JPS62265993A - 抗コレラ菌モノクロ−ナル抗体、それを生産するハイブリド−マ及びそれを用いたコレラ菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、コレラ菌の抗原す因子に対するモノクロー
ナル抗体及びこれを用いたコレラ菌の検出方法に関する
。さらにこの発明は、コレラ菌の抗原す因子に対するモ
ノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに関する。

［従来の技術］ コレラ菌は法定伝染病てあり、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ
　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｏ：Ｉ）によって引き起こされる
。また、コレラ菌は国際検疫伝染病原菌として重要な位
芒を占めている。

コレラ菌はビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ）に屈するが、分類学上のとブリオ・
コレラは多数の血清型に分けられ、コレラ菌はそれらの
うち血清型１に該当する。コレラ菌以外の血清型はしば
しばノンＯｌビブリオコレラ（ｎｏｎ−０１Ｖｉｂｒｉ
ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）又はナクビブリオ（ＮＡＧ　Ｖ
ｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ）と呼ばれ、コレラ菌と区別されてぃ
る。両者は共にビブリオ・コレラＮ：″膠す）か、そ−
の行政上の取扱いは全く異なっている。すなわち、血清
型ｌであるコレラ菌は法定伝染病、国際検疫伝染病の原
因菌であり、その他の血清型の菌は食中毒の原因菌とし
て扱われる。

また、コレラ菌はさらにその菌体抗原（０抗原）の差異
に基づき、小川型、稲葉型、彦島型に分類される。これ
らの各型の抗原解析か行なわれた（Ｊａｐａｎｅｓｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　１ｌｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃＢｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、２４．　ｐｐ、９
コー１００　’（１９７１））研究によると、小川型の
抗原構造がＣ因子、ｂ因子及びＣ因子て表現されるのに
対し、稲葉型はそのｂ因子の欠如した変異型てＣ因子及
びＣ因子て表現される。各因子の木質は菌の細胞表面上
にある多糖体である。Ｃ因子及びＣ因子は小川型及び稲
葉型の両方の型に共通しているが抗原の量的な違いがあ
り、℃因子は稲葉型には大量に存在し、小川型には少量
しか存在しない。また、彦島塁は小川型と稲葉型の中間
型てあり、抗原構造は小川型と同じくＣ因子、ｂ因子、
Ｃ因子で表現されるか量的にｂ因子は小川型より少なく
、Ｃ因子は小川型より多く稲葉型より少ない。

コレラ菌を検出する場合には、まず検査材料、通常大便
を分離培地に塗布して菌を培養し、形態学的及び生化学
的にビブリオ・コレラであると同定された場合には、い
ずれの型のコレラ菌とも反応して凝集を引き起こすコレ
ラ菌抗血清（混合血清）と菌とをスライド上て反応させ
て凝集するかどうかを調べ（スライド凝集試験）、凝集
した場合にはコレラ菌とし、凝集しない場合にはナグビ
ブリオとする。コレラ菌であると同定されたら次に小川
型及び稲葉型の型特異血清を用いスライド凝集試験によ
って抗原型を決定する。すなわち、小川型特異血清に凝
集し、稲葉型特異血清には３０秒以内には反応しないも
のは小川型とし、稲１！；型特異血清に中等度以上に凝
集し、小川型特異血清に全く反応しないものを稲葉型と
する。また１両特異血清のいずれにも明瞭に凝集するも
のを彦島型とする。

［従来技術の欠点］ 上記検査に用いられる市原の抗血清はコレラ菌をウサギ
、ヤギなどに直接免疫することによって得られるポリク
ローナル抗体を含むものてあり、抗原因子ａ、ｂ、ｃに
対する抗体のみか含まれているわけてはない。そのため
Ｒ型コレラ菌又はノンＯｆビブリオともまぎられしい凝
集を示す場合かある。また、これらの血清を作製する場
合、小川型と稲葉型において抗原因子Ｃか共通している
のて、稲葉型にのみ特異的に反応する血清を得ることか
困難であった。

［発明か解決しようとする問題点］ この発明の目的は、コレラ菌の抗原す因子に対するモノ
クローナル抗体を提供し、それによって小川型コレラ菌
を感度良く検出することを回走にすることである。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、この発明はコレラ菌の抗原す因子に対するモ
ノクローナル抗体を提供する。

また、この発明は、該モノクローナル抗体と、コレラ菌
の疑いのある菌とを反応させ、生成される抗原抗体反応
物を検出することから成るコレラ菌の検出方法を提供す
る。

さらにまた、この発明は、小川型コレラ菌で免疫化した
動物の肺細胞と骨髄腫細胞とを融合させることによって
得られ、コレラ菌の抗原す因子に対するモノクローナル
抗体を産生するバイプリトーマを提供する。

［発明の効果］ この発明によると、コレラ菌の抗原す因子に対するモノ
クローナル抗体か提供される。さらに、この発明による
と、小川型コレラ菌を感度良く検出することかてきるコ
レラ菌の検出方法か提供される。さらに、この発明によ
ると、上記モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マか提供される。

［発明の詳細な説明］ この発明のモノクローナル抗体は、コレラ菌の抗原す因
子に対するモノクローナル抗体てあり、従って、コレラ
菌の抗原す因子とのみ特異的に抗原抗体反応を起こす。

すなわち、この発明のない稲葉型コレラ菌は凝集させな
い。

この発明のモノクローナル抗体は、以下のような工程に
より製造することかできる。まず、小川型コレラ菌で動
物を免疫化し、抗小用型コレラ菌抗体を動物体内に誘導
する。

次に動物の脾細胞をとり、これを骨髄腫細胞と融合させ
る。脾細胞と骨髄腫細胞との融合は。

それぞれの細胞のベレットを融合剤、例えばポリエチレ
ングリコールを含む溶液て懸濁、混合し、インキュベー
トすることによって行なうことができる。この場合、各
細胞ベレットの細胞数は例えば１０７ないし１０８個、
ポリエチレングリコール溶液の量は例えば１１、好まし
いインキュベーション条件は２０℃ないし３７℃て２分
間から８分間てあり、脾細胞と骨髄腫細胞の数の好まし
い比率は１：１ないし１０：ｌである。また、ポリエチ
レングリコールの好ましい分子量は１０００から６００
０である。

このようにして脾細胞のうちのあるものは骨髄腫細胞と
融合し、ハイプリトーマかつくられる０次につくられた
バイプリトーマを選択する。

ハイブリドーマの選択は、上記混合細胞浮遊液をＨＡＴ
培地中て培養し、ＨＡＴ培地中に形成されたコロニーを
採取することによって行なうことかてきる。ＨＡＴ培地
中てはハイプリドーマ以外の細胞は生育することがてき
ないからである。

次にハイブリドーマの増殖を認めた培地の上清を採取し
、小川型コレラ菌とスライド上て反応させてスライド凝
集試験を行ない、抗体陽性を示すもの、すなわち、凝集
を示すものを検索する。

この試験において抗体陽性を示すコロニーには求めるコ
レラ菌のｂ因子に対するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマか含まれている。抗体陽性を示すハイプ
リドーマは限界希釈法によるクローニングを繰り返すこ
とにより単一クローンとすることかできる。限界希釈法
とはハイブリドーマの濃度が低濃度、例えば３個／ｍｌ
になるように適当な培地例えば１５ｗ／ｖ％牛脂児血清
を含むＲＰＭ１１６４０培地て希釈し、これを少量づつ
、例えば０．２１づつ分注し、クローンが増殖してきた
らこの操作を繰り返して単一クローンを得る方法である
。このようにしてこの発明のハイブリドーマを得ること
かできる。

このようにして得られたバイプリドーマを培養し、その
上清からこの発明のモノクローナル抗体を得ることかて
きる。また、特に抗体を大量に得るためには、この抗体
を動物、例えばマウスの腹腔内に摂取し、腹水を貯留さ
せ、この腹水から抗体を採取することもてきる。この場
合、マウスの腹腔に予めプリスタン（２，５，１０，１
４−テトラメチルペンタデカン）を接種しておくことが
好ましい。この場合の好ましい接種量は０．３１ないし
０．５１である。また、動物の腹腔内に接種されるハイ
フリドーマの好ましい数は１　ｘ　１０’ないし１　ｘ
　１０’である。

このようにして得られるこの発明のモノクローナル抗体
は、常法により、硫酸アンモニウムて塩析し、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等
により精製することかてきる。

この発明のモノクローナル抗体と検体とを反応させ、精
製される抗原抗体複合物を検出することによってコレラ
菌を検出することかてきる。このような検出は、従来の
免疫学的検出法、例えば凝集反応法、Ｅ　ｒ　Ａ　（Ｅ
ｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄｌｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
　Ａｓ５ａｙ）法、蛍光抗体法等に従来の抗体と同様に
用いることかてきる。凝集反応法では、不溶性担体にモ
ノクローナル抗体を結合させたものを含む懸濁液を調製
し、これをコレラ菌と反応させる。小川型コレラ菌か存
在すると小川型コレラ菌を介して担体か凝集するのて小
川型コレラ菌の存在を迅速に検出することかできる。凝
集は肉眼によっても確認することかできるし、吸光度°
を測定することによっても行なうことがてきる。不溶性
担体としては、従来と同様、ボリスチレンラテンクス、
各種動物の赤血球及びブドウ球菌等の細菌を用いること
かできる。また、従来から行なわれているのと同様に、
コレラ菌に対するポリクローナル抗体を不溶性担体に結
合させたものと検体とを反応させ、担体を洗浄後、標識
されたこの発明のモノクローナル抗体を反応させ、サン
ドイッチ複合体を形成させて反応に関与しなかった標識
抗体を除き、結合した標識物質の量を測定することによ
り、コレラ菌の検出を行なうこともてきる。この場合の
標識物質は酵素、ラジオアイソトープ、蛍光物質等を用
いることかてきる。また、スライド等にコレラ菌を固定
し、この発明のモノクローナル抗体を反応させ１次いで
このモノクローナル抗体に対する抗体に蛍光物質を結合
したものを反応させ、蛍光顕微鏡て観察してコレラ菌の
検出を行なうこともてきる。

以下、この発明の実施例を示し、この発明を具体的に説
明する。

実施例１ （１）免疫 コレラ菌小川型菌株（ＮｒＨ４１）と稲葉型菌株（ＮＩ
Ｈ３５Ａ３）とを普通寒天培地に培養し、０．５ｖ／ｖ
＄ホルマリンで不活化するか又は１００℃６０分間以上
加熱処理した菌体をバッファーに約ＩＢ／１の濃度にな
るように懸濁し、免疫抗原とした。この抗原をメスのＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に０．５１づつ６日間連続注
射した。ｌＯ日間後、同じ抗原を腹腔内に０．５１注射
し、同時に０．１１をマウスの尾静脈内に投与した。

（２）細胞融合 最終免疫より７２時間後、マウスの膵臓を取り出し、単
細胞ベレットを調製した。単細胞ベレット中の細胞数は
１０ｔ′個であった。単細胞ベレットの調製は、採取し
た膵臓をステンレスメツシュてろ過してＤ−ＭＥＭ培地
て３回遠心洗浄することによって行なった。この脾細胞
とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６：１−Ａｇ８−６．Ｓ、：
ｌ　ノヘレット（入手先：大日本製薬）とを分子量４０
００のポリエチレングリコールをダルベツコの培地に溶
かした溶液で懸濁、混合し、３７℃で８分間インキュベ
ートして融合した。この場合、骨髄腫細胞ベレットの細
胞数は１０７であり、ポリエチレングリコールの濃度は
４５重量％てあった。

（３）ハイブリドーマの選択 インキュベーション終了後、細胞浮遊液を９６穴のマイ
クロウェルプレートに１００．１づつ分注し、ＨＡＴ培
地を加えながら約１０日間３７°Ｃで、５ｚｃｏ２６度
インキュヘーター中で培養した。一方、別のマイクロウ
ェルプレートにて同様にＨＡＴ培地て培養した骨髄腫細
胞が７日間はどで死滅するのを確認した。１０日目位よ
り多数のウェルより融合細胞のコロニーの出現を認めた
。コロニー出現後、６日間ＨＴ培地て培養し、以後は１
５ｗ／ｖ％牛脂児血清を含むｌｌＰＭ＋１６４０培地て
３７℃て５＄［：０２６度インキュベーター中て培養し
た。

（４）抗体産生ハイブリドーマの選択及び単クローン化 ハイブリドーマの増殖を認めたウェルより培養上清を採
取し、小川型、稲葉型のコレラ菌を用いてスライド凝集
試験により抗体陽性を示すウェルを検索した。スライド
凝集試験はスライドガラス上て培養上清２５ル１と各型
の加熱菌（１２０℃、９０分加熱）浮遊液ｌＯルｌとを
混合し、凝集の有無及び程度を観察することにより行な
った。抗体陽性を示したハイブリドーマは限界希釈法に
よりクローニングを３回行ない単一クローンとした。限
界希釈法はハイブリドーマを３個／ｍｌに１５ｗ／ｖ％
牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地て希釈し９６ウ
エルプレートに０．２ｍｌ／ウェルづつ分注することに
より行なった。

（５）モノクローナル抗体の作製 クローン化したハイブリドーマを１５ｗ／ｖ％牛脂児血
’１２１　ヲ含ｔ？　ＲＰＭ１１６４０培地中て３７℃
テｓ％ｃｏ、　６度インキュベーター中て培養し、その
上清より抗体を得た。一方、多量の抗体を得るため０．
５１のブリスタンを予め腹腔内に摂取したＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に１０’個のバイブリドーマを注射した
。

約１週間後よりマウスの腹腔内に腹水の貯留か見られ、
その中には高濃度の抗体か含まれていた。

この腹水を採取して抗体とした。抗体の精製は、常法に
より、５０％飽和硫酸アンモニウムて分画後、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲルろ過法を用いて精製した。

イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過は常法に従
い、ＤＥＡＥセルロース及びセファデックスＧ１５０　
（商品名）を用いて行なった。

実施例２ 実施例１て確立されたハイプリドーマ株が産生ずる抗体
の免疫学的分類を調べた。これはハイブリドーマ培養上
清を各マウス免疫グロブリン特異抗血清を用いた二重拡
散法により試験することによって行なった。結果を次の
表に示す。

これらのハイツリドーマの産生する抗体をコレラ菌小川
型と稲葉型の菌株を用いてスライド凝集試験及び試験管
凝集試験て反応性の異同を決定した。この際、スライド
凝集試験及び試験管凝集試験は、具体的には上記腹水を
５０倍に希釈したものを抗体として用い、スライド凝集
試験はその２５ル１と菌液１０牌１をスライド上て反応
させ、試験管凝集試験は希釈した抗体の０．２５ｍ１と
菌液０．２５１を小試験管内で反応させ、それぞれ凝集
の有無及び程度を観察することによって行なった。

試験の結果、ハイブリドーマ番号１７６−１とＣ−８−
１９のバイブリトーマか産生する抗体は小川型、稲葉型
の両方の型のコレラ菌を凝集させ、Ｂ−３−１４と八−
ｉｔのハイブリドーマか産生する抗体は小川型コレラ菌
のみを凝集させた（強く凝集）、一方、ハイブリドーマ
番号４１−１と２２−４の産生する抗体は稲葉型コレラ
菌に強い凝集性を示し、小川型コレラ菌に対しては弱い
凝集性しか示さなかった。これらの結果は、各ハイブリ
ドーマの産生ずる抗体は前記のコレラ菌抗原因子ａ。

ｂ、ｃの理論に一致した成績を示すものてあった。ここ
で、強い凝集とは実質的に全ての菌か塊となり、そのた
め液中には画境以外に菌は実質的に存在しなくなって菌
が透明に見える程度の凝集を言い、弱い凝集とは、菌の
塊は形成されるけれども塊を形成しない菌も液中に存在
するため液が濁って見える程度の凝集を言う。

実施例３ 実施例１により得られた精製モノクローナル抗体をリン
酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，０）て希釈したものと、該
液でｌｖ／ｖ％になるように懸濁したラテックス粒子（
粒径０１Ｂｍ、ロース・ブーラン社製）とを等量づつ３
７℃て攪拌下に混合し。

十分感作させた。この場合、抗体の濃度は５００ｇｇ／
ｌてあった。感作したラテックスは遠心分離後、上清を
除き、　５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンて処理した
。このようにして得られたラテックスをＯ，１５Ｍ−ク
リシン緩衝液（ｐｏ７．ｏ）に懸濁して使用した。この
懸濁液の濃度は０．２５ｖ／ｖ＄であった。

上記の方法てハイブリドーマ番号１７６−１又はＣ−８
−１９の産生ずる抗体をラテックスに感作したものを以
後Ａラテックス液呼ぶ。同様にハイツリドーマ番号Ｂ−
］−１４又はＡ−１−１の産生ずる抗体をラテックスに
感作したものを以後Ｂラテックスと呼ぶ。同様にバイブ
リド−７番号４１−１又は２２−４の産生する抗体をラ
テックスに感作したものを以後Ｃラテックスと呼ぶ。

検体と感作ラテツクスとの反応は次のように行なった。

判定板（ガラス又は紙製）上にＡ、Ｂ、及びＣラテック
スの１滴（約２５．１）を滴下し、これに検体（菌液、
糞便液）を１滴（約２５ｇ１）づつ加え、判定板を液か
こぼれない程度に前後に傾はラテックス液と検体とを十
分に混合させ、約３０秒間はど反応させた。反応後ラテ
ックスの凝集を肉眼で判定した。

感作した各ラテックスは感作した抗体の反応性と同じて
Ａラテックスは小川型、稲葉型両方の型のコレラ菌と凝
集し、Ｂラテックスは小川型コレラ菌とのみ凝集した。

一方、Ｃラテックスは稲葉型コレラ菌に強い凝集性を示
し、反応時間を長くすると小川型コレラ菌とも弱い凝集
を示した。

また、各感作ラテツクスの最小検出感度はＡラテックス
か小川型、稲葉型両コレラ菌に対し５　ｘ　１０’個／
１、Ｂラテックスは小川型コレラ菌に対してｌ　ｘ　１
０’個／１．Ｃラテックスは稲葉型コレラ菌に対して５
　ｘ　１０’個／１てあった。最小検出感度の測定は、
濃度既知の菌液（４’ｘ　１０’／ｍｌ）を段階的に３
倍希釈した菌液のぞれぞれとラテックス浮遊液とを次々
と反応させ、弱い凝集かｌＩＩ察される最小濃度の菌液
の濃度を求めることにより行な９た。

実施例４　感作ラテツクスによるコレラ菌の血清型判別
と直接検出 実施例３て得た感作ラテツクスを用いてコレラ菌６２株
（小川型４９株、稲葉型１３株）との反応性を調べた。

全ての菌株を普通寒天培地に３７°Ｃで培養し、生理食
塩液にて連理浮遊液（Ｃ度約１　ｘ　１０’／ｍｌ）を
作製した。この菌液と各感作ラテツクスとを判定板上て
反応させた。その結果、Ａラテックスは６２株全てと凝
集した。Ｂラテックスは小川型４９株全てと凝集し、稲
葉型菌株とは凝集を示さなかった。一方、Ｃラテックス
は稲葉型１３株と強い凝集を示したか小川型４９株とは
凝集しなかった。

実施例５　　　　　・ 各感作ラテ・ンクスのコレラ菌以外の菌との交差凝集性
を調べた。用いた菌株はナグビブリオ１１株、赤痢菌ｌ
Ｏ株、病原大腸菌１０株、サルモネラ１０株及び腸炎ビ
ブリオ１０株てあった。その結果、３種類の感作ラテツ
クスはいずれの菌株とも凝集しなかった。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）コレラ菌の抗原ｂ因子に対するモノクローナル抗
   体。
2. （２）小川型コレラ菌に対して強い凝集性を示すが稲葉
   型コレラ菌に対しては凝集性を示さない特許請求の範囲
   第１項記載のモノクローナル抗体。
3. （３）小川型コレラ菌で免疫化した動物の脾細胞と骨髄
   腫細胞とを融合させることによって得られ、コレラ菌の
   抗原ｂ因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマ。
4. （４）ハイブリドーマＢ−３−１４又はＡ−１−１であ
   る特許請求の範囲第３項記載のハイブリドーマ。
5. （５）コレラ菌の疑いのある菌とコレラ菌の抗原ｂ因子
   に対するモノクローナル抗体とを反応させ、生成される
   抗原抗体反応物を検出することからなるコレラ菌の検出
   方法。