JPH06235725A

JPH06235725A - バイオ情報変換素子及びそれを用いた生物種検出方法

Info

Publication number: JPH06235725A
Application number: JP2301993A
Authority: JP
Inventors: Kinya Kato; 欽也加藤; Kazusane Tanaka; 和實田中
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1993-02-10
Publication date: 1994-08-23

Abstract

(57)【要約】【構成】生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部と、核
酸部と微粒子を介して結合して物種情報を核酸情報に変
換するためのバイオ情報変換素子を作成する。【効果】生物種とバイオ情報変換素子を結合させて得
られた結合体の有する核酸部の核酸をＰＣＲ法により増
幅させ、それを検出することで、微量存在量の微生物も
しくは増殖が困難な微生物の菌種及び菌数の検出を迅速
かつ容易に行うことができ、しかも抗体部と核酸部の結
合に微粒子を用いたことで検出操作をより効率的に実施
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞、微生物等の生物
種の存在情報を核酸情報に変換するバイオ情報変換素子
に関し、また本発明は、このバイオ情報変換素子を用い
て細胞、微生物等の生物種情報を核酸情報に変換するこ
とで細胞、微生物の存在を知る検出方法に関する。この
素子及び検出方法は生物種の定量または定性試験に用い
ることができるものである。

【０００２】

【従来の技術】医薬・食品・農業など多くのバイオテク
ノロジーの分野で、細胞や微生物の数や菌数を把握する
ことは重要な課題である。最も単純には、顕微鏡によっ
て直接菌数を測定すれば良い。しかしこれは煩雑である
上、菌種の区別が十分できない。また、例えば１ｍｌ中
に数万匹程度しかいない場合は測定不可能である（例え
ば、分子生物学実験マニュアルｐ１１〜（講談社サイエ
ンティフィク））。すなわち検出感度に限界がある。こ
のわずかにしか存在しない菌の、菌数と菌種を特定する
ことは直顕法では困難であるため、いろいろな手法が考
案されてきた。

【０００３】単純には、培養を行い菌数を増やし検出し
易くする試みである。しかし単にこの方法では菌種の区
別はつかないし、増殖過程で定量性は失われてしまう。
このような課題を解決する方法として広く用いられてい
るのが、ＭＰＮ（ＭｏｓｔＰｒｏｂａｌｅＮｕｍｂｅ
ｒ）法である。ＭＰＮ法とは、基本的に培地を入れた多
数の試験管に数段階の菌希釈液（サンプル）を一定量ず
つ接種して十分な期間培養した後に菌の生育の有無を判
定して統計処理により計数する方法である（土壌微生物
実験法、養賢堂、ｐ４５）。ここで、問題となるのは、
菌種をどうやって特定するかであるが、かかる菌が特定
物質を分離したり合成したりする場合はその活性を検出
すれば良い。また、ＤＮＡを用いた遺伝子系で検出を行
った例もある（ＥｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｏｆＴｎ５
ＭｕｔａｎｔＢａｃｔｅｒｉａｉｎＳｏｉｌ
ｂｙＵｓｉｎｇａＭｏｓｔ−ＰｒｏｂａｂｌｅＮ
ｕｍｂｅｒ−ＤＮＡＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰ
ｒｏｃｅｄｕｒｅａｎｄＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＲ
ｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｊ．Ｋ．Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏ
ｎ；ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５４，Ｎ
ｏ．２，１９８８）。これらの工夫で、菌の数と種類を
特定することが可能となったが、菌産生物質の検出やＭ
ＰＮ法では培養を行う必要があり、特に土壌微生物など
のように成育が遅い菌の場合、時間がかかり迅速な検出
が行えず不適当である。

【０００４】そこで培養を行わず微生物情報を増やす手
段として、検出にＤＮＡを用い、ＤＮＡレベルで増やす
という試みがなされている。ＤＮＡは、ＰＣＲ（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法で
増やすことができる（ＳｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３
１，１９８８）。しかしＤＮＡを用いる方法ではＤＮＡ
を抽出するプロトコルが避けられず煩雑であり、菌濃度
が低い場合には抽出の際にＤＮＡが失われ回収が困難で
ある。更に、たとえＤＮＡが回収できたとしてもこの方
法では、定量性のある情報は得られない。菌量とＤＮＡ
回収量とはかならずしも相関がないからである。また、
定量性を出すためＭＰＮ法とＰＣＲ法を組み合わせた例
（ＤＮＡ溶液の希釈それに続くＰＣＲ反応）もあるが、
この方法では最終段、即ちＤＮＡ溶液を希釈していき、
ＰＣＲ法で増幅が可能な最低限度の濃度が曖味である。
菌によるＭＰＮ法では菌体一個でも比較的容易に増殖が
可能であるが、ＤＮＡ一断片からＰＣＲ法で実際に増幅
が可能か否か技術的に明確でない。

【０００５】またＤＮＡや、菌を使う以外の方法とし
て、抗原・抗体反応とＭＰＮ法の組み合わせによって細
胞の数と種類を決める方法もある。しかし抗原・抗体反
応の特異性を利用して特定種の菌の有無を判断する方法
では、菌を増殖せず標識材のみで検出するため増感が高
々２〜３段（菌１個に対して標識材２〜３個を有する抗
体１個を結合させる）しか行えず、菌の増殖法、ＰＣＲ
法と比べ格段に増幅しにくく感度の面で限界がある。

【０００６】感度の改善については、最近ＥＬＩＳＡ
（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｌｕ
ｂｅｎｔａｓｓａｙ）とＰＣＲとを組合せた方法が提
案されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，（２），Ｏｃ
ｔｏｂｅｒ１９９２，ｐ１２０〜）。この方法は、従
来のＥＬＩＳＡ法の２次抗体と酵素の結合体を形成させ
る代わりに、予めＤＮＡにビオチンを取り込ませたビオ
チン化ＤＮＡと、このビオチンと特異的に接合する部位
（ストレプトアビジン）と抗体に特異的に結合する部位
（プロテインＡ）を持つキメラタンパク質を用意し、こ
の両者（ビオチン化ＤＮＡとキメラタンパク質）を結合
体（例えばｂｉｔｉｎｙｌａｔｅｄｐＵＣ１９ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄｔｏｔｈｅｓｔｒｅｐｔａｖｉ
ｚｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎＡｃｈｉｍｅｒａ）として
得ておき、この結合体を抗原と抗体の免疫反応の後のプ
ロセスで支持体上に固定された抗原と結合させ、この抗
体に結合した結合体の有するＤＮＡをＰＣＲで増幅し、
検出するものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述した従来技術で述
べたように、従来法は簡単にまとめると、菌数・菌種の
判断には、ある程度の量が必要なため培養若しくは増感
の手段が必要となる。細胞レベルでは比較的増殖は容易
であるが、成長の遅い菌の場合迅速検出が困難である。
一方ＤＮＡは、ＰＣＲ法で迅速に増幅が行えるがＤＮＡ
抽出の煩雑さや回収率の問題がある。これらの問題は特
にサンプル数が多い場合看過できない。また、抗原・抗
体反応系では増感の大きさに限界がある。

【０００８】また、ＥＬＩＳＡ法における検出工程にＤ
ＮＡとキメラタンパク質の結合体を利用する方法では、
キメラタンパク質の調製に高度な技術と複雑な操作が必
要であり、また抗原・抗体反応に続いて支持体に固定さ
れた抗原と結合した抗体と該結合体を反応させる煩雑な
操作が必要であるとい問題を有する。また、ＰＣＲで増
幅されるＤＮＡのビオチン化では、ビオチンをＤＡＮ鎖
の両端に結合させるので、次に続くＰＣＲ反応において
正確かつ効率良いＰＣＲ反応を常に行えるとは限らない
という問題もある。

【０００９】以上のことから、増殖の遅い菌の場合にお
いても、ＤＮＡの抽出を必要とせずに簡便でそして正確
に菌などの生物種の種類や数を把握できる方法は従来に
おいて見当たらないのが現状であった。

【００１０】本発明の課題は、検出対象の菌等の増殖速
度に拘らず、かつ菌等からのＤＮＡの抽出等の操作を行
わず、高い感度で菌等の数または種を迅速に把握するこ
とができる測定素子及びそれを用いた検出方法を提供す
ることにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】かかる課題を解決する本
発明は、生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部と、核酸
からなる核酸部とを有し、該抗体部と該核酸部が微粒子
を介して結合していることを特徴とする生物種情報を核
酸情報に変換するためのバイオ情報変換素子である。好
ましくは、該核酸が０．３〜３kbのＤＮＡ断片であり、
また、核酸部１分子に対して抗体部５〜５０分子が結合
しているものである。

【００１２】また本発明の生物種検出方法は、検出対象
となる生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部を有する上
記バイオ情報変換素子を該生物種と溶液中で混和し該バ
イオ情報変換素子と生物種との結合体を形成し、得られ
た結合体を溶液から分離した後、該結合体を構成するバ
イオ情報変換素子の核酸部の核酸をＰＣＲ法により増幅
し、増幅した核酸の検索を行うことにより生物種を検出
する方法であり、更に、かかる方法における結合体形成
を生物種濃度を数段階に予め希釈した溶液中で生物種と
バイオ情報素子を混和し行う生物種検出方法である。

【００１３】本発明によれば、微量存在量の細胞、微生
物または増殖が困難な細胞、微生物の種類及び存在量の
検出が迅速、容易に行えるようになる。しかも、抗体部
と核酸部とを結合する媒体として微粒子を用いたので、
未反応のバイオ情報変換素子と、生物種とバイオ情報変
換素子の結合体の分離が容易となる。

【００１４】以下に本発明について詳述する。

【００１５】本発明のバイオ情報変換素子の基本的構成
を図１に模式的に示す。この素子は、生物種、例えば微
生物や細胞を抗原として免疫反応を行う抗体からなる抗
体部１と、ＰＣＲで増幅可能であり、かつ増幅後に検出
可能な構成を有する核酸からなる核酸部２とが、微粒子
３を介して結合した構成を有する。

【００１６】本発明の変換素子に用いることのできる抗
体部としては、検出対象である生物種と特異的に反応す
るものであればよく公知の方法により調製された抗体を
用い得る。即ち、各種動物及び各クラスの免疫グロブリ
ンを用いることができ、例えば、免疫法により調製した
動物の抗血清を用いてもよいし、非特異反応を抑制し感
度を向上させるため常法により調製したモノクロ−ナル
抗体や更に、抗体の半分子や可変領域を残し特異性をよ
り高めた抗体の部分構造Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’）₂ 等、
種々の抗体分子を用いることができる。また、通常抗原
である生物種はエピト−プを複数有するので複数種の抗
体を用いてもよい。

【００１７】本発明の変換素子に用いることのできる核
酸部としては、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片を用い得るが、
ＰＣＲ法による増幅の容易性、確実性からＤＮＡ断片が
好ましい。ＰＣＲ法が適用できる限りは断片の大きさや
塩基配列等は特に制限されない。調製の容易性や取扱の
容易性等の観点から適宜選定すればよい。また、プライ
マ−が結合できれば用いる断片の大きさや塩基配列は全
て既知である必要はないが、増幅後の検索の便宜から塩
基配列等が既知のものが使い易い。好ましい核酸部とし
ては、ＰＣＲを効率良く行い、かつ増幅後の検出の容易
性等から０．３〜３kb、更には、０．５〜１．０kbのＤ
ＮＡ断片がよい。

【００１８】ＤＮＡ断片としては例えば、ｐＵＣ１８、
１９、１１８、１１９系ベクタ−やＭ１３系ベクタ−等
公知のベクタ−を利用し常法により大腸菌等で増殖し適
当な制限酵素で切り出すことで１本鎖ＤＮＡとして調製
できる。また、スクリ−ニング容易性を考えて公知のベ
クタ−の組換え体を用いてもよい。更に、ＤＮＡ合成機
で合成したものも利用できる。

【００１９】又、得られる変換素子の抗体部の抗原・抗
体反応性、核酸部のＰＣＲ反応性を損なわない限りで、
変性した抗体、核酸を用いることも可能で、例えば、微
粒子との結合若しくは架橋剤との結合を容易にするため
に核酸や抗体にアミノ基等の各種官能基を導入するなど
の変性を施したものを用いることができる。

【００２０】バイオ情報変換素子における核酸部と抗体
部の量比は、用いる微粒子の大きさ等にもよるが、核酸
１分子に対して抗体５〜５０分子、更には、１０〜２０
分子が結合しているのが好ましい。結合する抗体が少な
い場合は結合が不確かになり、多い場合はＰＣＲ反応を
阻害する一因ともなる。しかしながら、これらは核酸部
の長さに応じて決めると良い。

【００２１】核酸部及び抗体部の微粒子との結合には、
これらの機能を損なわない範囲内で種々の方法が利用可
能である。なかでも、化学的な結合が好ましく、カルボ
ジイミド法、臭化シアン法、イソシアネート法等が利用
できる。また、その表面を核酸部と直接または架橋剤を
介して結合し得る基で変性した微粒子を用いることも可
能である。

【００２２】微粒子としては種々のものが利用可能であ
るが、例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート
等を主成分とした有機高分子等を用いることができ、こ
れらの有機高分子微粒子の表面を必要に応じて変性して
例えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、ア
ルデヒド基、オキシシラン基等の抗体や核酸との結合を
容易とする官能基を導入したものが好ましい。

【００２３】また、微粒子の径等を適当に選択すること
によって、生物種とバイオ情報変換素子が結合すること
で微粒子の分散状態のバランスが崩れ、自然沈降を生じ
るようにすることも可能であり、その場合遠心分離など
の人工的手段を用いることなく生物種と結合している素
子と未反応の素子との分離を容易に行うことが可能とな
る。このような自然沈降効果を得るための微粒子の粒径
は検出対象としての生物種の大きさ等に応じて適宜選択
すれば良いが、細菌などの微生物等の生物種の検出に有
機高分子微粒子を用いる場合には、例えば０．０５〜１
０μｍ、好ましくは０．１〜２μｍの直径を有するもの
が利用できる。粒径が０．０５μｍ未満ではバイオ情報
変換素子を製造する工程中の遠心、洗浄における操作が
困難となり、また１０μｍを超えるとバイオ情報変換素
子の各種溶液内での分散安定性が不良となり、また上述
の自然沈降効果も得られないので好ましくない。

【００２４】更に、生物種との結合によって凝集性を発
揮する微粒子を用いれば、生物種とバイオ情報変換素子
の結合体を凝集沈殿させることが可能となる。

【００２５】これらの結合に用いる架橋剤としては、例
えば抗体の標識化及び核酸の標識化に用いられる一般的
な架橋剤が使用可能であり、マレイミド系、サクシンイ
ミド系、ジスルフィド系、カルボジイミド系、アルデヒ
ド系などの架橋剤がある。具体的には、カルボジイミド
メト−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等を
好適に用い得る。

【００２６】次に、本発明によるバイオ情報変換素子に
よる基本的な検出フローを図２を参照しつつ以下に示
す。１）検出対象、例えば微生物を含む水溶液に、本発明に
よるバイオ情報変換素子を入れ混和する。このときの抗
原としての微生物濃度は１０〜１０³個／μｌ程度が目
安である。また、添加する変換素子の量は微生物量に対
して過剰量がよく１０μｇ／ｍｌ程度がよい（図２の
（Ａ）参照）。２）バイオ情報変換素子の抗体部は、特定の微生物に結
合し、結合が生じなかったバイオ情報変換素子はそのま
ま溶液中を浮遊する（図２の（Ｂ）参照）。反応に要す
る時間は３７℃で数分間程度である。反応中は振盪する
とよい。３）この溶液を遠心し、微生物と結合を生じたバイオ情
報変換素子５ａと結合を生じなかったバイオ情報変換素
子５ｂとを分離する。即ち、遠心条件として結合体のみ
が沈降する条件を設定し、その条件での遠心操作によっ
て沈殿した結合体を、非結合体を含む上清と分離する
（図２の（Ｃ）参照）。なお、上述のように微粒子の直
径を選択して結合体のみが自然沈降する場合や微粒子と
して結合体を形成した際に凝集沈殿を生じるものを利用
した場合には、遠心分離を利用せずにこの分離操作を行
っても良いが、このらの場合でも遠心分離を併用しても
かまわない。４）沈殿物をＰＣＲ用の溶液中に溶解しＰＣＲ反応を行
う（図２の（Ｄ）参照）。所望のバイオ情報変換素子が
存在すれば、バイオ情報変換素子の核酸部の塩基配列を
鋳型としたＰＣＲ反応によって一定のＤＮＡが増幅され
る。プライマーは、用いる核酸の塩基配列の５’側と
３’側に相補的なものを用いればよい。ＰＣＲはＰＣＲ
用キットとして市販されているのでそれらを利用して実
施すればよい。増幅の回数は３０サイクル程度で分析に
必要な量が得られる。５）溶液から、核酸を回収し電気泳動などで核酸の存否
を知ることでもとの溶液中の微生物の存在を知ることが
できる（図２の（Ｅ）参照）。これらは常法に基づいて
実施できる。

【００２７】本発明の方法によれば原理的に１個の生物
種が存在すればこれを検出することが可能となる。

【００２８】この方法は、ＭＰＮ法のごとき数段階の希
釈サンプルそれぞれについて所望の生物種の存否を検出
する方法に適用することで、生物種の定量を容易に行う
ことができる。しかも本発明の場合は希釈するだけ足
り、その後に通常行われる培養の工程を実施する必要は
全くない。従って本方法は成長の遅い菌の場合極めて有
利である。

【００２９】

【実施例】以下に実施例をもって本発明を詳細に説明す
るが、これらは本発明の範囲をなんら限定するものでは
ない。

【００３０】実施例１バイオ情報変換素子の作成法常法により、ｐＵＣ１９のＳｓｐＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ断片
（約０．７Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位に挿入し
ｐＵＣ５５を構築した。このものはＤＮＡ長とＡｍｐ耐
性を指標として、常法に従い大腸菌により増殖後スクリ
ーニングをかけ、回収した。得られたｐＵＣ５５からＰ
ｖｕII、ＶｓｐＩ断片（約０．９Ｋｂ）を切り出して抽
出し常法に従ってＤＮＡ断片を調製し、これを熱変性に
よって一本鎖とし以下のバイオ情報変換素子の作成に供
した。

【００３１】１重量％の有機高分子微粒子水分散液（粒
子直径０．８μｍ、スチレン−アクリルアミド−アクリ
ル酸共重合体微粒子）の５００μｌに、上記一本鎖ＤＡ
Ｎ断片溶液（核酸濃度１０μｇ／ｍｌ、溶媒として０．
１ＭＭｇＣｌ₂ を含むリン酸緩衝液−生理食塩水（以
下ＰＢＳという）を使用）の２５００μｌ及び１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミドの０．０６ｇを添加して混合し、室温で１０分間放
置した。遠心分離による洗浄後、微粒子を１／１５Ｎリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に分散して、固形分１％の
微粒子分散液を得た。この微粒子分散液の５ｍｌに、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カル
ボジイミドの０．１２ｇを加え、室温で３時間振とうし
た。次に、この微粒子分散液から遠心分離により微粒子
を回収し、さらに１／１５Ｎリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．
０）で洗浄した。洗浄後の微粒子に、大腸菌のＩｇＧに
対するマウス抗体（フナコシ社）溶液（ＰＢＳで１ｍｇ
／ｍｌの濃度に調整）の１．０ｍｌを加えた後、３時間
振とうし、遠心分離によりＤＮＡ／微粒子／抗体・複合
体、すなわち本発明のバイオ情報変換素子を得た。

【００３２】実施例２ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａＫＫ０１株
のＯＤ０．５溶液５ｍｌに、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体１０³
個を含む溶液１ｍｌを加え反応液Ａとし、一方ＫＫ０１
株のＯＤ０．５溶液５ｍｌだけのものを反応液Ｂとし
た。この２つの反応液を個々に用いて以下の作業を同様
に行った。

【００３３】反応液を素早く遠心し（５，０００ｒ．
ｐ．ｍ（ＴＯＭＹ，ＭＲ−１５０）で５分間）、沈澱し
た菌体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに分散させ、これに実施例
１で作成したバイオ情報変換素子１μｇを加え混和した
後３７℃で１５分間静置した。静置によって沈澱が生じ
たので、この反応液から上澄液を除去し、得られた沈澱
物に２００μｌのＴＥ溶液を加え、８０℃に５分間加温
した。加温後、素早く上澄液の１５０μｌをピペットマ
ンで取り、これをＰＣＲ用チューブに移した。ＰＣＲ反
応は、プローブとしてＴＯＹＯＢＯのプライマーＰＲＭ
−００４及びＰＲＭ−００５を用い所定のプロトコルに
従って反応を行った。増幅は３０サイクル行った。ＰＣ
Ｒ反応後、チューブから反応液を取りＭｕｐｉｄ−２
（コスモバイオ）で電気泳動を行った（５０Ｖ）。反応
液Ａからのレーンでは、約０．９Ｋｂ付近にバンドが認
められたが、反応液Ｂではバンドは認められなかった。
即ち、バイオ情報変換素子により抗原であるＥ．ｃｏｌ
ｉの検出ができた。

【００３４】実施例３ＫＫ０１株のＯＤ０．５溶液５ｍｌに、Ｅ．ｃｏｌｉの
菌体１０³ 個を含む溶液１ｍｌを加え反応液とした。こ
の反応液を、１０倍づつ段階的に希釈した。すなわち原
液を反応液０、１０倍希釈液を反応液１、１０² 倍希釈
液を反応液２、１０³ 倍希釈液を反応液３、と１０¹⁰希
釈液を反応液１０までの計１１本用意し１系列とした。
この系列を５つ用意し、ｒｕｎｌからｒｕｎ５までの５
系列（計５５本）としてそのそれぞれについて以下の作
業を同様に行った。

【００３５】先ず、各反応液を素早く遠心し（５，００
０ｒ．ｐ．ｍ（ＴＯＭＹ，ＭＲ−１５０）で５分間）、
沈澱した菌体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに分散させ、これに
実施例１で作成したバイオ情報変換素子１μｇを加え混
和し、３７℃で１５分間静置した。静置によって沈澱が
生じたので、この反応液から上澄液を除去し、得られた
沈澱物に２００μｌのＴＥ溶液を加え、８０℃に５分間
加温した。加温後、素早く上澄液の１５０μｌをピペッ
トマンで取り、これをＰＣＲ用チューブに移した。ＰＣ
Ｒ反応は、プローブとしてＴＯＹＯＢＯのプライマーＰ
ＲＭ−００４及びＰＲＭ−００５を用い所定のプロトコ
ルに従って反応を行った。増幅は３０サイクル行った。
ＰＣＲ反応後、チューブから反応液を取りＭｕｐｉｄ−
２（コスモバイオ）で電気泳動を行った（５０Ｖ）。

【００３６】レーンに約０．９ｋｂ付近でバンドが認め
られたか否かの結果を表１に示す。即ち、反応液３まで
はバンドが全てのｒｕｎで認められたが、反応液４では
２つのｒｕｎで認められたが、ほかのｒｕｎでは認めら
れなかった。また、反応液５以降では全く認められなか
った。従って、バイオ情報変換素子により反応液中には
１０³個の抗原、すなわちＥ．ｃｏｌｉが存在してい
たことが定量的に測定できたことが判る。

【００３７】

【表１】参考例上記の実施例において用いたＫＫ０１株は以下の方法に
より得られたものである。用いたＭ９培地は下記の組成
を有するものである。Ｍ９培地組成（１リットル中）；ＮａＨＰＯ₄ ６．２ｇＫＨ2 ＰＯ₄ ３．０ｇＮａＣｌ０．５ｇＮＨ₄ Ｃｌ１．０ｇ（ｐＨ７．０）（フェノールによるスクリーニング）タカサゴシロアリ
のハタラキシロアリを１０匹シャーレにとり、エチルア
ルコール（９５％）をこれに注ぎシロアリ表面を殺菌し
た。次に、０．０５％のフェノールを含有するＭ９培地
でシロアリを２回洗い、その表面からエチルアルコール
を除去した。洗浄後、シロアリの腸をピンセットで摘み
出し、それを０．０５％のフェノールを含有するＭ９培
地中ですり潰し、腸破砕物を含む液状混合物を得た。こ
の混合物の一部を、０．０５％フェノール及び０．０５
％酵母エキストラクトを含有するＭ９培地に接種し、３
０℃で好気条件下で培養した。培地中のフェノール量の
変化を常法により求め、シロアリ腸内にフェノール資化
性の微生物が存在することを確認した。（フェノールを用いた単離株の取得）上記のＭ９培地
（０．０５％フェノール及び０．０５％酵母エキストラ
クトを更に含有する）での培養により得られた培地（増
殖菌体を含む）を、フェノール含有Ｍ９寒天培地（０．
０５％フェノール及び１．２％寒天を含む）の表面に塗
布し、３０℃で２日間培養した。寒天培地上に良好に生
育してきたコロニーを単離株として得た。単離株の１つ
についてその菌学的性質を調べたところ下記の結果が得
られ、この単離株はシュードモナス・セパシアに属する
ものであるとの結論に至った。Ａ．形態的性状（１）グラム染色：陰性（２）菌の大きさ及び形：長さ１．０〜２．０μｍ、幅
０．５μｍ前後の桿菌（３）運動性：ありＢ．各種培地における生育状況

【００３８】

【表２】Ｃ．生理的性質（１）好気性、嫌気性の区別：偏性好気性（２）糖の分解様式：酸化型（３）オキシダーゼの生成：＋（４）硝酸銀の還元：＋（５）硫化水素の生成： − （６）インドールの生成： − （７）ウレアーゼの生成： − （８）ゼラチンの液化： − （９）アルギニンの加水分解：− （１０）リジンの脱炭酸：＋（１１）オルニチンの脱炭酸：− （１２）クエン酸の利用：＋（１３）メチルカルビノールアセチル反応（ＶＰ反
応）：− （１４）トリプトファンデアミナーゼの検出：− （１５）ＯＮＰＧ： − （１６）炭水化物類の利用性：ブドウ糖：＋果糖：＋麦芽糖：＋ガラクトース：＋キシロース：＋マンニット： ± 白糖： − 乳糖：＋エスクリン： − イノシット： − ソルビット： − ラムノース： − メリビオース：− アミグダリン：− Ｌ−（＋）−アラビノース：＋この単離菌株をＫＫ０１株と命名して、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した（寄託日：平成
４年３月１１日、寄託番号ＦＥＲＭＰ−１２８６
９）。

【００３９】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のバイオ情
報変換素子を用いることによって、微量存在量の細胞や
微生物又は増殖が困難な細胞や微生物の種類及び存在量
の検出が迅速かつ容易に行うことができる。即ち、検出
に際し、菌等の増殖を必要としないため増殖速度に拘ら
ず定性、定量の分析が可能で、又、菌等からのＤＮＡの
抽出等の操作をすることなく、高い感度で菌等の数また
は種を迅速に把握することができる。

【００４０】しかも、抗体部と核酸部とを結合する媒体
として微粒子を用いたので、未反応のバイオ情報変換素
子と、生物種とバイオ情報変換素子の結合体の分離が容
易となる。

【００４１】更に、本発明のバイオ情報変換素子を用い
れば抗原として生物種ばかりでなく、低分子化合物や脂
肪、多糖質に至る迄、抗原・抗体反応を起こすものであ
れば全て検出可能であり、検出測定素子として極めて有
用性が高いものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のバイオ情報変換素子の構成を示す模式
図である。

【図２】本発明のバイオ情報変換素子を用いて抗原を検
出する方法を説明する模式図であり、図中（Ａ）→
（Ｂ）→（Ｃ）→（Ｄ）→（Ｅ）の手順で検出を行うこ
とを示す。

【符号の説明】

１抗体部２核酸部３微粒子４検出対象生物種５バイオ情報変換素子５ａ検出対象生物種と結合した素子５ｂ未反応の素子

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部
と、核酸からなる核酸部とを有し、該抗体部と該核酸部
が微粒子を介して結合していることを特徴とする生物種
情報を核酸情報に変換するためのバイオ情報変換素子。
【請求項２】前記微粒子が０．０５〜１０μｍの直径
を有するものである請求項１に記載のバイオ情報変換素
子。
【請求項３】前記微粒子が有機高分子材料からなるも
のである請求項１または２に記載のバイオ情報変換素
子。
【請求項４】前記微粒子がポリスチレンを主体とする
有機高分子微粒子である請求項３に記載のバイオ情報変
換素子。
【請求項５】検出対象となる生物種と抗原・抗体反応
を行う抗体部を有する請求項１〜４のいずれかに記載の
バイオ情報変換素子を該生物種と溶液中で混和し、該バ
イオ情報変換素子と生物種との結合体を形成し、得られ
た結合体を溶液から分離した後、該結合体を構成するバ
イオ情報変換素子の核酸部の核酸をＰＣＲ法により増幅
し、増幅した核酸の検索を行うことにより生物種を検出
する方法。
【請求項６】生物種濃度を数段階に予め希釈した溶液
中で生物種とバイオ情報素子を混和し、結合体を形成す
る請求項６に記載の生物種検出方法。
【請求項７】結合体の分離を凝沈、自然沈降または遠
心分離により行う請求項５または６に記載の生物種検出
方法。