る。しかしながら、アミン及びチオールとは別の他の反応基も使用するいことができ、例えば、アルデヒド、カルボン酸及びグルタミンである。
例1−変更された表面構造を用いたb−PEG−PSAナノ粒子の製造
2層シェル構造を有するナノ粒子の通常の製造において、ストレプトアビジンコーティング超常磁性粒子(ビーズ)が、出発材料として使用され、これは商業的に入手可能である(例えば、Adamtech)。第1のステップにおいて、磁性ビーズに、50Wで3秒間、3度、超音波を当てた。10mg/mLでのストレプトアビジンコーティングナノ粒子懸濁液の24μLを、10mMのPBS緩衝溶液で3度洗浄し、最終体積が120μL(2mg/ml)になるまで希釈した。懸濁液に、再び、50Wで3秒間、3度、超音波を当て、続いて、200μLのPBS懸濁液を添加した。次のステップで、製造されたストレプトアビジンコーティングナノ粒子の懸濁液の50μlを、PSA(前立腺特異抗原)抗体に結合された(10kDaの分子量を有する)ビオチン化PEG−リンカー分子(b−PEG10kDa−PSA)で15分間インキュベートした。続いて、得られた懸濁液を、追加的に、5kDaの分子量を有する非アフィン性のビオチン化スペーサ分子(b−PEG5kDa)の50μM溶液で、15分間インキュベートした。得られた懸濁液を、11.62μlのストレプトアビジン(1mg/ml)で10分間インキュベートした。次にステップで、10kDaの分子量を有する、4mMの非アフィン性のビオチン化スペーサ分子(b−PEG10kDa−リンカー)の20μlを添加し、15分間インキュベートした。任意に、5mMのb−PEG5kDa−スペーサ分子18.6μlが使用される。結果のナノ粒子溶液をアッセイバッファで3度洗浄し、続いて、バッファを、最終体積が100μlになるまで添加した。最終的な懸濁液に、50Wで3秒間、3度超音波を当てた。
この例において、種々の表面修飾を有するナノ粒子の特性が評価されている。ナノ粒子は、例1のプロトコルで述べられたように製造された。非アフィン性のスペーサ分子を、約40nmの長さに対応する、3.5kDaより高い範囲で、CreativePegWorksから購入した。リンカー分子もまた、CreativePegWorksから購入した。これらの分子は、一方の端部でビオチンに結合され、他方の端部でN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)−基に結合される。ビオチン化ポリエチレングリコール(PEG)リンカーは、NHS−化学的性質によって、PSA(前立腺特異抗原)に対する抗体に結合されている。バイオ結合(bioconjugation)は、1より多いPEGリンカーが抗体に結合されるように、実行されている。ビオチン化抗体(25μg/mg)が、非アフィン性のスペーサ分子と共に、ストレプトアビジンコーティングナノ粒子とインキュベートされる。粒子あたりの抗体の量は、抗体含有リンカー分子及び非アフィン性のスペーサ分子の溶液濃度の割合によって調整することができる。抗体濃度は、ナノ粒子製造業者によって述べられている最大範囲となるよう選択された(Masterbeads 500nm, StreptaDivin coated, Ademtech−仕様書に係るアビジンの結合容量>1nM)。非アフィン性のスペーサ分子の濃度、は、ストレプトアビジンコーティング粒子あたりのビオチンの最大充填が得られるように選択された。ビオチンを有するナノ粒子表面の完全適用範囲は、粒子の架橋結合を避けるために必要である。第2の層の密な3次元構造が、その四量体構造が、4つのビオチン分子を結合することができることによる、ストレプトアビジンの多価の結合特性によって形成された。ストレプトアビジンの多価性は、したがって、図1の右側のパネルに描かれるような非アフィン性のスペーサ分子のメッシュに繋がる。
磁性粒子のクラスタリングを評価するために、Ranzoniら、2011, Nano Lett, 11, 2017−2022で述べられるようなバイオナノ技術を使用した。この光磁性技術は、粒子間結合によって、流体内の生体分子検出するために適用された。アッセイは、非特異的及び特異的粒子−粒子結合から得られる信号の決定を可能にした。
この例は、また、Ranzoniら、2011, Nano Lett, 11, 2017−2022で述べられるような光学磁性セットアップを使用した。分析アッセイは、具体的に、ヒト血漿といった生物学的マトリクスで挑戦している。アッセイバッファと比較して、ヒト血漿は、非特異的にナノ粒子に結合することができ、厳しいクラスタリングを引き起こす、大量の潜在的な阻害剤及び生体分子を含む。上記述べられたように、非特異的クラスタリングは、より高いブランク信号につながり、このアッセイにおいて、検出の限界に負に影響を及ぼす。
例4のものと同じ実験セットアップが、しかしながら、女性のドナーからの処理されていない血漿プールが調査されているという違いを有して、適用された。血漿は、2%w/vPluronicF127を含んでいた。この例において、例4で述べられたようなPSAの削減は、女性のドナーからの血漿は、PSAを欠いているため、不必要である。この実験の背後にある対比は、例4におけるPSAの削減によって、また、ある量の非特異的に相互作用している分子が、血漿から除去されるということである。一方、この実験セットアップは、事前の処理が実行されていない状況を提供する。
Claims (15)
- シェル構造を含むコーティングであって、
前記シェル構造は、1つ以上のアフィニティ分子を含む第1の層と、前記第1の層に結合される更なる第2の層と、を含み、
前記第1の層及び前記第2の層は、メッシュを形成する非アフィン性のスペーサ分子を含み、
前記1つ以上のアフィニティ分子は、前記のコーティング構造内に組み込まれ、
前記メッシュは、非特異的分子に関する立体障害を作り出す、
コーティング。 - 前記アフィニティ分子は、アプタマー、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド及び分子インプリントポリマーから構成される群から選択され、
前記アフィニティ分子は、好ましくは、抗体又は抗体断片である、
請求項1に記載のコーティング。 - 前記第1の層は、粒子表面、平面、マトリクス又はナノ粒子表面に結合され、
前記の表面又は前記マトリクスの材料は、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び磁性材料から構成される群から選択される材料を含む、
請求項1又は2に記載のコーティング。 - 前記第1の層は、追加的に、非アフィン性のスペーサ分子、好ましくは、ペプチド、核酸、デンドリマー、デンドロン、ポリマー実体、金ナノ粒子及びタンパク質又はそれらの混合物から構成される群から選択される分子を含む非アフィン性のスペーサ分子を含み、
前記リンカーは、好ましくは、ポリエチレングリコールを含む、
請求項1乃至3のいずれか一項に記載のコーティング。 - 非アフィン性のスペーサ分子の前記メッシュは、多価結合分子、好ましくはストレプトアビジン等の複数の結合サイトを有し、ビオチン等の対応する相互作用パートナーに関する高いアフィニティを有する、タンパク質の相互作用によって形成され、
前記非アフィン性のスペーサ分子は、好ましくはポリエチレングリコールを含む、
請求項1乃至4のいずれか一項に記載のコーティング。 - 前記非アフィン性のスペーサ分子の長さは、
前記シェル構造の結果得られる厚さが、表面の高周波数、短波長成分によって決定される粒子表面の平均粗さよりも大きくなるように、及び/又は、
前記の粒子の帯電が少なくとも50%低くされるように、
選択される、請求項1乃至4のいずれか一項に記載のコーティング。 - 請求項1、2、4乃至6のいずれか一項に記載のコーティングを含む、好ましくは、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び磁性材料から構成される群から選択される材料を含む、
粒子、好ましくはナノ粒子、平坦構造又はマトリクス。 - 請求項7に記載の粒子であって、前記粒子は、磁性ナノ粒子である、
粒子。 - サンプルから特定の標的生体分子の検出及び任意で精製;及び/又は前記特定の標的生体分子の濃度の決定、のための、
請求項1乃至6のいずれか一項目に記載のコーティング、請求項7に記載の粒子、平坦構造又はマトリクス、又は請求項8に記載のナノ粒子の使用。 - 前記特定の標的生体分子は、前記アフィニティ分子によって捕獲され、
前記特定の標的生体分子は更に、好ましくは、発光、蛍光又は電気化学的を発生することができる酵素に結合されている、検出分子によって認識され、
前記検出分子は、好ましくは、抗体又は抗体断片である、
請求項9に記載の使用。 - 前記特定の標的生体分子は、少なくとも2つの磁性ナノ粒子及び少なくとも1つの標的生体分子を含むクラスターの検出を介して検出される、又は、
センサ表面上の検出分子への結合を介して検出される、
請求項9又は10に記載の使用。 - 前記標的生体分子の前記の精製は、
i)標的生体分子を捕獲すること、
ii)適切なバッファで洗浄すること、及び
iii)前記のマトリクス、表面又は粒子から前記標的生体分子を溶出すること、
のステップを含む、
請求項9乃至11のいずれか一項に記載の使用。 - i)アフィニティ分子を含む予め存在している表面層の特異性を改善すること、及び/又は
ii)前記予め存在している表面層への、非特異的結合を防ぐこと又は最小化すること、
のための、請求項1、2、4乃至6のいずれか一項に記載のコーティングの使用であって、
非アフィン性のスペーサ分子の前記メッシュは、アフィニティ分子の予め存在している層の頂部に結合されている、
使用。 - 請求項1乃至6のいずれか一項に記載のコーティング、請求項7に記載の粒子、平坦構造又はマトリクス、又は請求項8に記載のナノ粒子の使用を含む、
サンプルから特定の標的生体分子の検出、及び/又は特定の標的生体分子の濃度の決定、のためのアッセイ。 - 前記標的生体分子の検出は、光磁性システムで実行され、
前記の磁性ナノ粒子は、磁気駆動され、固定されたサンプル流体中で光学的に検出され、
i)標的生体分子を捕獲すること、
ii)磁性駆動すること、及び
iii)検出すること、
のステップを含む、
請求項14に記載のアッセイ。
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