JP5547363B2 - 可溶性検体の検出および増幅 - Google Patents
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Description
離すること、従って偽「陽性」シグナルに対する真の「陽性」シグナルの比を大きくすることによって、化合物の検出方法の感度を高め、それによって有効性を高めることができるとの認識によるものである。本発明は、目的の化合物を固相で捕捉または検出する必要のない、汎用性のある検出システムをさらに提供する。目的の化合物がペプチドやタンパク質などの核酸以外の分子を含む場合、本発明の方法は、目的のペプチドもしくはタンパク質を特定し、検出用にDNA増幅を利用するために、該ペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列を予め知っておく必要がない、という利点をさらに提供する。
本発明は、偽「陽性」シグナルに対する真の「陽性」シグナルの比を大きくすることによって、化合物の検出方法の感度を高め、それによって該方法の有効性を高めることができるとの認識によるものである。本発明は、目的の化合物を固相で検出する必要のない検出システムの汎用性をさらに認めるものであり、核酸を含まない目的の化合物の検出においても(核酸増幅などの)シグナル増幅法の利点を享受することの価値を認めるものである。
(1)試料中の目的の化合物を検出する方法であって、目的の化合物を認識して結合する認識部分と核酸部分とを含む結合構成物を提供する工程と、結合構成物を試料と混合して構成物と化合物との複合体を形成させる工程と、結合構成物の認識部分を認識して結合し得る1または複数の接触可能な結合標的を有する1または複数の表面を提供する工程と、表面を結合構成物と試料との混合物に導入して、結合していない全ての結合構成物とともに表面が構成物と表面との複合体を形成するようにする工程と、混合物から構成物と表面との複合体を分離して構成物と化合物との複合体を残す工程と、結合構成物の核酸部分の有無を検出する工程とを含み、結合構成物の核酸部分の存在が試料中に目的の化合物が存在することを示すことを特徴とする方法。
本発明の第1の方法は、試料中の非常に少ない量の目的の化合物の存在を検出し得る、試料中の目的の化合物を検出するための感度の高い方法を含む。本発明の第1の方法は、核酸標識結合構成物による目的の化合物の認識と、1または複数の結合標的を有する1または複数の表面を用いた結合していない核酸標識結合構成物の分離と、前記結合構成物の核酸部分の有無を溶液中で検出することとを要し、結合構成物の核酸部分の存在が、目的の化合物が試料中に存在することを示すことを特徴とする。目的の化合物を含むと思われる試料は、例えば、完全に天然のものであってもよいし、完全に非天然のもの(例えば合成物)であってもよいし、天然物と非天然物との組合せであってもよい。試料としては、完全な細胞、組織、器官、体液、抽出物、または環境試料が挙げられる。
NA、または核酸模倣物(例えば、限定するものではないが、ペプチド核酸)、またはこれらの組合せが挙げられる。本発明の核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。好適な一実施形態では、本発明の結合構成物に含まれる核酸部分の配列は、試料中に見出されることが予測される配列を含まない配列であり、従って試料中の核酸配列が混入物になりにくいことが期待されながらも、容易に検出可能なように設計される。核酸部分は、選択した検出方法で容易に検出されるのに十分な長さであることが好ましい。
ていてもよい。試料中の2種類以上の異なる目的化合物を検出するためには、各々が異なる化合物を認識し得る異なる認識部分を有している2種類以上の異なる結合構成物が提供される。該結合構成物は、試料中の2種類以上の目的化合物の有無を検出するために、結合構成物の種類ごとにそれぞれ固有の核酸部分を含む。
本発明の第2の方法は、目的の化合物の溶液相での検出の感度を増大させる方法を含む。本方法は、目的の化合物を低濃度または少量含むと思われる試料に特に適している。
法で容易に検出されるのに十分な長さであることが好ましい。
ていてもよい。試料中の2種類以上の異なる目的化合物を検出するためには、各々が異なる化合物を認識し得る異なる認識部分を有している2種類以上の異なる結合構成物が提供される。該結合構成物は、試料中の2種類以上の目的化合物の有無を検出するために、結合構成物の種類ごとにそれぞれ固有の核酸部分を含む。
本発明は、試料中の非常に少ない量の目的の化合物の存在を検出し得る、試料中の目的の化合物を検出するために使用されるキットも含む。
増幅用のプライマー対、例えば各プライマーが核酸部分の標的核酸配列の3’末端で相補配列にハイブリダイズするPCRプライマー対を任意選択で含みうる。キットは、核酸増幅用の酵素、例えばTaqポリメラーゼまたはRNA逆転写酵素などを任意選択でさらに含みうる。結合構成物の核酸部分が核酸のハイブリダイゼーションによって検出される実施形態では、キットは、1つ以上のハイブリダイゼーション用プローブ、例えば検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドを含んでいるとよい。シグナルの増幅を含む実施形態では、キットは、シグナルの増幅に必要な試薬、例えば酵素または基質などを任意選択で含みうる。本発明のキットは、結合構成物の核酸部分を直接検出するための試薬、例えば分子ビーコンや適切な抗体などを任意選択で含みうる。キットは、構成物と表面との複合体と、結合していない全ての表面とを分離する手段、例えば表面が磁性粒子の実施形態については磁石、表面が濾過可能な粒子状物の実施形態についてはフィルタ、表面がチューブの管壁の実施形態についてはピペットを任意選択で含みうる。
本発明の方法およびキットは、様々な種類の目的の化合物を検出するために使用することができる。本発明の方法は、試料中に少量または低濃度で存在すると思われる目的の化合物を検出するのに特に適している。目的の化合物としては、限定するものではないが、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、レクチン、抗体、酵素、および受容体;糖質(単糖、オリゴ糖、および多糖)およびグリコシル化された分子;脂質、脂肪、脂質化分子;ならびに抗原全体または部分抗原が挙げられる。目的の化合物は、小分子(例えば、受容体のリガンド、乱用薬物、無機イオン、金属もしくはキレート、代謝物、化学物質中間体、または天然産物)であってもよい。目的の化合物は、モノマーでも、オリゴマーでも、ポリマーでもよく、複数の分子の会合体(例えば、アミロイドβプロトフィブリル、ジストロフィンと糖タンパク質との会合体、プロテアソーム、シャペロンタンパク質、または細胞壁もしくは細胞膜の断片など)であってもよい。目的の化合物は、完全に天然物由来のものでもよいし、完全に人工物由来のものでもよいし、両方の組合せ(例えば天然の化合物を化学的もしくは物理的に修飾したもの)であってもよい。
本発明の方法は、目的の化合物を含むと思われる任意の適切な試料に適用することができる。試料は完全に天然のものであってもよいし、完全に非天然のもの(例えば合成物)であってもよいし、天然物と非天然物との組合せであってもよい。試料は、完全な細胞(例えば、原核細胞、細菌の細胞、真核細胞、植物細胞、菌類の細胞、または無脊椎動物、脊椎動物、哺乳動物、およびヒトなどの多細胞生物由来の細胞)、組織、器官、または体液(例えば、限定するものではないが、血液、血清、血漿、尿、精液、および脳脊髄液)を含みうる。試料は、生体材料(例えば原核生物、細菌、真核生物、植物、菌類、多細胞生物または動物、無脊椎動物、脊椎動物、哺乳動物、およびヒト由来のもの)から得られた抽出物であってもよい。試料は、生物全体もしくは生物の一部、細胞、器官、組織、体液、培養物全体もしくは培養物の一部、または環境試料もしくはその一部から得られた抽出物であってもよい。試料は、本発明の方法で使用するために最小限の調製(例えば適切な容器に回収すること)しか必要ないものでもよいし、さらなる調製(例えば、限定するものではないが、望ましくない物質もしくは混入物の除去、不活性化、もしくは阻害、濾
過、サイズ選択、アフィニティ精製、細胞の溶解もしくは組織の消化、濃縮、または希釈)を要するものでもよい。試料は、処理(例えば、機械的破砕、溶解、加熱、溶剤の添加、または懸濁剤などによる処理)することによって溶液中に構成物と化合物との複合体を検出できる限りは、いかなる相(固体、液体、または気体)であってもよく、溶液状でも懸濁物でもよい。例えば、試料は、緩衝剤水溶液に懸濁し、任意選択で濾過して望ましくない粒子状物質を結合構成物の導入前に除去した土壌試料であってもよい。
本発明は結合構成物を含む。結合構成物は、目的の化合物を認識かつ結合し得る認識部分と、核酸部分とを含む。認識部分は、目的の化合物を認識かつ結合し得る、事実上あらゆる分子または分子の組合せでありうる。そのような認識部分には、限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、ミモトープ、抗体、Fab断片、核酸、核酸模倣物、アプタマー、細胞表面抗原、糖質、小分子(例えば低分子の抗原または受容体のリガンド)、無機イオンもしくはキレート、またはこれらの組合せが挙げられる。特に好適なのは、目的の化合物に一価として結合し得る認識部分である。
, Peptide Res., 6, p.314-319; Folgori et al., 1994, EMBO J., 13, p.2236-2243; Smith and Petrenko, 1997, Chem. Rev., 97, p.391-410 )もしくは定向進化法、例えば酵母のツーハイブリッドシステム、タンパク質再構成アッセイ(protein fragment complementation assay)、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、および細菌表面ディスプレイなどの技法(Crameri and Suter, 1993, Gene, 137, p.69-75; Meola et al., 1995, J. Immunol., 154, p.3162-3172; Georgiou et al., 1997, Nature Biotechnol., 15, p.29-34; Moessner and Plueckthun, 2001, Chimia, 55, p.324; B.K. Kay, J. Winter, and J. McCafferty (editors), "Phage Display of Peptides and proteins: A Laboratory Manual", Academic Press, Inc., San Diego, 1996, p.344 )により作出された分子、またはこれらの組合せを含みうる。認識部分は、当分野
で知られている任意の適切な手段、例えばアフィニティ選択、アフィニティ精製、パニングの反復、または表面プラズモン共鳴技術など(Faegerstam et al., 1991, J. Mol. Recognition, 3, p.208-214; Houshmand et al., 1999, Anal. Biochem., 268, p.363-370)により目的の化合物を認識かつ結合する能力について選択可能である。
本発明はまた、結合構成物の認識部分により認識されて該認識部分に結合することが知られている1または複数の接触可能な結合標的を有する1または複数の表面を含む。そのような表面は、粒子状の表面でも粒子状でない表面でもよく、任意の適切な材料、例えば、限定するものではないが、プラスチック、ポリマー、セラミックス、ガラス、シリカ化合物、修飾シリカ化合物、フルオロカーボン、金属もしくは金属酸化物、吸着剤、樹脂、生体材料(例えばポリペプチドおよび糖質)、またはこれらの組合せから作製され得る。粒子状の表面には、液体試料から分離可能な任意の粒子、例えば、磁性粒子、ポリマー粒子、ガラス粒子、シリカ粒子、セラミックス粒子などでよい。粒子状の表面は、球状、非球状、対称形、非対称形、または不規則形などを含む任意の形状であってよく、大きさは均一でも不均一でもよい。粒子状の表面は、例えば、粉末、ビーズ、繊維、高分子集合体、ナノ粒子、またはナノチューブなどの任意の適切な形態をとりうる。粒子状の表面は、任意選択で、例えば再利用可能もしくは使い捨てのカートリッジ、カセット、またはインサートなどのチャンバ内に封入されていてもよい。粒子状でない表面には、限定するものではないが、平面状もしくは非平面状の表面(例えば、チューブもしくはウェルの側面)、無孔のフィルムもしくは膜、多孔質のフィルムもしくは膜、繊維、充填材、メッシュ、格子、フィルタ、マトリクス、ゲル、またはこれらの組合せが挙げられる。
構成物と表面との複合体および全ての過剰な結合していない表面を、任意の適切な分離方法を用いて、試料溶液中の構成物と化合物との複合体から分離させるが、分離方法は使用する表面の種類によって変わりうる。そのような方法には、限定はしないが、圧力もしくは真空、遠心分離、サイズ排除、濾過、またはこれらの組合せによる分離が挙げられる
。非限定的な分離例は以下のとおりである。表面が粒子状物(粉末、ビーズ、繊維、高分子集合体、ナノ粒子、またはナノチューブなど)である場合、構成物と表面との複合体を、沈降法、遠心分離法、濾過法、サイズ排除法、または非共有結合による誘引力(例えば、電荷または疎水性による相互作用)により分離することができる。表面が平面状もしくは非平面状の非粒子状物(マイクロタイターウェルもしくはチューブもしくは容器の壁面など)である場合、構成物と表面との複合体を、デカンテーションまたは吸引により分離することができる。表面が磁性粒子である場合、構成物と表面との複合体を混合物から分離するには、磁石に曝露するなどして磁力を適用すればよい。
分離工程後、結合構成物の核酸部分の有無を検出することによって、試料中の目的の化合物の有無が示される。結合構成物の核酸部分の有無は、必ずしも核酸の増幅を必要としない、核酸の有無を検出することのできる任意の方法、例えば酵素による増幅、ハイブリダイゼーション、または標識の検出によって検出可能である。結合構成物の核酸部分の検出は、そのような目的に適した任意の方法により達成可能である。これらの方法は当分野で周知であり、限定するものではないが、核酸部分の増幅、核酸部分のハイブリダイゼーション、シグナルの増幅、標識の検出、またはこれらの組合せなどが含まれる。
適切な大きさの増幅断片を検出することによって、測定または検出することができる。核酸部分の増幅には、任意の適切な増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応による増幅または逆転写による増幅(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Joseph Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, p.999; Short Protocols in Molecular Biology, Frederick M. Ausubel et al., (editors), John Wiley & Sons, 2002, p.1548 )、RCA法(rolling circle amplification)(Liu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc.,
118, p.1587-1594 )、アンチセンスRNA増幅(Phi llips and Eberwine, 1996, Methods, 10, p.283-288 )、SDA法(strand displacement amplification )(Walker et
al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, p.1691-1696)、複合プライマーSDA法(composite primer/strand displacement amplification)(クルン(Kurn)の米国特許番号第
6,251,639号、2001年6月26日、「ポリヌクレオチド配列を定温で線形増幅するための、RNA‐DNA複合プライマーを用いる方法および組成物(Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences, using a RNA-DNA composite primer)」、Qβレプリカーゼを用いた増幅法(Lomeli et al., 1989, Clin. Chem., 35, p.1826-1831 )、LLA法(linked linear amplification )(Reyes et al., 2001, Clin. Chem., 47, p.31-40)、3SR法(self-sustained sequence replication )(Fahy et al., 1991, Genome Res., 1, p.25-33)、または当分野で周知のその他の核酸増幅法(Andras et al., 2001, Mol. Biotechnol., 19, p.29-44)を使用することができる。結合構成物の核酸部分を検出する別の方法は、例えば、プライマー伸長ならびに伸長させた核酸の検出によるものでもよい。
方法、例えばアガロースゲルを用いて増幅結果を検出すればよい。
図1は、実施例3に記載されているような、本発明の方法において使用するための結合構成物を複数示している。各結合構成物101は、目的の化合物を認識かつ結合する認識部分102と、核酸部分103とを備えている。この実施形態では、認識部分102は、Fab断片、例えば目的の化合物に対するモノクローナル抗体の重鎖のジスルフィド架橋を切断する事によって作製されたFab断片を含むことが好ましい。この実施形態では、核酸部分103はDNAを含むことが好ましい。認識部分102は、共有結合104によって、例えば核酸部分103と認識部分102のFab断片の遊離スルフヒドリル基との間の共有結合によって核酸部分103に結合させることができる。
本実施例では、表面が接触可能な結合標的としてミモトープペプチドを有する磁性粒子であることを特徴とする、本発明の非限定的な一実施形態が提供される。このモデル系では、細菌の細胞壁タンパク質であるモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis )OMPEタンパク質を認識する抗体を使用した。モラクセラ・カタラーリスのOMPEタンパク質の組換え断片は、バッファロー大学のティモシー・マーフィ博士より供与されたものであり、モノクローナル抗体12D.5(Mab 12D.5)を調製するための免疫原として用いた。ペプチドの重複マッピングを用いて、抗原エピトープが組換え断片のアミノ酸187−220の中に存在することが示された。このエピトープに相当するペプチド(Mopep2と命名)を、合成後に遊離スルフヒドリル基結合性の構造に結合するように、N末端にシステインを備えて合成した。Mab 12D.5を、2‐メルカプトエチルアミンHCl(ピアス社(Pierce))を用いて切断して2つのFab断片とし、別の分子に結合させることのできる反応性のスルフヒドリル基が残るようにした。
社(Micromod)のNanomag(登録商標)Silica(商標)、NH250(ロット番号210213T、カタログ番号13‐01‐252、ドイツ国ロストック‐バーレンミュンデ所在のミクロモート・パルティケルテヒノロギー・ゲーエムベーハー(Micromod Partikeltechnologie GmbH ))を、DMSO中の140mgのSIABと反応させて暗所にて2時間回転させた。この粒子を磁石により分離し、続いて5mMのEDTAと1.7mg/mlのMopep2を100μl含む50mMのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)の中で一晩インキュベートした。Mopep2ペプチド上の遊離スルフヒドリル基はSIAB処理された磁性粒子と反応して安定なチオエーテル結合を生じた。未反応の部位を遊離システインでブロッキングし、このMopep2で標識された粒子を洗浄して、分析のために1mlのPBS中に再懸濁した。
本実施例では、結合構成物の認識部分としてFab断片が使用されることを特徴とする、結合構成物の一実施形態が提供される。プラスミドpUC19をインビトロジェン(Invitrogen)から購入し、プラスミドDNAをEcoRIで直線状にした。この直線状のpUC19 DNAをアガロースゲルから抽出して精製した。このDNAをMab 12D.5のFab断片に結合し、結合構成物の核酸部分とした。続いて市販のプライマーを使用して直線状の鋳型pUC19から1kbの断片を増幅させた。遊離スルフヒドリル基(‐SH)を介して12D.5のFab断片に結合して結合構成物の核酸部分となり得るDNA断片を作製するため、5’ソラレン、3’アミノ‐オリゴヌクレオチドを、利用可能なアミンを介してSIABリンカーに結合させた。1kbのpUC19 DNAを過剰量のオリゴヌクレオチドの存在下で変性させ、長波長紫外線を用いてソラレンにアニーリングさせた。分子量カットオフ(MWCO)フィルタを用いて過剰なオリゴヌクレオチドを取り除き、次いで、SIAB/pUC19鋳型を、SIABリンカーの遊離スルフヒドリル基結合性の端部を用いてFab断片に結合させた。Fab‐DNAと命名されたこの結合構成物全体については、さらなる精製は実施しなかった。
本実施例では、結合構成物の核酸部分がPCRにより増幅されることを特徴とする、目的の化合物の検出の一実施形態が提供される。この実験から、結合構成物Fab‐DNA(Mab 12D.5/pUC19構成物)が目的の化合物である遊離の抗原(細菌の組
換えOMPE断片すなわちrOMPE)に結合し、その結果溶液中に構成物と化合物との複合体を形成しうることが示された。接触可能な結合標的(Mopep2ペプチド)を有する表面(磁性粒子)は、目的の化合物に結合していない全てのFab‐DNAに結合し、磁石を用いて該表面が分離され、構成物と化合物との複合体(抗原に結合したFab‐DNA)が、核酸増幅に使用可能な結合構成物の核酸部分(pUC19)とともに溶液中に残った。
異なる種類の目的の化合物についての非限定的な検出例は以下のとおりである。
(アミロイドβプロトフィブリル)
この実施例では、目的の化合物はプロトフィブリルと呼ばれるアミロイドβタンパク質のオリゴマーである。アミロイドβプロトフィブリルの検出は、アルツハイマー病の早期
検出に有用である。試料は、アルツハイマー病であるかそのリスクを負っていると思われる患者由来の血清または脳脊髄液(CSF)である。結合構成物は、(1)プロトフィブリルを認識する抗体もしくは抗体断片である認識部分と、(2)天然には存在しない核酸部分とを含んでいる。核酸部分は合成プライマーによって認識可能なDNA鋳型であり、該合成プライマーはPCRを用いて増幅するために低ストリンジェンシーで鋳型に結合するように設計されている。結合構成物を、100μlの血清試料に10ng/mlとなるように添加し、十分な時間インキュベートして抗体もしくは抗体断片が試料中に存在するプロトフィブリルに結合して溶液中に構成物と化合物(構成物とプロトフィブリル)との複合体が形成されるようにする。結合表面は、接触可能な結合標的、すなわち抗プロトフィブリル抗体(結合構成物の認識部分)を作製するために免疫原として使用されたのと同一のペプチド配列、で標識された磁性粒子である。この磁性粒子は反応性の第1級アミン基を有するので、例えば1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)などの水溶性カルボジイミドを用いて前記免疫原性ペプチドをそのカルボキシ末端のカルボキシルを介して粒子に結合させることが可能となっている。30%の粒子懸濁物10μlを、構成物と化合物(構成物とプロトフィブリル)との複合体を含む溶液に添加して、結合していない抗プロトフィブリル/DNA結合構成物とともに粒子が構成物と表面との複合体を形成できるようにする。この溶液に磁石を適用して磁性粒子を分離することにより、結合していない結合構成物を分離して溶液中に構成物と化合物との複合体を残す。その結果得られた(構成物と化合物との複合体を含む)溶液2μlを、プライマーと、遊離のヌクレオチドと、TaqDNAポリメラーゼとを含むPCR反応溶液に添加する。溶液中に構成物と化合物との複合体として存在する全ての結合構成物のDNA部分が増幅される。このPCR反応物を1%アガロースゲルで展開し、エチジウムブロマイド染色で視覚化する。試料中にアミロイドβプロトフィブリルが存在するか否かは、増幅されたDNA断片の正しい分子量に相当するバンドがゲル中に存在するか否かによって示される。
この実施例では、目的の化合物はレジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia )セログループ1の糖質抗原である。レジオネラ・ニューモフィラは、在郷軍人病として知られる市中肺炎ならびにポンティアック熱の病原因子である。セログループ1は在郷軍人病症例の大部分に関与している。試料は、レジオネラ・ニューモフィラに感染している疑いのある患者の尿試料であることが好ましい。結合構成物は、(1)レジオネラ・ニューモフィラのセログループ1の糖質抗原(「抗原」)を認識する抗体もしくは抗体断片である認識部分と、(2)天然には存在しない核酸部分とを含む。核酸部分は、PCRにより増幅するために低ストリンジェンシー条件で結合するように設計された合成プライマーによって認識されうるDNA鋳型である。該結合構成物を、100μlの尿試料に10ng/mlの濃度になるように添加し、十分な時間インキュベートして、抗体もしくは抗体断片が試料中に存在するレジオネラ・ニューモフィラのセログループ1の糖質抗原に結合して溶液中に構成物と化合物との複合体(構成物と抗原との複合体)を形成できるようにする。結合性の表面は、接触可能な結合標的すなわち前記抗体もしくは抗体断片(結合構成物の認識部分)の可変領域に結合し得るペプチドミモトープで標識された磁性粒子である。好適なペプチドミモトープは当分野で周知の方法、例えばランダムもしくは非ランダムなペプチドライブラリーのファージディスプレイまたはペプチドのコンビナトリアル合成と、その後のアフィニティ選択により入手可能である(Smith and Petrenko, 1997, Chem. Rev., 97, p.391-410; Kramer et al., 1993, Peptide Res., 6, p.314-319)。磁性粒子は反応基の第1級アミンを有し、1‐エチル‐3[3‐ジメチルアミノプロピル]‐カルボジイミド塩酸塩(EDC)などの水溶性カルボジイミドを用いて、ペプチドミモトープのカルボキシ末端のカルボキシルを介してペプチドミモトープを粒子に結合させることが可能である。30%の粒子懸濁物10μlを、構成物と化合物との複合体(構成物とレジオネラ・ニューモフィラのセログループ1の糖質抗原との複合体)を含む溶液に
添加し、結合していない抗体/DNA結合構成物とともに粒子が構成物と表面との複合体を形成しうるようにする。該溶液に磁石を適用して磁性粒子を分離することによって、結合していない結合構成物を分離して溶液中に構成物と化合物との複合体を残す。得られた溶液(構成物と化合物との複合体を含む)2μlを、プライマー、遊離のヌクレオチド、およびTaqDNAポリメラーゼを含むPCR反応溶液に添加する。構成物と化合物との複合体として溶液中に存在している全ての結合構成物のDNA部分が増幅される。PCR反応物を1%アガロースゲルで展開し、エチジウムブロマイド染色により視覚化する。レジオネラ・ニューモフィラのセログループ1の糖質抗原が試料中に存在するか否かは、増幅させたDNA断片について正しい分子量に該当するバンドがゲル中にそれぞれ存在するか否かによって示される。
この実施例では、目的の化合物は、結核菌の38キロダルトンの細胞外タンパク質に対して特異的な結核菌特異的ヒトIgG(抗MTbIgG)である。結核菌はヒトの肺結核症の病原因子である。試料は、結核菌に感染している疑いのある患者の血清であることが好ましい。結合構成物は、(1)抗MTbIgGの可変領域によって認識かつ結合されうるペプチドエピトープもしくはミモトープである認識部分と、(2)試料中に見出されることが予測される配列を含まない配列、例えば哺乳動物や細菌には見出されない高等植物由来の核酸配列を有する核酸部分とを含む。認識部分は、抗MTbIgGのミモトープでもよいし、抗MTbIgGによって認識される細菌タンパク質もしくはペプチドに由来する天然のペプチド配列であってもよく、いずれの場合においても、該ペプチドは結核菌特異的ヒト免疫グロブリンGのサブクラスと結合して構成物と化合物との複合体(構成物と抗MTbIgGとの複合体)を形成することができる。核酸部分は、PCRにより増幅するために低ストリンジェンシー条件で結合するように設計された合成プライマーによって認識されうるDNA鋳型である。該結合構成物を、100μlの血清試料に10ng/mlの濃度になるように添加し、十分な時間インキュベートして、結合構成物の認識部分が試料中に存在する抗MTbIgGに結合して溶液中に構成物と化合物との複合体(構成物と抗MTbIgGとの複合体)を形成できるようにする。結合性の表面は、結合構成物の認識部分を認識かつ結合しうる抗体もしくは抗体断片が結合しているアガロースビーズである。該アガロースビーズは、シアノボロ水素化ナトリウム(NaBH3CN)を用いて抗体の重鎖のアミノ基に架橋させることが可能な反応性のアルデヒド基を有する。30%の粒子懸濁物20μlを、構成物と化合物との複合体(構成物と抗MTbIgGとの複合体)を含む溶液に添加し、結合していないペプチド/DNA結合構成物とともにビーズが構成物と表面との複合体を形成しうるようにする。この混合物をエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離してアガロースビーズを懸濁物からペレットとし、構成物と化合物との複合体(構成物と抗MTbIgGとの複合体)が上清中に溶液状態で遊離したまま残るようにする。該上清2μlを、プライマー、遊離のヌクレオチド、およびTaqDNAポリメラーゼを含むPCR反応溶液に添加する。構成物と化合物との複合体として溶液中に存在している全ての結合構成物のDNA部分が増幅される。PCR反応物を1%アガロースゲルで展開し、エチジウムブロマイド染色により視覚化する。試料中に結核菌特異的ヒト免疫グロブリンGが存在するか否かは、増幅させたDNA断片について正しい分子量に該当するバンドがゲル中にそれぞれ存在するか否かによって示される。
Claims (15)
- 溶液中において試料中の目的の化合物を検出する方法であって、
(a)前記目的の化合物を認識し結合する認識部分と、核酸部分とを含んでなる結合構成物を提供する工程と、
(b)前記結合構成物を前記試料と混合して混合物の溶液を生成し、結合構成物と化合物との複合体を溶液中に形成させる工程と、
(c)前記結合構成物の前記認識部分を認識して結合しうる1または複数の接触可能な結合標的を有する磁性粒子である1または複数の表面を提供する工程と、
(d)前記1または複数の表面を、前記結合構成物と前記試料との前記溶液に導入して、前記1または複数の表面が、結合していない全ての結合構成物とともに構成物と表面との複合体を形成するようにする工程と、
(e)前記構成物と表面との複合体を前記溶液から物理的に取り除くことなく、前記構成物と表面との複合体を前記溶液から分離して前記構成物と化合物との複合体を前記溶液中に残す工程と、
(f)前記結合構成物の前記核酸部分の前記溶液中での有無を検出する工程と
からなり、前記結合構成物の前記核酸部分の存在が試料中に前記目的の化合物が存在することを示すことを特徴とする方法。 - 工程(f)において、前記結合構成物の前記核酸部分の有無の検出が、前記核酸部分の増幅、前記核酸部分のハイブリダイゼーション、酵素による増幅、標識の検出、またはこれらの組合せからなる、請求項1に記載の方法。
- 工程(f)において、前記結合構成物の前記核酸部分の有無の検出が、前記核酸部分の増幅からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸部分の増幅がポリメラーゼ連鎖反応からなる、請求項2に記載の方法。
- 前記認識部分が受容体を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記認識部分が抗原を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記認識部分が抗体または抗体断片を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記認識部分が一本鎖抗体の可変領域の断片を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記認識部分がFab断片を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記Fab断片が該Fab断片の遊離のスルフヒドリル基を介して前記核酸部分に結合している、請求項9に記載の方法。
- 前記目的の化合物が抗体または抗体断片を含んでなり、前記結合構成物の前記認識部分が前記目的の化合物によって認識される抗原を含んでなり、前記接触可能な結合標的が前記結合構成物の前記認識部分を認識かつ結合し得る抗体または抗体断片を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸部分がDNAを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸部分がRNAを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸部分が、試料中に見出されることが予測される配列を含まない核酸配列を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(a)が、2以上の異なる種類の結合構成物を提供することからなり、前記2以上の異なる結合構成物それぞれが異なる認識部分および異なる核酸部分を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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US4134792A (en) * | 1976-12-06 | 1979-01-16 | Miles Laboratories, Inc. | Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance |
US4628037A (en) * | 1983-05-12 | 1986-12-09 | Advanced Magnetics, Inc. | Binding assays employing magnetic particles |
US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
DE3433652A1 (de) | 1984-09-13 | 1986-03-20 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren fuer haptene und proteine |
ATE80948T1 (de) * | 1986-07-14 | 1992-10-15 | Abbott Lab | Diagnostisches immuntest-verfahren mittels festphasenabscheidung. |
US5244816A (en) * | 1989-10-11 | 1993-09-14 | Akzo N.V. | Method for purifying chelator conjugated compounds |
US5665539A (en) * | 1991-07-12 | 1997-09-09 | The Regents Of The University Of California | Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection |
US5985548A (en) * | 1993-02-04 | 1999-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
US5445936A (en) | 1993-09-15 | 1995-08-29 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for non-competitive binding assays |
US5648213A (en) * | 1994-08-30 | 1997-07-15 | Beckman Instruments, Inc. | Compositions and methods for use in detection of analytes |
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US6686150B1 (en) * | 1998-01-27 | 2004-02-03 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Amplification of nucleic acids with electronic detection |
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US6511809B2 (en) * | 2000-06-13 | 2003-01-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter |
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