JPH06500391A - 分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　分析装置 本発明は、イムノアッセイによる生物学的活性分子の定量に係り、特に、このよ うな定量に用いられるバイオセンサーとして知られる種の装置に関する。

イムノアッセイ技術は、試験下の種（分析物）とこれが特異的に結合するであろ う他の種（「特異結合パートナ−（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｒ ｔｎｅｒ）Ｊ　）との間で複合体を形成することを包含する。複合体形成が起こ る程度は、分析物の存在量に依存する。

バイオセンサー装置において、特異結合パートナ−は装置の表面に固定されるこ とができ、複合体が形成され、それゆえ分析物の濃度が、その表面での特性、例 えば光学的特性の変化としてモニターされる。

知られているイムノアッセイシステムの欠点は、複合体の形成の際に起こる変化 が比較的小さく、そのために検出が困難であるということから起こる。

この問題を克服し得る１つの方法は、特異結合パートナ−を、高い屈折率又は強 い色彩を存する生成物を生成するように基質に働く酵素で標識することである。

この効果は、分析物の存在に対する装置の応答を増幅し、感度を増加して、それ ゆえ検出限度を下げる。

しかし、実施に際して、この酵素標識と基質は複合体が形成するまで分離させて おかなければならず、従来、これをバイオセンサー装置内で達成することは困難 であった。酵素とその基質が分離領域又は表面にあるようなセンサーの組み立て が用いられ得るが、より精密な組み立て方法を必要とし、また、基質と酵素との 十分な混合にかなりの時間がかかるために、センサー性能を損うことになる。

ここに、バイオセンサー装置か考案され、この装置では、酵素−基質相互作用が 分析物の存在に対する装置の応答を増幅するために用いられ得る。

本発明によれば、酵素−基質相互作用を応答増幅に用いて、溶液中の分析物を検 出するためのバイオセンサーが提供される。このバイオセンサーは、分析物に対 する固定された一次特異結合パートナーと、この分析物に対する二次特異結合パ ートナ−又は−次特異結合パートナーに対する特異結合パートナ−のいずれかと なる酵素標識化試薬（ｅｎｚｙｍｅ−１ａｂｅｌｌｅｄ　ｒｅａｇｅｎｔ）と、 この酵素に対する基質とを含む被覆層を有し、この基質はリポソーム内に被包さ れている。

本発明に従うバイオセンサーは、他の知られた装置より敏感である点に主な利点 かある。これは、一層低い濃度の分析物を検出でき、且つ／又は高い精密度で分 析物濃度を検出することができる。この装置は、それでもなお、使いやすく、測 定は、単に、試料をこの装置と接触させることにより、概ね行われ、追加の試薬 を必要としない。

使用において、酵素と基質はリポソームに基質が被包されていることにより、こ の装置が分析物を含む試料と接触させられるまで、分離されたままである。次い で、試料が被覆層に吸収されると、「サイドイッチ」複合体が、酵素標識化試薬 （この場合、これが分析物に対する二次特異結合パートナ−）と分析物と一次特 異結合パートナーとの間で形成されるか、又は、分析物と標識化試薬（この場合 、これが−次特異結合パートナーに対する特異結合パートナ−１例えば標識化さ れた分析物）が−次特異結合パートナーに対して競合的に結合するかである。

いずれの場合においても、酵素標識がリポソームから放出された基質の接近によ ってもたらされ、酵素−基質相互作用が起こる。

基質を被包するリポソームは、この目的のための分野において知られているいず れの方法によっても調製され得る。一般的には、リバーストフェース・エバポレ ート小胞（ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ　ｖｅｓｉｃ ｌｅｓ：ＲＥＶ）と称されるタイプのリポソームが、比較的大きな水性コアと低 い透過性を有するので、好ましい。

被覆層は、多くの形態を採り得、主として試料に対して透過性であることが要求 される。

被覆層は、好ましくは、例えばポリアクリルアミドゲルのようなゲル、又はアガ ロース若しくはデキストランのような適当な多糖類の層にし得る。

分析物が２つの同類のエピトープを有する場合は、固定される特異結合パートナ −と酵素標識化特異結合パートナ−とは同じになることかでき、又は、分析物か ２つの異なるエピトープを有する場合は、異なることができる。

酵素と基質か１つのゲル層に保持されることができるが、この酵素とこの基質と の分離を向上するために、被覆層は、２つの層、つまり基質を含む層と酵素標識 化試薬を含む第２の層とを含み得る。この場合、第２の被覆層にリポソームを分 解し、それによって基質を放出させることを促進する作用物質を組み込むことが 好ましいてあろう。このような作用物質は、例えばホスホリパーゼといったまた 別の酵素又は洗浄剤であり得る。後者の場合は、非イオン性の洗浄剤が、系のタ ンパク質成分を変性しにくいので好ましい。この洗浄剤は、都合上、装置を保管 する温度（典型的には４’Ｃ前後）で不溶性構造を有するか使用温度（典型的に は３７”Ｃ）では可溶性であるものとし得る。いずれの溶解剤が用いられても、 リポ゛ノームに用いられる脂質（又は脂質混合物）は、装置保管温度より高く、 かつ使用時のセンサーの温度より低いゲル一層状相転移（ｇｅｌ−１ａｍｅｌｌ ａｒ　ｐｈａｓｅｔｒａｎｓｅｉｔｉｏｎ）を有するものにすべきである。ホス ホリパーゼ及び洗浄剤は、一般的には、固体の脂質二重層を溶解するより、流体 の脂質二重層を溶解するのに一層有効である。

第」及び第２の被覆層はゲル層とすることができ、これは同様又は異なる物質と ！７てもよく、同様又は異なる有孔性を有してもよい。

所定の酵素−基質系は２以上の基質を含み得る。これらの異なる基質は別個のリ ポソームへ組み込み得る。

酵素−基質システムの例には、以下のものか用いられ得る：酵素　基質１　基質 ２ ホースラデイツノユ　（１）過酸化水素　フェノール化合物ベルオキシダーゼ　 （２）過酸化水素　ジアミノベンジジンアルカリ　（１）４−ニトロフェニル− ホスファターゼ　ホスフエート （２）　ブロモクロロ−ニトロブルー インドリルホスフェート　テトラゾリウム本発明に従うバイオセンサー装置は、 多種のバイオセンサーに組み込まれ得る。

例えば導波路又は共鳴空洞装置のような才ブトエレクトロ二ノクセンサーがある 。

この場合、工ヴアネソセント波成分を用いて試料を検査する。このような装置は 当業者によく知られたものである。それらは、活性表面近くで屈折率又は色強度 のいずれかの変化に応答することができる。

バイオセンサーの好ましい形態は、フラストレイテッドトータルリフレクション （ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ　ｔｏｔａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　：　ＦＴＲ）の 原理に基づいたものである。このフラストレイデッドトータルリフレクションの 原理は周知であり、この手法は例えば、Ｂｏｓａｃｃｈｉと０ｅｈｒｌｅによる （：Ａｐｐｌｉｅｄ　０ｐｔｉｃｓ、　（１９８２）、　２１．２１６７−２１ ７３）に記述されている。イムノアッセイに利用されるＦＴＲ装置は、米国特許 第４、８５７．２７３号に開示されており、これは、一方の側が試験下の試料で 、他方の側が基板に取り付けられているスペーサー層で、固定された空洞層を含 んでいる。

基板とスペーサー層との界面は、全反射が起こるように単色放射線により照射さ れ、付随する工ヴアネッセント場がスペーサー層に浸透する。スペーサー層の厚 みが適当で、入射平行波ベクトルが共鳴モードの伝搬定数に整合すれば、全反射 は妨げられ、放射は空洞層中へ結合される。この空洞層は、スペーサー層よりも 高い屈折率を持ち、入射放射の波長で透過性の物質で構成されなければならない 。

ごく最近では、空洞層が比較的高い屈折率の物質、典型的には無機酸化物の薄膜 であるＦＴＲバイオセンサーが記載されている（例えば、ＰＣＴ特許出願Ｗ０９ ０１０６５０３及びＷ０９１１０６８６２）。

実施にあたり、結合した（複合した）酵素標識化試薬により形成された反応生成 物と、遊離の酵素標識化試薬との相互作用により形成された生成物とを区別する 必要があるだろう。これは装置表面のすぐ近くの表面領域だけを感知することに より行われ得る。例えば、工ヴアネッセント場を用いる装置において、パラメー ターは、工ヴアネッセント場の浸入深さが比較的小さくなるように選ばれ得る。

あるいは、遊離試薬が表面から拡散することに頼ることができる。更に他の例で は、固定された試薬に基づく酵素標識化試薬のパルスを描く手段を提供し得る。

これは例えば、活性装置表面側で例えばスポンジゲルのウィッキング効果により 達せられ得る。

このバイオセンサーは、下記のステップにより得ることができる：１）　装置の 表面に一次特異結合パートナーを固定する（これを達し得る方法は、当業者の知 るところであろう）、及び ２）　この表面に被覆＠（リポソームに被包された基質と酵素標識試薬を含む） を適用する。

ここに、本発明の特定の態様を下記の図面を参照して説明するか、それらは例示 にすぎない。

図１は、オプトエレクトロニック・バイオセンサーの概略図である。

図２は、図１のセンサーを使用した「サンドイッチ」タイプのアッセイの概略図 である。

図３は、図１のセンサーを用いた競合アッセイの概略図である。

まず、図１を参照するに、オプトエレクトロニック・バイオセンサー装置は、石 英導波路ｌを含んでおり、その上面に、側壁部材３．４により画定された試料ウ ェル２の上部表面が形成されている。単色光はプリズム５を通って導波路ｌに結 合し、第２のプリズム６により導波路ｌから出ていく。多重内部反射が導波路１ の内部に起こり、工ヴアネッセント波が試料ウェル２に浸入する。

試料ウェル２の基底部を形成する導波路１の表面は第１及び第２のゲル層７．８ で被覆されている。第１ゲル層７は導波路１０表面に固定された抗体９及び酵素 −基質系の２つの基質Ｓ１、Ｓ２を被包しているリポソーム１０．１１の層を含 む。

「サンドイッチ」タイプアッセイに使用するには、図２に示すように、第２ゲル 層８は、酵素標識化抗体１２とリポソームｌ０１１１を分解するためのデタージ エント１３とを含む。試験下にて抗原１４を含む試料がゲル層７．８に吸収され る場合、複合体は、酵素標識化抗体１２、抗原１４及び固定された抗体９の間で 形成される。この複合体形成は、基質Ｓｌ、Ｓ２に酵素を接近させ、生成物Ｐか 形成される。生成物Ｐは強く着色し単色光の波長の光を吸収するので、第２のプ リズムを通して導波路１から出てい（光の強度は減少する。光強度の減少は、分 析物１４の濃度に比例する。

図３に描かれている競合アッセイでは、第２ゲル層８は、固定された抗体９と結 合するために、試料１４中の抗原と競合する酵素標識化分析物１５を含む。この 場合、試料中の分析物１４の濃度は高くなる程、基質Ｓｔ　、Ｓｔの近傍に達す る酵素の濃度は低くなり、それゆえ、生成される生成物Ｐの濃度が一層低くなる 。

従って、光強度の減少は、分析物１４の濃度に逆比例する。

他の態様においては、図３に示すものと同様に、第２ゲル層８は酵素標識化分析 物１５を含み、これは、ゲル分子と共有的に連結している抗体を介して、ゲルに 可逆的に結合される。この場合、試料中の分析物１４は、第２ゲル層８中の抗体 上で酵素標識化分析物１５と置き換わる。酵素標識化分析物１５は、次いで、第 」ゲル層７中の固定された抗体９に結合する。この場合、試料中の分析物１４の 濃度が高くなる程、基質Ｓｚ　、Ｓ２の近傍に達する酵素の濃度は高くなる。そ のために、生成される生成物Ｐの濃度が一層高くなる。従って、光強度の減少は 、分析物１４の濃度に比例する。

一８− 国際調査報告 国際調査報告 ＧＢ　９１０１２２１ ＳＡ　４９６２０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．応答増幅のために酵素−基質相互作用を用いて、溶液中の分析物を検出する ためのバイオセンサーであり、分析物に対する固定された一次特異結合パートナ ー９と、分析物に対する二次特異結合パートナー又は一次特異結合パートナー９ に対する特異結合パートナーのいずれかとなる酵素標識化試薬１２と、酵素に対 する基質を含む被覆層７、８とを有し、該基質がリポソーム１０、１１内に被包 されている、上記バイオセンサー。
2. ２．リポソーム１０、１１がリバースドフェース・エバポレート小胞である、請 求項１に記載のバイオセンサー。
3. ３．前記被覆層７、８がゲルの層である、請求項１又は２に記載のバイオセンサ ー。
4. ４．前記ゲルがポリアクリルアミド又は多糖類のゲルである、請求項３に記載の バイオセンサー。
5. ５．前記被覆層が２つの層７、８であり、１つは基質を含み、第２の層は酵素標 識化試薬１２を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
6. ６．前記第２の層８がリポソーム１０、１１を分解して促進し、それによって基 質を放出させることを促進する作用物質１３を含む、請求項５に記載のバイオセ ンサー。
7. ７．別個のリポソーム１０、１１に取り込まれた２つ又はそれ以上の基質を含む 、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
8. ８．フラストレイテッドトータルリフレクション（ＦＴＲ）の原理に基づく前記 の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
9. ９．比較的高い屈折率の無機酸化物の薄いフィルムの形態の空洞層を含む、請求 項８に記載のバイオセンサー。
10. １０．固定された試薬に基づく酵素標識化試薬のパルスを描くための更なる手段 を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
11. １１．１）装置の表面に一次特異結合パートナー９を固定する工程と、２）該表 面に被覆層７、８（リポソームに被包された基質、及び酵素標識化試薬を含む） を適用する工程と、 を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサーを製造する方法。