CN103649753B

CN103649753B - 用于具有低非特异性结合的亲和测定的磁性颗粒上的分子结构

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Publication number: CN103649753B
Application number: CN201280032557.2A
Authority: CN
Inventors: A·兰佐尼; G·萨瓦特; M·W·J·普林斯
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2032-06-26
Also published as: US20140127722A1; JP6031100B2; EP2726873A1; EP2541250A1; WO2013001447A1; JP2014521929A; CN103649753A; EP2726873B1

Abstract

本发明涉及用于防止分子非特异性结合至包含亲和分子的表层的包衣，所述包衣包含单层，所述单层包含形成网的非亲和间隔分子；或者包含壳结构，其中所述壳结构包含第一层和第二层，第一层包含一种或多种亲和分子，第二层偶联至第一层，并且其中所述第二层包含形成网的非亲和间隔分子。本发明还涉及包含这样的包衣的颗粒、平结构或基质。在另一方面，本发明涉及包衣、包被的颗粒、包被的平结构或包被的基质在从样品检测和/或纯化特异性靶生物分子和/或确定所述特异性靶生物分子的浓度中的用途。本发明还涉及一种从样品检测特异性靶生物分子和/或确定特异性靶生物分子的浓度的测定方法，其包括使用这类包衣、包被的颗粒、包被的平结构或包被的基质，特别是包被的纳米颗粒。

Description

用于具有低非特异性结合的亲和测定的磁性颗粒上的分子结构

技术领域

本发明涉及用于防止分子非特异性结合至包含亲和分子的表层的包衣，所述包衣包含单层，所述单层包含形成网的非亲和(non-affine)间隔分子；或者包含壳结构，其中所述壳结构包含第一层和第二层，第一层包含一种或多种亲和分子，第二层偶联至第一层，并且其中所述第二层包含形成网的非亲和间隔分子。本发明还涉及包含这样的包衣的颗粒、平结构或基质。在另一方面，本发明涉及包衣、包被的颗粒、包被的平结构或包被的基质在从样品检测和/或纯化特异性靶生物分子和/或确定所述特异性靶生物分子的浓度中的用途。本发明还涉及一种从样品检测特异性靶生物分子和/或确定特异性靶生物分子的浓度的测定方法，其包括使用这类包衣、包被的颗粒、包被的平结构或包被的基质，特别是包被的纳米颗粒。

背景技术

对普遍和有效的医疗保健的需求使得世界上体外诊断向着整合的随机接入和点护理解决方案发展。实现这类解决方案要求：测试需要快速、灵敏、定量和准确。此外，进行测试的平台需要易于使用和紧凑。

亲和测定使用生物分子以从样品捕获特异性靶分子并测定它们的浓度。通常，亲和捕获通过将用捕获分子包被的纳米颗粒或微粒分散入样品液体来进行(Luchini,A.etal.,2008,NanoLett.,8(1),350-361)。因此，典型的基于亲和的测定用于大量应用，例如诊断测定，在研究中检测生物分子如蛋白、肽和核酸从而使用亲和分子如抗体，通常所述抗体的特征在于对特定生物分子的高结合亲和力。

然而，亲和测定的一个重要缺点是灵敏度主要受到非特异性结合的限制。主要的困难是构想非常灵敏和特异性的测定，并且测定本身不会受到来自所探测的样品液体的高背景信号的影响。非特异性结合通常导致增加的背景信号和不准确的检测。特别地，当复杂的生物基质如人血浆用作样品液体时，非特异性结合甚至更具挑战性。

最近几年，已开发更准确和灵敏的基于溶液的亲和测定，其基于新一代测定的超顺磁性纳米颗粒的使用。例如，用亲和分子官能化的磁性纳米颗粒捕获靶分子，并且光学检测靶标诱导的颗粒的簇和链的形成(WO03/044532;Ranzonietal.,2011,NanoLett,11,2017-2022)。但是，特别是在基于颗粒的测定中，对非特异性信号的重要贡献来自颗粒-颗粒相互作用和颗粒-表面相互作用。US5212063A1公开了一种使用生物素缀合物通过免疫测定检测包含游离生物素的体液中的分析物的方法。该文件提到聚合物颗粒由核心组成，并且包含具有许多生物素结合位点的聚合物以及至少一层蛋白作为覆盖物。Townsendetal.,2007,Biomaterials,28(34),5176-5184公开了用于将靶药物递送至神经元的破伤风毒素C片段-缀合的纳米颗粒。Grolletal.,2005,Langmuir,21(7),3076-3083公开了来自异氰酸酯封端的星形PEG预聚物的超薄包衣。具体地，该文件描述了在底物上形成交联网络模式的星形PEG包衣。EP0617284A2公开了用于物质的定性和定量测量的装置和方法。所述装置包含液体可渗透性多孔反应膜，其表面具有一个固定亲和物质的反应区域；装在多孔反应膜上部的多孔体，可溶性物质粘附在其上；吸附膜以及液体不透性透明盖和箱。US2002/128234公开了在底物表面上合成的多功能聚离子共聚物。据显示该包衣可用于抑制分析物溶液中存在的分子或离子组分的非特异性相互作用、吸附或粘附。

因此需要设计新的结构，其能够有效防止或最小化非特异性结合至用亲和分子包被的表面，特别是颗粒表面，同时增强特异性亲和力。还强烈需要避免颗粒的非特异性簇聚，这是许多检测测定中的限制因素。

发明内容

本发明满足了这些需求，并且提供减少非特异性结合至颗粒、表面和基质的方法。上述目的具体通过用于防止分子非特异性结合至包含亲和分子的表层的包衣来完成，其中所述包衣包含单层，所述单层包含形成网的非亲和间隔分子；或者包含壳结构，其中所述壳结构包含第一层和第二层，第一层包含一种或多种亲和分子，第二层偶联至第一层，并且其中所述第二层包含形成网的非亲和间隔分子。本发明背后的比例是提供间隔分子的分子结构，所述间隔分子作为屏障发挥作用并因此产生对非特异性分子的空间位阻。另一方面，如果在颗粒如微粒或纳米颗粒上提供这样的包衣，双层非亲和间隔分子作为空间屏障发挥功能并进一步产生熵效应，防止颗粒表面互相接触。一个主要优点是本发明的包衣允许用间隔分子的致密三维网有效覆盖表面。因此这类包衣综合了强特异性亲和力和低非特异性结合的有利特征。

具体地，可以观察到提供包含比表面粗糙度厚的间隔分子网的包衣会防止非特异性结合并使得能够有效捕获靶分子。

不希望受到理论的束缚，所观察到的高特异性亲和力的一个解释是掺入的捕获分子以高密度存在于表面上。此外，包埋在厚的间隔分子三维壳内的亲和分子可以有效地朝向远离表面的方向。另一原因可以是亲和分子在包衣内充分运动并充分接触以形成与靶分子的生物化学相互作用。因此，如本文所述的非亲和间隔分子的网络具有平衡效应，并且使第一层的亲和分子朝向远离表面的方向。因此，间隔分子的分支形成致密网，其可以作为亲和分子与表面之间的空间屏障发挥作用。

具体地，在剂量反应测定中，可以证实常规颗粒表面，其中亲和分子如抗体直接偶联，没有接头和额外的壳结构，需要相当量的表面活性剂以降低背景水平。相比之下，本发明的包衣结构能够降低背景水平2倍而不使用表面活性剂。与现有技术相比的一个主要优点是修饰的表面结构提高光磁检测测定中的空白水平，因此提高检测的限制。

在本发明的一优选实施方案中，亲和分子选自适配体、肽、蛋白、寡核苷酸和分子印迹聚合物。

在本发明的另一优选实施方案中，亲和分子为抗体或其片段。

在本发明的另一优选实施方案中，包含亲和分子的表层或第一层偶联至颗粒表面、平面、基质或纳米颗粒表面。

在本发明的另一优选实施方案中，所述表面或所述基质的材料包含选自琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和磁性材料的材料。

在本发明的另一优选实施方案中，表层或第一层额外地包含非亲和间隔分子。

在本发明的另一优选实施方案中，非亲和间隔分子包含选自肽、核酸、树状聚体、树枝化基元(dendron)、聚合实体、金纳米颗粒和蛋白的分子或者它们的混合物。

在本发明的另一优选实施方案中，接头包含聚乙二醇。

在本发明的另一优选实施方案中，非亲和间隔分子的网是通过多价结合分子的相互作用形成的，所述多价结合分子具有对相应的相互作用配对物(partner)的高亲和力。

在本发明的另一优选实施方案中，多价结合分子是具有多个结合位点的蛋白。

在本发明的另一优选实施方案中，具有多个结合位点的蛋白为链霉抗生物素蛋白。

在本发明的另一优选实施方案中，相应的相互作用配对物为生物素。

在本发明的另一优选实施方案中，非亲和间隔分子包含聚乙二醇。

在本发明的另一优选实施方案中，这样选择所述非亲和间隔分子的长度：所得的壳结构的厚度大于颗粒表面的平均粗糙度。

在本发明的另一优选实施方案中，这样选择所述非亲和间隔分子的长度：所述颗粒的静电荷显著降低。

在另一方面，本发明涉及包含这样的包衣的颗粒、平结构或基质。

在本发明的另一优选实施方案中，所述颗粒为纳米颗粒。

在本发明的另一优选实施方案中，所述颗粒、平结构或基质包含这样的包衣，所述包衣包含选自琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和磁性材料的材料。

在本发明的另一优选实施方案中，颗粒为磁性纳米颗粒。

在另一方面，本发明涉及这样的包衣、颗粒、平结构、基质或纳米颗粒在从样品检测和/或纯化特异性靶生物分子和/或确定所述特异性靶生物分子的浓度中的用途。

在本发明的另一优选实施方案中，通过亲和分子捕获特异性靶生物分子，其中通过检测分子进一步识别特异性靶生物分子。

在本发明的另一优选实施方案中，将检测分子缀合至能够产生发光、荧光或电化学信号的酶。

在本发明的另一优选实施方案中，检测分子为抗体或其片段。

在本发明的另一优选实施方案中，通过检测包含至少两个磁性纳米颗粒和至少一个靶生物分子的簇来检测特异性靶生物分子。

在本发明的另一优选实施方案中，通过结合至感应器表面的检测分子来检测特异性靶生物分子。

在本发明的另一优选实施方案中，靶生物分子的纯化包括以下步骤：i)靶生物分子捕获，ii)用适当的缓冲液洗涤，以及iii)从基质、表面或颗粒洗脱靶生物分子。

本发明的另一方面涉及这样的包衣在以下方面中的用途：i)提高包含亲和分子的预先存在的表层的特异性，和/或ii)防止或最小化非特异性结合至所述预先存在的表层；其中非亲和间隔分子的网粘附至预先存在的亲和分子层的上方。

本发明的另一方面涉及一种从样品检测特异性靶生物分子和/或确定特异性靶生物分子的浓度的测定方法，其包括使用这样的包衣、颗粒、平结构或基质，或者纳米颗粒。

在本发明的另一优选实施方案中，在光磁系统中进行所述靶生物分子的检测，其中所述磁性纳米颗粒在静止的样品液体中被磁性驱动和光学检测，包括以下步骤：i)靶生物分子捕获，ii)磁性驱动，以及iii)检测。

附图说明

图1示出分子两层结构的示意图。在这个实施例中，链霉抗生物素蛋白包被的颗粒用作起始材料。链霉抗生物素蛋白显示为灰色星。在左图中，将第一层加入颗粒。第一层由生物素化的抗体和生物素化的间隔分子的混合物组成。在右图中，将第二层加入第一层。第二层包含结合至生物素化的间隔分子的链霉抗生物素蛋白。链霉抗生物素蛋白是多价的，即具有一个以上生物素结合位点。

图2示出图表，其示出不同表面修饰的ζ-电位(图2A)和纳米颗粒的平均直径(图2B)。有效防止颗粒的非特异性簇聚的PEG的最短长度为约12nm(3.5kDa)。

图3示出图表，其示出剂量-反应曲线。水平线表示空白水平(V/Hz^0.5)。在图3A中，示出没有修饰的表面结构的纳米颗粒的剂量反应曲线。检测极限为约5pm。图3B示出具有两层壳结构的纳米颗粒的剂量-反应曲线。背景水平减少约2倍，并且检测极限提高至约200fM的值。

图4示出图表，其示出95%预澄清的人血浆池中的剂量-反应曲线。修饰的表面导致0.7pM的检测极限。早饱和是由于复杂基质的粘度较高，这影响化学结合的纳米簇的捕获动力学和临界频率。

图5示出来自女性供体的未处理的血浆池的剂量-反应曲线。检测极限为约500fM。下面的频率依赖性图(图5B和C)证实血浆中的大小区别。

图6示出富集测定(图a)和参考测定(图b)。用抗体(Ab₁)包被的颗粒P捕获生物标记蛋白(B)。将颗粒浓缩至较小体积(V_el)的纯净基质中，其中通过酶促洗脱从颗粒洗脱捕获的抗体。在步骤5中于夹心免疫测定中检测生物标记。可以利用抗体包被的传感器表面和抗体包被的磁性颗粒作为标记(L)检测生物标记。可以根据Brulsetal.,2009在f-TIR生物传感器中通过光散射检测标记。

具体实施方式

本发明涉及用于防止非特异性结合的表面结构的修饰。

虽然本发明会关于具体实施方案来描述，但是这种描述不应理解为具有限制意义。

在详细描述本发明的示例性实施方案之前，给出对于理解本发明很重要的定义。

在本说明书和所附权利要求书中使用时，除非上下文清楚地指出，否则单数形式的“一个(a)”和“一个(an)”还包括各自的复数。

在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示准确性的间隔，本领域技术人员会理解所述准确性的间隔仍确保考虑的特征的技术效果。该术语通常表示所示数值的±20%，优选±15%，更优选±10%，并且甚至更优选±5%的偏差。

应当理解术语“包含”不是限制性的。为了本发明的目的，认为术语“由…组成”是术语“包含”的优选实施方案。如果此后组定义为至少包含一定数量的实施方案，这表示还涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。

此外，在描述和权利要求书中，术语“第一”、“第二”、“第三”或者“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分相似的元素而不是描述顺序或时间顺序所必需的。应当理解这样使用的术语在适当的环境下可互换，并且本文所述的本发明的实施方案能够以与本文描述或说明的顺序不同的其他顺序进行。

如果术语“第一”、“第二”、“第三”或者“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”“i”、“ii”等涉及方法或用途或测定的步骤，则步骤之间没有时间或时间间隔相关性，即步骤可以同时进行，或者这些步骤之间可以有数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年的时间间隔，除非如上文或下文所示在本申请中其他地方指出。

应当理解本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应当理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。

如上文所示，本发明在一方面涉及用于防止分子非特异性结合至包含亲和分子的表层的包衣，所述包衣包含单层，所述单层包含形成网的非亲和间隔分子；或者包含壳结构，其中所述壳结构包含第一层和第二层，第一层包含一种或多种亲和分子，第二层偶联至第一层，并且其中所述第二层包含形成网的非亲和间隔分子。

如本文所用，术语“包衣”指覆盖在表面上的用于防护的一层或多层分子。通常，如本文所用的包衣可以包含一层、两层、三层或更多层，其可以具有相同或不同组成。

如本文所用，术语“表面”指任何表面类型、表面结构或表面大小。该术语包括二维和三维表面，并且优选包括分子相互作用范围内已知的任何表面类型或形式。在具体实施方案中，这类表面可以具有一种或多种活性，例如它们可以具有化学、物理或生物化学/生物学活性。例如，化学活性可以是以催化剂形式允许化学反应的能力。例如，生物学活性可以是结合一种或多种生物学相关实体或分子或者进行酶促反应等的能力。在具体实施方案中，例如，表面可以已包含包衣，如本发明的包衣。可选地或任选地，表面可以具有结构重要性，或者具有结构上可区分的元件，例如通过提供平面或非平面元件，通过是平面的或非平面的。其还可以包含平面或类似平面表面中的一个或多个箱(crate)，平面或类似平面表面中的一个或多个划痕、平面或类似平面表面中的一个或多个洞，平面或类似平面表面中的一个或多个凸起，平面或类似平面表面中的一个或多个材料的边缘，其可以具有粗糙结构，或者包含一个或多个突起或突出。

表面可以具有一定程度的粗糙度，这理解为表面质地的度量。表面的粗糙度可以通过真实表面与其理想形式的垂直偏差来定量。如果这些偏差很大，则认为表面是粗糙的；如果它们很小，则认为表面是光滑的。为了本发明的目的，认为表面的粗糙度是测量的表面的高频、短波长组分。粗糙度的测量可以用任何合适的技术或方法进行，例如通过确定轮廓粗糙度参数、振幅参数和/或斜率、间距和计数参数。通常，粗糙表面可以具有比光滑表面更高的摩擦系数。

本发明的包衣的一个主要功能是例如在生物污染的情况下通过防止上文提到的表面的生物学活性来防止或最小化非特异性结合至表面。因此，包衣表示覆盖层，其可以用来覆盖或保护预先存在的亲和分子的表层。例如，如果包衣为单层，则该层还可以构建为主要包含非亲和间隔分子。例如，这样的单层可以应用于已用亲和分子包被的表面。还可以这样构建包衣结构，将亲和分子包埋在包衣结构内，即亲和分子构成一个或多个包衣层的一部分。

另一重要方面是由于其分子结构，包衣可以作为空间屏障或间隔发挥作用，其防止其他分子的结构，或者其使其他分子或颗粒保持一定距离。本发明的包衣还可以这样理解：它们形成分子的网络或网。因此，本发明的包衣层可以包含小的单元或实体，其具有相同或相似的化学、物理和/或生物学特征。优选地，如本文所述的包衣层可以包含能够形成一定长度的聚合物的生物或化学分子。例如，合适的聚合物可以为核酸、核糖核酸、肽、蛋白、碳水化合物、脂质、聚乙二醇、多糖、树状聚体、树枝化基元、纳米管或金纳米颗粒，或者它们的混合物。优选地，这些聚合实体包含在接头或非亲和间隔分子中。在本发明的具体实施方案中，包衣可以包含单一表层或壳结构。

如本文所用，术语“分子网”或“分子网络”指包含构件和孔的结构，所述孔在0.3nm-1微米，更优选1nm-100nm的范围中。例如，孔直径可以在约0.3nm-约400nm的范围中，例如直径为约0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.75nm、1nm、2nm、3nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm或者任何合适的更大或更小的直径的孔。

此外，这样的网或网络可以具有明显的柔性，这可以取决于所述网或网络中存在的分子的大小、量、结构和/或刚性。因此，如本领域技术人员已知的，柔性可以通过修改任何上文提到的参数来进行调整。

如本文所用，术语“单一表层”指能够形成分子的致密网或网络的单层。例如，单一表层可以包含一种或多种类型的非亲和间隔分子，优选单一类型的非亲和间隔分子或相容的非亲和间隔分子的组合。单一表层可以具有一定厚度，例如范围为约1nm-200nm，优选约3nm-150nm，更优选约5nm-120nm，甚至更优选约10nm-约100nm。厚度可以根据存在的分子、网和网络大小以及技术人员已知的其他因素而变化。例如，单一表层可以应用在预先存在的表层的上方。在本发明的具体实施方案中，单一表层可以构成结构的最外层，例如包含两个或更多个内层的结构。这类内层可以与单一表层在结构或化学上不同。在本发明的其他具体实施方案中，单层可以包含厚度为约一个非亲和间隔分子的层，例如在生物素接头的上下文中，如图1所示。但是本发明并不限于这种接头类型，而是进一步涵盖本领域技术人员已知或适合所述方法的非亲和间隔分子。

如本文所用，术语“壳结构”指被膜样结构，其通常包含小单元或实体，所述小单元或实体具有相同或相似的化学、物理和/或生物学特征。优选地，壳结构包含两个不同或相同的分子层形成双层(double-layer)或双层(bilayer)结构。特别优选包含第一层和第二层的壳结构。本发明的壳结构可以覆盖上文提到的任何表面，例如固体形式的表面，基本上平的表面，任何颗粒的表面，例如球形或椭球形颗粒的表面，或者任何材料的表面，例如金属、有机材料、无机材料或具有不规则形状的它们的任何组合如基质。在本发明的其他具体实施方案中，壳结构可以包含厚度为约两个或三个非亲和间隔分子的层，例如在生物素接头的上下文中，如图1右图所示。但是本发明并不限于这种接头或接头类型，而是进一步涵盖本领域技术人员已知或适合所述方法的非亲和间隔分子。

术语“第一层”或“表层”指分子层，其直接或间接结合至表面结构，例如上文定义的表面。在本发明的具体实施方案中，第一层或表层可以包含一种或多种亲和分子。在多层或双层结构中，第一层可以是直接或间接偶联至表面结构的层。

如本文所用，术语“直接结合至表面结构”指层分子如非亲和间隔分子与一种或多种表面分子或者表面结构之间的直接相互作用。这样的相互作用可以基于共价结合、范德华相互作用或静电相互作用。

如本文所用，术语“间接结合至表面结构”指非亲和间隔分子与一种或多种表面分子或者表面结构之间通过结合分子间接相互作用。结合分子又可以直接结合至一种或多种表面分子或者表面结构。

如本文所用，术语“第二层”指例如通过存在或不存在亲和分子、非亲和间隔分子的相同性或不相同性、其厚度等可以与第一层相同或与第一层不同的层。在本发明的具体实施方案中，所述第二层可以不含如本文所定义的亲和分子。因此，在某些实施方案中，第二层可以包含如本文所定义的一种或多种亲和分子。可选地，第一层和第二层可以包含如本文所定义的亲和分子。

在本发明的其他实施方案中，壳结构可以包含超过两层，例如本文所定义的3、4、5、6、7、8或更多层，例如构成多层结构。这些层可以以不同构型存在，例如上文所定义第一层可以被如上文所定义的2、3、4、5或更多第二层覆盖。可选地，如上文所定义的第一层被如上文所定义的另一第一层覆盖。在其他选择中，如上文所定义的第一层可以被如上文所定义的第二层，然后被另一第一层等覆盖，或者可以随后还被另一如上文所定义的第二层和/或第一层等覆盖。本发明还涉及第一层和第二层的其他组合。

当用于第一层和第二层的连接时，术语“偶联”指第一层和第二层元件之间的共价或非共价结合。这样的偶联可以是例如层之间的共价结合、范德华结合或静电结合。在具体实施方案中，层之间的结合可以是可逆的，或者可以例如通过改变pH、温度、离子浓度，通过光照，通过酶促降解或酶促切割等来终止，从而例如一个或多个最外层脱落。

术语“亲和分子”指具有对第二分子的高结合亲和力的任何分子，即相互作用配对物。在本发明的意义中亲和分子通常包含结合或捕获分子，其能够结合特定靶分子，或者能够结合包含分子的靶实体如病毒、或者细胞或细胞片段、或者来源于组织的材料。靶分子可以是亲和分子结合的任何分子。优选地，本发明的上下文中的靶分子为核酸，例如DNA或RNA分子，或者寡核苷酸如DNA或RNA寡核苷酸。甚至更优选的是诸如肽、蛋白、药物分子、小分子或维生素的靶分子。

在一特别优选的实施方案中，亲和分子选自适配体、肽、蛋白、寡核苷酸和分子印迹聚合物，其中所述亲和分子优选为抗体或其片段。

在亲和分子的上下文中使用时，“适配体”可以是短核酸分子，例如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子或者本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式，能够结合至如本文所定义的靶分子，优选结合至如本文所定义的核酸靶分子。此外，本发明涉及肽适配体，即能够特异性结合包含特定氨基酸序列的蛋白、多肽或肽的适配体。通常，肽适配体为可变肽环，包含例如10-20个氨基酸。在本发明的上下文中，在具体实施方案中，肽适配体可以粘附在支架结构的一端或两端。支架结构可以是任何分子，优选蛋白，例如具有良好溶解性特征的蛋白。合适的支架分子是本领域技术人员已知的。在本发明的上下文中使用的合适的支架分子的实例为细菌蛋白硫氧还蛋白-A。适配体肽环可以优选插入支架分子的还原活性位点内。可选地，葡萄球菌蛋白A及其结构域以及这些结构域的衍生物如蛋白Z或脂质运载蛋白在本发明的上下文中可以用作支架结构。核酸或肽适配体可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法来制备，例如通过PCR或分子合成方法或酵母双杂交方法。

在亲和分子的上下文中使用时，“肽”可以包含一段2-35个氨基酸、氨基酸衍生物或它们的混合物，或者可选地由一段2-35个氨基酸、氨基酸衍生物或它们的混合物组成。肽可以是线性的、支化的、环状的或它们的混合物。肽亲和分子也可以粘附至如上文所定义的支架结构。

在亲和分子的上下文中使用时，“蛋白”可以包含一段超过约35个氨基酸、氨基酸衍生物或它们的混合物，或者可选地由一段超过约35个氨基酸、氨基酸衍生物或它们的混合物组成。蛋白可以具有线性、支化、环状形式，或者包含这些形式的混合物。蛋白亲和分子也可以粘附至如上文所定义的支架结构。

在亲和分子的上下文中使用时，“寡核苷酸”可以包含一段约5-120个核苷酸，或者可选地由一段约5-120个核苷酸组成，例如一段10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，优选约15-60个核苷酸。寡核苷酸亲和分子可以优选为RNA分子或DNA分子，或者两者的混合物。

如本文所用，术语“分子印迹聚合物”指在提取后留下互补空腔的分子的存在下形成的聚合物。通常，分子印迹聚合物表现出一定的对原始分子的化学亲和性。分子印迹聚合物可以由本领域技术人员已知的任何合适的聚合单元组成。它们的制备技术包括聚合技术如堆积、沉淀、乳化、悬浮、分散、凝胶化和多步溶胀聚合。特别优选分层印迹法。

在亲和分子的上下文中使用时，“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、lgG4、lgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。本发明的抗体可以通过它们识别或特异性结合的本发明的多肽的表位或部分来描述或说明。具体表位以及它们与抗体的相互作用是本领域技术人员已知的。如本文所用，术语“特异性结合”指抗体对抗原表位的免疫特异性检测和结合。术语“特异性地结合”排除非特异性结合，但是不必排除与其他抗原的交叉反应性，特别是与包含目前的抗体检测的抗原表位的抗原的交叉反应性。

在一优选实施方案中，抗体可以为多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体，单链抗体，或者构成Fab片段、Fab'片段，通过Fab表达库产生的片段，F(ab’)2，Fv，二硫键连接的Fv，微抗体，双抗体，scFv，sc(Fv)2，全免疫球蛋白分子，小模块免疫药物(SMIP)，结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，骆驼化抗体，包含VHH的抗体，抗独特型(抗Id)抗体以及上述任一种的任何表位结合片段。最优选地，抗体为本发明的人结合抗原的抗体片段，包括Fab、Fab'和F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)以及包含VL或VH结构域的片段。

本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体为人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、猴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。

本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的。多特异性抗体可以是对本发明的多肽的不同表位特异性的，或者可以是对本发明的多肽以及异源表位如异源多肽或固体支持材料特异性的。优选单特异性抗体。

如本文所用，术语“非亲和间隔分子”指主要具有间隔功能的分子。为了这个目的，这些聚合分子具有一定长度和强度以便能够像聚合纤维一样发挥作用。

在本发明的具体实施方案中，非亲和间隔分子可以具有长达约500nm的长度，优选长达约450、400、350、300和250nm，甚至更优选长达200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20和10nm。

在本发明的其他具体实施方案中，非亲和间隔分子可以为线性、环状或支化样分子，或者它们的混合物。如果它们是支化的，它们可以不同程度地支化，例如表现出2、3、4、4或更多层级。本发明还涉及网络、层或壳结构内非亲和间隔分子的不同类型的组合，例如线性和支化的、不同支化程度、不同间隔长度等。在本发明的可选实施方案中，间隔分子或间隔分子的混合物提供均匀的网或网络，即具有基本上相同大小的开口的均布网或网络。特别优选地，网提供有开口，其允许溶液中的靶分子有效接近网内的亲和分子，特别是这些亲和分子的结合区(例如互补位)。此外，亲和分子应当优选具有一些运动自由度，从而它们对于结合靶标是具有官能性的。如果网这样均匀，则特别优选，从而在靶分子对亲和分子的可接近性和亲和分子的运动自由度方面，网的功能特征是均匀的。这些参数可以通过如本文所定义的非亲和间隔分子的长度、支化程度等来调整。

在本发明的其他具体实施方案中，非亲和间隔分子可以直接或间接互连以形成分子的三维网。这样的互连可以基于分子末端或位于分子中心(例如在考虑支化的情况下)的官能团。互连的控制、其程度等可以根据本领域技术人员已知的原理和方法来实现，例如来自合格的教科书如"Bioconjugatetechniques",Hermanson,2^ndEd.AcademicPress,Elsevier或"Dendrimersandotherdendriticpolymers"FrechetandTomalia,J.Wiley的原理和方法。

如本文所用，术语“非亲和”指间隔分子不结合至其他分子或实体或者不被其他分子或实体结合的能力。例如，非亲和间隔分子可以是化学惰性的，缺少官能团或反应基团，不能结合至生物分子如蛋白、肽、核酸或它们的衍生物。但是，在本发明的具体实施方案中，这些非亲和间隔分子可能能够在小的网或封闭的网中机械地限制其他分子或实体。这种扣留能力通常是由于网或网络的结构特征，而不是由于分子-分子相互作用。

在本发明的上下文中，合适的非亲和间隔分子可以是例如核酸、核糖核酸、肽、蛋白、碳水化合物、脂质、聚乙二醇、多糖、树状聚体、树枝化基元、纳米管或金纳米颗粒，或者它们的任何合适的衍生物或组合。非亲和间隔分子的组具体地可以包含基于烃的表面活性剂、胆固醇、糖脂、胆汁酸、皂草苷、脂肪酸、合成的两亲嵌段共聚物、天然产物如蛋黄磷脂。

“核酸非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何核酸分子。这类分子可以包含单链和/或双链DNA分子，或者其任何类型的衍生物。所述分子还可以是PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子，或者它们的任何混合物或组合，或者与本文所定义的任何其他非亲和间隔分子的任何混合物或组合。在具体实施方案中，非亲和间隔分子为核糖核酸分子，或者核糖核酸与任何其他提到的核酸分子的任何混合物或与本文所定义的任何其他非亲和间隔分子的任何混合物。核酸或核糖核酸分子可以具有不同的碱基组成和/或长度。分子的长度可以在约5个核苷酸至约5000个核苷酸之间变化。还考虑所示范围内的其他长度或任何长度值。长度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。

优选的核酸是具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子。单链分子可以例如包含碱基序列的重复，完全随机，或者来源于自然，或者仅有一种碱基，例如AAA等、TTT等、CCC等或GGG等；或者包含数段这样的单碱基区，例如仅包含A和C、或者C和T。

在本发明的具体实施方案中，核酸非亲和间隔分子可能能够杂交至互补核酸分子或被互补核酸分子杂交，或者优选杂交至部分互补的核酸分子或被部分互补的核酸分子杂交。具有互补性的区域可以包含例如分子的约5-65%。因此调整网的大小、灵活性、程度或者孔大小是可能的。

“肽非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何肽分子。这类肽可以具有不同的氨基酸组成和/或长度。分子的长度可以在约3个氨基酸至约35个氨基酸之间变化。还考虑所示范围内的其他长度或任何长度值。长度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。氨基酸组成可以在单氨基酸组成(例如仅一种天然产生的氨基酸或其任何衍生物或可合成的氨基酸)与包含或选自所有已知的氨基酸的完全随机氨基酸组成之间变化。还涉及包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种不同氨基酸的组成。氨基酸可以存在于数段相同的氨基酸中，或者以模式或基序的形式提供，或者随机分布。

“蛋白非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何蛋白分子。这类蛋白可以具有不同的氨基酸组成和/或长度。分子的长度可以在约35个氨基酸至约500个氨基酸或更多之间变化。还考虑所示范围内的其他长度或任何长度值。长度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。氨基酸组成可以在单氨基酸组成(例如仅一种天然产生的氨基酸或其任何衍生物或可合成的氨基酸)与包含或选自所有已知的氨基酸的完全随机氨基酸组成之间变化。还涉及包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种不同氨基酸的组成。氨基酸可以存在于数段相同的氨基酸中，或者以模式或基序的形式提供，或者随机分布。

“碳水化合物非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何碳水化合物分子。这类碳水化合物可以具有不同的组成和/或长度。分子的长度可以在约5个C原子至约100个C原子或更多之间变化。还考虑所示范围内的其他长度或任何长度值。长度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。

“脂质非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何脂质分子。这类脂质可以具有不同的组成和/或长度。分子的长度可以在约5个C原子至约100个C原子或更多之间变化。还考虑所示范围内的其他长度或任何长度值。长度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。优选的脂质为磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、卵磷脂酰-乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺。特别优选磷脂MPPC、DPPC、DPPE-PEG2000或LissRhodPE。

“聚乙二醇非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何聚乙二醇分子。这类聚乙二醇可以具有不同的组成和/或长度。长度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。优选的聚乙二醇(PEG)变体包括多分散或单分散PEG。特别优选单分散PEG。PEG还可以是支化的，例如具有从中心核心基团发出的3-10条PGE链，是具有从中心核心基团发出的10-100条PEG链的星状PEG，或者是具有移植至不同的聚合物或线性PEG骨架的多条PEG链的梳状PEG。根据PEG的平均分子量，涉及的PEG可以为PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10,000或具有更高分子量的PEG。特别优选PEG10,000。

“树状聚体”或“树状聚体(dendrimetic)非亲和间隔分子”可以是不引起特异性分子结合反应，特别是没有干扰如本文所定义的亲和分子的分子结合反应的任何重复支化的大致球形的大分子。这类树状聚体可以具有不同的组成和/或长度，和/或支化程度。长度和支化程度可以根据所考虑的网大小或孔大小、所考虑的层的大小和/或层或壳结构中存在的亲和分子的大小或量、和/或所考虑的层或壳结构的灵活性或稳定性来制备。本发明所涉及的树状聚体可以包含低分子量或高分子量物质。

在某些实施方案中，本发明的树状聚体在分子表面包含官能团如亲水基团，或者可选地具有内部官能度。为了本发明的目的所涉及的树状聚体可以是第1代、第2代、第3代、第4代或更高代的树状聚体。优选的树状聚体包括例如newkome树状聚体或arbolol和聚酰胺胺(PAMAM)。用于本发明的上下文中的其他变体以及合成方法等是本领域技术人员已知的，或者可以来源于合适的文件，例如"Dendrimersandotherdendriticpolymers"FrechetandTomalia,J.Wiley。

“树枝化基元”或“树枝化基元的非亲和间隔分子”应理解为包含树状聚体的单一化学可寻址的基团，即如上文所定义的树状聚体的焦点。

如本文所用，术语“纳米管”指碳纳米管，即具有圆柱形纳米结构的碳的同素异形体。这类纳米管可以是单壁纳米管或多壁纳米管。本发明还涉及不同类型、形式和复杂度的富勒烯结构家族的间隔分子，例如球形或椭球形布基球形式、布基球富勒烯或者具有布基球的纳米管的组合等。

在本发明的其他特别优选的实施方案中，上文定义的非亲和间隔分子可以提供有相互作用因子官能度，例如允许与其他分子相关作用的化学基团或残基，例如与其他非亲和间隔分子，和/或与一种或多种结合分子，和/或与一种或多种如上文定义的亲和分子。优选采用生物素或生物素样官能度，其稠和或连接至如上文所定义的非亲和间隔分子。稠和可以在间隔分子的一端或更多端，或者在分子内进行。

特别优选本发明的网或包含这样的网的包衣，或者如上文所定义的单层或多层或者如上文所定义的壳结构包含亲和分子，例如高密度的抗体。额外地或任选地，优选所述亲和分子如抗体处于高效特异性结合靶分子如特异性抗原或其上的表位的分子构象。额外地或任选地，优选亲和分子由颗粒核心朝外，特别是由磁性颗粒如磁性纳米颗粒朝外。此外，额外地或任选地，优选本发明的亲和分子是移动的，例如充分移动以到达靶分子并形成生物化学键。

在本发明的说明性实例和特别优选的实施方案中，这些特征已在包含链霉抗生物素蛋白和生物素偶联的PEG间隔的颗粒上实现，其具有高于约3.5kDa的范围，或者与抗PSA抗体一起约40nm的长度。但是，本发明并不限于这种参数的联合，而是涵盖如上文或下文所述的其他变体。

在本发明的优选实施方案中，所定义的表层或第一层可以偶联至颗粒表面或平面或基质或基质样结构。如本文所用，术语“颗粒表面”指实体的形式，表面作为小的局部物体位于其上，可以具有物理特征如体积或质量。此外，在其转运和特征方面，颗粒基本上与整个单元表现一样。因此颗粒和它们的表面可以具有对称、球状、基本上球状或球形的形状，或者具有不规则、不对称的形状或形式。粒径(和表面的面积)可以变化。优选纳米和微米范围至几微米的颗粒和颗粒表面。特别优选纳米颗粒的表面，例如直径约1-700纳米的颗粒的表面。特别优选纳米颗粒的表面，所述纳米颗粒可以具有约10-600nm的直径，例如10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、170nm、200nm、220nm、250nm、270nm、300nm、320nm、350nm、370nm、400nm、420nm、450nm、470nm、500nm、520nm、550nm、570nm、600nm、620nm或其间的任何值。甚至更优选具有约500nm的直径的纳米颗粒。

如本文所用，术语“平面”指平的、基本上平的或类似平的表面，例如存在于装置或者较大的非颗粒物体或实体中或其上。在具体实施方案中，这类表面还可以包括倾斜、突出、不规则等。其他实施方案涉及例如几何实体或物体如正方体或长方体结构上的不同方向、不同角度的平面的组合。

如本文所用，术语“基质”指不规则形状的结构，其包含空腔或洞元素。在具体实施方案中，这类空腔或洞可以存在于物质的固体之上或固体层之下。在其他实施方案中，整个物体可以包含空腔或洞，例如网或3维晶格的形式。因此基质实体的表面可以是倾斜的，频繁变化或倾斜的非平面的。

在本发明的其他优选实施方案中，上述表面所处的物体的材料可以是特定的。例如，所述材料可以具有无机或有机性质。例如，所述材料可以包含金属或金属的合金、或者包含碳水化合物元素的有机材料，基本上由金属或金属的合金、或者包含碳水化合物元素的有机材料组成，或者由金属或金属的合金、或者包含碳水化合物元素的有机材料组成。所考虑的材料的实例包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或复合材料。特别优选磁性或铁磁金属、合金或组合物。

在其他优选的实施方案中，材料可以具有特定特征。例如，材料可以是磁性或非磁性的。在其他实施方案中，材料可以是疏水或亲水的。

在一特别优选的实施方案中，材料为磁性材料。在其他特别优选的实施方案中，如上文所定义的表面所处的实体或本发明的包衣所位于的实体为磁性纳米颗粒。

如本文所用，“结合分子”应理解为如本文所定义的非亲和间隔分子与本文所定义的一种或多种表面分子或者表面结构之间的连接物，和/或如本文所定义的两种或更多种非亲和间隔分子之间的连接物。在具体实施方案中，结合分子对于相同或相似的相互作用或者它们相互作用的能力可以是单价、二价、三价或多价的，即结合分子可以结合1、2、3或更多个相同的相互作用分子，例如非亲和间隔分子或表面实体。可选地或额外地，关于不同的相互作用分子如非亲和间隔分子或表面实体，结合分子可以是二价、三价或多价的。因此，结合分子可以结合1、2、3、4、5、6、7或更多个不同的相互作用分子，例如非亲和间隔分子或表面实体。而且两种能力的组合可以存在于一种结合分子内，即结合分子可以结合结合两个或更多个相同的相互作用物，并且同时结合一个、两个、三个或更多个不同的相互作用物等。

在优选的实施方案中，结合分子可以为蛋白或肽，例如具有多个结合位点的蛋白。特别优选的实例为链霉抗生物素蛋白。可选地，可以使用结合分子如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白衍生物、(链霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白相关蛋白、抗生物素蛋白样实体如tamavidin1和2、bradavidin、NeutrAvidin等。

在另一特别优选的实施方案中，非亲和间隔分子如聚乙二醇可以提供有能够结合至结合蛋白如链霉抗生物素蛋白的相互作用官能度如生物素。在一特别优选的实施方案中，本发明这样考虑：第一层或壳结构主要包含PEG、生物素和链霉抗生物素蛋白作为结构组分。层或壳结构可以额外地包含亲和分子，例如优选如上文所定义的抗体。

在本发明的另一具体实施方案中，例如包含如本文所定义的壳结构或单层的如上文所定义的包衣可以根据或依赖于如上文所定义的非亲和间隔分子的长度来设计。例如，如果非亲和间隔是包含超过20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700或1000个如本文所定义的单一单元(C-原子、核苷酸、氨基酸、官能团等)，则壳结构可以包含一层或两层。

在本发明的其他实施方案中，非亲和间隔分子的长度可以根据或依赖于实体的表面，特别是颗粒的表面来选择。优选地，非亲和间隔分子的长度可以这样选择：所得的壳或层结构或包衣的厚度大于物体表面的平均粗糙度，如上文所定义的，例如通过轮廓粗糙度参数、振幅参数和/或斜率、间距和计数参数所确定的。在一优选实施方案中，非亲和间隔分子的长度可以这样选择：所得的壳或层结构或包衣的厚度大于颗粒表面的平均粗糙度，更优选大于如上文所定义的纳米颗粒表面的平均粗糙度，例如通过上述参数所确定的。

在本发明的其他实施方案中，非亲和间隔分子的长度可以根据或依赖于物体如颗粒，优选纳米颗粒的静电荷来选择。优选地，非亲和间隔分子的长度可以这样选择：降低物体，颗粒，优选纳米颗粒的静电荷。如本文所用，术语“降低”指有和无包衣、有和无单层或多层结构的层、或者有和无如本文所定义的壳结构的物体，特别是颗粒之间的比较。如果具有包衣的物体，优选颗粒的静电荷减少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%或超过100%，或者发生2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100倍或更多的减少，则可以认为静电荷降低。优选静电荷显著降低例如至少50%。

在本发明的其他优选实施方案中，如果物体，颗粒，优选纳米颗粒的静电荷如上文所定义地降低，或者可选地，如果所述物体、颗粒如纳米颗粒的静电荷相同(与没有如上文所定义的包衣的物体或颗粒相比)，则所述物体或颗粒如纳米颗粒可以由于如上文所定义的层结构、壳结构或包衣的存在而表现出减少的非特异性簇聚。在非特异性簇聚的上下文中使用时，术语“减少”表示减少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%或超过100%，或者减少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100倍或更多倍。非特异性簇聚的减少可以优选通过非亲和间隔分子的长度来调整。可选地，通过调节非亲和间隔分子，例如通过调整它们的长度，电荷还可以增加，这可以进一步提高对非特异性相互作用的抑制程度。在非特异性相互作用的上下文中使用时，术语“增加”表示增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%或超过100%。

在本发明的另一实施方案中，非亲和间隔分子的长度可以这样选择：所得的壳或层结构或包衣的厚度大于颗粒表面的平均粗糙度，更优选大于如上文所定义的纳米颗粒表面的平均粗糙度，例如通过上述参数所确定的，并且颗粒，优选纳米颗粒的静电荷大大降低。

在另一方面，如上文所定义的包衣或层结构可以用于提高预先存在的包含亲和分子的表层的特异性，其中非亲和间隔分子的网粘附在预先存在的亲和分子层的上方。优选地，包含非亲和间隔分子和任选存在的结合分子的第二层元素可以用来覆盖包含如上文所定义的亲和分子如抗体的颗粒、结构或基质。因此，可以制备两层或多层结构或壳结构，其主要对应于如上文所定义的两层或多层结构或壳结构。连接点或附着点可以在颗粒或物体表面本身上，或者在亲和分子如抗体上(还参见图1，右图，认为其为这种方法的具体实施方案，如果从图1左图所示的位置开始，或者从不存在非亲和间隔分子的相似位置开始)。

在另一方面，如上文所定义的包衣或层结构可以用于防止或最小化非特异性结合至预先存在的表层，其中非亲和间隔分子的网粘附在预先存在的亲和分子层的上方。优选地，包含非亲和间隔分子和任选存在的结合分子的第二层元素可以用来覆盖包含如上文所定义的亲和分子如抗体的颗粒、结构或基质。因此，可以制备两层或多层结构或壳结构，其主要对应于如上文所定义的两层或多层结构或壳结构。连接点或附着点可以在颗粒或物体表面本身上，或者在亲和分子如抗体上(还参见图1，右图，认为其为这种方法的具体实施方案，如果从图1左图所示的位置开始，或者从不存在非亲和间隔分子的相似位置开始)。

通过提供亲和分子周围的网结构，可以减少或者完全消除或避免分子或实体非特异性结合至亲和分子或其附近的分子。

在另一方面，本发明涉及包含如上文所定义的包衣、单层、多层或壳结构的颗粒。本发明还涉及包含如上文所定义的包衣、单层、多层或壳结构的平结构。在本文中使用时，“颗粒”表示小的局部物体，其可以具有物理特征如体积或质量。此外，在其转运和特征方面，颗粒基本上与整个单元表现一样。因此颗粒可以具有对称、球状、基本上球状或球形的形状，或者具有不规则、不对称的形状或形式。本发明所涉及的颗粒的大小可以变化。优选纳米和微米范围至几微米的颗粒。特别优选纳米颗粒，例如直径约1-700纳米的颗粒。特别优选纳米颗粒的表面，所述纳米颗粒可以具有约10-600nm的直径，例如10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、170nm、200nm、220nm、250nm、270nm、300nm、320nm、350nm、370nm、400nm、420nm、450nm、470nm、500nm、520nm、550nm、570nm、600nm、620nm或其间的任何值。甚至更优选具有约500nm的直径的纳米颗粒。

如本文所用，术语“平结构”指平的、基本上平的或类似平的物体，例如存在于装置或设备或者较大的非颗粒实体或物体中或其上。在具体实施方案中，这类平结构还可以包括倾斜、突出、不规则等。其他实施方案涉及例如几何物体如正方体或长方体结构等上的不同方向、不同角度组合的平结构的组合。

在另一方面，本发明涉及包含如上文所定义的包衣、单层、多层或壳结构的如上文所定义的基质。因此基质可以是包被的，从而保留任何洞、不规则或空腔，或者可选地，部分、大部分或完全封闭任何洞、不规则或空腔。因此，在具体实施方案中，基质可以在提供本发明的包衣、层或壳结构时转化为如上文所定义的平的或平面的物体或颗粒。

如上文所定义的颗粒、平结构可以包含本领域技术人员已知的任何合适的材料，或者由本领域技术人员已知的任何合适的材料组成，例如它们可以包含无机或有机材料，或者由无机或有机材料组成，或者基本上由无机或有机材料组成。通常，它们可以包含金属或金属的合金、或者有机材料，或者由金属或金属的合金、或者有机材料组成，或者基本上由金属或金属的合金、或者有机材料组成，或者包含碳水化合物元素，或者由碳水化合物元素组成，或者基本上由碳水化合物元素组成。所考虑的材料的实例包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或复合材料。特别优选磁性或铁磁金属、合金或组合物。在其他优选的实施方案中，材料可以具有特定特征。例如，材料可以是磁性或非磁性的。在其他实施方案中，材料可以是疏水或亲水的。

特别优选包含如上文所定义的包衣、单层、多层或壳结构的磁性颗粒。甚至更优选包含如上文所定义的包衣、单层、多层或壳结构的磁性纳米颗粒。

在其他优选的实施方案中，材料可以具有特定特征。例如，材料可以是磁性或非磁性的。在其他实施方案中，材料可以是疏水或亲水的。在本发明的特别优选的实施方案中，材料或颗粒如纳米颗粒可以是超顺磁性颗粒，其通常分散于水溶液中并保留少量负电荷，保持颗粒分离并避免非特异性簇聚。

在本发明的其他实施方案中，如上文所定义的，即包含如上文所定义的包衣、层结构或壳结构的颗粒、平结构或基质可以用于分子诊断、生物学样品分析、化学样品分析、食品分析和/或法医分析。

在另一方面，本发明涉及如上文所定义的包衣，例如单层或多层包衣，或者如上文所定义的壳结构，如上文所定义的颗粒，如上文所定义的平结构，如上文所定义的基质，或者如上文所定义的纳米颗粒在检测来自样品的特异性靶生物分子中的用途。

如本文所用，术语“检测”指特异性识别如上文所定义的靶分子，优选蛋白、药物分子或核酸。这种特异性识别优选在如本文所定义的亲和分子的帮助下进行。因此，识别可以包括靶分子特异性地可逆或不可逆地结合至如上文所述的包衣、单层或壳结构内的亲和分子。随后这种结合通过本领域技术人员已知的任何合适的方式可见或识别。

检测可以在任何合适的环境中进行。这类的环境的实例包括包含颗粒、结构、基质或任何其他物体的溶液，所述颗粒、结构、基质或任何其他物体包含如上文所定义的包衣。例如，包含本发明的包衣的纳米颗粒可以浸没或部分浸没于溶液中。例如，溶液可以包含例如样品或加工的样品形式的靶分子。额外地或可选地，溶液可以包含进行如上文或下文所述的检测所需的一种或多种实体。在本发明的其他实施方案中，检测可以在传感器表面或感应表面进行，例如在包含磁性检测手段的生物传感器的表面。可以用于本发明的上下文的这类传感器的实例在Brulsetal.,2009,LabChip,9,3504-3510中提供。

如本文所用，“样品”指包括如本文所定义的靶分子的任何样品。例如，这类样品可以包括来源于或包含以下物质的样品：粪便，全血，血清，血浆，眼泪，唾液，鼻液，痰，耳液，生殖液，乳房液，乳，初乳，胎盘液，羊水，汗液，滑液，腹水，脑脊液，胆汁，胃液，房水，玻璃体液，胃肠液，渗出液，漏出液，胸水，心包积液，精液，上呼吸道液，腹腔液，收获自免疫应答部位的液体，收获自集中的收集部位的液体，支气管灌洗液，尿，活检材料，例如来自所有合适的器官，如肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰、胃等，有核细胞样品，与粘膜表面、毛发或皮肤相关的液体。此外，可以使用来自环境来源的样品，例如水样品、肉或家禽样品、来自潜在的污染源的样品等。

在一些实施方案中，靶分子可以直接获得自样品。在其他情况下，可以使样品经过样品制备技术，例如基于标准方案，包括例如部分纯化，这使得靶分子对于结合配对物，即如本文所定义的亲和分子更易于接近。例如，可以将血液样品离心以分离包括全细胞或膜的部分与血清，可以将粪便样品切片并用生理上可接受的缓冲液和去污剂匀浆，可以将痰样品液化并分级分离。此外，可以将抗生素或杀菌剂加入样品以防止存在的任何生物进一步生长。还可以将全细胞去除，或者可以将其裂解以释放内含物。

优选地，为了制备包含核酸的样品，可以加入DNA和RNA降解酶的抑制剂和蛋白酶。此外，还可以在检测之前例如通过本领域技术人员已知的合适的PCR反应或连接酶链反应扩增核酸靶分子。

在其他实施方案中，可以将样品中的核酸剪切或切割为较小的片段(例如，通过机械剪切或限制性酶消化)。优选导致大小为50-500个核苷酸，优选200个核苷酸的核酸分子的剪切过程。通常，可以使用通过聚焦超声的剪切技术，例如基于任何合适的装置如Covaris销售的仪器。在将样品装入设备之前可以将异质的样品进一步纯化以基本上去除所有非核酸分子。额外地或可选地，可以通过分离技术如毛细管电泳加工异质的样品以除去期望长度范围以外的分子，优选具有50-500个核苷酸范围以外的大小的分子。

在一特别优选的实施方案中，本发明涉及如上文所定义的包衣，例如单层或多层包衣，或者如上文所定义的壳结构，如上文所定义的颗粒，如上文所定义的平结构，如上文所定义的基质，或者如上文所定义的纳米颗粒在检测来自样品的特异性靶分子如生物分子中的用途，其中通过如上文所定义的亲和分子捕获所述特异性靶分子，并且其中随后通过检测分子识别所述特异性靶分子。如本文所用，“检测分子”是适合识别如上文所定义的亲和分子与结合至所述亲和分子的特异性靶分子之间的相互作用的任何分子。例如，检测分子可以特异性地识别靶分子，和/或识别靶分子与亲和分子之间的相互作用。这类检测分子的优选实例是如上文所定义的抗体或抗体片段或变体，其特异性地结合亲和分子上捕获或固定的靶分子。在抗体检测分子的情况下，抗体可以结合与亲和分子不同的靶分子表位，或者可以检测通过靶分子特异性结合至亲和分子所产生的表位。此外，可以通过合适的检测分子特异性地检测靶分子上的糖基化模式。在额外或可选的实施方案中，可以检测分子的其他修饰，例如特定氨基酸或官能团上的磷酸化、特定基团上的乙酰化等。

在本发明的其他优选实施方案中，可以将如上文所述的检测分子缀合至能够产生发光、荧光或电化学信号的实体。

因此，在本发明的具体实施方案中，可以将检测分子，优选抗体或者其片段或衍生物与各种标记缀合或用标记进行标记，所述标记允许检测、可视和/或定量。这可以利用任何合适的标记完成，可以利用本领域技术人员已知的任何合适的技术或方法将所述标记缀合至检测分子。合适的标记的实例包括荧光染料或金属(例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如视紫红质)、化学发光化合物(例如鲁米那(luminal)、咪唑)和生物发光蛋白(例如萤光素、萤光素酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、它们的衍生物)。还可以用荧光标记如6-FAM、HEX、TET、ROX、Cy3、Cy5、德克萨斯红和/或同时用猝灭标记如TAMRA、Dabcyl、BlackHoleQuencher、BHQ-1或BHQ-2标记检测分子。各种其他可用的荧光和发色团描述于Stryer,1968,Science,162:526-533。还可以优选用产生发光、荧光或电化学信号的酶或酶促结构域标记检测分子。这类酶的特别优选的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-内酰胺酶。在其他实施方案中，可以用放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³²P、³³P、³⁵S、¹²⁵I、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶²Cu、¹²⁴I、⁷⁶Br、⁸²Rb、⁶⁸Ga或¹⁸F)或颗粒(例如金)标记检测分子。可以利用各种化学，例如胺反应或硫醇反应将不同类型的标记缀合至检测分子。但是，还可以使用除胺和硫醇之外的其他反应基团，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。

在另一具体实施方案中，本发明涉及一种检测特异性靶分子的方法，所述方法包括提供包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒，使样品与包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒接触，以及通过可视化或识别靶分子与所述亲和分子之间的结合来确定所述样品中存在所述靶分子。

在本发明的另一优选实施方案中，检测可以通过检测包含至少两个磁性纳米颗粒和至少一个靶分子的簇来进行。例如，如上文所定义的磁性纳米颗粒可以提供有包衣，从而在存在至少一个待检测的靶分子时，两个或更多个纳米颗粒可以簇聚，所述靶分子能够桥接或结合两个颗粒。在一特别优选的实施方案中，检测可以在光磁系统中进行，其中所述磁性纳米颗粒在静止的样品液体中被磁性驱动和光学检测，包括以下步骤：i)靶分子捕获，例如如上文所定义的，ii)磁性驱动，以及iii)检测。

在本发明的上下文中使用时，“磁性驱动”应理解为对包含已与待检测的靶分子温育的纳米颗粒的样品施用均匀的磁场。当激活场时，纳米颗粒本身排列为链，并且在互相靠近时自由振动和转动。

通过光磁系统检测纳米颗粒具体可以通过以下步骤进行：(1)用输入光辐照样品体积；(2)通过磁性驱动场驱动样品体积中的如上文所定义的磁性纳米颗粒；以及(3)检测源自样品体积中输入光与所述磁性纳米颗粒的簇的相互作用的输出光。在具体实施方案中，所述驱动场至少被暂停中断一次。已发现这种以重复脉冲计的动态驱动减少非特异性相互作用并增加结合事件的数量。其他细节和参数是本领域技术人员已知的，或者可以来源于Ranzonietal.,2011,NanoLett.,11,2017-2022。

在另一可选实施方案中，检测可以通过本发明的包被的实体结合至传感器表面如生物传感器来进行，所述包被的实体例如包被的颗粒，优选包被的纳米颗粒，更优选包被的磁性纳米颗粒。因此检测可以通过生物传感器领域的任何合适的方法来进行，例如可从Brulsetal.,2009,LabChip,,9,3504-3510,Yageretal.,2006,Nature,442(7101),412-418,Sternetal,,2010,Nat.Nanotechnol.5(2),138-142;或Fanetal.,2008,Nat.Biotechnol,26(12),1373-1378推导的方法。实例包括如本文所述的，或者本领域技术人员已知的，或者可从合格的教科书或文件如Wild,D.,2005,Theimmunoassayhandbook;ElsevierScienceLtd:NewYork推导的旋转和散射方法。特别优选采用在感应表面的纳米颗粒的光散射和/或光吸收方法。这类方法是本领域技术人员已知的，或者可以来源于Brulsetal.,LabChip,2009,9,3504-3510。

在另一方面，本发明涉及如上文所定义的包衣，例如单层或多层包衣，或者如上文所定义的壳结构，如上文所定义的颗粒，如上文所定义的平结构，如上文所定义的基质，或者如上文所定义的纳米颗粒在纯化来自样品的特异性靶分子如生物分子中的用途。

纯化可以优选通过提供包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒与如上文所定义的包含一种或多种靶分子的样品来进行。因此可以通过如本文所定义的亲和分子结合或捕获靶分子。可以采用其他步骤以纯化结合的靶分子。例如，可以用本领域技术人员已知的合适的洗涤缓冲液洗涤颗粒的包被结构。这类洗涤步骤可以进行一次或重复进行。在具体实施方案中，可以使用如上文所定义的检测分子，以便确定结合的靶分子的量和/或纯化等级，例如确定竞争分子等。随后，例如在已终止洗涤过程之后，可以例如通过适当的洗脱缓冲液、pH或盐浓度的变化、采用加热或光照来从包被的颗粒或结构洗脱结合至亲和分子的靶分子。

在另一具体实施方案中，本发明涉及一种纯化特异性靶分子的方法，所述方法包括提供包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒，包括用本领域技术人员已知的合适的洗涤缓冲液洗涤的洗涤步骤，以及如上文所述洗脱结合的靶分子的步骤。

在一特别优选的实施方案中，包被的实体在纯化中的使用，或者靶分子如上述生物分子的纯化方法可以包括以下步骤：(i)捕获靶生物分子；(ii)用适当的洗涤缓冲液洗涤靶分子/亲和分子复合物，以及；(iii)从所述如上文所定义的基质、表面或颗粒洗脱靶生物分子。

在本发明的具体实施方案中，可以对靶分子与亲和分子一起的复合物进行洗脱。例如，通过使用温和的酶促洗脱方法，随后通过亲和测定检测蛋白生物标记变得可能。优选地，这样的方法依赖于以下步骤(还参见图6)：通过磁性颗粒特异性捕获，然后浓缩为小体积，随后纯化并洗脱。最后，可以在免疫测定中重新捕获生物标记用于检测。在第一步中，可以将体积为V_P的抗体包被的颗粒(P)如磁性颗粒加入包含生物标记分子(B)的样品体积(V_S)。在合并的体积V_capt中，可以通过抗体Ab₁捕获生物标记，所述抗体Ab₁可以通过DNA接头固定在颗粒上。随后可以将颗粒转移至较小体积(V_el)的纯净溶液中，其中可以通过DNA接头的限制性或降解来从颗粒洗脱生物标记抗体复合物(Ab₁-B)。随后，可以任选地例如在夹心免疫测定中检测洗脱的复合物，所述夹心免疫测定采用结合与Ab₁不同的表位的两种抗体Ab₂和Ab₃。

在另一方面，本发明涉及如上文所定义的包衣，例如单层或多层包衣，或者如上文所定义的壳结构，如上文所定义的颗粒，如上文所定义的平结构，如上文所定义的基质，或者如上文所定义的纳米颗粒在确定样品中的特异性靶分子如生物分子的浓度中的用途。确定特异性靶分子的浓度可以例如通过以定量方式应用如上文所定义的检测方法来进行，例如通过确定或提供可用的亲和分子的量，特别是通过进行合适的对照测量，例如基于空样品或已知浓度的靶分子，或者交错浓度的靶分子。在本发明的其他实施方案中，确定可以在可如上文所述获得的纯化的靶分子的基础上进行。因此，可以根据本领域技术人员已知的任何确定方法定量洗脱的靶分子。

在另一具体实施方案中，本发明涉及一种确定特异性靶分子的浓度或量的方法，所述方法包括提供包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒，包括用本领域技术人员已知的合适的洗涤缓冲液洗涤的洗涤步骤，以及如上文所述洗脱结合的靶分子的步骤，然后使洗脱的靶分子特异性结合至特异性亲和分子的步骤。可选地，方法可以包括提供包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒，使样品与包含如上文所定义的包衣的结构或颗粒接触的步骤，以及通过可视化或识别靶分子与所述亲和分子之间的结合来确定所述样品中所述靶分子的存在，随后的步骤是进行合适的对照测量，例如基于上述空样品或已知浓度的靶分子，或者交错浓度的靶分子。

在另一方面，本发明涉及一种从样品检测特异性靶分子如生物分子和/或确定特异性靶生物分子的浓度的测定方法，其包括使用如上文所定义的包衣，或者使用包含如上文所定义的包衣的颗粒、平结构或基质，或者使用如上文所定义的纳米颗粒。

在一特别优选的实施方案中，检测所述靶生物分子可以在光磁系统中进行，其中所述磁性纳米颗粒在静止的样品液体中被磁性驱动和光学检测，包括以下步骤：i)靶生物分子捕获，例如上文所定义的，ii)磁性驱动，以及iii)检测。

例如，通过光磁系统检测纳米颗粒可以通过以下步骤进行：(1)用输入光辐照样品体积；(2)通过磁性驱动场驱动样品体积中的如上文所定义的磁性纳米颗粒；以及(3)检测源自样品体积中输入光与所述磁性纳米颗粒的簇的相互作用的输出光。

在具体实施方案中，所述驱动场至少被暂停中断一次。已发现这种以重复脉冲计的动态驱动减少非特异性相互作用并增加结合事件的数量。还考虑修改暂停，例如暂停的持续时间和/或暂停的数量。暂停的持续时间和/或暂停的数量的相应值可以额外地从校准测量确定。优选地，暂停的范围可以在约0.1s与约10s之间，更优选在约1s与约2s之间。在另一具体实施方案中，磁性驱动场可以被约10-约50个暂停中断。在本发明的另一优选实施方案中，磁性驱动场可以旋转。

在本发明的其他具体实施方案中，输出光可以包含通过磁性颗粒的簇散射的输入光。还优选检测的簇是通过两个磁性颗粒形成的。

在另一优选实施方案中，所述磁性颗粒，优选磁性纳米颗粒可以有两种，特别是具有靶分子的不同结合位点。这类不同的结合位点可以通过存在不同的亲和分子如结合靶分子的不同表位的不同抗体来提供。还特别优选所述磁性颗粒如磁性纳米颗粒可以以夹心构型结合至样品中的靶分子。

在本发明的其他实施方案中，如上文所定义的方法或测定，例如基于包含如上文所定义的包衣、层结构或壳结构的颗粒、平结构或基质可以用于分子诊断、生物学样品分析、化学样品分析、食品分析和/或法医分析。

为了说明目的提供以下实施例和图。因此应当理解实施例和图不应理解为限制性的。本领域技术人员能够清楚地设想本文列出的原理的进一步的修改。

实施例

实施例1-具有修饰的表面结构的b-PEG-PSA纳米颗粒的制备

在具有两层壳结构的纳米颗粒的典型制备中，可商购的链霉抗生物素蛋白包被的超顺磁性颗粒(珠)用作起始材料(例如Adamtech)。在第一步中，将磁珠超声处理3次，每次在50W下3秒。将24μl的10mg/mL的链霉抗生物素蛋白包被的纳米颗粒在10mMPBS缓冲液中洗涤3次并稀释至120μl的终体积(2mg/ml)。将悬浮液再次超声处理3次，每次在50W下3秒，随后加入200μlPBS缓冲液。在下一步中，将50μl制备的链霉抗生物素蛋白包被的纳米颗粒与偶联至PSA(前列腺特异性的抗原)抗体的生物素化的PEG-接头分子(具有10kDa的分子量)(b-PEG_10kDa-PSA)温育15分钟。随后，将获得的悬浮液额外地与具有5kDa的分子量的非亲和生物素化的间隔分子(b-PEG_5kDa)的50μM溶液温育15min。将获得的悬浮液与11.62μl链霉抗生物素蛋白(1mg/ml)温育10分钟。在下一步中，加入20μl的具有10kDa的分子量的5mM非亲和生物素化的间隔分子(b-PEG_10kDa-接头)并温育15分钟。任选地，使用18.6μl的5mMb-PEG_5kDa-间隔分子。将所得的纳米颗粒溶液在测定缓冲液中洗涤3次，随后用缓冲液加至100μl的终体积。将最终的悬浮液超声处理3次，每次在50W下3秒。

实施例2-具有不同表面修饰的纳米颗粒的ζ-电位和平均直径

在这个实施例中，评价了具有不同表面修饰的纳米颗粒的特征。如实施例1的方案所述制备纳米颗粒。非放射间隔分子购自CreativePegWorks，范围高于3.5kDa，这对应于约40nm的长度。接头分子也购自CreativePegWorks。这些分子的一端偶联至生物素，而另一端偶联至N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-基团。通过NHS-化学将生物素化的聚乙二醇(PEG)接头缀合至针对PSA(前列腺特异性的抗原)的抗体。进行生物偶联，从而将一种以上PEG-接头偶联至抗体。将生物素化的抗体(25μg/mg)与链霉抗生物素蛋白包被的纳米颗粒连同非亲和间隔分子温育。每颗粒的抗体量可以通过包含抗体的接头分子和非亲和间隔分子的溶液浓度的比例来调整。选择抗体浓度，从而获得如纳米颗粒制造者所述的最大覆盖(Masterbeads500nm，StreptaDivin包被的，Ademtech-根据说明书，抗生物素蛋白的结合能力>1nM)。选择非亲和间隔分子的浓度，从而获得每链霉抗生物素蛋白包被的颗粒的生物素的最大负荷。用生物素完全覆盖纳米颗粒表面是必需的，以便避免颗粒的交联。通过链霉抗生物素蛋白的多价结合特征形成第二层的致密三维结构，链霉抗生物素蛋白的多价结合特征是由于其四聚体结构能够结合4个生物素分子。因此链霉抗生物素蛋白的多价导致如图1的右图所示的非亲和间隔分子的网。

然后通过动态光散射(DLS)分析具有不同表面修饰的纳米颗粒的特征。具体地，测量所制备的纳米颗粒表面的电荷和平均流体力学半径。结果如图2所示。左图中的图表显示纳米颗粒上的负电荷随着纳米颗粒上装载的接头/间隔分子的长度(分子量)的增加，即表面包衣的厚度的增加而逐渐减少。对于双层构型，电荷(Z-电位)达到最小值。这还指示较低的胶体稳定性，因为接头-分子的存在显著降低静电荷。图2B证实，同时平均直径随着纳米颗粒上装载的接头/间隔分子的长度(分子量)的增加而显著增加。裸露的纳米颗粒具有约510nm的直径，而具有双层包衣的纳米颗粒具有约570nm的直径。

实施例3-利用基于簇的光磁测定确定非特异性和特异性颗粒-颗粒结合

为了评价磁性颗粒的簇聚，如Ranzonietal.,2011,NanoLett,11,2017-2022所述使用生物纳米技术。这种光磁技术用来通过颗粒间的结合检测液体中的生物分子。该测定允许确定源自非特异性和特异性颗粒-颗粒结合的信号。

当抗体直接偶联至磁性纳米颗粒的表面时，即没有接头，量相当高。因此，直接偶联的纳米颗粒只可以在这样的测定中使用，当测定缓冲液中存在表面活性剂以减少非特异性相互作用。图3A示出用这种生物纳米技术测量的剂量-反应曲线，使用常用的纳米颗粒，即其中抗体直接结合，没有任何接头和包衣。较厚的水平线指示空白信号，其在确定检测极限时构成限制因素。通过纳米颗粒的非特异性结合过程确定检测极限。对于未包被的纳米颗粒，空白水平为约160V/Hz^0.5。

相比之下，如果在这个测定中使用具有如实施例1或2中制备的双层结构的纳米颗粒，则空白信号显著降低。在图3B中可以看到，空白水平降低至少于80V/Hz^0.5，即降低2倍。因此，虽然在没有表面包衣的构型中确定的检测极限为约5pM(见图3A)，但是双层结构能够使这个值显著改进至约200fM(见图3B)。重要的是，因此具有修饰的表面结构的纳米颗粒的测量不需要存在表面活性剂。因此这种空白水平的降低代表在动态范围和检测极限方面的显著改进。

实施例4-确定复杂的生物基质中的非特异性和特异性颗粒-颗粒结合

这个实施例也使用如Ranzonietal.,2011,NanoLett,11,2017-2022所述的光磁设置。分析测定在生物基质如人血浆中特别具有挑战性。与测定缓冲液相比，人血浆包含大量潜在的干扰物质和生物分子，它们可以非特异性地结合至纳米颗粒并引起严重簇聚。如上文所提到的，非特异性簇聚导致较高的空白信号并负面影响这个测定中的检测极限。

在这个实施例中，使用95%人血浆池，其事先通过用抗PSA包被的珠pull-down来耗尽前列腺特异性抗原(PSA)。图4中的图表示出具有如实施例1和2所述的双层壳结构的抗PSA包被的纳米颗粒的剂量-反应曲线。即使不用表面活性剂，这种复杂基质中测量的空白信号为140V/Hz^0.5。引人注目地，测量的背景信号因此甚至低于包含表面活性剂的测定缓冲液中未包被的纳米颗粒的空白值(见实施例3和图3A)。在较高浓度下信号的饱和可以这样解释，血浆比缓冲液粘稠约5倍，这使得难以磁性驱动。但是，在低浓度PSA下的斜率和性能特征几乎与缓冲液中的比较测量相同。检测极限仍低于0.7pM。

实施例5-确定未处理的血浆池中的非特异性和特异性颗粒-颗粒结合

应用与实施例4相同的实验设置，但是不同之处在于研究来自女性供体的未处理的血浆池。血浆包含2%w/vPluronicF127。在这个实施例中，无需如实施例4所述的PSA消耗，因为来自女性供体的血浆缺少PSA。这个实验背后的比例是通过实施例4中的PSA消耗，也从血浆中去除了一定量的非特异性相互作用分子。因此，这种实验设置提供不进行预处理的情况。

在图5中可以看到，改进的纳米颗粒的表面结构导致0.7pM的检测极限，虽然未处理的血浆中的非特异性相互作用分子的量更高。因此，在这个实验设置中，空白水平未受到负面影响，这表明双层包衣在未消耗的复杂基质中有效防止非特异性相互作用并且还增加纳米颗粒的胶体稳定性。图5A中的剂量-反应曲线示出两个斜率。在低浓度下的信号水平对应于两个颗粒的驱动器的种类，而在高于10pM浓度下的斜率对应于超过两个颗粒的簇。因此，在10pM的支点代表从两个颗粒的簇转变为具有更大簇大小的更广泛的大小分布。图5还示出在1pM(图5B)和25pM(图5C)的PSA的浓度下的频率反应。在1pM下的曲线显示在约4Hz的一个临界转换，而在25pM下的测量显示临界转换迁移至约1Hz。所述迁移是由于溶液中形成较大的簇，并且这是通过较高浓度的PSA触发的。这种测定系统中这样的对照水平证实如本文所述的纳米颗粒包衣防止复杂基质中的非特异性颗粒簇聚的能力。

Claims

1.一种包含壳结构的包衣，其中所述壳结构包含第一层和第二层，所述第一层包含一种或多种亲和分子，所述第二层偶联至所述第一层，并且其中所述第一层和第二层包含形成网的非亲和间隔分子，其中所述一种或多种亲和分子包埋在所述包衣结构内，并且其中所述网产生对非特异性分子的空间位阻，其中所述非亲和间隔分子的网是通过多价结合分子的相互作用形成的，所述多价结合分子具有对相应的相互作用配对物的高亲和力。

2.权利要求1的包衣，其中所述亲和分子选自适配体、肽、蛋白、寡核苷酸和分子印迹聚合物。

3.权利要求2的包衣，其中所述亲和分子为抗体或其片段。

4.权利要求1-3中任一项的包衣，其中所述第一层偶联至颗粒表面、平面或基质。

5.权利要求1-3中任一项的包衣，其中所述第一层偶联至纳米颗粒表面。

6.权利要求4或5的包衣，其中所述表面或所述基质的材料包含选自琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和磁性材料的材料。

7.权利要求1-3中任一项的包衣，其中所述第一层和第二层包含非亲和间隔分子，所述非亲和间隔分子包含选自以下的分子：肽、核酸、树状聚体、树枝化基元、聚合实体、金纳米颗粒和蛋白或者前述分子的混合物。

8.权利要求7的包衣，其中所述非亲和间隔分子包含聚乙二醇。

9.权利要求1-3中任一项的包衣，其中所述多价结合分子是具有多个结合位点的蛋白。

10.权利要求9的包衣，其中所述具有多个结合位点的蛋白是链霉抗生物素蛋白，并且其中所述相应的相互作用配对物是生物素。

11.权利要求1-3中任一项的包衣，其中所述非亲和间隔分子包含聚乙二醇。

12.权利要求1-3中任一项的包衣，其中所述非亲和间隔分子的长度这样选择：使得所得的壳结构的厚度大于由表面之高频、短波组分所决定的颗粒表面的平均粗糙度，和/或使得所述颗粒的静电荷降低至少50％。

13.一种颗粒、平结构或基质，其包含权利要求1-12中任一项的包衣。

14.权利要求13的颗粒，其为纳米颗粒。

15.权利要求的13或14的颗粒，其为磁性纳米颗粒。

16.权利要求13的颗粒、平结构或基质，其包含选自琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和磁性材料的材料。

17.权利要求1-12中任一项的包衣，权利要求13或16的颗粒、平结构或基质，或者权利要求14或15的纳米颗粒在从样品检测和任选地纯化特异性靶生物分子和/或确定所述特异性靶生物分子的浓度中的用途。

18.权利要求17的用途，其中通过所述亲和分子捕获所述特异性靶生物分子，并且其中通过检测分子进一步识别所述特异性靶生物分子。

19.权利要求18的用途，其中所述检测分子缀合至能够产生发光或电化学信号的酶。

20.权利要求18的用途，其中所述检测分子缀合至能够产生荧光的酶。

21.权利要求19的用途，其中所述检测分子为抗体或其片段。

22.权利要求20的用途，其中所述检测分子为抗体或其片段。

23.权利要求17-22中任一项的用途，其中通过检测包含至少两个磁性纳米颗粒和至少一个靶生物分子的簇来检测所述特异性靶生物分子，或者通过结合至传感器表面上的检测分子来检测所述特异性靶生物分子。

24.权利要求17-22中任一项的用途，其中所述纯化靶生物分子包括以下步骤：

i)靶生物分子捕获，

ii)用适当的缓冲液洗涤，以及

iii)从所述基质、表面或颗粒洗脱所述靶生物分子。

25.权利要求1-12中任一项的包衣在以下方面中的用途：

i)提高预先存在的包含亲和分子的表层的特异性，和/或

ii)防止或最小化非特异性结合至所述预先存在的表层；

其中所述包衣粘附至预先存在的亲和分子层的上方。

26.一种从样品检测特异性靶生物分子和/或确定特异性靶生物分子的浓度的测定方法，其包括使用权利要求1-12中任一项的包衣，权利要求13或16的颗粒、平结构或基质，或者权利要求14或15的纳米颗粒。

27.权利要求26的测定方法，其中检测所述靶生物分子在光磁系统中进行，其中所述磁性纳米颗粒在静止的样品溶液中被磁性驱动和光学检测，所述测定方法包括以下步骤：

i)靶生物分子捕获，

ii)磁性驱动，以及

iii)检测。