JPH06500391A - 分析装置 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称 分析装置
本発明は、イムノアッセイによる生物学的活性分子の定量に係り、特に、このよ
うな定量に用いられるバイオセンサーとして知られる種の装置に関する。
イムノアッセイ技術は、試験下の種(分析物)とこれが特異的に結合するであろ
う他の種(「特異結合パートナ−(specific binding par
tner)J )との間で複合体を形成することを包含する。複合体形成が起こ
る程度は、分析物の存在量に依存する。
バイオセンサー装置において、特異結合パートナ−は装置の表面に固定されるこ
とができ、複合体が形成され、それゆえ分析物の濃度が、その表面での特性、例
えば光学的特性の変化としてモニターされる。
知られているイムノアッセイシステムの欠点は、複合体の形成の際に起こる変化
が比較的小さく、そのために検出が困難であるということから起こる。
この問題を克服し得る1つの方法は、特異結合パートナ−を、高い屈折率又は強
い色彩を存する生成物を生成するように基質に働く酵素で標識することである。
この効果は、分析物の存在に対する装置の応答を増幅し、感度を増加して、それ
ゆえ検出限度を下げる。
しかし、実施に際して、この酵素標識と基質は複合体が形成するまで分離させて
おかなければならず、従来、これをバイオセンサー装置内で達成することは困難
であった。酵素とその基質が分離領域又は表面にあるようなセンサーの組み立て
が用いられ得るが、より精密な組み立て方法を必要とし、また、基質と酵素との
十分な混合にかなりの時間がかかるために、センサー性能を損うことになる。
ここに、バイオセンサー装置か考案され、この装置では、酵素−基質相互作用が
分析物の存在に対する装置の応答を増幅するために用いられ得る。
本発明によれば、酵素−基質相互作用を応答増幅に用いて、溶液中の分析物を検
出するためのバイオセンサーが提供される。このバイオセンサーは、分析物に対
する固定された一次特異結合パートナーと、この分析物に対する二次特異結合パ
ートナ−又は−次特異結合パートナーに対する特異結合パートナ−のいずれかと
なる酵素標識化試薬(enzyme−1abelled reagent)と、
この酵素に対する基質とを含む被覆層を有し、この基質はリポソーム内に被包さ
れている。
本発明に従うバイオセンサーは、他の知られた装置より敏感である点に主な利点
かある。これは、一層低い濃度の分析物を検出でき、且つ/又は高い精密度で分
析物濃度を検出することができる。この装置は、それでもなお、使いやすく、測
定は、単に、試料をこの装置と接触させることにより、概ね行われ、追加の試薬
を必要としない。
使用において、酵素と基質はリポソームに基質が被包されていることにより、こ
の装置が分析物を含む試料と接触させられるまで、分離されたままである。次い
で、試料が被覆層に吸収されると、「サイドイッチ」複合体が、酵素標識化試薬
(この場合、これが分析物に対する二次特異結合パートナ−)と分析物と一次特
異結合パートナーとの間で形成されるか、又は、分析物と標識化試薬(この場合
、これが−次特異結合パートナーに対する特異結合パートナ−1例えば標識化さ
れた分析物)が−次特異結合パートナーに対して競合的に結合するかである。
いずれの場合においても、酵素標識がリポソームから放出された基質の接近によ
ってもたらされ、酵素−基質相互作用が起こる。
基質を被包するリポソームは、この目的のための分野において知られているいず
れの方法によっても調製され得る。一般的には、リバーストフェース・エバポレ
ート小胞(reversed phase evaporated vesic
les:REV)と称されるタイプのリポソームが、比較的大きな水性コアと低
い透過性を有するので、好ましい。
被覆層は、多くの形態を採り得、主として試料に対して透過性であることが要求
される。
被覆層は、好ましくは、例えばポリアクリルアミドゲルのようなゲル、又はアガ
ロース若しくはデキストランのような適当な多糖類の層にし得る。
分析物が2つの同類のエピトープを有する場合は、固定される特異結合パートナ
−と酵素標識化特異結合パートナ−とは同じになることかでき、又は、分析物か
2つの異なるエピトープを有する場合は、異なることができる。
酵素と基質か1つのゲル層に保持されることができるが、この酵素とこの基質と
の分離を向上するために、被覆層は、2つの層、つまり基質を含む層と酵素標識
化試薬を含む第2の層とを含み得る。この場合、第2の被覆層にリポソームを分
解し、それによって基質を放出させることを促進する作用物質を組み込むことが
好ましいてあろう。このような作用物質は、例えばホスホリパーゼといったまた
別の酵素又は洗浄剤であり得る。後者の場合は、非イオン性の洗浄剤が、系のタ
ンパク質成分を変性しにくいので好ましい。この洗浄剤は、都合上、装置を保管
する温度(典型的には4’C前後)で不溶性構造を有するか使用温度(典型的に
は37”C)では可溶性であるものとし得る。いずれの溶解剤が用いられても、
リポ゛ノームに用いられる脂質(又は脂質混合物)は、装置保管温度より高く、
かつ使用時のセンサーの温度より低いゲル一層状相転移(gel−1amell
ar phasetranseition)を有するものにすべきである。ホス
ホリパーゼ及び洗浄剤は、一般的には、固体の脂質二重層を溶解するより、流体
の脂質二重層を溶解するのに一層有効である。
第」及び第2の被覆層はゲル層とすることができ、これは同様又は異なる物質と
!7てもよく、同様又は異なる有孔性を有してもよい。
所定の酵素−基質系は2以上の基質を含み得る。これらの異なる基質は別個のリ
ポソームへ組み込み得る。
酵素−基質システムの例には、以下のものか用いられ得る:酵素 基質1 基質
2
ホースラデイツノユ (1)過酸化水素 フェノール化合物ベルオキシダーゼ
(2)過酸化水素 ジアミノベンジジンアルカリ (1)4−ニトロフェニル−
ホスファターゼ ホスフエート
(2) ブロモクロロ−ニトロブルー
インドリルホスフェート テトラゾリウム本発明に従うバイオセンサー装置は、
多種のバイオセンサーに組み込まれ得る。
例えば導波路又は共鳴空洞装置のような才ブトエレクトロ二ノクセンサーがある
。
この場合、工ヴアネソセント波成分を用いて試料を検査する。このような装置は
当業者によく知られたものである。それらは、活性表面近くで屈折率又は色強度
のいずれかの変化に応答することができる。
バイオセンサーの好ましい形態は、フラストレイテッドトータルリフレクション
(frustrated total reflection : FTR)の
原理に基づいたものである。このフラストレイデッドトータルリフレクションの
原理は周知であり、この手法は例えば、Bosacchiと0ehrleによる
(:Applied 0ptics、 (1982)、 21.2167−21
73)に記述されている。イムノアッセイに利用されるFTR装置は、米国特許
第4、857.273号に開示されており、これは、一方の側が試験下の試料で
、他方の側が基板に取り付けられているスペーサー層で、固定された空洞層を含
んでいる。
基板とスペーサー層との界面は、全反射が起こるように単色放射線により照射さ
れ、付随する工ヴアネッセント場がスペーサー層に浸透する。スペーサー層の厚
みが適当で、入射平行波ベクトルが共鳴モードの伝搬定数に整合すれば、全反射
は妨げられ、放射は空洞層中へ結合される。この空洞層は、スペーサー層よりも
高い屈折率を持ち、入射放射の波長で透過性の物質で構成されなければならない
。
ごく最近では、空洞層が比較的高い屈折率の物質、典型的には無機酸化物の薄膜
であるFTRバイオセンサーが記載されている(例えば、PCT特許出願W09
0106503及びW091106862)。
実施にあたり、結合した(複合した)酵素標識化試薬により形成された反応生成
物と、遊離の酵素標識化試薬との相互作用により形成された生成物とを区別する
必要があるだろう。これは装置表面のすぐ近くの表面領域だけを感知することに
より行われ得る。例えば、工ヴアネッセント場を用いる装置において、パラメー
ターは、工ヴアネッセント場の浸入深さが比較的小さくなるように選ばれ得る。
あるいは、遊離試薬が表面から拡散することに頼ることができる。更に他の例で
は、固定された試薬に基づく酵素標識化試薬のパルスを描く手段を提供し得る。
これは例えば、活性装置表面側で例えばスポンジゲルのウィッキング効果により
達せられ得る。
このバイオセンサーは、下記のステップにより得ることができる:1) 装置の
表面に一次特異結合パートナーを固定する(これを達し得る方法は、当業者の知
るところであろう)、及び
2) この表面に被覆@(リポソームに被包された基質と酵素標識試薬を含む)
を適用する。
ここに、本発明の特定の態様を下記の図面を参照して説明するか、それらは例示
にすぎない。
図1は、オプトエレクトロニック・バイオセンサーの概略図である。
図2は、図1のセンサーを使用した「サンドイッチ」タイプのアッセイの概略図
である。
図3は、図1のセンサーを用いた競合アッセイの概略図である。
まず、図1を参照するに、オプトエレクトロニック・バイオセンサー装置は、石
英導波路lを含んでおり、その上面に、側壁部材3.4により画定された試料ウ
ェル2の上部表面が形成されている。単色光はプリズム5を通って導波路lに結
合し、第2のプリズム6により導波路lから出ていく。多重内部反射が導波路1
の内部に起こり、工ヴアネッセント波が試料ウェル2に浸入する。
試料ウェル2の基底部を形成する導波路1の表面は第1及び第2のゲル層7.8
で被覆されている。第1ゲル層7は導波路10表面に固定された抗体9及び酵素
−基質系の2つの基質S1、S2を被包しているリポソーム10.11の層を含
む。
「サンドイッチ」タイプアッセイに使用するには、図2に示すように、第2ゲル
層8は、酵素標識化抗体12とリポソームl0111を分解するためのデタージ
エント13とを含む。試験下にて抗原14を含む試料がゲル層7.8に吸収され
る場合、複合体は、酵素標識化抗体12、抗原14及び固定された抗体9の間で
形成される。この複合体形成は、基質Sl、S2に酵素を接近させ、生成物Pか
形成される。生成物Pは強く着色し単色光の波長の光を吸収するので、第2のプ
リズムを通して導波路1から出てい(光の強度は減少する。光強度の減少は、分
析物14の濃度に比例する。
図3に描かれている競合アッセイでは、第2ゲル層8は、固定された抗体9と結
合するために、試料14中の抗原と競合する酵素標識化分析物15を含む。この
場合、試料中の分析物14の濃度は高くなる程、基質St 、Stの近傍に達す
る酵素の濃度は低くなり、それゆえ、生成される生成物Pの濃度が一層低くなる
。
従って、光強度の減少は、分析物14の濃度に逆比例する。
他の態様においては、図3に示すものと同様に、第2ゲル層8は酵素標識化分析
物15を含み、これは、ゲル分子と共有的に連結している抗体を介して、ゲルに
可逆的に結合される。この場合、試料中の分析物14は、第2ゲル層8中の抗体
上で酵素標識化分析物15と置き換わる。酵素標識化分析物15は、次いで、第
」ゲル層7中の固定された抗体9に結合する。この場合、試料中の分析物14の
濃度が高くなる程、基質Sz 、S2の近傍に達する酵素の濃度は高くなる。そ
のために、生成される生成物Pの濃度が一層高くなる。従って、光強度の減少は
、分析物14の濃度に比例する。
一8−
国際調査報告
国際調査報告
GB 9101221
SA 49620
Claims (11)
- 1.応答増幅のために酵素−基質相互作用を用いて、溶液中の分析物を検出する ためのバイオセンサーであり、分析物に対する固定された一次特異結合パートナ ー9と、分析物に対する二次特異結合パートナー又は一次特異結合パートナー9 に対する特異結合パートナーのいずれかとなる酵素標識化試薬12と、酵素に対 する基質を含む被覆層7、8とを有し、該基質がリポソーム10、11内に被包 されている、上記バイオセンサー。
- 2.リポソーム10、11がリバースドフェース・エバポレート小胞である、請 求項1に記載のバイオセンサー。
- 3.前記被覆層7、8がゲルの層である、請求項1又は2に記載のバイオセンサ ー。
- 4.前記ゲルがポリアクリルアミド又は多糖類のゲルである、請求項3に記載の バイオセンサー。
- 5.前記被覆層が2つの層7、8であり、1つは基質を含み、第2の層は酵素標 識化試薬12を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 6.前記第2の層8がリポソーム10、11を分解して促進し、それによって基 質を放出させることを促進する作用物質13を含む、請求項5に記載のバイオセ ンサー。
- 7.別個のリポソーム10、11に取り込まれた2つ又はそれ以上の基質を含む 、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 8.フラストレイテッドトータルリフレクション(FTR)の原理に基づく前記 の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 9.比較的高い屈折率の無機酸化物の薄いフィルムの形態の空洞層を含む、請求 項8に記載のバイオセンサー。
- 10.固定された試薬に基づく酵素標識化試薬のパルスを描くための更なる手段 を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 11.1)装置の表面に一次特異結合パートナー9を固定する工程と、2)該表 面に被覆層7、8(リポソームに被包された基質、及び酵素標識化試薬を含む) を適用する工程と、 を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサーを製造する方法。
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