JPH01316662A - 抗核抗体測定用器具の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗核抗体／１Ｉｌｌ定用器具の製法およびそ
れによって製造された器具を提供する。本発明のｆｌＦ
Ｊ定用器具用器具ば血液や体液中の抗核抗体を簡便に高
精度でｉＨ定できるので自己免疫疾患の診断に利用でき
、特に、−次スクリーニングに広く利用できる。また、
本発明は、コストの安い測定法を提供することができる
ので、その操作の簡便さも併せて、これまで特殊なケー
スでなければｎ１定されることのなかった、抗核抗体が
、一般の健康診断でも広く診断できることになり、自己
免疫疾患を比較的早期のうちに診断し、治療することを
可能にする。

［従来の技術］ 自己免疫性疾患として知られる、全身性エリテマトーデ
ス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｉｕｐｕｓ　ｃｒｙｔｈｃａ＋
ａｔｏｓｕｓ　；５ＬＥ）や全身性強皮症（ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓｉｖｅ　ｓｙｓｔｅｍＩｃｓｃｌｃｒｏｓｏｓ　
；　Ｐ　Ｓ　Ｓ　）　、慢性関節リウマチ（ｒｈｃｕＩ
Ｉａｔｏｌｄ　ａｒｔｈｒｌｔｉｓ　：ＲＡ）　、Ｓｊ
ｏｃｇｒｅｎ症候群（ＳｊＳ）、皮膚筋炎（ｄｃｒｍａ
ｔｏＢｏｓｉｔｌｓ　；ＤＭ）　、多発性筋炎（ｐｏｌ
ｙ＋ｇｙｏｓＨＩｓ　；　ＰＭ）、混合性結合組織病（
ｍｌｘｃｄ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅｄｌ
ｓｅａｓｃ；Ｍ　ＣＴ　Ｄ　）等の患者では、血液中に
抗核抗体がしばしば高い濃度で検出される。抗核抗体に
は、抗ｄｓ−又は５ｓ−ＤＮＡ抗体や抗ヒストン抗体、
抗非ヒストン核蛋白質抗体、抗セントロメア抗体、抗Ｕ
ｌ−ＲＮＰ抗体、抗Ｓ＋ｓ抗体等、細胞核に存在する種
々の抗原に対する２０種類以上の抗体が知られている。

例えば、血液中の抗ｄｓ−又は５Ｓ−ＤＮＡ抗体の存在
がＳＬＨの診断の根拠に用いられるごとく、それぞれの
抗核抗体について、種々の自己免疫性疾患との関連が知
られており、血液中のこれらの抗体を検出することが自
己免疫性疾患の診断に役立っている。

これまで、抗核抗体を検出するために最も用いられてい
る標準的なｎ１定方法は、蛍光抗体法であり（総説；　
「臨床検査Ｊ　、　ｖｏｌ、３０．　Ｎｏ、７．１９８
８゜ｐ６８４−７２８）　、他に、二重免疫拡散法やＲ
ＩＡ。

ＥＬＩＳＡ、赤血球凝集反応等がある。蛍光抗体法は、
ガラススライド上に組織切片又は、株化細胞を固定した
ものを抗原材料とし、血液等の検体中の抗核抗体の有無
及び、細胞の蛍光染色パターンを蛍光顕微鏡下で観察し
、抗核抗体の種類を判定する。このｔ−１定法は、蛍光
染色パターンと抗核抗体の関連がよく調べられており、
自己免疫性疾患の診断において、その有効性は広く認め
られている。しかし、この蛍光法には、正確な判定は熟
練者の肉眼によってのみ可能であることや、蛍光色素が
比較的不安定であり扱いにくいこと、さらに蛍光顕微鏡
の感度や検鏡条件が判定に影響を与えることなどの欠点
を有している。

このために、より個人差が少なく、かつ、操作が簡便で
定量性のある測定法としてＥＬＩＳＡ（ｃｎｚｙａ＋ｅ
　１１ｎｋｅｄ　ｉｍＩＩｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓ
ｓａｙ）法の開発が行なわれてきた。抗核抗体のＥＬＩ
ＳＡ法は、大きく二種類に分けられる。ひとつは、細胞
核より分離精製した、種々のＤＮＡやＲＮＡ、ヒストン
蛋白質、非ヒストン蛋白質等の精製抗原をプラスチック
支持体に担持させたＥＬＩＳＡ法で、抗核抗体の同定が
可能であるが、全ての核抗原についてそれぞれＥＬＩＳ
Ａを行なうことは繁雑であるので、主に、二次的スクリ
ーニングにて蛍光法と共にあるいは別々に用いる。

これに対して、抽出核抗原（ｅｘＬｒａｃＬａｂｌｅｎ
ｕｃｌｅａｒ　ａｎＬＩｇｅｎ　；　ＥＮＡ）をプラス
チック支持体に担持させたＥＬＩＳＡ法が、多くの種類
の抗核抗体の存在を迅速に検出する、主として一次スク
リーニングを目的として開発されてきた（Ｒ，Ｖａｒｌ
ｏｖら、　　’Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　１ｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ。

ｖｏｌ、２．　ｐ１５４−１８０．１９８４）。この方
法は、肝臓等の組織や株化細胞の核抗原を可溶化又は、
酸抽出して使用しているが、核抗原のうち、不溶性の抗
原や酸で抽出できない抗原に対する抗核抗体は見落して
しまう欠点があって、標準法の蛍光法による判定と必ず
しも一致しないことがあった。

さらに、１９８７年、Ｖ、Ｌ、　リップ等による「抗核
抗体の検出方法及び装置」が特許出願公開となった（特
開昭６２−３２３８３）。このａｌ定法では、乾燥法に
より核を固体支持体に担持させており、不溶性の核抗原
をも検出可能である。

しかしこの方法は核単独ではなく、界面活性剤処理の後
、超音波処理して得た核抗原（Ｎ　Ｓ）や、ＥＮＡｔ＋
調製して、三者を併せて固体支持体に担持させるという
繁雑な操作を必要としており、検体として未希釈血清を
用いる感度の低い方法である。また、未希釈血清を直接
用いるために、検体中に夾雑する大量の非特異的抗体に
よるバックグラウンドの反応が検出されやすい。さらに
上記特許出願公開明細書では、実際の自己免疫性疾患患
者の血液等の検体をｎ１定した実施例を欠き、その実用
化のためには更に改良が必要と思われる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、抗核抗体を測定する ＥＬ　Ｉ　ＳＡ用の器具を簡単な操作で製造することが
できる方法を提供することにある。更には、抗核抗体を
精度よくスクリーニングできるδ１１定器具を提供する
ことである。

〔発明の構成〕

本発明によれば、細胞核の懸濁液を直接支持体と接触さ
せて細胞核を支持体に吸着させ、前記懸濁液と分離した
後、５０〜９０％アセトン溶液で処理することにより細
胞核を支持体に固定させることによって、細胞核を支持
体に担持させる。

ここにおいて細胞核とは、細胞内での正常な構造を保持
した状態（Ｉｎｔａｅｔ）の核又はその機械的破壊によ
る断片（ｔｒａｇＩＩｌｃｎｔ）を意味する。

本発明において、細胞核は高等動物特にヒトの細胞株由
来のものを用いる。特に好適な細胞株としては、ＨＥｐ
−２，Ｗｉ＋−２，Ａ−５４９。

ＰＣ−１３，ＺＲ−７５１等が挙げられる。細胞核の懸
濁液は、以下のようにして作成できる。

細胞を常法により、培養し、集めたあと等張緩衝液で洗
い、次に、塩濃度を減じた低張緩衝液に懸濁して破れな
い程度に細胞を膨満させる。膨満した細胞は、簡単なホ
モジナイズ操作により緩和にこわされるので、細胞核は
比較的無傷で得られる。

ここにおいて用いられる等張緩衝液としてはトリス緩衝
液、リン酸緩衝液等が挙げられる。

また低張緩衝液とは、塩濃度が等張液に比してｌ／２か
ら１／１５の範囲のものが適当である。

ホモジナイズ操作により細胞を９０％以上破壊すること
が望ましい。ホモジナイズ操作のほか、超音波処理によ
って細胞を破壊することも可能である。

このようにして得られた細胞破砕液を遠心分離すること
によって核画分が採取される。採取された核画分は上記
低張液中に再び懸濁して核画分の懸濁液を作成する。こ
の際の核画分の濃度は細胞核に換算して２ｘｌＯ５／ｍ
１以上とするのが望ましい。

この核画分懸濁液を直接支持体、好ましくはプラスチッ
ク支持体と接触させることにより核画分を支持体に吸着
させる。プラスチック支持体としてはポリスチレン、表
面処理をほどこしたポリスチレン、ポリビニール製のも
の等が用いられる。

９６穴のウェルを持つポリスチレン製のＥＬＩＳＡ法の
プレートが市販されており、これをそのまま用いるのが
便利である。しかし、その形状は、試験管状、板状等の
任意の形をとることができる。

核画分懸濁液をプラスチック支持体と接触させるのは室
温で３０〜１２０分間ｆ９置すれば良い。温度と時間は
適当な範囲内で変化させることができる。

ウェルのあるＥＬＩＳＡプレートを用いる場合は、核画
分懸濁液を分注し、そのまま必要な時間静置すれば良い
。

ついでプラスチック支持体と核画分懸濁液を分離し、５
０〜９０％アセトン溶液で処理して核画分をプラスチッ
ク支持体に固定する。ウェルのあるＥＬＩＳＡプレート
を用いたときは、核画分懸濁液を吸引等の適宜の手段で
除いた後、核画分懸濁液と等量の５０〜９０％アセトン
溶液を分注する。通常室温に１０分以上静置すれば細胞
核はプラスチック支持体に固定され、洗浄によってもは
がれなくなる。ウェルから核画分懸濁液を除いた後、洗
浄を行なうと細胞核が洗い流されるので通常は洗浄しな
い方が望ましい。しかし、支持体に担持する細胞核の数
を調節するために洗浄を行なうことは可能である。アセ
トン溶液としては８５％の水溶液を用いるのが望ましい
。９０％より濃いアセトン溶液を用いるとプラスチック
支持体がアセトンによって侵されるので好ましくない。

アセトンは水溶液であることが望ましいが、水の一部を
例えばエチルアルコール等の極性溶媒でおきかえる等の
こともできる。処理温度と時間は適当な範囲内で変化さ
せることができる。本発明のアセトン処理は、細胞核を
支持体に固定する効果のほか、細胞核のリン脂質膜を溶
かし、核内部の核抗原に抗核抗体が近づき晶＜シており
、このことが測定の精度の向上に大きく寄与している。

これらの処理により、本発明で作成された細胞核担持プ
ラスチックＥＬＩＳＡプレートでは、１００倍希釈の血
清で充分測定可能な、感度のよい、しかも検体中に共存
する非特異的抗体によるバックグラウンドの少ない抗核
抗体の測定が可能となる。すなわち、このプレートを用
いるときは、特開昭６２−３２３８３で行っているよう
に、核抗原（Ｎ　Ｓ）やＥＮＡを塗布しなくても、自己
免疫疾患の患者の抗核抗体の有無を精度良くスクリーニ
ングすることができる。しかし、検出を更に容品にする
ためにＥＮＡ等をこのプレートに更に担持させることも
できる。このためには、本方法によって得られたプレー
トをＥＮＡと接触させることによりＥＮＡをプレートに
吸着させる。

本発明で作成された細胞核担持プラスチック支持体を用
いる抗核抗体の検出は、抽出核抗原をプラスチック支持
体に担持させたＥＬＩＳＡ法と同様に行なうことができ
る。

すなわち、本発明によって細胞核を担持させたプラスチ
ックウェルに被検血清を加えて反応させ、未反応血清を
除去洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）
等で標識したウサギやヤギ等の抗ヒト免疫グロブリン抗
体あるいはプロティンＧ等を反応させて、細胞核と結合
した抗核抗体に結合させる。洗浄後ＨＲＰＯをテトラメ
チルベンデシン（ＴＭＢ）発色液により発色させる。

本発明によれば簡単な操作で、精度の高い抗核抗体の検
出のためのプラスチックプレートが得られる。このよう
にして得られたプラスチックプレートは低温低湿に保存
すれば１年以上効力の低下がなく保存することができる
。

以下に実施例および試験例によって本発明を具体的に説
明する。

実施例 （細胞の培養） 真核細胞の核画分調製の材料として、ＡＴＣＣ（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ）から、ヒト喉頭上皮細胞癌由来のＨＥｐ−２
細胞株（ＡＴＣＣＣＣＬ２３）を購入した。購入したＨ
Ｅｐ−２細胞は、速やかに１０％Ｆ　Ｂ　Ｓ　−ＲＰ　
Ｍ　Ｉ　ｌＧ４０培地にて、培養し、凍結保存する。細
胞核の実際の調製は、この凍結保存細胞を解凍し、約１
週間細胞を成育させ、１×１０８個の細胞を集める。培
養フラスコから細　′胞をはがす際に０．０２％ＥＤＴ
Ａ−りん酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　　（Ｎａ　　ＨＰＯ１
１１２Ｈ２０；１４．５ｓｒ。

Ｂ ＫＨ２ＰＯ４；１．ｏｒ、　ＮａＣ，ｌ？　；４０．Ｏ
ｇ、　ＫＣＮ　；１、Ｏｇを蒸留水に溶解し、ｐＨを７
．２に調製し、全量を５リツトルとし、さらに、ＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ　−２Ｈ２０を溶解し、オートクレーブ滅菌
をする。）を用いる。

（低張緩衝液による細胞核の抽出および固定）１×１０
８個のＨＥｐ−２細胞を、トリス緩衝溶液（Ｔ　Ｂ　Ｓ
）　　（０，ＯＩＭ　　　Ｔｒｌｓ−ＨＣｊ！　、０．
１５ＭＮ　ａ　ＣＤ　、　ｐＨ７，４）に浮遊させた。

５０ｍ１のＴＢＳで２回、洗浄し、５ＯＯＸｇで５分間
、遠心分離により細胞を沈殿として集めた。この細胞を
、２０ｍ１の低張緩衝液（０，０１Ｍ　　Ｔｒｌｓ−Ｈ
Ｃｇ、　０．ＯＩＭＮａ　ＣＤ　、　　１　ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＮ　２．　ｐＨ７，４）に浮遊させ、氷上に１５分
間静置した。ダウンスホモジナイザーで細胞を破壊し、
細胞膜が９０％以上、好ましくは９５％以上破壊されて
いることを顕微鏡下で確認した後、再び、２，０ＯＯＸ
　ｆ　、　１０分で遠心分離した。残渣として得られる
核画分を、上記低張緩衝液に、細胞核に換算した時の濃
度が２Ｘ１０５／ｍｌとなるように懸濁し、プラスチッ
クマイクロプレート（例えば、Ｎ　ｕｎｃ社より市販さ
れている）の各ウェルに５０μｑづつ添加した。このプ
ラスチックプレートを室温にて、３０分放置した。放置
後、添加液上清を、自動洗浄機等（例えば、ベーリング
社のモデルＢ　Ｅ　Ｐ　−ｎ）で充分に吸引除去した。

次に、各ウェルに８５％アセトン水溶液を３０μＱづつ
添加し、室温にて１０分間静置した。アセトン溶液を吸
引除去し、乾燥機中でこのプラスチックプレートを乾燥
させた。このようにして作成された、細胞核を担持させ
たプラスチックプレートは、サランラップ等で包んで、
４℃にて半年以上保存が可能であった。

（超音波処理による細胞核の抽出および固定）先に記し
た方法により培養したＨＥｐ−２細胞を１×Ｉ０８個Ｔ
ＢＳに浮遊させた。細胞は５０ｍ１のＴＢＳで３回洗浄
をし、５００Ｘ、で５分間遠心分離により細胞を沈殿と
して集めた。この細胞を１０ｍ１のＴＢＳに浮遊させた
後、超音波処理により細胞を破壊した。超音波処理の条
件は、市販の超音波発振器（日本精器製作新製）により
、出力２．０、位相１．２で４０秒問おこなった。超音
波処理後、２、ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離し、細胞
核を含む沈殿を得た。この沈殿を８０ｍ１のＴＢＳにて
再懸濁しく２．５Ｘ１０５細胞／ｍｌ）、プラスチック
プレートの各ウェルに５０μρずつ添加した。これを先
の例と同様に固定した。すなわち、このプラスチックプ
レートを３０分間放置し、添加液上清を吸引除去した。

次に、各ウェルに８５％アセトン水溶液を５０μρづつ
添加し、室温にて１０分間静置し、アセトン水溶液を吸
引除去した後、プラスチックプレートを乾燥させた。

試験例 低張緩衝液により抽出した細胞核を担持させたプラスチ
ックプレートに、正常人（３７例）又は、自己免疫性疾
患患者（７１例）より得られたヒト血清を、それぞれ１
００倍に希釈した検体を、各ウェル当り、４０μσづつ
加えた。この時、ヒト血清の希釈は、カゼインを０．０
１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ，Ｑ　１０．１５ＭＮａＣｊ）
緩衝液（ｐＨ７，４，防腐剤０．１％　Ｎ　ａ　Ｎ　３
を含む）に飽和するまで溶かして調整した希釈液を用い
た。検体の希釈血清の添加後、室温にてプレートを約１
時間放置した。放置後、各ウェルから未反応上清を吸引
除去し、洗浄液（１，３ｍｇ／ｍ１Ｎａ　　ＨＰＯ３Ｊ
ｍｇ／ｍ１ＫＨＰＯ１００２４°　　　　　　　２　４
゜ ａｇ／ｍ１Ｎａｃｌ）及び、２０ｍｇ／ｍｌモノラウリ
ン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含む濃縮洗浄液を
用事２０倍に希釈して使用）にて３回ウェルを洗う。

次に、各ウェルにＨＲＰＯ標識プ標識プロティン口ティ
ンＧは免疫グロブリンと特異的に反応する蛋白であり、
コスモ・バイオ■より市販されている。）をカゼイン溶
液（希釈液に同じ、ただし、防腐剤は０．２％フェノー
ル）に５１１１ｇ／ｍｌの濃度で溶かした標識溶液を４
０μｇづつ加え、さらに室温にて約１時間放置する。再
放置後、各ウェルから未反応標識溶液を吸引除去し、再
び、洗浄液にて各ウェルを洗う。次に、各ウェルに５０
μｇのテトラメチルベンデシン（ＴＭＢ）発色液（５ｍ
ｇ／ｍｌテトラメチルベンデシン、　　０．２ｍｇ／ｍ
ｌフェノキシメチルペニシリンカリウム、３．２μｍ２
／ｍｌ塩酸を含むクロモゲン水溶液と０．２７＋＋＋ｇ
／ｍｌ尿素・過酸化水素。

Ｈ，１ｍｇ／ｍｌ水酸化ナトリウム、　１．６４μ＋！
／ｍｌ酢酸を含む基質液を用事１対ｌＯで混合し使用）
を加え、室温にて３０分間放置後、各ウェルに５０μＱ
の０．５Ｎ硫酸を加えて反応を停止させ、４５０ｎ１１
にて吸光度を測定した。

結果を図に示す。図において１個のＯまたは・印は１つ
の検体を表わす。Ｏ印は対照とし　２て行った可溶化抗
原（ＥＮＡ）を用いた従来のＥＬＩＳＡ法の場合、・印
は本発明の測定用器具を用いた場合の各検体の吸光度を
示す。またＩは現在標準法とされるＨＥｐ−２細胞を固
定したスライドガラスを用いた蛍光抗体法で陽性の自己
免疫患者血清をΔ−１定した場合、■は正常人血清を測
定した場合、■は蛍光抗体法で陰性の自己免疫患者血清
を測定した場合を示す。■で吸光度の低いところにＯ印
がかたまっているのは、従来法の測定器具の感度が悪い
ことを示している。

本発明による核画分を担持させたプレートによるＥＬ　
Ｉ　ＳＡ法による陽性、陰性の判定と、蛍光抗体法によ
る判定の間には８５〜９５％の相関率が認められたのに
対して、従来のＥＮＡを用いた従来のＥＬＩＳＡ法と蛍
光抗体法による判定の間には８０〜７０％の相関率が認
められたにすぎなかった。

また、本発明のＥＬ　Ｉ　ＳＡによるｎ１定値と蛍光抗
体法の蛍光染色強度の間にも高い相関性が認められた。

【図面の簡単な説明】

図は本発明および従来の測定用器具を用いて検体血清中
の抗咳抗体を測定した結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）細胞核の懸濁液を支持体と接触させて細胞核を支持
   体に吸着させ、支持体を前記懸濁液から分離した後、そ
   の表面を５０〜９０％アセトン溶液で処理して細胞核を
   支持体に固定することを特徴とする抗核抗体測定用器具
   の製法。 ２）細胞核の懸濁液をプラスチック支持体のウェルに添
   加し、室温にて３０〜１２０分間静置して細胞核をプラ
   スチック支持体上に吸着させ、未吸着上清をウェルから
   除去後、５０〜９０％アセトン溶液を、ウェルに添加し
   、室温にて１０分間以上静置して、細胞核をプラスチッ
   ク支持体上に固定させることを特徴とする請求項１の製
   法。 ３）等張液にて洗浄した細胞を、塩濃度が等張液に比し
   て１／２から１／１５の範囲に調製された、低張液中に
   浮遊させ、 ホモジナイザーにて細胞を９０％以上破砕し、細胞破砕
   液を遠心分離して得られる核画分を、上記低張液中に再
   び懸濁し、 核画分懸濁液をプラスチック支持体のウェルに添加し、
   室温にて３０〜１２０分間静置して核画分をプラスチッ
   ク支持体上に吸着させ、 未吸着上清をウェルから除去し、 ５０〜９０％アセトン溶液を、ウェルに添加し、室温に
   て１０分間以上静置して、核画分をプラスチック支持体
   上に固定させ、 アセトン溶液をウェルから除去し、 空気中でウェルを乾燥させる、 ことを特徴とする請求項２の製法。 ４）請求項１〜３のいずれかによって製造された抗核抗
   体測定用器具。