CN1875116A - 可溶性分析物的检测和扩增 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测低水平存在于样品中的目标化合物的方法。具体而言,本发明涉及通过核酸标记的结合构建物、分离未结合核酸标记的结合构建物以及液相中检测结合的核酸标记的结合构建物,检测溶液中的目标化合物的方法。本发明尤其适用于与核酸扩增反应联合,检测溶液中是否存在结合构建物的核酸部分,表明是否存在目标化合物。
Description
发明领域
本发明通常涉及化合物检测的领域,尤其是检测化合物的方法和检测化合物的试剂盒。
发明背景
过去15年以来,在患者血清中检测对病原生物的免疫应答或检测病原体相关蛋白或其它抗原,极大的得益于免疫测定法的发展。在一种形式的免疫测定中,使用识别其它物种免疫球蛋白的单克隆或多克隆抗体。这些试剂,被称为抗物种抗体,典型地使用荧光染料或酶标记它们,用于通过免疫血清中发现的免疫球蛋白检测结合的抗原。在另一种形式的被称为夹心测定的免疫测定中,定向作用病原蛋白的抗体用于从例如患者血清或脑脊液(CSF)中捕获抗原,然后通过结合另外定向作用相同抗原的标记抗体而进行检测。然而,所有这些测定受检测结合免疫球蛋白的灵敏度限制,并需要相当高摩尔浓度的标记试剂。
最近的测定法利用了核酸扩增的方法,例如用于DNA扩增的聚合酶链反应(PCR),以检测非常低水平的核酸。核酸扩增方法可允许以远低于免疫测定法的水平检测血清或环境中的病理因子。然而,这项技术对来自环境的污染通常非常敏感,并且为了鉴定核酸部分并扩增其用于检测需要目标核酸序列的现有知识。核酸扩增需要有核酸存在以进行扩增和检测,因此当目标化合物为蛋白、碳水化合物或其它非核酸分子时,不能利用或用途有限。此外,希望改进样品中化合物检测的效果和敏感度,本发明解决了存在的问题,提供了相关的益处。
发明概述
在本申请书引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体结合到本申请书中。这些文献的引用并不有意承认它们的任何一项是有关的现有技术。所有关于这些文献内容的数据或陈述的说明都基于可获自申请人的信息,不构成任何承认这些数据和文献内容的正确性。
本发明涉及检测可低水平存在于样品中的目标化合物的方法。具体而言,本发明涉及通过结合目标化合物的核酸标记的结合构建物、分离未结合的核酸标记的结合构建物、以及检测溶液相中结合的核酸标记的结合构建物,检测溶液中目标化合物的方法。本发明尤其适用于与核酸扩增方法联合使用,检测样品中是否存在结合构建物的核酸部分,因此表明是否存在目标化合物。
本发明认识到,通过从溶液中分离没有结合目标化合物的任何过量或未结合的结合构建物,因此增加了真“阳性”信号与假“阳性”信号之比,可使化合物的检测方法更灵敏,并因此更有效。本发明还提供了通用的检测系统,其不需要固相捕捉或检测目标化合物。当目标化合物包括非核酸分子如肽或蛋白时,本发明的方法还具有不需要编码目标肽或蛋白的核酸序列现有知识以鉴定它和使用DNA扩增进行检测的优点。
本发明的第一个方面是检测样品中的目标化合物的方法,包括使用结合构建物。该结合构建物包括识别和结合目标化合物的识别部分和核酸部分。当该结合构建物与样品混合时,该识别部分与目标化合物结合,形成构建物-化合物复合物。本发明也包括具有一个或多个可接近结合靶位的表面,该可接近结合靶位能结合结合构建物的识别部分。当表面与样品混合物接触时,该表面的可接近结合靶位与任何过量的或未结合的结合构建物结合,形成构建物-表面复合物。经充分孵育之后,从混合物中分离构建物-表面复合物与任何未结合或过量的表面,在溶液中留下构建物-化合物复合物。经分离之后,分析溶液以检测是否存在结合构建物的核酸部分,其中存在结合构建物的核酸部分表明样品中存在目标化合物。
本发明的第二个方面是增加液相检测样品中目标化合物的灵敏度。本方法包括提供怀疑含有目标化合物的样品;提供包括能结合目标化合物的识别部分和核酸部分的结合构建物;将样品与结合构建物接触一段时间,该时间足以允许识别部分结合样品中的任何目标化合物,因此在溶液中形成构建物-化合物复合物。本方法还包括提供一种或多种具有可接近结合靶位的表面,该结合靶位能结合识别部分;将该表面与溶液接触一段时间,该时间足以允许可接近结合靶位结合任何未结合目标化合物的结合构建物的识别部分,因此形成构建物-表面复合物。从溶液中分离构建物-表面复合物,在溶液中留下构建物-化合物复合物。检测溶液中是否存在结合构建物的核酸部分。从溶液中分离构建物-表面复合物导致基本分离所有未结合目标化合物的结合构建物,增加了检测目标化合物的灵敏度,存在结合构建物的核酸部分表明样品中存在目标化合物。
本发明的第三个方面是检测目标化合物的试剂盒,其包括含有识别部分和核酸部分的结合构建物,该识别部分识别和结合目标化合物。本发明的试剂盒也包含一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,该结合靶位能结合结合构建物的识别部分。本发明的试剂盒也可任选包括核酸扩增引物对,其中引物对的各引物在结合构建物的核酸部分的靶核酸序列3’末端与它的互补序列杂交。
附图简述
图1描述了多种结合构建物,每一种包含识别部分和核酸部分(参见实施例I)。
图2描述了多种结合构建物,其中某些已将目标化合物识别和结合到它们的识别部分,形成构建物-化合物复合物(参见实施例I)。
图3描述了具有可接近结合靶位的表面,其被结合构建物的识别部分识别并结合,形成构建物-表面复合物(参见实施例I)。
图4描述从构建物-化合物复合物分离构建物-表面复合物(参见实施例I)。
图5描述实施例II的结果:Mopep2颗粒能结合并从溶液中分离单克隆抗体12D5(12D.5Mab)辣根过氧化物酶(HRPO)缀合物,因此阻止12D.5Mab HRPO缀合物以剂量依赖方式结合到涂布Mopep2的孔上。涂布有牛血清白蛋白(BSA)的颗粒不能抑制12D.5Mab HRPO缀合物结合到涂布Mopep2的孔。OD,吸光度。
图6描述实施例IV中获得的结果,使用本发明的方法检测目标化合物,其中结合构建物的核酸部分经PCR扩增。该实验证明结合构建物Fab-DNA(Mab 12D.5/pUC19构建物)结合到目标化合物,游离抗原(OMPE或rOMPE的细菌重组片段),的能力,因此在溶液中形成构建物-化合物复合物。具有可接近结合靶位(Mopep2肽)的表面(磁性颗粒)结合任何未结合目标化合物的Fab-DNA,并使用磁体分离表面,在溶液中留下构建物-化合物复合物(结合抗原的Fab-DNA),结合构建物的核酸部分(pUC19)可用于核酸扩增。聚合酶链反应扩增导致下列样品中的可检测2.6千碱基DNA片段:790皮克、395皮克、198皮克、98皮克和12皮克。在49皮克和24皮克的样品中也观察到非常细微的2.6kb条带。
发明详述
介绍
本发明认识到,通过增加真阳性信号与假阳性信号之比,可使化合物的检测方法更灵敏,因而更有效。本发明还认识到不需要固相检测目标化合物的检测系统的通用性,还认识到从信号扩增方法(如核酸扩增)中得益的希望,甚至在检测不包含核酸的目标化合物时。
作为本发明的范围的非限制介绍,本发明包括某些常规和有用的方面,包括:
1)检测样品中目标化合物的方法,包括以下步骤:提供包含识别部分和核酸部分的结合构建物,该识别部分识别和结合目标化合物;结合构建物与样品混和以形成构建物-化合物复合物;提供一种或多种表面,其中该表面具有一个或多个能识别和结合结合构建物识别部分的可接近结合靶位;将表面引入结合构建物和样品的混合物,以使表面与任何未结合的结合构建物形成构建物-表面复合物;从混合物中分离构建物-表面复合物,留下构建物-化合物复合物;检测是否存在结合构建物的核酸部分,其中存在结合构建物的核酸部分表明样品中存在目标化合物。
2)增加液相检测目标化合物的灵敏度的方法,包括以下步骤:提供怀疑含有目标化合物的样品;提供包含识别部分和核酸部分的结合构建物,该识别部分能结合目标化合物;样品与结合构建物接触一段时间,该时间足以允许识别部分结合样品中的任何目标化合物,因此在溶液中形成构建物-化合物复合物;提供一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,该结合靶位能结合识别部分;使表面与溶液接触一段时间,该时间足以允许可接近结合靶位结合任何未结合目标化合物的结合构建物的识别部分,因此形成构建物-表面复合物;从溶液中分离构建物-表面复合物,在溶液中留下构建物-化合物复合物;检测在溶液中是否存在结合构建物的核酸部分,其中从溶液中分离构建物-表面复合物导致基本分离了所有未结合目标化合物的结合构建物,增加了检测目标化合物的灵敏度,其中存在结合构建物的核酸部分表明样品中存在目标化合物。
3)检测目标化合物的试剂盒,包含:含有识别部分和核酸部分的结合构建物,该识别部分识别和结合目标化合物;一种或多种表面,其中该表面具有一个或多个已知能结合结合构建物识别部分的可接近结合靶位。该试剂盒任选包含核酸引物对,其中引物对的各引物在结合构建物核酸部分的靶序列3’末端与其互补序列杂交。
本发明涉及依靠能识别和结合目标化合物的核酸标记的结合构建物,检测样品中存在的目标化合物的灵敏方法,样品如生物液体、生物抽提物或环境样品。这种化合物的检测方法被称为可溶性分析物检测和扩增。本发明提供了检测目标化合物的方法,其尤其适用于目标化合物低水平存在于样品中的样品。“灵敏度”可定义为通过系统检测到的真阳性的比例,该系统设计为区分通常称为阳性和阴性的两类。本发明提供了增强的检测灵敏度,因为可能提供了甚至过量的结合构建物,然后从样品中分离任何未结合的(即没有结合目标化合物)或过量的结合构建物(其检测将导致假“阳性”信号),因此在溶液中只留下构建物-化合物复合物中的结合目标化合物的结合构建物,以用于检测为真“阳性”信号。因此,检测灵敏度与从溶液中分离未结合或过量的结合构建物的效率成比例。本发明也通常更通用,因为检测发生在溶液相,不限于固相检测。此外,只需要一种结合实体(结合构建物)以识别和结合目标化合物,从而避免了使用两种结合实体的方法伴随的问题,例如,由第一种抗体结合引起的构象变化导致的位阻或敏感性潜在丢失的问题,例如可发生在,例如,双抗体夹心分析法中。
随着说明的进行并当与附图组合时,本发明的其它目的和优点将是显而易见的。为获得本发明范围完整的正确评价,将进一步认识到可组合本发明的各个方面以获得本发明希望的实施方案。
除非另有说明,所有本文使用的技术和科学术语都具有本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同含意。通常,本文使用的命名法和如下描述的制造或实验室方法是公知的,并普遍应用于本领域。本文使用的技术术语具有本领域使用的普通含义,如各种技术字典所例证。当提供的术语为单数形式时,发明者也考虑到了此术语的复数形式。本文使用的命名法和如下描述的操作是公知的并普遍应用于本领域。当通过引用结合到本文中的参考文献使用的术语和定义有不符之处时,用于本申请的术语具有本文中给出的定义。用于本文的其它技术术语具有其使用领域中的其普通含义,为各种技术字典所例证(例如Chambers Dictionary of Science和Technology,Peter M.B.Walker(editor),Chambers Harrap Publishers,Ltd.,Edinburgh,UK,1999,1325页)。发明人无意限制作用的机制或方式。提供其参考文献只是为了说明目的。
I检测样品中的目标化合物的方法
本发明的第一种方法包括检测样品中的目标化合物的灵敏方法,其能检测到样品中存在的非常微量的化合物。本发明的第一种方法包括通过核酸标记的结合构建物识别目标化合物,依靠一种或多种具有一个或多个结合靶位的表面分离未结合的核酸标记结合构建物,检测溶液中是否存在结合构建物的核酸部分,其中存在结合构建物的核酸部分表明样品中存在目标化合物。怀疑含有目标化合物的样品可以是,例如,完全天然来源的,完全非天然来源的(如合成来源),或天然和非天然来源的组合。样品可包括全细胞、组织、器官、生物液体、抽提物或环境样品。
本发明的第一种方法包括使用结合构建物。将结合构建物与样品混合,允许结合构建物的识别部分结合到目标化合物,以在溶液中形成构建物-化合物复合物。
结合构建物包含可识别和结合到目标化合物的识别部分以及核酸部分。该识别部分事实上可包含任何能识别和结合目标化合物的分子或分子组合。这种识别部分可包括但不限于,肽、多肽、抗体、Fab片段、核酸、核酸模拟物、细胞表面抗原、碳水化合物或其组合。在一个实施方案中,识别部分包括抗体(天然的、修饰的或重组的)或抗体片段(如Fab片段或单链抗体可变区片段)。在另一个实施方案中,识别部分可以是结合抗体的抗原、结合靶如肽或小分子的适体或结合配基的受体。在一个优选实施方案中,识别部分单价结合到目标化合物上。在另一个优选实施方案中,识别部分多价结合,例如二价和任选双特异性结合目标化合物。
结合构建物的核酸部分可包括能被检测的任何核酸或核酸模拟物。用作结合构建物核酸部分的核酸可包括任何类型的核酸,例如DNA或RNA、或核酸模拟物(例如,但不限于,肽核酸)或其组合。本发明的核酸可以是单链或双链。在一个优选实施方案中,本发明的结合构建物包括核酸部分,其中核酸部分的序列不包括预期在样品中存在的序列,因此有理由期待较不易受到样品中核酸序列的污染,但是要设计成容易检测到。核酸部分优选足够长以容易通过所选择的检测方法检测到。
识别部分可通过任何方法、共价或非共价、直接或间接连接于核酸部分,其取决于给定识别部分的性质。非共价连接方法包括但不限于物理吸附、静电力、离子相互作用、氢键、亲水-疏水相互作用、范德华力和磁力。其中希望的是,例如,当需要增加灵活性时,可使用间隔臂间接将识别部分连接于核酸部分。优选的是,通过共价键或通过高亲和的非共价键相互作用(如生物素和抗生物素蛋白的作用),将识别部分连接于核酸部分。
本发明的第一种方法包括使用一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,该结合靶位已知为识别并结合结合构建物的识别部分。这种表面可以是任何能从液体样品中分离的颗粒,或这种表面可以是非颗粒表面如平面或非平面表面,或其组合。该表面可任选被封装,例如,封装入室中。结合靶位可包括任何能识别和结合到结合构建物的识别部分的靶位,例如,抗体可变区的肽模拟表位或表位模拟物、全抗原或半抗原、核酸或糖部分。该可接近结合靶位可通过任何方法连接至表面,这取决于给定表面和结合靶位的性质。
当将表面引入样品与结合构建物的混合物时,充分孵育后,表面的可接近结合靶位结合了任何未结合的结合构建物的识别部分,形成构建物-表面复合物。然后通过适合使用的表面类型的方法,例如,磁体或分离的磁性颗粒,从平面表面倾析,或通过压力或真空、离心或过滤分离,从样品溶液中将构建物-表面和任何过量的未结合的表面从构建物-化合物复合物中分离出来。或者,任何未结合目标化合物形成构建物-化合物复合物的结合构建物,都可通过以下方法从溶液中分离出来,例如但不限于沉淀、盐析、分子排阻或过滤、萃取或相分离。
分离步骤后,通过检测是否存在结合构建物的核酸部分,确定样品中是否存在目标化合物。可通过任何能检测是否存在核酸的方法,例如酶扩增、杂交或标记检测,检测是否存在结合构建物的核酸部分。在本发明的一个实施方案中,优选可使该方法适合于通过核酸部分的扩增,例如依靠使用合适引物的聚合酶链反应,检测是否存在结合构建物的核酸部分。在这个实施方案中,只需要少数、最少只要一个构建物-化合物复合物用作核酸扩增的模板。通过任何合适的方法,例如,使用标记的寡核苷酸或通过检测聚丙烯酰胺凝胶电泳上适当的条带,可测量或检测扩增的核酸。
在本发明的一个实施方案中,待分析的样品可含有两种或更多目标化合物。为了检测样品中的两种或更多不同的目标化合物,提供了两种或更多不同类型的结合构建物,每一类结合构建物都具有能识别不同化合物的不同识别部分。为了检测样品中是否存在两种或更多目标化合物,每类结合构建物都包括各类独特的核酸部分。
II.提高液相检测目标化合物灵敏度的方法
本发明的第二种方法包括提高液相检测目标化合物灵敏度的方法。该方法尤其适合于怀疑含有低浓度或少量目标化合物的样品。
本发明的第二种方法包括以下步骤:提供怀疑含有目标化合物的样品;提供了包含能结合目标化合物的识别部分和核酸部分的结合构建物;将样品与结合构建物接触一段时间,该时间足以允许识别部分结合样品中的任何目标化合物,因此在溶液中形成构建物-化合物复合物;提供一种或多种具有一个或多个能结合到识别部分的可接近结合靶位的表面;将表面与溶液接触一段时间,该时间足以使得可接近结合靶位结合任何未结合目标化合物的结合构建物的识别部分,因此形成构建物-表面复合物;从溶液中分离构建物-表面复合物,在溶液中留下构建物-化合物复合物;检测溶液中是否存在结合构建物的核酸部分,其中从溶液中分离构建物-表面复合物导致基本分离了所有未结合目标化合物的结合构建物,增加了检测目标化合物的灵敏度,其中存在结合构建物的核酸部分表明样品中存在目标化合物。
本发明的第二种方法包括提供怀疑含有目标化合物的样品和提供结合构建物的步骤。怀疑含有目标化合物的样品可以是,例如,完全天然来源的,完全非天然来源的(如合成来源),或天然和非天然来源的组合。样品可包括全细胞、组织、器官、生物液体、抽提物或环境样品。结合构建物包括可识别和结合目标化合物的识别部分和核酸部分。将样品与结合构建物接触一段时间,该时间足以允许结合构建物的识别部分结合目标化合物,在溶液中形成构建物-化合物复合物。
结合构建物的识别部分事实上可包括任何能识别和结合目标化合物的分子或分子组合。这种识别部分可包括但不限于肽、多肽、抗体、Fab片段、核酸、核酸模拟物、细胞表面抗原、碳水化合物或其组合。在一个实施方案中,识别部分包括抗体(天然的、修饰的或重组的)或抗体片段(如Fab片段或单链抗体可变区片段)。在另外的实施方案中,识别部分可以是结合抗体的抗原、结合靶如肽或小分子的适体或结合配基的受体。在一个优选实施方案中,识别部分单价结合到目标化合物。在另一个优选实施方案中,识别部分多价,例如,二价或任选双特异性结合到目标化合物。
结合构建物的核酸部分可包含能被检测到的任何核酸或核酸模拟物。用作结合构建物核酸部分的核酸可包括任何类型的核酸,例如DNA或RNA,或核酸模拟物(例如,但不限于,肽核酸),或其组合。本发明的核酸可以是单链或双链。在一个优选实施方案中,本发明的结合构建物包括核酸部分,其中,核酸部分的序列不包括预期在样品中存在的序列,因此可有理由预期样品较不易受到样品中核酸序列的污染,但是要设计成容易检测。核酸部分优选足够长以容易被所选择的检测方法检测到。
识别部分可通过任何方法,共价或非共价、直接或间接连接于核酸部分,其取决于给定核酸部分的性质。非共价结合的方法包括但不限于物理吸附、静电力、离子相互作用、氢键、亲水-疏水相互作用、范德华力和磁力。其中希望的是,例如,当需要增加灵活性时,可使用间隔臂间接将识别部分结合于核酸部分。优选的是,通过共价键或通过高亲和力的非共价相互作用(如生物素和抗生物素蛋白的作用),使识别部分连接至核酸部分。
本发明的第二种方法包括提供一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,已知该结合靶位识别并结合到结合构建物的识别部分。这种表面可以是任何能从液体样品中分离的颗粒,或这种表面可以是非颗粒表面,如平面或非平面,或其组合。该表面可被任选封装,例如,封装入室中。结合靶位可包含任何能识别和结合结合构建物识别部分的靶位,例如,抗体可变区的肽模拟表位或表位模拟物、全抗原或半抗原、核酸或糖部分。该可接近结合靶位可通过任何方法连接表面,这取决于给定表面和结合靶位的性质。
将表面与溶液接触一段时间,该时间足以使可接近结合靶位结合任何未结合目标化合物的结合构建物的识别部分,因此形成构建物-表面复合物。从溶液中分离构建物-表面复合物和任何过量的未结合表面,留下构建物-化合物复合物。可通过任何适合于所使用表面的方法进行分离,例如,分离磁性颗粒的磁体,从平面表面倾析,或通过压力或真空、离心或过滤分离。或者,可通过方法例如,但不限于,沉淀、“盐析”、分子排阻或过滤、萃取或相分离,从溶液中分离任何未结合目标化合物形成构建物-化合物复合物的结合构建物。分离构建物-表面复合物和任何过量的未结合表面导致基本分离了所有未结合目标化合物的结合构建物。最优选的是,所有的未结合目标化合物的结合构建物都从溶液中分离出来。构建物-表面复合物和任何过量未结合表面的分离导致减少了由未结合目标化合物的结合复合物产生的假阳性信号,因此相对没有分离未结合的或过量的结合构建物的测定,增加了检测目标化合物的灵敏度。
经分离步骤后,通过检测是否存在结合构建物的核酸部分,确定样品中是否存在目标化合物。通过任何能检测是否存在核酸的方法,例如,酶扩增、杂交或标记检测,可检测是否存在结合构建物的核酸部分。在本发明的一个实施方案中,优选可使该方法适合于通过核酸部分的扩增,例如依靠使用适合引物的聚合酶链反应,检测是否存在结合构建物的核酸部分。在这个实施方案中,只需要少数、最少只要一个构建物-化合物复合物作为核酸扩增的模板。通过合适的方法,例如,使用标记的寡核苷酸或通过检测聚丙烯酰胺凝胶电泳上适当的条带,测量或检测扩增的核酸。
在本发明的一个实施方案中,待分析的样品可含有两种或更多目标化合物。为了检测样品中的两种或更多种不同的目标化合物,提供了两种或更多不同类型的结合构建物,每一种都具有能识别不同化合物的不同识别部分。为了检测样品中是否存在两者或更多种目标化合物,每一类型的结合构建物包含各类独特的核酸部分。
III.检测目标化合物的试剂盒
本发明也包括用于检测样品中的目标化合物的试剂盒,其能检测样品中存在的非常微量的目标化合物。
本发明的试剂盒包含结合构建物。该结合构建物包括能识别和结合目标化合物的识别部分和核酸部分。识别部分事实上可包括能识别和结合目标化合物的任何分子或分子组合。这种识别部分可包括,不限于,肽、多肽、抗体、Fab片段、核酸、核酸模拟物、细胞表面抗原、碳水化合物或其组合。在一个实施方案中,识别部分包括抗体(天然的、修饰的或重组的)或抗体片段(如Fab或单链抗体可变区片段)。在另外的实施方案中,识别部分可以是结合抗体的抗原、结合靶如肽或小分子的适体或结合配基的受体。在一个优选实施方案中,识别部分单价结合目标化合物。在另一个优选实施方案中,识别部分多价结合,例如二价和任选双特异性结合目标化合物。
结合构建物的核酸部分可包括能检测到的任何核酸或核酸模拟物。用作结合构建物核酸部分的核酸可包括任何类型的核酸,例如DNA或RNA或核酸模拟物(例如,但不限于,肽核酸),或其组合。本发明的核酸可以是单链或双链。在一个优选实施方案中,本发明的结合构建物包括核酸部分,其中核酸部分的序列不包括预期在样品中存在的序列,因此可有理由预期样品较不易受到样品中核酸序列的污染,但是要设计成容易检测。核酸部分优选充分长以容易被所选择的检测方法检测到。
识别部分可通过任何方法,共价或非共价、直接或间接连接于核酸部分,这取决于给定核酸部分的性质。非共价结合的方法包括但不限于物理吸附、静电力、离子相互作用、氢键、亲水-疏水相互作用、范德华力和磁力。其中预期的是,例如,当需要增加灵活性时,可使用间隔臂将识别部分间接结合于核酸部分。优选的是,通过共价键或通过高亲和力的非共价相互作用(如生物素和抗生物素蛋白的作用),使识别部分连接至核酸部分。
本发明的试剂盒也包括一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,已知该结合靶位识别并结合结合构建物的识别部分。这种表面可以是任何能从液体样品中分离的颗粒,或这种样品可以是非颗粒表面,例如平面或非平面,或其组合。该表面可被任选封装,例如,封装入室中。结合靶位可包含任何能识别和结合结合构建物识别部分的靶位,例如,抗体可变区的肽模拟表位或表位模拟物、全抗原或半抗原、核酸或糖部分。该可接近结合靶位可通过任何方法连接表面,这取决于给定物质和结合靶位的性质。
在结合构建物的核酸部分通过核酸扩增检测的实施方案中,试剂盒可任选包括核酸扩增引物对,例如PCR引物对,其中引物对的各引物在核酸部分的靶核酸序列3’末端与它的互补序列杂交。该试剂盒还任选包括核酸扩增的酶,例如Taq聚合酶或RNA逆转录酶。在结合构建物的核酸部分通过核酸杂交检测的实施方案中,试剂盒可包含一种或多种杂交探针,例如使用可检测标记标记的寡核苷酸。在包括信号放大的实施方案中,试剂盒任选包括进行信号放大所需的试剂,如酶或底物。本发明的试剂盒可任选包括直接检测结合构建物核酸部分的试剂,例如分子指示物或合适的抗体。该试剂盒任选包括分离构建物-表面复合物和任何未结合表面的方法,例如,磁体用于其中该表面为磁性颗粒的实施方案,滤器用于其中表面为可滤颗粒的实施方案,或移液器用于其中表面为管壁的实施方案。
任选试剂盒可包括使用试剂盒的说明。这种说明可以是任何合适的形式,例如小册子、传单、手册、不装订的小册或视听材料。优选说明为足够详细的说明,以允许试剂盒的使用者成功地使用试剂盒检测样品中的目标化合物。这种说明可包括,例如,混合试剂、操作试剂盒元件、样品适当处理的说明、安全测量和解释结果的指南,以及故障检查说明。
目标化合物
本发明的方法和试剂盒可用于检测各类目标化合物。该方法尤其适用于检测怀疑以少量或低浓度存在于样品中的目标化合物。目标化合物可包括但不限于核酸、肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、凝集素、抗体、酶和受体;碳水化合物(单糖、寡糖和多糖)和糖基化的分子;脂质、脂肪和脂化的分子;全抗原或半抗原。目标化合物可以是小分子(例如,受体的配基、滥用的药物、无机离子、金属或螯合物、代谢物、化学中间体或天然产物)。目标化合物可以是单体、低聚体或聚合物;它们也可以是多分子组件(例如,淀粉样蛋白β初原纤维、肌养蛋白-糖蛋白装配物、蛋白体、侣伴蛋白或细胞壁或细胞膜的片段)。目标化合物可以是完全天然来源的、完全人工来源或两者的组合(例如经化学或物理修饰的天然来源化合物)。
样品
本发明的方法可用于任何合适的怀疑含有目标化合物的样品。该样品可以是完全天然来源的、完全非天然来源的(例如合成来源)、或天然来源和非天然来源的组合。样品可包括全细胞(例如原核细胞、细菌细胞、真核细胞、植物细胞、真菌细胞或来自多细胞生物的细胞(包括无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物和人类))、组织、器官、或生物液体(例如但不限于血液、血清、血浆、尿、精液和脑脊液)。样品可以是从生物材料制得的抽提物,例如来自原核生物、细菌、真核生物、植物、真菌、多细胞生物或动物、无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物、非人哺乳动物和人类。样品可以是从以下制得的抽提物:全生物体或生物体部分、细胞、器官、组织、液体、全培养物或培养物部分、或环境样品或其部分。用于本发明方法的样品可需最少制备(例如收集于合适的容器),或更多制备(例如,但不限于,去除、灭活或阻断不希望的物质或污染物、过滤、尺寸选择、亲和提纯、细胞溶解或组织消化、浓缩或稀释)。样品可为任何相(固相、液相或气相)、在溶液或悬浮液中,只要可处理它(例如通过机械破碎、裂解、加热、添加溶剂或悬浮剂)以允许检测溶液中的构建物-化合物复合物。例如,样品可以是土壤样品,其可悬浮于水缓冲液中,在引入结合构建物之前任选过滤去除不希望的颗粒。
结合构建物
本发明包括结合构建物。该结合构建物包含能识别和结合目标化合物的识别部分和核酸部分。识别部分事实上可以是任何能识别和结合目标化合物的分子或分子组合。这种识别部分可包括但不限于肽、多肽、模拟表位、抗体、Fab片段、核酸、核酸模拟物、适体、细胞表面抗原、碳水化合物、小分子(如小分子抗原或受体的配基)、无机离子或螯合物、或其组合。尤其优选的是能单价结合目标化合物的识别部分。
在一个实施方案中,识别部分为抗体,例如,人或其它哺乳动物的IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、SigA或IgE或鸟类IgY,在另一个优选的实施方案中,识别部分为抗体片段。抗目标化合物的抗体和抗体片段的制备为本领所熟知。这些技术描述于,例如,Antibodies,A Laboratory Manual,(Harlow和Lane)Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988),在Using Antibodies,A LaboratoryManual,(Harlow和Lane)Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)中得到更新。当识别部分是抗体或抗体片段时,其可以是天然的(如从血清中分离到的免疫球蛋白)、修饰的(如还原的或去糖基化的抗体)、重组体(如由噬菌体展示技术生产的抗体)或其组合。
识别部分可以是天然的、修饰的或重组的抗体结合片段,如Fab片段、或如单链抗体可变区片段或ScFv,ScFv中免疫球蛋白轻链和重链域的重组可变区通过连接序列相连(Pantoliano等,(1991)Biochemistry,30:10117-10125)。在一个实施方案中,结合构建物的识别部分包括Fab片段,能单价结合目标化合物。通过还原或酶裂解二硫键(此二硫键使得重链连接在一起),裂解抗目标化合物的抗体,将抗体转化成两个独立的Fab片段,每一个片段都能识别和结合目标化合物,并具有可连接到其它分子(如结合构建物的核酸部分)的活化巯基,这时可生产抗目标化合物的Fab片段。在一个实施方案中,Fab片段可通过Fab片段游离的巯基直接共价结合核酸部分,因此形成了结合构建物。在另一个实施方案中,通过能特异结合所述Fab片段和所述核酸部分的双功能连接体,Fab片段可间接共价结合到结合构建物的核酸部分,形成结合构建物。或者,本发明的识别部分也可通过非共价方式连接核酸部分,例如,通过抗生物素蛋白-生物素相互作用、锌-多聚组氨酸相互作用、抗体-抗原相互作用、适体-肽相互作用,或通过能结合核酸的其它多肽如结合锌的多肽域。
识别部分(例如,肽、模拟表位、抗体或适体)可包括天然分子、人工分子、融合或嵌合分子、随机或非随机组合合成获得的分子(Dooley和Houghten(1993)Life Sci.,52:1509-1517;Kramer等,(1993)Peptide Res.,6:314-319;Folgori等,(1994)EMBO J.,13:2236-2243;Smith & Petrenko(1997)Chem.Rev.,97:391-410),或通过定向进化方法如酵母双杂交系统、蛋白片段互补测定、噬菌体展示、核糖体展示、酵母表面展示和细菌表面展示技术获得的分子(Crameri和Suter(1993)Gene,137:69-75;Meola等,(1995)J.Immunol.,154:3162-3172;Georgiou等,(1997)Nature Biotechnol.,15:29-34;Mossner和Pluckthun(2001)Chimia,55:324;B.K Kay,J.Winter和J.McCafferty(editors),″Phage Display of Peptides and proteins:A Laboratory Manual″,Academic Press,Inc.,San Diego,1996,344页),或其组合。也可通过本领域已知的合适方法,例如,通过亲和选择、亲和纯化、反复淘选或表面等离子共振技术(Fagerstam等,(1991)J.Mol.Recognition,3:208-214;Houshmand等,(1999)Anal.Biochem.,268:363-370),选择识别部分识别和结合目标化合物的能力。
结合构建物的识别部分可以单价或多价形式结合目标化合物。在一个优选实施方案中,结合构建物的识别部分与目标化合物的结合是单价的。单价结合的实例包括但不限于单价结合抗原的Fab片段、单价结合配基的受体分子、单价结合肽的适体。在某些其它实施方案中,结合构建物的识别部分与目标化合物的结合可优选是多价的,例如,二价或三价。多价可为希望的,例如,以增加结合构建物和目标化合物之间的亲合力。在某些实施方案中,结合构建物的识别部分与目标化合物的结合可以是二价和双特异的(即识别部分可结合和识别目标化合物的两种独立的特异性结合位点)。二价单特异性结合的实例是设计成单特异性结合的二聚抗体片段或双抗体(Holliger等,(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA,90:6444-6448)。二价双特异性抗体的实例是设计成结合目标化合物两种不同结合位点的双抗体。
结合构建物的核酸部分可包括任何能检测到的核酸或核酸模拟物。用作结合构建物核酸部分的核酸可包括任何类型的核酸,例如DNA或RNA、或核酸模拟物(例如但不限于肽核酸)、或其组合。在这方面,结合构建物的核酸部分作为标记用于检测,例如,通过核酸扩增、核酸杂交、酶信号放大、标记的检测或这些检测方法的组合进行检测。本发明的核酸可以是单链或双链。
在一个优选实施方案中,本发明的结合构建物包括核酸部分,其中核酸部分的序列不包括预期在样品中存在的序列,因此可有理由预期样品较不易受到样品中核酸序列的污染,但是要设计成容易检测。例如,当样品是来自哺乳动物的血清样品时,核酸部分的序列可包括认为只存在于高等植物中的核酸序列,因此不可能在哺乳动物血清中存在。在另一个优选实施方案中,本发明的结合构建物包括核酸部分,其中核酸部分的序列不包括认为天然出现的序列。在其它实施方案中,本发明的核酸部分可包括人工衍生序列(例如通过随机或非随机组合方法获得的序列)或重复序列,例如,可与单一杂交引物或探针互补的重复序列。在其它的实施方案中,本发明的核酸部分可包括多个重复的核酸部分,串联或并列连接至识别部分。
核酸部分优选足够长,以容易被所选择的检测方法检测到。当核酸部分的检测包括核酸扩增时,核酸部分优选包含长度约50到约5000个核苷酸的单链,或约100到约4000个核苷酸,或约200到约3000个核苷酸。然而,核酸部分可包括适合所选择核酸部分扩增方法(例如PCR或逆转录PCR)的任何数量的核苷酸。当核酸部分的检测不包括核酸扩增时,核酸部分优选包括约4个核苷酸至约5000个核苷酸长度的单链,或约20个核苷酸至约4000个核苷酸,或约100个核苷酸至约3000个核苷酸。然而,核酸部分可包括适合所选检测核酸部分方法的任何数量的核苷酸。
识别部分可通过任何方法共价或非共价、直接或间接连接至核酸部分,取决于给定识别部分和核酸部分的性质。这种连接方法可以是,例如,本领域已知的共价交联以及非共价连接方法(参见例如R P.Haugland,″Handbook of Fluorescent Probes和Research Products″,9th edition,J.Gregory(editor),Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR,USA,2002,966 pp.;Seitz和Kohler(2001),Chemistry,7:3911-3925;PierceTechnical Handbook,Pierce Biotechnology,Inc.,1994,Rockford,IL)。需要时,例如,当需要增加灵活性时,可使用间隔臂将识别部分连接至核酸部分(Keyes等,(1997)Biophys.J,72:282-90;Hustedt等,(1995)Biochemistry,34:4369-4375;Pierce Technical Handbook,PierceBiotechnology,Inc.,1994,Rockford,IL)。在一个实施方案中,识别部分通过共价键结合核酸部分。共价方法为本领域所熟知,可包括,例如,使用反应基团、化学修饰或活化、光活化交联、或双功能或三功能交联剂(Pierce Technical Handbook,Pierce Biotechnology,Inc.,1994,Rockford,IL)。在另一个实施方案中,识别部分通过非共价方法结合核酸部分。非共价方法包括但不限于物理吸附、静电力、离子相互作用、氢键、亲水-疏水相互作用、范德华力和磁力。可使用共价和非共价连接方法的组合。例如,可生物素化核酸部分(或核酸部分的重复)和非共价连接多价的抗生物素蛋白部分,该抗生物素蛋白与识别部分共价交联。
表面和可接近结合靶位
本发明也包括一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,已知该结合靶位识别和结合结合构建物的识别部分。这种表面可以是颗粒表面或非颗粒表面,可以由任何合适的材料制成,例如但不限于塑料、聚合物、陶瓷、玻璃、二氧化硅化合物、修饰的二氧化硅化合物、碳氟化合物、金属或金属氧化物、吸着剂、树脂、生物材料(例如,多肽和碳水化合物)或其组合。颗粒表面可以是任何能与液体样品分离的颗粒,例如磁性颗粒、聚合物颗粒、玻璃颗粒、二氧化硅颗粒、陶瓷颗粒等。颗粒表面可以是任何形状,包括球状、非球状、对称、不对称或不规则的;它们的尺寸可均匀或不均匀。颗粒表面可采取任何合适的形式,例如,粉末、珠、纤维、大分子聚集物、纳米颗粒或纳米管。任选可将颗粒表面封装入室中,例如封装入可重复利用的或一次性的筒、盒、或插入片中。非颗粒表面包括但不限于平面或非平面表面(例如,管或孔的侧面)、非多孔薄膜或膜、多孔薄膜或膜、纤维、填充物、筛孔、网格、滤器、基质、凝胶或其组合。
本发明的可接近结合靶位可以是任何能识别和结合结合构建物识别部分的结合靶位,例如,核酸、抗体可变区的肽模拟表位或表位模拟物(Geysen等,(1986)Mol.Immunol,23:709-715)、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、凝集素、抗体、酶、受体、碳水化合物(单糖、寡糖和多糖)和糖基化的分子;脂质、脂肪和脂化的分子;全抗原或半抗原;小分子(例如受体的配基、滥用的药物、无机离子或螯合物、代谢物、化学中间体或天然产物)。可接近结合靶位可以是单体、寡聚体、多聚体;它们也可以是多分子组件。可接近结合靶位可以是完全天然来源的、完全人工来源的或两者的组合(如经化学修饰的天然来源化合物)。
可接近结合靶位可通过任何方法,共价或非共价、直接或间接连接至表面,这取决于给定表面和可接近结合靶位的性质。可接近结合靶位可通过共价键连接表面,例如,使用合适的试剂,使可接近结合靶位的化学活性基团与表面的化学活性基团的反应。例如,具有伯胺的结合靶位可使用氰基硼氢化钠连接到结合氨基的支持物上,形成仲胺;具有碳水化合物的结合靶位可连接到具有游离酰肼基团的表面,形成稳定的腙键。在另外的实例中,盐酸1-乙基-3[3-二甲氨基丙基]-碳二亚胺(EDC)可用于将羧基连接到具有伯胺的表面。可接近结合靶位可通过非共价形式连接到表面,包括但不限于物理吸附、静电力、离子相互作用、氢键、亲水-疏水相互作用、范德华力和磁力。非共价方式的非限制性实例包括生物素-抗生物素蛋白相互作用、A蛋白或G蛋白与免疫球蛋白的相互作用,和抗原-抗体相互作用。
可接近结合靶位可通过各种表面化学方法共价连接至表面,例如但不限于聚合物、陶瓷、玻璃、硅或有机表面。容易获得带有羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基官能团的表面,无论是颗粒还是非颗粒。在一个实施方案中,其中表面是磁性颗粒,可使用商业化的磁性材料,可选择性质以允许希望的可接近结合靶位连接到磁性颗粒。例如,商业可获得的磁性颗粒材料Micromod、Nanomag SilicaTM、NH250(目录编号13-01-252,Micromod Partikeltechnologie GmbH,Rostock-Wamemuende,Germany)在其表面上含有游离的氨基,其能与交联剂反应,例如(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(SIAB)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基SMCC),每一个都具有氨基活性末端和巯基活性末端。SIAB的NSH酯可偶联到含有伯氨基的分子,确保反应得到稳定的酰胺键。
分离
使用合适的分离方法,在样品溶液中将构建物-表面和任何过量的未结合表面与构建物-化合物复合物分离,分离方法取决于使用的表面类型。这类方法可包括但不限于通过压力或真空、离心、分子排阻、过滤或其组合。下面是分离的非限制性实例。当表面为颗粒(例如粉末、殊、维、大分子聚集物、纳米颗粒或纳米管)时,构建物-表面复合物可通过沉淀、离心、过滤、分子排阻或非共价吸引(例如电荷或疏水相互作用)。当表面是平面或非平面非颗粒(例如微量滴定孔或管或容器的壁)时,可通过倾析或抽吸分离构建物-表面复合物。当表面是磁性颗粒时,可通过应用磁力,如通过暴露于磁体,从混合物中分离构建物-表面复合物。
在一个实施方案中,表面可永久或临时封装入室中(如管、筒、柱或盒),这可有利于分离过量或未结合的结合构建物。例如,含有样品和结合构建物的混合物可经过含有结合可接近结合靶位的表面(如珠、基质、凝胶或滤器)的筒或柱,由此洗脱或经过筒或柱的溶液除去了过量的或未结合的结合构建物。
在某些实施方案中,当足以从液相检测步骤中分离构建物-表面复合物时,从混合物中分离构建物-表面复合物不需要从溶液中物理清除构建物-表面复合物。例如,当表面是磁性颗粒时,通过应用磁力,例如,应用于含有混合物的容器侧壁,因此将磁性颗粒吸引到容器的侧壁,并从溶液分离出来,允许取等分溶液作为样品用于检测步骤,可适当地完成分离构建物-表面复合物和混合物。
在一个替代性实施方案中,构建物-化合物复合物中任何未结合目标化合物的结合构建物都可通过以下方法从溶液中分离,例如,但不限于,沉淀、“盐析”、分子排阻或过滤、萃取或相分离。在这个替代性实施方案中,本发明方法的原理保持相同,也就是说,(1)只使用单种结合实体(结合构建物);(2)基本分离了所有未结合目标化合物的结合构建物,导致真“阳性”信号与假“阳性”信号之比增加,因此增加了检测目标化合物的灵敏度;(3)液相中检测,不需要进行固相检测;(4)不需要目标化合物核酸序列的现有知识。
检测
分离步骤之后,通过检测是否存在结合构建物的核酸部分,指示样品中是否存在目标化合物。可通过任何能检测是否存在核酸的方法,不一定包括核酸扩增,例如,酶扩增、杂交或标记检测,检测是否存在结合构建物的核酸部分。可通过任何适合于此目的的方法进行结合构建物的核酸部分的检测。这些方法为本领域所熟知,包括但不限于核酸部分的扩增、核酸部分的杂交、信号的放大、标记的检测或其组合。
本发明的方法可包括核酸部分的核酸扩增。本发明的优选实施方案能检测微量或低浓度的目标化合物,能扩增和检测少许、最少一个构建物-化合物复合物。在这种优选的实施方案中,只需要少许、最少只要一个构建物-化合物复合物保留在溶液中,以在分离构建物-表面复合物之后作为扩增模板。可通过任何合适的方法,例如,使用标记的寡核苷酸作为杂交探针或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测合适大小的扩增片段,测量或检测扩增的核酸。扩增核酸部分可使用任何合适的扩增方法,例如聚合酶链反应扩增或逆转录扩增(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Joseph Sambrook等,ColdSpring Harbor Laboratory,2001,999页;Short Protocols in MolecularBiology,Frederick M.Ausubel等(editors),John Wiley & amp;Sons,2002,1548页)、滚环扩增(Liu等(1996),J.Am.Chem.Soc.,118:1587-1594)、反义RNA扩增(Phillips和Eberwine(1996)Methods,10:283-288)、链置换扩增技术(Walker等(1992),Nucleic Acids Res.,20:1691-1696)、混合引物/链置换扩增(美国专利第6,251,639号,Kum,″Methods andcompositions for linear isothermal amplification of polynucleotidesequences,using a RNA-DNA composite primer″,2006年1月26日刊发)、Q-β复制酶介导的扩增(Lomeli等(1989)Clin.Chem.,35:1826-1831)、连锁线性扩增(linked linear amplification)(Reyes等(2001)Clin.Chem.,47:31-40)、自主序列复制(3SR)(Fahy等,(1991)Genome Res.,1:25-33)、或其它的本领域已知的扩增方法(Andras等,(2001)Mol.Biotechnol.,19:29-44)。检测结合构建物核酸部分的另外方法可以是,例如,通过引物延伸和检测核酸的延伸。
通过探针与结合构建物的核酸部分杂交,可完成核酸部分的杂交,随后依据本领域已知的方法检测杂交结构。探针可包括DNA、RNA、核酸模拟物(例如但不限于肽核酸)或其组合。该探针可包含合适的标记,例如但不限于放射性元素、自旋标记物、荧光团(包括有机染料和镧系元素螯合物)、发色团、共振能量转移对的一个或两个成员、半抗原、抗原、抗体或酶。标记,例如,荧光团或半抗原,也可通过本领域已知的方法直接掺入核酸,随后检测标记。核酸的检测可包括信号的酶放大(例如来自探针上标记的信号),例如通过使用过氧化物酶-酪胺信号放大(R P.Haugland,″Handbook ofFluorescent Probes and Research Products″,9th edition,J.Gregory(editor),Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR,USA,2002,966页),或碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶信号放大。也可通过其它方法直接或在扩增或杂交之后检测结合构建物的核酸部分,其它方法包括但不限于分子指示物(任选与即时检测组合)或其它共振能量转移方法、或免疫检测(例如在ELISA类测定中使用识别和捕获扩增DNA序列的抗体)。
当结合构建物核酸部分的检测包括扩增时,优选方法为依据本领域已知的方法通过聚合酶链反应扩增核酸部分(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Joseph Sambrook等,Cold Spring HarborLaboratory,2001;Short Protocols in Molecular Biology,Frederick M.Ausubel等(editors),John Wiley & Sons,2002)。检测样品中目标化合物的能力可通过偶联聚合酶链反应得到显著提高和扩展。PCR拥有巨大的扩增能力,在这个过程中核酸的特定序列可被扩增数百万倍。这种巨大的扩增能力基于扩增两侧为一套引物的核酸具体靶序列的能力。一旦扩增核酸,可使用任何适合这种目的的方法检测结果,例如,使用琼脂糖凝胶。
实施例
实施例I:检测样品中目标化合物的方法的非限制性实施方案
图1描述多种用于本发明方法的结合构建物,如实施例III所述。每种结合构建物101包括识别和结合目标化合物的识别部分102和核酸部分103。在这个实施方案中,识别部分102优选包括Fab片段,如通过裂解抗目标化合物的单克隆抗体重链的二硫键而制得的Fab片段。在这个实施方案中,核酸部分103优选包括DNA。识别部分102可通过共价键104连接到核酸部分103,例如通过核酸部分103和识别部分102的Fab片段的游离巯基之间的共价键。
图2显示许多结合构建物101,其已与含有目标化合物201的样品混合,如实施例IV所述。结合构建物101的识别部分102已识别目标化合物201,形成构建物-化合物复合物202。图的最下方部分中也显示了结合构建物101,其包括未结合目标化合物201的识别部分102和核酸部分103。
图3显示表面301,其具有可接近结合靶位302。在这个实施方案中,表面301为磁性颗粒,可接近结合靶位302为肽模拟表位,如实施例II所述。将表面引入样品混合物,该混合物可含有结合构建物101,其可结合目标化合物形成构建物-化合物复合物201,或未结合目标化合物。可接近结合靶位301结合任何未结合目标化合物的结合构建物101的识别部分102,形成构建物-表面复合物303。
图4显示用于分离构建物-表面复合物303的磁体401,如实施例IV所述。分离该构建物-表面复合物303和任何过量或未结合的表面301,在溶液中留下构建物-化合物复合物202。分离之后,包含在构建物-化合物复合物202中的结合构建物101的核酸部分103可通过任何适合此目的的方法检测。检测存在结合构建物101的核酸部分103表明存在目标化合物201。
实施例II:具有模拟表位的磁性颗粒的制备
本实施例提供了本发明的一个非限制性实施方案,其中表面为磁性颗粒,具有作为可接近结合靶位的肽模拟表位。在这个模型系统中,使用了识别细菌细胞壁蛋白粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)OMPE蛋白的抗体。粘膜炎莫拉氏菌OMPE蛋白的细菌重组片段由Buffalo大学的Dr.Timothy Murphy提供,并用作免疫原用于制备单克隆抗体12D.5(Mab 12D.5)。使用重叠的肽作图法,显示抗原表位位于重组片段的187-220氨基酸中。对应这个表位的肽被称为Mopep2,合成为带有N末端半胱氨酸,用于合成后连接游离巯基结合结构。使用盐酸2-巯基乙胺(Pierce)将Mab 12D.5裂解成两个Fab片段,留下能连接到其它分子的活性巯基。
10毫克/毫升磁性颗粒材料Micromod、Nanomag SilicateTM、NH250(批号210213T,产品目录号13-01-252,Micromod PartikeltechnologieGmbH,Rostock-Warnemuende,Germany),其在表面含有游离氨基,将其在DMSO中与140微克SIAB反应,并在黑暗中搅拌2小时。通过磁体的方法分离颗粒,随后在50毫摩尔pH 9.6的硼酸钠缓冲液(含有5毫摩尔EDTA)中与100微升1.7mg/ml Mopep2(DMSO中)孵育,孵育过夜。Mopep2肽上的游离巯基与SIAB处理过的磁性颗粒反应,产生了稳定的硫醚键。使用游离半胱氨酸封闭未反应的位点,洗涤Mopep2标记的颗粒,重新悬浮于1毫升PBS中进行分析。
为了测试Mopep2颗粒结合溶液中游离12D.5 Mab的能力,进行了抑制ELISA。10微升Mopep2颗粒或类似用牛血清白蛋白(BSA)标记的对照颗粒,与在PBS中2倍连续稀释的辣根过氧化物酶(HRPO)缀合12D.5在96孔微量滴定板上孵育(总体积100微升),辣根过氧化物酶缀合12D.5以2微克/毫升开始,孵育30分钟。依靠磁体将颗粒分离到孔底部,将每50微升各组稀释液添加到涂布Mopep2的平板上,再孵育30分钟。然后加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物进行标准的ELISA,允许显色10分钟,不添加终止液在630纳米处读取吸光度。数据描述于图5中,显示Mopep2颗粒能从溶液中结合和分离单克隆抗体12D5(12D.5 Mab)辣根过氧化物酶(HRPO)缀合物,因此阻止了12D.5 Mab HRPO缀合物以剂量依赖方式结合到涂布Mopep2的孔。使用牛血清白蛋白(BSA)涂布的颗粒不能抑制12D.5Mab HRPO缀合物结合到涂布Mopep2的孔。
实施例III:结合构建物的制备
本实施例提供了结合构建物的一个实施方案,其中Fab片段用作结合构建物的识别部分。质粒pUC19购自Invitrogen,质粒DNA通过EcoRI线性化。从琼脂糖凝胶中抽提和纯化线性化pUC19 DNA。将该DNA连接到Mab 12D.5的Fab片段,用作结合构建物的核酸部分。随后使用商业可获得的引物从线性化pUC19模板中扩增1kb的片段。为了产生可通过游离巯基(-SH)连接12D.5 Fab片段并用作结合构建物核酸部分的DNA片段,通过可获得的胺将5’-补骨脂素、3’-氨基寡核苷酸结合到SIAB连接体。存在过量寡核苷酸下使pUC 1kb的片段变性,并使用长波紫外急速(snap)退火到补骨脂素上。使用分子量截留(MWCO)滤器去除过量的寡核苷酸,然后使用连接连接体的游离巯基结合末端将SIAB/pUC模板结合到Fab片段。整个结合构建物称为Fab-DNA,不进一步纯化。
实施例IV:通过PCR检测目标化合物
本实施例提供了检测目标化合物的一个实施方案,其中通过PCR扩增结合构建物的核酸部分。这个试验证明Fab-DNA结合构建物(Mab12D.5/pUC19构建物)结合目标化合物即游离抗原(OMPE或rOMPE的细菌重组片段)的能力,因此在溶液中形成了构建物-化合物复合物。具有可接近结合靶位(Mopep2肽)的表面结合任何未结合目标化合物的Fab-DNA,并使用磁体分离表面,在溶液中留下构建物-化合物复合物(结合抗原的Fab-DNA),结合构建物的核酸部分(pUC19)用于核酸扩增。
在两倍稀释步骤中,在1ml PBS中将rOMPE从100ng/ml滴定至1.56ng/ml。各系列稀释物使用20微升(8微克Fab-DNA)孵育30分钟,然后每个孔添加10微升Mopep2颗粒,再孵育30分钟。对照孔包括:(1)1.1毫升PBS和0.2毫升Fab-DNA,无rOMPE(阳性对照),(2)1毫升PBS、0.2毫升Fab-DNA和0.1毫升颗粒(阴性对照)。将孔暴露于稀土元素磁体下15分钟,从溶液中分离磁性颗粒,从每个孔中移取0.2毫升溶液进行扩增。
如下通过PCR扩增样品。50微升PCR反应混合物含有5微升无MgCl2的10X PCR缓冲液、1微升50毫摩尔的MgCl2、0.5微升50毫摩尔的dNTP、1微升pUC19的有义或反义引物、1微升Taq聚合酶、2微升样品(溶液)和38.5微升ddH2O。有义引物具有序列CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC(SEQ ID NO.1)。反义引物具有序列CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTG(SEQ ID NO.2)。所有序列以5’-3’方向给出。
使用下列循环参数扩增样品:
步骤 | 时间 | 温度 | 循环 |
起始变性 | 2分钟 | 93℃ | 1 |
变性 | 30秒 | 93℃ | 35 |
退火 | 30秒 | 52℃ | 35 |
延伸 | 2分钟 | 73℃ | 35 |
最终延伸 | 7分钟 | 73℃ | 1 |
将PCR样品在1%琼脂糖凝胶上解析,并通过溴化乙锭显示。将10微升各浓度的PCR样品装载于凝胶。PCR引物扩增大约2650bp的pUC19片段。使用1kb延伸DNA梯(DNA Ladder)(Invitrogen)作为分子量标准。如图6所示,PCR引物在以下片段中扩增了2.6kb的DNA片段:790皮克、395皮克、198皮克、98皮克和12皮克。在49皮克和24皮克的样品中观察到非常细微的条带。
实施例V:目标化合物的检测
检查不同类型目标化合物的非限制性实例如下。
β-淀粉样蛋白初原纤维:在这个实施例中,目标化合物为淀粉样β蛋白的低聚物,称为原纤维。淀粉样蛋白β初原纤维的检测可用于阿尔茨海默病的早期检测。样品为来自怀疑患有或有风险患阿尔茨海默病的患者的血清或脑脊液(CSF)。结合构建物包括:(1)识别部分,为识别原纤维的抗体或抗体片段;(2)自然中不存在的核酸部分。核酸部分为能被合成引物识别的DNA模板,该引物设计为以低严谨度结合模板进行PCR扩增。将结合构建物加入100微升血清样品中至10纳克/毫升浓度,孵育充足时间以允许抗体或抗体片段结合存在于样品中的原纤维,因此在样品中形成构建物-化合物(构建物-原纤维)复合物。结合表面是使用可接近结合靶位标记的磁性颗粒,该结合靶位为用作免疫原产生抗原纤维抗体(结合构建物的识别部分)的相同肽序列。磁性颗粒具有伯胺反应基团,使用水溶性碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC),允许免疫原肽通过它的羧基末端羧基结合到颗粒。将10微升30%颗粒悬浮液添加到含有构建物-化合物(构建物-原纤维)复合物的溶液中,允许颗粒与未结合的抗原纤维/DNA结合构建物形成构建物-表面复合物。将磁体应用于溶液,分离磁性颗粒,因此分离了未结合的结合构建物,在溶液中留下构建物-化合物复合物。将2微升所得溶液(含有构建物-化合物复合物)添加到含有引物、游离核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反应溶液中。扩增在溶液中以构建物-化合物复合物存在的任何结合构建物的DNA部分。将PCR反应物在1%琼脂糖凝胶上解析,并通过溴化乙锭染色显示。通过凝胶中是否存在对应扩增DNA片段的分子量的条带,表明样品中是否存在淀粉样蛋白β初原纤维。嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)抗原:在这个实施例中,目标化合物为嗜肺军团菌血清群1糖抗原。嗜肺军团菌是称为军团病和庞蒂亚克热的社区获得性肺炎的致病因子。血清群1是引起大多数军团病的原因。样品优选为来自怀疑感染嗜肺军团菌的患者的尿样。结合构建物包括:(1)识别部分,为识别嗜肺军团菌血清群1糖抗原(“抗原”)的抗体或抗体片段,(2)在自然中不存在的核酸部分。核酸部分为能被合成引物识别的DNA模板,该引物设计为以低严谨度结合到模板进行PCR扩增。将结合构建物加入100微升尿样中至10纳克/毫升的浓度,孵育足够时间以允许抗体或抗体片段结合存在于样品中的嗜肺军团菌血清群1糖抗原,因此在溶液中形成构建物-化合物(构建物-抗原)复合物。结合表面是使用可接近结合靶位即能结合抗体或抗体片段可变区的肽模拟表位(结合构建物的重组片段)标记的磁性颗粒。合适的肽模拟表位可通过本领域已知的方法获得,例如,随机或非随机肽文库或组合肽合成的噬菌体展示,然后通过亲和选择(Smith & Petrenko(1997)Chem.Rev.,97:391-410;Kramer等,(1993)Peptide Res.,6:314-319)。磁性颗粒具有伯胺反应基团,使用水溶性碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC),允许肽模拟表位通过它的羧基末端羧基结合到颗粒。将10微升30%颗粒悬浮液添加到含有构建物-化合物(构建物-嗜肺军团菌血清群1糖抗原)复合物的溶液中,允许颗粒与未结合的抗抗原纤维/DNA结合构建物形成构建物-表面复合物。将磁体应用于溶液,分离磁性颗粒,因此分离了未结合的结合构建物,在溶液中留下构建物-化合物复合物。将2微升所得溶液(含有构建物-化合物复合物)添加到含有引物、游离核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反应溶液中。扩增溶液中以构建物-化合物复合物存在的任何结合构建物的DNA部分。将PCR反应物在1%琼脂糖凝胶上解析,并通过溴化乙锭染色显示。通过凝胶中是否存在对应扩增DNA片段的分子量的条带,表明样品中是否存在嗜肺军团菌血清群1糖抗原。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)特异性人抗体:在这个实施例中,目标化合物为结核分枝杆菌-特异性人IgG,其特异性作用来自结核分枝杆菌38千道尔顿胞外蛋白(抗MTb IgG)。结核分枝杆菌是人中肺结核的致病因子。样品优选为来自怀疑感染结核分枝杆菌的患者的血清。结合构建物包括:(1)识别部分,其是被抗MTb IgG可变区识别和结合的肽表位或模拟表位,(2)核酸部分,最优选的核酸部分中核酸部分的序列不包括预期在样品中存在的序列,例如,在哺乳动物或细菌中不存在的来自高等植物的序列。识别部分可以是抗MTb IgG模拟表位,或是被抗MTb IgG识别的细菌蛋白或肽的衍生天然肽序列;在这两种情况中,该肽能结合结核分枝杆菌特异性人IgG的亚类,形成构建物-化合物(构建物-抗MTb IgG)复合物。核酸部分为能被合成引物识别的DNA模板,该引物设计为以低严谨度结合到模板进行PCR扩增。将结合构建物加入100微升血清样品中至10纳克/毫升的浓度,孵育足够时间以允许结合构建物的识别部分结合存在于样品中的抗MTb IgG,因此在溶液中形成构建物-化合物(构建物-抗MTB IgG)复合物。结合表面为琼脂糖珠,能识别和结合结合构建物识别部分的抗体或抗体片段连接到琼脂糖珠上。该琼脂糖珠具有醛反应性基团,其可以使用氰基硼氢化钠(NaBH3CN)与抗体重链上的氨基交联。将20微升30%颗粒悬浮液添加到含有构建物-化合物(构建物-抗MTb IgG)复合物的溶液中,允许珠与未结合的肽/DNA结合构建物形成构建物-表面复合物。将混合物置于Eppendorf管,离心,从悬浮液中沉淀琼脂糖珠,在溶液上清中留下保持游离的构建物-化合物(构建物-抗MTb IgG)。将2微升上清溶液添加到含有引物、游离核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反应溶液中。扩增在溶液中以构建物-化合物复合物存在的任何结合构建物的DNA部分。将PCR反应物在1%琼脂糖凝胶上解析,并通过溴化乙锭染色显示。通过凝胶中是否存在对应扩增DNA片段的分子量的条带表明样品中是否存在结核分枝杆菌-特异性人IgG。
所有标题是为了方便读者,不应用于限制标题后的文本的含义,除非另有说明。可对本发明进行各种变化和修改而不背离本发明的精神和范围。因此,本发明无意受限于本说明书中的具体描述或附图中的描述,而只是如权利要求中的阐述。
序列表
<110>Lawton,Robert L.
<120>可溶性分析物的检测和扩增
<130>BX/TF-101.P.1
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>1
cctctagagt cgacctgcag gcatgc 26
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>2
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtg 27
Claims (46)
1.一种在样品中检测目标化合物的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供包含识别部分和核酸部分的结合构建物,所述识别部分识别和结合所述目标化合物;
b)将所述结合构建物与所述样品混合形成构建物-化合物复合物;
c)提供一种或多种表面,其中所述表面具有一个或多个能识别和结合所述结合构建物的所述识别部分的可接近结合靶位;
d)将所述一种或多种表面引入所述结合构建物和所述样品的所述混合物,以使得所述一种或多种表面与任何未结合的结合构建物形成构建物-表面复合物;
e)从所述混合物中分离所述构建物-表面复合物,留下所述构建物-化合物复合物;
f)检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分;
其中存在所述结合构建物的所述核酸部分表明在所述样品中存在所述目标化合物。
2.权利要求1的方法,其中所述-种或多种表面选自:颗粒、粉末、珠、平面表面、非平面表面、管、孔、非多孔薄膜、非多孔膜、多孔薄膜、多孔膜、纤维、填充物、筛孔、网格、滤器、基质、凝胶和其组合。
3.权利要求1的方法,其中所述一种或多种表面包括颗粒。
4.权利要求3的方法,其中所述颗粒包括磁性颗粒。
5.权利要求4的方法,其中所述步骤(e)包括依靠磁体将所述构建物-表面复合物分离出所述混合物。
6.权利要求1的方法,其中在步骤(f)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增、所述核酸部分的杂交、酶扩增、标记的检测或其组合。
7.权利要求1的方法,其中在步骤(f)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增。
7.权利要求7的方法,其中所述核酸部分的所述扩增包括聚合酶链反应。
8.权利要求5的方法,其中在步骤(f)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增、所述核酸部分的杂交、酶扩增、标记的检测或其组合。
9.权利要求5的方法,其中在步骤(f)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增。
10.权利要求9的方法,其中所述核酸部分的所述扩增包括聚合酶链反应。
11.权利要求1的方法,其中所述识别部分包含受体。
12.权利要求1的方法,其中所述识别部分包含抗原。
13.权利要求1的方法,其中所述识别部分包含抗体或抗体片段。
14.权利要求1的方法,其中所述识别部分包含单链抗体可变区片段。
15.权利要求1的方法,其中所述识别部分包含Fab片段。
16.权利要求15的方法,其中所述Fab片段通过Fab片段的游离巯基连接至所述核酸部分。
17.权利要求12的方法,其中所述目标化合物包含抗体或抗体片段,所述结合构建物的所述识别部分包含被所述目标化合物识别的抗原,所述可接近结合靶位包含能识别和结合所述结合构建物的所述识别部分的抗体或抗体片段。
18.权利要求1的方法,其中所述核酸部分包含DNA。
19.权利要求1的方法,其中所述核酸部分包含RNA。
20.权利要求1的方法,其中所述核酸部分包含的核酸序列不包括预期在样品中存在的序列。
21.权利要求1的方法,其中所述步骤(a)包括提供两种或更多不同类型的结合构建物,其中所述两种或更多不同结合构建物各自具有不同的识别部分和不同的核酸部分。
22.一种增加液相检测目标化合物的灵敏度的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供怀疑含有所述目标化合物的样品;
b)提供包含以下部分的结合构建物:
i)能结合所述目标化合物的识别部分,
ii)核酸部分;
c)将所述样品与所述结合构建物接触一段时间,所述时间足以允许所述识别部分结合所述样品中存在的所述目标化合物,因此在溶液中形成了构建物-化合物复合物;
d)提供一种或多种表面,其中所述一种或多种表面具有一个或多个能结合所述识别部分的可接近结合靶位;
e)将所述一种或多种表面与所述溶液接触一段时间,所述时间足以使得所述一个或多个可接近结合靶位结合未结合所述目标化合物的任何结合构建物的所述识别部分,因此形成构建物-表面复合物;
f)从所述溶液分离所述构建物-表面复合物,在所述溶液中留下所述构建物-化合物复合物;
g)检测所述溶液中是否存在所述结合构建物的所述核酸部分,
其中从所述溶液中分离所述构建物-表面复合物导致基本分离了所有未结合目标化合物的结合构建物,增加了所述目标化合物的检测灵敏度,并且
其中存在所述结合构建物的所述核酸部分表明在所述样品中存在所述目标化合物。
23.权利要求22的方法,其中所述一种或多种表面选自颗粒、粉末、珠、平面表面、非平面表面、管、孔、非多孔薄膜、非多孔膜、多孔薄膜、多孔膜、纤维、填充物、筛孔、网格、滤器、基质、凝胶和其组合。
24.权利要求22的方法,其中所述一种或多种表面包括颗粒。
25.权利要求24的方法,其中所述颗粒包括磁性颗粒。
26.权利要求25的方法,其中所述步骤(f)包括依靠磁体从所述溶液基本分离了所有所述构建物-表面复合物。
27.权利要求22的方法,其中在步骤(g)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增、所述核酸部分的杂交、酶扩增、标记的检测或其组合。
28.权利要求22的方法,其中在步骤(g)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增。
29.权利要求28的方法,其中所述核酸部分的所述扩增包括聚合酶链反应。
30.权利要求26的方法,其中在步骤(g)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增、所述核酸部分的杂交、酶扩增、标记的检测或其组合。
31.权利要求26的方法,其中在步骤(g)中,所述检测是否存在所述结合构建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的扩增。
32.权利要求31的方法,其中所述核酸部分的所述扩增包括聚合酶链反应。
33.权利要求22的方法,其中所述识别部分包含受体。
34.权利要求22的方法,其中所述识别部分包含抗原。
35.权利要求22的方法,其中所述识别部分包含抗体或抗体片段。
36.权利要求22的方法,其中所述识别部分包含单链抗体可变区片段。
37.权利要求22的方法,其中所述识别部分包含Fab片段。
38.权利要求37的方法,其中所述Fab片段通过Fab片段的游离巯基连接所述核酸部分。
39.权利要求34的方法,其中所述目标化合物包含抗体或抗体片段,所述结合构建物的所述识别部分包含被所述目标化合物识别的抗原,所述可接近结合靶位包含能识别和结合所述结合构建物的所述识别部分的抗体或抗体片段。
38.权利要求21的方法,其中所述核酸部分包含DNA。
39.权利要求21的方法,其中所述核酸部分包含RNA。
40.权利要求21的方法,其中所述核酸部分包含的核酸序列不包括预期在样品中存在的序列。
41.权利要求21的方法,其中所述步骤(b)包括提供两种或更多不同类型的结合构建物,其中所述两种或更多不同结合构建物各自具有不同的识别部分和不同的核酸部分。
42.一种检测样品中目标化合物的试剂盒,所述样品怀疑含有所述目标化合物,所述试剂盒包含
a)结合构建物,包含
i)识别和结合所述目标化合物的识别部分,
ii)核酸部分;
b)一种或多种具有一个或多个可接近结合靶位的表面,所述结合靶位能结合所述结合构建物的所述识别部分。
43.权利要求42的试剂盒,所述试剂盒还包含核酸扩增引物对,其中所述引物对的各引物能在所述核酸部分的靶核酸序列3’末端与它的互补序列杂交。
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