CN113508141A - 抗体及其功能片段 - Google Patents

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Abstract

公开了结合3'‑唾液酸乳糖的抗体或其功能片段，编码所述抗体或其功能片段的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体，以及用于疾病的检查药物和包含所述抗体或其功能片段的药物组合物，所述抗体或其功能片段包含重链可变区，所述重链可变区任选地被3个或更少的氨基酸取代并且其包含由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列。

Description

抗体及其功能片段
技术领域
本发明涉及抗体及其功能片段。此外，本发明还涉及编码所述抗体或其功能片段的多核苷酸、含有所述多核苷酸的表达载体、以及用于疾病的检测药物和含有所述抗体或其功能片段的药物组合物。
背景技术
癌症是日本的主要死因，随着平均预期寿命的增加，癌症死亡人数逐年增加。早期诊断被认为对降低癌症死亡人数最重要。然而，在许多情况下，早期阶段没有特征性症状，而在诊断出癌症的时候，癌症已经进展并且治疗变得困难。另外，对于癌症如胰腺癌，即使可以通过手术切除癌组织，手术后的复发率也很高，而且术后监测必不可少。因此，简单的癌症检测方法如血液检测发挥重要作用，因为正确实施可以获得可靠的效果。
目前已经产生了很多针对癌抗原的抗体，特别是因为单克隆抗体具有高敏感性和特异性并且可以半永久性使用，所以通常使用单克隆抗体。对于最难以早期诊断的胰腺癌，已有报道使用CA19-9单克隆抗体的检测方法(非专利文献1)。另外，在癌症检测中，CEA抗体被用于胃癌，而CA125抗体被用于卵巢癌。
引文列表
非专利文献
NPL 1:Erxi W.Shuang Z.Kruttika B.Qingyong M.:CA19-9 and pancreaticcancer.Clin Adv Hematol Oncol.2013 11(1):53-55.
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供可以用于检测和治疗癌症的抗体或其功能片段。此外，本发明的一个目的是提供编码所述抗体或其功能片段的多核苷酸，含有所述多核苷酸的表达载体，用于疾病的检测药物和含有所述抗体或其功能片段的药物组合物。
问题解决方案
为了实现上述目的，发明人进行了深入研究，结果，发明人通过用人ES细胞免疫小鼠获得了抗体，并发现可以通过使用抗体的抗原值作为指标来确定发生癌症的可能性。另外，发明人还发现所述抗体具有癌症细胞毒活性。
本发明在这些发现的基础上通过进一步研究而完成，并提供以下抗体或其功能片段、多核苷酸、表达载体、用于疾病的检测药物和药物组合物。
第1项.结合3'-唾液酸乳糖的抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含重链可变区，所述重链可变区任选地被3个或更少的氨基酸取代，并且其包含由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列。
第2项.结合3'-唾液酸乳糖的抗体或其功能片段，包含：
(i)重链可变区，其任选地被3个或更少的氨基酸取代并且其包含由氨基酸序列GIDFSIYW(SEQ ID NO:1)组成的CDR序列，由氨基酸序列INSDSSTI(SEQ ID NO:2)组成的CDR序列，和由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列，和/或
(ii)轻链可变区，其任选地被1个或更少的氨基酸取代并且其包含由氨基酸序列KSISKY(SEQ ID NO:4)组成的CDR序列，由氨基酸序列SGS组成的CDR序列，和由氨基酸序列QQHNEYPWT(SEQ ID NO:5)组成的CDR序列。
第3项.根据第1项或第2项所述的抗体或其功能片段，其中抗体源自脊椎动物。
第4项.根据第1至3项中任一项所述的抗体或其功能片段，其中抗体源自小鼠。
第5项.根据第1至4项中任一项所述的抗体或其功能片段，其中抗体是IgG或IgM。
第6项.根据第1至5项中任一项的所述抗体或其功能片段，其中所述功能片段是Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双体、三抗体、四抗体或微抗体。
第7项.编码根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段的多核苷酸。
第8项.包含根据第7项所述的多核苷酸的表达载体。
第9项.用于疾病的检测药物，包含根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段。
第10项.根据第9项所述的检测药物，其中所述疾病是癌症。
第11项.根据第10项所述的检测药物，其中所述癌症是选自由胰腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、胃癌、睾丸癌和卵巢癌组成的组中的至少一种癌症。
第12项.用于诊断疾病的药物组合物，包含用诊断剂标记的根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段。
第13项.根据第12项的药物组合物，其中诊断剂是放射性物质。
第14项.用于治疗疾病的药物组合物，包含根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段。
第15项.用于治疗疾病的药物组合物，包含用治疗剂标记的根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段。
第16项.根据第15项所述的药物组合物，其中所述治疗剂是抗癌剂。
第17项.根据第15项所述的药物组合物，其中所述治疗剂是放射性物质。
本发明还提供以下内容。
第18项.用于检验发生癌症如胰腺癌的可能性的方法，所述方法包括(1)使用根据第9至11项中的任一项所述的检测药物，测量从受试者收集的生物样品中抗原的量或浓度的步骤。
第19项.根据第18项所述的方法，还包括(2)当在步骤(1)中的测量的抗原的量或浓度的值等于或高于预设的截止值时，确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高的步骤。
第20项.用于诊断受试者中癌症如胰腺癌的方法，所述方法包括：
(1a)使用根据第9至11项中任一项所述的检测药物，测量从受试者收集的生物样品中抗原的量或浓度的步骤；和
(2a)当在步骤(1a)中测量的抗原的量或浓度的值等于或高于预设的截止值时，确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高的步骤。
第21项.根据第20项所述的方法，还包括(3)对在步骤(2a)中确定发生癌症如胰腺癌的可能性高的受试者，应用用于癌症如胰腺癌的诊断方法的步骤。
第22项.根据第21项所述的方法，其中步骤(3)中应用的用于癌症如胰腺癌的诊断方法是选自由活组织检查法、PET检查法、CT检查法和超声波检查法组成的组中的至少一种方法。
第23项.用于检查和治疗受试者中癌症如胰腺癌的方法，所述方法包括：
(1b)使用根据第9至11项中任一项所述的检测药物，测量从受试者收集的生物样品中抗原的量或浓度的步骤；
(2b)当在步骤(1b)中测量的抗原的量或浓度的值等于或高于预设截止值时，确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高的步骤；
(3b)对在步骤(2b)中确定为发生癌症如胰腺癌的可能性高的受试者，应用用于癌症如胰腺癌的诊断方法的步骤；
(4b)对在步骤(2b)中确定为发生癌症如胰腺癌的可能性高的受试者或在步骤(3b)中确定为患有癌症如胰腺癌的受试者进行癌症如胰腺癌的治疗的步骤。
第24项.用于诊断受试者中癌症如胰腺癌的方法，所述方法包括将用诊断剂标记的根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段给予需要诊断的受试者的步骤。
第25项.根据第24项所述的方法，其中所述诊断剂是放射性物质。
第26项.用于治疗受试者中癌症如胰腺癌的方法，包括将根据第1至6项中任一项所述的抗体或其功能片段给予需要治疗的受试者的步骤。
第27项.根据第26项所述的方法，其中所述抗体或其功能片段用治疗剂标记。
第28项.根据第27项所述的方法，其中所述治疗剂是抗癌剂。
第29项.根据第27项所述的方法，其中所述治疗剂是放射性物质。
发明的有益效果
根据本发明，可提供可以用于诊断和治疗癌症的抗体或其功能片段。另外，当使用含有所述抗体或其功能片段的检测药物时，可检查发生癌症如胰腺癌的可能性。此外，当使用含有所述抗体或其功能片段的药物组合物时，可诊断和治疗癌症如胰腺癌。
附图简要说明
[图1]图1示出实施例2中进行的3B1E2抗体(小鼠IgG2a)与3'-唾液酸乳糖结合的结果，其中纵轴表示450nm处的吸光度，并且横轴表示抗体浓度。
[图2]图2示出实施例2中进行的3B1E2抗体(小鼠IgM)与3'-唾液酸乳糖结合的结果，其中纵轴表示450nm处的吸光度，并且横轴表示抗体浓度。
[图3]图3示出实施例4中在健康受试者和胰腺癌患者血清中3B1E2抗体的抗原值，其中纵轴表示3B1E2抗体的抗原值(数值为450nm处的吸光度)。
[图4]图4示出实施例5中进行的3B1E2抗体(小鼠IgG2a)和对照抗体(小鼠IgG2a)的癌症细胞毒活性的结果，其中纵轴表示癌症细胞毒活性，横轴表示抗体浓度，并且数据以平均值±标准差示出，n＝3
具体实施方式
下文，将详细说明本发明的实施方式。
应当指出的是，在本说明书中，“包含”还包括“基本上由...组成”的含义和“由......组成”的含义。
1.抗体或其功能片段
本发明的抗体或其功能片段可以结合的特定抗原的例子是3'-唾液酸乳糖。3'-唾液酸乳糖的结构式的例子是下述式(A)[其中，Ac表示乙酰基]，其分子式是C23H34NO19，并且其分子量是628.51。
Figure BDA0003236735560000051
3'-唾液酸乳糖的糖链是由Neu5Acα(2→3)Galβ(1→4)Glc表示的糖链，即，一种糖链，其中在神经氨酸(Neu5Ac)的2-位上的羟基基团和在半乳糖(Gal)的3-位上的羟基基团通过α-糖苷键连接，并且在半乳糖(Gal)的1-位上的羟基基团和在葡萄糖(Glc)的4-位上的羟基基团通过β-糖苷键连接。
本发明的抗体或其功能片段的特征在于，其包含重链可变区，所述重链可变区任选地被3个或更少的氨基酸取代并且包含由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列。
本发明的抗体或其功能片段的特征还在于，其包含
(i)重链可变区，其任选地被3个或更少的氨基酸取代并且包含由氨基酸序列GIDFSIYW(SEQ ID NO:1)组成的CDR序列，由氨基酸序列INSDSSTI(SEQ ID NO:2)组成的CDR序列，和由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列，和/或
(ⅱ)轻链可变区，其任选地被1个或更少的氨基酸取代并且其包含由氨基酸序列KSISKY(SEQ ID NO:4)组成的CDR序列，由氨基酸序列SGS组成的CDR序列，和由氨基酸序列QQHNEYPWT(SEQ ID NO:5)组成的CDR序列。
进行氨基酸取代，以便维持与3'-唾液酸乳糖的结合能力。上面“任选地被3个或更少的氨基酸取代”和“任选地被1个或更少的氨基酸取代”是指在重链可变区或轻链可变区中总共3个或更少，或者1个或更少的氨基酸被取代，并且氨基酸取代优选在CDR部分进行。
氨基酸取代的数目优选是2个或更少，更优选是1个或更少，并且进一步优选0。当取代氨基酸时，认为原始抗体片段的活性可以通过用具有相似性质的氨基酸取代来容易地保持。用于在特定的氨基酸序列中取代氨基酸的技术是已知的。
“其功能片段”定义为包含具有该功能片段所来源的抗体的部分或全部结合活性的重链多肽和/或轻链多肽。功能片段的例子包括Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2、F(ab')2、单链Fv(scFv)、双体、三体、四体和微抗体。
“重链”是指约50至70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的五种不同类型之一。不同类型的重链大小不一，α、δ、γ大约含有450个氨基酸，而μ和ε大约含有550个氨基酸。当这些不同类型的重链与轻链结合时，产生了五类众所周知的抗体，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。
“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区并且羧基末端部分包括恒定区。轻链的大约长度是211到217个氨基酸。根据恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，被称为kappa(κ)或lambda(λ)。
“可变区”一般位于轻链或重链的氨基末端，在重链含有约120至130个残基，在轻链含有约100至110个残基，并且是参与与特定抗原的结合和特异性的抗体的轻链或重链的一部分。可变区在不同抗体之间具有广泛的序列差异，序列的可变性集中在存在于可变区的CDR(互补决定区)中，并且可变区中的低可变部分被称为框架区。轻链和重链的CDR主要参与抗体和抗原之间的相互作用。
“CDR”是指抗体重链(H)可变区β-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或者抗体轻链(L)可变区β-折叠框架的非框架区内三个高变区(L1、L2或L3)之一。CDR是分散在框架区序列内的高变区序列。
“结合”是指分子之间形成复合物的相互作用。相互作用是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。抗体或其功能片段的结合可以使用例如酶结合免疫吸附测定法或其他已知方法来检测，该酶结合免疫吸附测定法是实施例2和4中展现的方法。
本发明的抗体优选来源于脊椎动物，例如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊和豚鼠，并且更优选来源于小鼠。
本发明抗体的同种型没有特别限制。同种型的例子包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中优选IgG或IgM。
优选地，SEQ ID NO:1至3的CDR氨基酸序列分别对应于重链可变区CDR1至3，而SEQID NO:4、SGS和SEQ ID NO:5的CDR氨基酸序列分别对应于轻链可变区CDR1至3。
本发明的抗体优选包含重链可变区和轻链可变区两者。
本发明的多核苷酸的特征在于编码抗体或其功能片段。
“多核苷酸”是指任意长度的聚合物形式的核苷酸，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的序列由四种类型的核苷酸碱基组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸是RNA时，用尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。多核苷酸的例子可以包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸等。多核苷酸是指双链分子和单链分子。
编码SEQ ID NO:1至3的CDR氨基酸序列的核苷酸序列分别是例如GGAATCGATTTTAGTATATACTGG(SEQ ID NO:6)、ATTAATTCAGATAGCAGTACAATA(SEQ ID NO:7)和GCAAGAAAGAATGGGGGATTGGACTATGCTATGGACTAC(SEQ ID NO:8)。此外，编码SEQ ID NO:4、SGS、SEQ ID NO:5的CDR氨基酸序列的核苷酸序列分别是例如AAGAGCATTAGCAAATAT(SEQ IDNO:9)、TCTGGATCC和CAACAGCATAATGAATACCCGTGGACG(SEQ ID NO:10)。
本发明的多核苷酸可以是化学合成的，或者也可以使用可以与序列的3'和5'端杂交的合成引物通过PCR扩增获得，或者通过使用对来自合适的来源(例如，从选择用于表达抗体的抗体表达细胞(如杂交瘤细胞)中分离的cDNA)的特定核酸序列特异的寡核苷酸探针进行克隆。然后可以使用任何本领域公知的方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。
当获得编码本发明抗体或其功能片段的多核苷酸时，可以使用本领域公知的方法通过重组DNA技术生产用于产生抗体或其功能片段的载体，并且可以使用公知的方法进一步构建含有抗体或其功能片段的编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。此外，虽然诸如人、小鼠和大鼠等物种之间的恒定区差异很大，但同一物种的抗体恒定区非常相似。因此，人、小鼠、大鼠等的抗体可以通过克隆到含有编码各物种恒定区的核苷酸序列的载体中而产生。
可以通过常规方法将表达载体导入宿主细胞，然后可以通过常规方法培养转染的细胞，以产生本发明的抗体或其功能片段。为了表达整个免疫球蛋白分子，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链两者的载体。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体或其功能片段。宿主表达载体系统的例子包括微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))和用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌(例如，Saccharomyces pikia)，用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞，用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞，以及具有重组表达构建体的哺乳动物细胞(例如，COS、CHO、HEK293、3T3细胞)，该重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒(例如，晚期腺病毒启动子)的启动子。
当本发明的抗体或其功能片段通过重组表达产生时，抗体或其功能片段可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的方法进行纯化，例如色谱(例如，离子交换色谱、蛋白A色谱、凝胶过滤柱色谱)、离心、盐析等。此外，本发明的抗体或其功能片段可以与已知的异源多肽序列融合以利于纯化。例如，本发明的抗体或其功能片段可以通过重组添加多组氨酸标签(His标签)、FLAG标签、血凝素标签(HA标签)或myc标签来纯化。
此外，本发明的抗体的功能片段可以通过已知的方法产生。例如，本发明的抗体的Fab和F(ab')2片段可以使用酶，例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)和胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切来产生。
2.疾病检查药物
用于本发明的疾病的检查药物的特征在于包含所述抗体或其功能片段。本发明的检查药物特别是用于检查发生癌症的可能性的药物。
本发明的用于疾病的检查药物可以用于检查(或确定)发生癌症如胰腺癌的可能性的方法，其包括在从受试者收集的生物样品中，测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度的步骤(在本说明书中，该方法有时被称为“本发明的检查方法”)。这将在下面描述。
待检查的癌症，例如胰腺癌，没有特别限制并且包括所有类型、分期等的癌症。癌症的类型优选胰腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、胃癌、睾丸癌和卵巢癌，并且特别优选胰腺癌。胰腺癌的类型的例子包括胰腺导管癌、胰腺内分泌肿瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、粘液性囊性肿瘤和腺泡细胞癌，并且优选胰腺导管癌等。黑色素瘤的类型的例子包括肢端雀斑样黑色素瘤、浅表扩散黑色素瘤、结节性黑色素瘤和恶性雀斑样黑色素瘤。肢端雀斑样黑色素瘤在日本人中占主导地位，而浅表扩散黑色素瘤在白种人中占主导地位。待检查的癌症分期从早期开始依次为0期、I期、II期、III期和IV期(IVa期、IVb期)。
受试者是本发明的检查方法的目标生物，并且其生物物种没有特别限制。受试者的生物物种的例子包括各种哺乳动物，例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、猫和兔，并且优选人。
受试者关于癌症的病况没有特别限制。受试者的例子包括其中不知晓是否发生癌症的受试者、没有癌症史的受试者、具有癌症史并已经接受癌症治疗的受试者、以及已经通过另一确定方法确定患有癌症(或没有癌症)的受试者。
生物样品没有特别限制，只要生物样品可以含有与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原。生物样品的例子包括体液，例如全血、血清、血浆、唾液、脊髓液、滑液、尿液、组织液、汗液和眼泪，以及来源于这些体液的样品。来源于体液的样品没有特别限制，只要样品是由体液制备，并且其例子包括通过例如从体液浓缩或纯化本发明的抗体或其功能片段所结合的抗原而获得的样品。体液的优选例子包括全血、血清和血浆。作为生物样品，可以单独使用一种类型，也可以组合使用两种或更多的类型。
可以通过本领域技术人员已知的方法从受试者收集生物样品。例如，可以使用注射器等通过采血来收集全血。采血优选由诸如医生和护士的医务人员进行。血清是通过从血液中去除血细胞和特定凝血因子而获得的血液的一部分，并且可以例如作为血液凝固后的上清液获得。血浆是通过从血液中除去血细胞而获得的血液的一部分，并且可以例如在血液不凝固的条件下对血液进行离心时作为上清液获得。
与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原没有特别限制，只要该抗原是可以与本发明的抗体或其功能片段结合的3'-唾液酸乳糖，或含有3'-唾液酸乳糖的分子。本发明的检查方法包括测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度的步骤，并且该方法没有特别限制。该方法的例子包括免疫测定法。无论是直接法、间接法、均一法、非均一法、竞争法、非竞争法等，都可以广泛采用免疫测定法。免疫测定法的更具体例子包括ELISA(例如，直接法、间接法、夹心法、竞争法等)、放射免疫测定法(RIA)、免疫放射测定法(IRMA)、酶免疫测定法(EIA)、夹心EIA、免疫色谱、Western印迹、免疫沉淀、狭缝或斑点印迹测定法、免疫组织化学染色、荧光免疫测定法、使用亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素系统的免疫测定法，以及使用表面等离子体共振(SPR)方法的免疫测定法。作为检测方法，可以单独采用一种方法，也可以组合采用两种或更多的方法。
在测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度的步骤中，用于检测抗原的标记物(例如，标记抗体)的标记类型没有特别限制。标记的例子包括荧光物质、发光物质、色素、酶、胶体金和放射性同位素。其中，从安全性、经济性、检测灵敏度等角度考虑，优选酶标记，例如过氧化物酶和碱性磷酸酶。
将详细描述用于测量和计算与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度的方法。
该方法的一种方式的例子包括使本发明的抗体或其功能片段与从受试者收集的生物样品接触的步骤，以及测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量的步骤。
与从受试者收集的生物样品的接触方式没有特别限制，可以根据用于测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度的方法(例如，各种免疫测定法等)的类型来选择合适的方式。
接触方式的例子包括这样的方式，其中本发明的抗体或其功能片段与生物样品在只有本发明的抗体或其功能片段与生物样品之一被固定在固相上的状态下相互接触，以及这样的方式，其中本发明的抗体或其功能片段与生物样品在本发明的抗体或其功能片段与生物样品都没有被固定在固相上的状态下相互接触。其中，从效率等的观点考虑，优选的是本发明的抗体或其功能片段与生物样品在只有本发明的抗体或其功能片段被固定在固相上的状态下相互接触的方式。
当只有本发明的抗体或其功能片段与生物样品之一被固定在固相上时，固定后，固相优选用含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)和/或醚型非离子表面活性剂的溶液洗涤。
固相没有特别限制，只要本发明的抗体或其功能片段与生物样品可以被固定到其上即可。固相的例子包括板、玻片、含有聚苯乙烯的膜、玻璃、硝酸纤维素等作为主要组分。固相可以涂覆有用于更容易地固定本发明的抗体或其功能片段与生物样品的组分，例如易反应的化合物(例如，具有易反应基团的化合物，胶体金，等)。具有易反应基团的化合物的例子包括具有能够与糖链或糖链衍生物形成共价键的基团的化合物，例如(1H-咪唑-1-基)羰基，琥珀酰亚胺酰氧基羰基，环氧基，醛基，氨基，硫醇基，羧基，叠氮基，氰基，活性酯基(1H-苯并三唑-1-基氧基羰基，五氟苯基氧基羰基，对硝基苯基氧基羰基等)，羰基卤基(碳酰氯基，羰基氟基，羰基溴基，羰基碘基)等。
具有易反应基团的化合物的例子包括环氧硅烷和聚赖氨酸。
当使用涂覆有易反应的化合物的固相时，易反应的化合物优选使用含有牛血清白蛋白(BSA)等的缓冲溶液封闭，并且封闭时间优选为60分钟或更长。此外，封闭液优选含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)和/或醚型非离子表面活性剂。
用于测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原量的方式没有特别限制，可以根据上述用于测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原量或浓度的方法(例如，各种免疫测定法等)的类型选择适当的方式。例如，可以通过量化来源于所用标记物的标记的信号来进行测量。作为更具体的方式，例如可以通过使本发明的标记抗体或其功能片段或针对抗原的标记抗体与结合于本发明的抗体或其功能片段的抗原相接触，并量化来源于结合的标记抗体的标记的信号来进行测量。
基于所获得的信号量，可以计算与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量。例如，在非竞争法的情况下，所获得的信号量可以直接用作与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量。另外，作为另一例子，在竞争法的情况下，由于所获得的信号量与结合于本发明的抗体或其功能片段的抗原的量彼此成反比，因此可以从基于该关系获得的信号量来计算结合于本发明的抗体或其功能片段的抗原的量。
根据本发明的检查方法，可以提供与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的值，该值是检测癌症如胰腺癌的发生的指标，由此可以帮助确定发生癌症如胰腺癌的可能性。
作为一种方式，本发明的检查方法优选还包括以下步骤：当结合于本发明的抗体或其功能片段的抗原的量或浓度的测量值等于或高于预设的截止值时，确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高。此处，“发生癌症如胰腺癌的可能性”是指“在采集生物样品时发生癌症如胰腺癌的可能性”。
根据本发明的检查方法，可以确定发生胰腺癌的可能性。另外，通过本发明的检查方法，可以以更高的灵敏度确定发生癌症如胰腺癌的可能性，从而可以将确实发生癌症如胰腺癌的受试者更可靠地确定为“发生癌症如胰腺癌”(即，可以进一步降低错误确定为“未发生胰腺癌”的可能性)。
截止值可以由本领域技术人员从灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值等角度适当设置，例如可以是在从未发生癌症如胰腺癌的受试者收集的生物样品中，与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度值的平均值、百分位值或最大值。更具体地，例如，可以通过在从未发生癌症如胰腺癌的受试者和已经发生癌症如胰腺癌的每个受试者中收集的生物样品中，测量与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度来设置截止值，并根据接受者操作特征(ROC)曲线等(更具体地，示例了使用约登指数的方法)，使用测量值进行统计分析。
此外，截止值可以是在一定时间段之前从同一受试者收集的生物样品中与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度值。“一定时间段”没有特别限制，只要该一定时间段是与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度可以在同一受试者内发生变化的时间段。该一定时间段包括约1个月至10年，2个月至5年，3个月至2年和4个月至1年的时期。
本发明的检查方法的修改是这样的方法，包括步骤：当与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度值高于在一定时间段之前从同一受试者采集的生物样品中与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度值，确定受试者未来可能发生癌症如胰腺癌的步骤。未来发生胰腺癌的风险由包括该步骤的检查方法确定。
该“一定时间段”没有特别限制，只要该一定时间段是其中与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度可以在同一受试者内发生变化的时间段。该一定时间段的例子包括约1个月至10年，2个月至5年，3个月至2年，和4个月至1年的时期。
“更高”的程度没有特别限制，并且其例子包括与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度值为在一定时间段之前从同一受试者采集的生物样品中，与本发明的抗体或其功能片段结合的抗原的量或浓度值的2倍或更多、4倍或更多、8倍或更多以及20倍或更多。
当通过本发明的检查方法确定在受试者中发生癌症如胰腺癌的可能性高，通过进一步组合本发明的检查方法与另一诊断方法可以以更高的准确度诊断癌症如胰腺癌的发生。其他诊断方法没有特别限制，并且可以采用各种已知的诊断方法。诊断方法的例子包括活检法、PET检查法、CT检查法、超声检查法，以及肿瘤标志物检查法。其中，从能够以更高的准确度诊断胰腺癌的观点考虑，优选的是活检法，PET检查法，CT检查法，超声检查法等。作为诊断方法，可以单独采用一种方法，或可以组合采用两种或更多种方法。
本发明的检查药物可以是包含本发明的抗体或其功能片段的组合物的形式。如果需要的话，组合物可以含有其它组分。其它组分的例子包括基料，载体，溶剂，分散剂，乳化剂，缓冲剂，稳定剂，赋形剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，增稠剂，保湿剂，着色剂，调味剂，和螯合剂。
本发明的检查药物可以是包含本发明的抗体或其功能片段的试剂盒的形式。试剂盒可包含可以用于执行本发明的检查方法的仪器、试剂等。
仪器的例子包括试管、微量滴定板、琼脂糖颗粒、乳胶颗粒、纯化柱、环氧涂层载玻片和胶体金涂层载玻片。
试剂的例子包括针对本发明的抗体的抗原的抗体或其标记抗体，和标准样品(阳性对照、阴性对照)。
作为针对本发明的抗体的抗原的抗体，可以使用针对3'-唾液酸乳糖的抗体、针对本发明的抗体所结合的分子(例如蛋白质)的抗体等。
用于制造标记抗体的标记的类型没有特别限制。标记的例子包括荧光物质、发光物质、色素、酶、胶体金和放射性同位素。其中，从安全性、经济性、检测灵敏度等角度考虑，优选酶标记，如过氧化物酶、碱性磷酸酶。
作为标准样品，使用本发明的抗体的抗原。本发明的抗体的抗原可以使用本发明的抗体通过例如免疫沉淀法从生物样品中分离并纯化。此外，本发明的抗体的抗原可以通过生产含有3'-唾液酸乳糖(例如，3'-唾液酸乳糖PAA，由GlycoTech Corporation制造)、具有暴露在其表面上的3'-唾液酸乳糖的脂质体或蛋白质等的聚合物来获得。
本发明还提供了用于诊断疾病的药物组合物，包含用诊断剂标记的本发明的抗体或其功能片段。当通过本发明的检查方法确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高时，通过例如血管内、肌内、皮下或腹膜内给予包含用诊断剂标记的本发明的抗体或其功能片段的药物组合物，并检查全身，可以以更高的准确度诊断癌症如胰腺癌的发生。
本发明的用于诊断疾病的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。可以使用的药学上可接受的载体的例子包括本领域已知的标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂，包括油/水乳剂等，以及各种类型的润湿剂。此外，本发明的用于诊断疾病的药物组合物中还可以使用其他组分，例如药物级稳定剂、缓冲剂、防腐剂和赋形剂，并且可以通过已知方法，考虑pH、等渗性、稳定性等，进行药物组合物的制备。
用于标记本发明的抗体或其功能片段的诊断剂的例子包括放射性物质、荧光材料、发光材料、生物发光材料和光声成像材料。放射性物质的例子包括各种正电子发射金属，如锆(89Zr)、碘(131I、125I、124I、123I和121I)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)和镓(68Ga、67Ga)。发光材料的例子包括伞形酮、荧光素和异硫氰酸荧光素。发光材料的例子包括鲁米诺。生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。光声成像材料的例子包括金纳米粒子、单层碳纳米管、吲哚菁绿和亚甲基蓝。
标记本发明的抗体或其功能片段的方法的例子包括使用接头如聚乙二醇来间接结合化合物的方法，以及通过在抗体或其功能片段的半胱氨酸残基处形成二硫键来直接结合化合物的方法。还可以使用异源双功能交联剂如N-琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯将化合物直接结合到抗体或其功能片段。此外，还可以通过氧化抗体Fc区的糖链来结合化合物。
本发明的用于诊断疾病的药物组合物中所含的用诊断剂标记的抗体或其功能片段的剂量没有特别限制，只要该剂量是药理学有效量。剂量可以根据种族、性别、年龄、癌症类型等适当确定，并且通常是0.01至1000mg/kg，且优选0.1至100mg/kg。将用诊断剂标记的本发明的抗体或其功能片段在受试者的结合位点上优先浓缩，并除去未与该结合位点结合的抗体或其功能片段，至本底水平所需的时间可以根据所使用的诊断剂的类型、给药方法等适当确定，并且例如是给药后6至48小时左右。此外，当监测到疾病时，从首次诊断起的1至12个月内，例如以给药后5至20天的时间间隔重复监测疾病。
本发明的用于诊断疾病的药物组合物中含有的用诊断剂标记的抗体或功能片段的存在可以通过使用已知方法检查受试者的全身来检测。检测方法取决于要使用的诊断剂的类型，并且可以用于本发明的方法的例子包括计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、磁共振成像、超声检查和光声成像。
可以使用本发明的药物组合物诊断的疾病的例子包括癌症，例如上述胰腺癌，并且本发明的药物组合物对于诊断高表达3'-唾液酸乳糖的癌症特别有用。即，当通过本发明的检查方法确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高时，可以通过给予本发明的药物组合物以更高的准确度诊断受试者中癌症如胰腺癌。
3.癌症治疗
当通过本发明的检查方法确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高时，或者当结合另一诊断方法诊断出受试者患有癌症时，可以通过对受试者进行癌症治疗来治疗受试者的癌症。另外，通过本发明的检查方法，能够以更高的灵敏度确定发生癌症如胰腺癌的可能性，从而可以通过本发明的检查方法或通过与另一诊断方法的组合，更可靠地治疗确实发生癌症的受试者(即可以降低从待治疗的受试者中排除确实发生癌症的受试者的可能性)。
癌症治疗的方法没有特别限制，并且可以采用各种已知的治疗方法。治疗方法的例子包括化学疗法、手术治疗、放射疗法和免疫疗法。这些治疗可以按照已知的方法进行。
用于化学疗法的治疗剂没有特别限制，可以使用各种抗癌剂。抗癌剂的例子包括烷化剂、抗代谢药、微管抑制剂、抗生素抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、铂制剂、分子靶向药物、激素剂和生物制剂。烷化剂的例子包括环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑、甲基苄肼和雷莫司汀。抗代谢药的例子包括依诺他滨、卡莫呋、卡培他滨、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美嘧啶-奥替拉西钾、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷烷磷酸酯(cytarabine ocfosfate)、奈拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、氨甲蝶呤、克拉屈滨、去氧氟尿苷、羟基脲和巯嘌呤。微管抑制剂的例子包括基于生物碱的抗癌剂如长春新碱和基于紫杉烷的抗癌剂如多西紫杉醇和紫杉醇。抗生素抗癌剂的例子包括丝裂霉素C、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、博来霉素、放线菌素D、阿柔比星、伊达比星、吡柔比星、培洛霉素、米托蒽醌、氨柔比星和净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)。拓扑异构酶抑制剂的例子包括具有拓扑异构酶I抑制作用的CPT-11、伊立替康和诺吉替康(nogitecan)，以及具有拓扑异构酶II抑制作用的依托泊苷和索布唑烷。铂制剂的例子包括顺铂、奈达铂、奥沙利铂和卡铂。激素剂的例子包括地塞米松、非那雄胺、他莫昔芬、阿那曲唑、依西美坦、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、亮丙瑞林、来曲唑、雌莫司汀、托瑞米芬、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮和美雄烷。生物制剂的例子包括免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体、干扰素α、β和γ、白细胞介素2、乌苯美司和干BCG。分子靶标药物的例子包括利妥昔单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、吉非替尼、厄罗替尼、替西罗莫司、贝伐珠单抗、VEGF trap、舒尼替尼、索拉非尼、托珠单抗、硼替佐米、吉妥珠单抗、替伊莫单抗(ibritumomab-ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、他米巴罗汀和维甲酸。除了此处指定的分子靶标药物外，还可包括以下分子靶标药物：靶向血管生成的抑制剂，例如人表皮生长因子受体2抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂和内皮生长因子受体2抑制剂(α-VEGFR-2抗体)；酪氨酸激酶抑制剂，例如MAP激酶抑制剂；靶向细胞因子的抑制剂、蛋白酶体抑制剂和抗体-抗癌剂制剂。这些抑制剂还包括抗体。
典型的胰腺癌治疗剂包括吉西他滨、TS-1、厄罗替尼、吉西他滨与厄罗替尼的合用药、吉西他滨与白蛋白结合的紫杉醇的合用药、以及四种药物(奥沙利铂、左旋亚叶酸、伊立替康和氟尿嘧啶)的合用药。
本发明还提供了用于治疗疾病的药物组合物，包含本发明的抗体或其功能片段。如后述实施例所示，本发明的抗体或其功能片段本身具有癌症细胞毒活性，因此本发明的抗体或其功能片段可以单独用于治疗癌症如胰腺癌。本发明还提供了用于治疗疾病的药物组合物，包括用治疗剂标记的本发明的抗体或其功能片段，该治疗剂例如上述各种抗癌剂和胰腺癌治疗剂，包括赖氨酸的毒素化合物等，以及放射性物质，包括放射性金属离子(例如，具有放射性活性的化合物，如α发射体)等。标记方法的例子包括使用接头如聚乙二醇来间接结合化合物的方法，以及通过在抗体或其功能片段的半胱氨酸残基处形成二硫键来直接结合化合物的方法。还可以使用异源双功能交联剂例如N-琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯将化合物直接结合到抗体或其功能片段。此外，还可以通过氧化抗体Fc区的糖链来结合化合物。
本发明的用于治疗疾病的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。可以使用的药学上可接受的载体的例子包括本领域已知的标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂，包括油/水乳剂等，以及各种类型的润湿剂。此外，本发明的用于治疗疾病的药物组合物中还可以使用其他组分，例如药物级稳定剂、缓冲剂、防腐剂和赋形剂，并且可以通过已知方法，考虑pH、等渗性、稳定性等，进行药物组合物的制备。
本发明的用于治疗疾病的药物组合物中所含的抗体或其功能片段的剂量和用治疗剂标记的抗体或其功能片段的剂量没有特别限制，只要各剂量是药理学有效量。每个剂量可以根据种族、性别、年龄、癌症类型等适当确定，并且通常每个抗体或其功能片段可以以0.01至1,000mg/kg并且优选以0.1至100mg/kg每1至180天一次、或一天两次或三次或更多次给予。
可以使用本发明的药物组合物治疗的疾病的例子包括癌症例如上述胰腺癌，并且本发明的药物组合物对于治疗高表达3'-唾液酸乳糖的癌症特别有用。即，当通过本发明的检查方法确定受试者发生癌症如胰腺癌的可能性高时，可以通过给予本发明的药物组合物来治疗受试者中癌症如胰腺癌。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限于这些实施例等。
实施例1.抗人ES细胞的小鼠单克隆抗体的制备
(a)杂交瘤的制备
在含有添加剂(20％KSR(KnockOut血清替代物，Invitrogen制造，目录号：10828028)，2mM谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸)的DMEM/F12培养基(Sigma-Aldrich制造，目录号：D9785)中在丝裂霉素处理的小鼠原代成纤维细胞上培养人ES细胞(克隆名称：KhES-1)以保持未分化潜能。将含有酶溶液(0.25％胰蛋白酶、1mg/ml胶原酶IV、20％KSR、1mMCaCl2)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)加入未分化的人ES细胞中，并通过移液将细胞剥离，并离心(1000rpm，3分钟)。将PBS加入未分化的人ES细胞中作为沉淀物悬浮细胞，然后加入两倍量的ADJUBANT COMPLETE FREUND(DIFCO制造，目录号：263810)，将混合物超声乳化，制备免疫源。
将50μl免疫源注射到8周龄雌性C57BL/6JJmsSl小鼠的脊中，14天后，用将未分化的人ES细胞悬浮在PBS中所获得的悬浮液作为免疫源进行加强免疫。加强免疫3天后，从腹部淋巴结收集淋巴细胞，测量淋巴细胞数，然后将1×108个淋巴细胞和2×107个小鼠骨髓瘤SP2细胞混合并离心(1300rpm，10分钟)。向沉淀中加入1ml的PEG1500(Roche制造，目录号：783641)，将混合物在37℃保温2分钟，进行细胞融合。然后，加入4.5ml的DMEM培养基(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，目录号：044-29765)，并将混合物离心。接下来，将50ml的HAT培养基(杂交瘤-SFM(GIBCO制造，目录号：12300-067)含有次黄嘌呤13.61mg/l、氨基蝶呤0.176mg/l、胸苷3.88mg/l、胎牛血清10％)加入沉淀中并混合。然后，在四个96孔板上每孔接种100μl杂交瘤悬浮液并培养5天。
(b)杂交瘤的筛选
在96孔板中的小鼠原代成纤维细胞上培养未分化的人ES细胞，然后向其中加入用PBS稀释10倍的37％甲醛(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，目录号：06400406)，并在室温进行固定15分钟。用PBS洗涤1次后，每孔加入50μl的0.5％Triton-X100，然后使板在室温静置5分钟。用PBS洗涤3次后，加入NGS封闭液(含1％BSA、2％山羊血清和3.75％甘氨酸的PBS溶液)，并使板在室温静置30分钟。接下来，除去NGS封闭液，加入40μl实施例1(a)中的杂交瘤上清液，并使板在室温静置1小时。用PBS洗涤3次后，加入用NGS封闭液稀释500倍的山羊抗小鼠IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(由Abcam制造，目录号：ab150113)，并使板在室温静置30分钟。接下来，用PBS洗涤3次后，每孔加入50μl的PBS，用荧光显微镜观察荧光图像以筛选杂交瘤上清液，其中仅染色未分化的人ES细胞，而不染色小鼠原代成纤维细胞。
从含经筛选的上清液的孔中收集杂交瘤，每100个杂交瘤加入10ml的HAT培养基，并且向96孔板的每孔加入100μl混合物(理论上，每孔1个杂交瘤)，并培养。通过以上述相同的免疫染色筛选杂交瘤上清液。结果，获得克隆3B1E2，其产生与未分化的人ES细胞反应的抗体。
(c)3B1E2抗体的纯化
在用于繁殖的HAT培养基中扩增和繁殖克隆3B1E2。繁殖到10cm的培养皿后，克隆3B1E2用在HAT培养基中从10％逐渐降低到5％，2％，1％和0％的胎牛血清中培养，再接种到15cm的培养皿中，并在不含胎牛血清的HAT培养基中培养12天。
将硫酸铵和1/10体积的1M Tris-HCl(pH 8.0)加入到所获得的培养物上清液以具有314g/l的浓度，并将该混合物在室温搅拌1小时。将混合物离心(18000rpm，4℃，30分钟)，并向所获得的沉淀物中加入2ml含20mM的NaCl的15.7mM磷酸缓冲液(pH 6.3)以完全溶解沉淀物，并且将溶液应用到PD-10柱(GE Healthcare制造，目录号：17-0851-01)，然后用2.5ml相同的缓冲溶液洗脱。然后将所获得的洗脱液应用于HiTrap SP HP强离子交换柱(GEHealthcare制造，目录号：17-1151-01)，洗脱并用含有1M NaCl的15.7mM磷酸盐缓冲液(pH6.3)分级。每个级分进行SDS-PAGE以获得抗体级分，并且使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific制造，目录号：23225)确定蛋白质浓度。此外，当使用小鼠单克隆抗体同工型检查剂盒(BioRad制造，目录号：MMT1)测定抗体类别时，它是IgM，κ。
(d)3B1E2抗体基因的确定
使用ISOGENII(Nippon Gene Co.,Ltd.制造，目录号：311-07361)从克隆3B1E2纯化总RNA，并向总RNA中加入用于小鼠IgM的重链或轻链恒定区的引物(Mu IgM VH 3'-1引物或Mu IgκVL 3'-1引物：Merck制造，目录号：69831-3CN)和逆转录酶(Thermo FisherScientific制造，目录号：18080044)，并在55℃反应30分钟以制备cDNA。使用获得的cDNA和小鼠Ig-Primer Set(Merck制造，目录号：69831-3CN)的Mu Ig VH 5'-F引物和Mu IgM VH3'-1引物，或Mu IgκVL 5'-G引物和Mu IgκVL 3'-1引物进行PCR，以分别获得具有约500bp的重链和轻链的小鼠抗体基因片段。将所获得的基因片段插入到pGEM-T Easy载体(Promega制造，目录号：A1360)，并克隆。
通过DNA测序仪来确定3B1E2抗体的重链和轻链的CDR碱基序列，并且鉴定出在表1中所示的重链和轻链的CDR1-3的氨基酸序列。此外，整个重链可变区和整个轻链可变区的氨基酸序列和碱基序列如下所示。
表1
Figure BDA0003236735560000211
重链可变区(氨基酸序列)
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFSIYWMSWVRRAPGKGLEWIGEINSDSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARKNGGLDYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:11)
轻链可变区(氨基酸序列)
MVLISLLFWISGAQCDVQITQSPSYLAASPGETITINCRSSKSISKYLAW
YQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:12)
重链可变区(碱基序列)
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTGAAGCTTCTCCAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGAATCGATTTTAGTATATACTGGATGAGTTGGGTTCGGCGGGCTCCAGGGAAAGGACTAGAATGGATTGGAGAAATTAATTCAGATAGCAGTACAATAAACTATGCACCATCTCTAAAGGATAAATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGAAAGAATGGGGGATTGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:13)
轻链可变区(碱基序列)
ATGGTTCTCATATCCTTGCTGTTCTGGATATCAGGTGCCCAGTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGTCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTACAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(SEQ IDNO:14)
(e)3B1E2抗体(小鼠IgG2a、κ)的制备
将实施例1(d)中获得的重链或轻链可变区基因片段分别插入到小鼠抗体(IgG2a)表达载体pUC19-CAG-HC(mIgG2a)或pUC19-CAG-HC(mKappa)。使用PEI(Merck制造，目录号：408727-100ML)将制备的两种质粒各0.25μg导入0.4×106细胞的HEK293细胞中，并培养3天。收集所获得的培养物上清液，并以与实施例1(c)中相同的方式添加硫酸铵和1M Tris-HCl(pH8.0)以制备3B1E2抗体(小鼠IgG2a，κ)。
实施例2. 3B1E2抗体与3'-唾液酸乳糖的结合
将100μl 10μg/ml的3'-唾液酸乳糖-PAA(聚丙烯酰胺)(GlycoTech Corporation制造，目录号08-038)的PBS溶液加入MaxiSorp 96孔板(Thermo Fisher Scientific制造，目录号：439454)的每孔，并使板在室温静置16小时。接下来，每孔用300μl含有1％Triton-X100的PBS(洗涤液)洗涤3次，然后向每孔加入200μl含有5％BSA和1％Triton-X 100的PBS，并使板在室温静置1小时。每孔用300μl洗涤液洗涤，然后向每孔加入100μl的3B1E2抗体(小鼠IgG2a或小鼠IgM))或对照抗体(小鼠IgG2a：BioLegend制造，目录号：401502，或小鼠IgM：BioLegend制造，目录号：401602)，并使板在室温下静置2小时。
接下来，每孔用300μl洗涤液洗涤5次，然后向每孔加入100μl过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Immuno Research制造，目录号：115-035-071)或稀释1000倍的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgM抗体(Jackson ImmunoResearch制造，目录号：115-035-075)，并使板在室温静置1小时。然后，用300μL洗涤液洗涤3次，向每孔加入100μl过氧化物酶底物溶液(SeraCare Life Sciences制造，目录号：5120-0053)，并使板在室温静置30分钟。反应后，加入50μl的2％硫酸终止反应，然后用酶标仪测量每个孔在450nm处的吸光度。
结果，如图1所示，显示与对照抗体相比，3B1E2抗体(小鼠IgG2a)与3'-唾液酸乳糖更强地结合。此外，如图2所示，显示与对照抗体相比，3B1E2抗体(小鼠IgM)与3'-唾液酸乳糖更强地结合。
实施例3. 3B1E2抗体对癌组织的病理检查
将放置了多种类型组织的癌组织切片(每种类型约15个样本)的组织阵列玻片(USBiomax制造，目录号：MC5003c)脱蜡(二甲苯7分钟3次，甲醇2分钟3次，水洗)，然后加入含3％过氧化氢的甲醇以灭活内源性过氧化物酶。水洗后，将组织阵列玻片在10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中98℃保温5分钟以激活抗原。洗涤后，每个样本用Pap笔包围，然后向其中加入Block Ace(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.制造，目录号：UKB40)溶液并在室温下进行封闭处理15分钟。
接下来，加入300μl的50μg/ml 3B1E2抗体(小鼠IgG2a)，并使玻片在室温静置2小时。用PBS洗涤3次后，加入用于人体组织的Histofine Simple Stain MAX-PO(NichireiCorporation制造，目录号：424131)，并使玻片在室温下静置30分钟。用PBS洗涤3次后，加入DAB显色液(Dako制造，目录号：K3468)并反应1分钟。然后用水进行洗涤，加入苏木精溶液(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.制造，目录号：8656)，并染色细胞核约30秒。用水洗涤后，将玻片脱水(75％乙醇3分钟，95％乙醇3分钟，100％乙醇3分钟两次)，澄清(二甲苯3分钟两次)，然后密封，并用显微镜观察。
作为测量用3B1E2抗体(小鼠IgG2a)染色的阳性样本占全部样本的比例的结果，如表2所示，50％或更多的样本为胰腺癌和黑色素瘤阳性，而10％或更多的样本为甲状腺癌、胃癌、睾丸癌和卵巢癌阳性。由此显示，在胰腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、胃癌、睾丸癌和卵巢癌的癌组织中检测到3B1E2抗体的抗原。
[表2]
癌症 阳性样本的比例
胰腺 ++
黑色素瘤 ++
甲状腺 +
胃 +
睾丸 +
卵巢 +
++：50％或更多，+：10％或更多
实施例4. 3B1E2抗体对胰腺癌患者的血液检查
(a)3B1E2抗体(小鼠IgM)的过氧化物酶标记
使用Ab-10快速过氧化物酶标记试剂盒(DOJINDO LABORATORIES制造，目录号：LK33)，根据方案用过氧化物酶标记10μg的3B1E2抗体(小鼠IgM)。
(b)血清样品的制备
作为生物样品，通过FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation从美国的医院获得13名健康受试者和55名胰腺癌患者(I期：15名患者，II期：15名患者，III期：11名患者，IV期：14名患者)的血清。用样品稀释液(含有1％BSA和0.05％Triton-X 100的PBS)将每种血清稀释6倍以制备血清样品。
(c)健康受试者和胰腺癌患者血清中3B1E2抗体的抗原值测量
在MaxiSorp 96孔板的每孔中加入100μl 10μg/ml的3B1E2抗体(小鼠IgG2a)，并使板在4℃静置16小时。接下来，用200μl洗涤液(含0.05％Triton-X 100、140mM NaCl的50mMTris-HCl(pH8.0))洗涤每孔3次，向每孔加入200μl含5％BSA的洗涤液，并使板在室温静置1小时。每孔洗涤3次，向每孔加入100μl血清样品，并使板在室温静置1小时。然后每孔洗涤5次，向每孔加入用样品稀释液稀释10,000倍的100μl过氧化物酶标记的3B1E2抗体(小鼠IgM)，并使板在室温静置1小时。每孔洗涤5次，然后向每孔加入100μl过氧化物酶底物溶液(SeraCare Life Sciences制造，代码号：5120-0053)，并使板在室温静置30分钟。反应后加入50μl的2％硫酸终止反应，并用酶标仪测量各孔在450nm处吸光度。
结果，如图3所示，显示在胰腺癌患者中，血清中3B1E2抗体的抗原值显著高于(p<0.0001)健康受试者，并且胰腺癌的发生和3B1E2抗体的抗原值相互关联。
实施例5.3B1E2抗体对癌细胞的损伤作用
3B1E2抗体与人胰腺癌细胞系KP-3L(JCRB生物资源库，细胞注册号：JCRB0178.1)的细胞膜表面结合。KP-3L分散在含有1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich制造，目录号：A7906)的RPMI-1640培养基(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，代码号：186-02155)中，在96孔培养板上每孔接种2×104KP-3L细胞。第二天，除去35μl培养基，并加入10μl含有3B1E2抗体(小鼠IgG2a)或对照抗体(BioLegend制造，目录号：401502)的RPMI-1640培养基，并使板在室温静置30分钟。接下来，加入25μl兔补体血清(Sigma-Aldrich制造，目录号：S7764)，在37℃、5％CO2下培养4小时。然后在1,000rpm下将板离心5分钟，收集50μl上清液，并且使用细胞毒性检测试剂盒(Roche制造，目录号：4744926)测量上清液中乳糖脱氢酶活性。对于阴性对照，加入RPMI-1640培养基代替抗体，对于阳性对照，加入RPMI-1640培养基和Tween(商标)20代替抗体和兔补体血清，并以相同方式进行测量。基于下式计算抗体的癌症细胞毒活性。
癌症细胞毒活性(％)＝(抗体485nm处吸光度-阴性对照485nm处吸光度)/(阳性对照485nm处吸光度-阴性对照485nm处吸光度)×100
结果，如图4所示，显示3B1E2抗体的癌症细胞毒活性以浓度依赖性方式增加，并且在所有浓度下，该活性均显著(p<0.01)高于对照的活性。
工业适用性
通过使用本发明的抗体的检查药物，可以确定发生癌症如胰腺癌的可能性。还可以通过测量本发明抗体的抗原值来监测癌症如胰腺癌的进展和抗癌剂的有效性。此外，使用本发明抗体的药物组合物，可以诊断和治疗癌症如胰腺癌。
Figure IDA0003236735610000011
Figure IDA0003236735610000021
Figure IDA0003236735610000031
Figure IDA0003236735610000041

Claims (17)

1.结合3'-唾液酸乳糖的抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含重链可变区，所述重链可变区任选地被3个或更少的氨基酸取代，并且其包含由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列。
2.结合3'-唾液酸乳糖的抗体或其功能片段，包含：
(i)重链可变区，其任选地被3个或更少的氨基酸取代并且其包含由氨基酸序列GIDFSIYW(SEQ ID NO:1)组成的CDR序列，由氨基酸序列INSDSSTI(SEQ ID NO:2)组成的CDR序列，和由氨基酸序列ARKNGGLDYAMDY(SEQ ID NO:3)组成的CDR序列，和/或
(ii)轻链可变区，其任选地被1个或更少的氨基酸取代并且其包含由氨基酸序列KSISKY(SEQ ID NO:4)组成的CDR序列，由氨基酸序列SGS组成的CDR序列，和由氨基酸序列QQHNEYPWT(SEQ ID NO:5)组成的CDR序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体来源于脊椎动物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体来源于小鼠。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是IgG或IgM。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述功能片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或微抗体。
7.编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能片段的多核苷酸。
8.包含根据权利要求7所述的多核苷酸的表达载体。
9.用于疾病的检查药物，包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能片段。
10.根据权利要求9所述的检查药物，其中所述疾病是癌症。
11.根据权利要求10所述的检查药物，其中所述癌症是选自由胰腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、胃癌、睾丸癌和卵巢癌组成的组中的至少一种癌症。
12.用于诊断疾病的药物组合物，包含用诊断剂标记的根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能片段。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述诊断剂是放射性物质。
14.用于治疗疾病的药物组合物，包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能片段。
15.用于治疗疾病的药物组合物，包含用治疗剂标记的根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能片段。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述治疗剂是抗癌剂。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述治疗剂是放射性物质。
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