JP4981448B2 - Ｃｄ４４の抗原性部分を発現する細胞の結合検査法及び単離法 - Google Patents

Description

この発明は、腫瘍細胞の細胞毒性の媒介と、より詳しくは細胞毒性応答を開始させるための手段として、必要に応じて１種類以上の化学療法薬を併用させる癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）を利用する結合検査の方法に関する。また本発明はＣＤ４４の抗原性部分を発現する試料内の細胞を単離またはスクリーニングするための方法に関する。

ヒト白血球に対するモノクローン抗体の確立は、ＣＤ４４抗原の発見をもたらした。単鎖ヒアルロン酸（ＨＡ）結合糖タンパク質が多種多様の正常組織および全ての種類の造血細胞で発現した。そのことは、リンパ球活性化およびホーミングに元来、関係していた。現在のところ、推定上の生理学的役割として、炎症性遺伝子の活性化、細胞周期の変調、細胞増殖の誘導、分化および発現の誘導、細胞骨格の再編成および細胞遊走、ならびにアポトーシスに対する細胞生存／耐性も挙げられる。
ヒトでは、ＣＤ４４の単一遺伝子コピーは第１１染色体の短腕部１１ｐ１３領域に位置する。この遺伝子は１９のエクソンを含み、最初の５つは定常であり、次の９つは可変であり、その後の３つは定常であり、さらに最後の２つは可変である。選択的スプライシングによって生じ得る異性体の数は１，０００を越える。しかし、現在、自然発生的な変異体で同定されているものは、わずかに数ダースだけである。
ＣＤ４４標準糖タンパク質は、Ｎ末端細胞外（２０アミノ酸のリーダー配列および膜近位領域（８５アミノ酸））、ドメイン（２７０アミノ酸）、膜貫通領域（２１アミノ酸）、ならびに細胞質尾部（７２アミノ酸）からなる。細胞外領域は、Ｎ末端に連結モジュールも有する。この領域は、長さが９２アミノ酸であり、他のＨＡ結合連結タンパク質と相同性を示す。高相同性がマウス型のＣＤ４４とヒト型のＣＤ４４との間にある。タンパク質の変異型は、エクソン５のカルボキシ末端に挿入され、発現された際に細胞外に位置する。
血清可溶型のＣＤ４４もまた、自然発生的に生じるとともに、停止コドン（可変領域内）またはタンパク質分解活性から生じ得る。ＴＮＦ−αを含む種々の刺激による細胞の活性化は、ＣＤ４４受容体の放出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）をもたらす。受容体の放出もまた、腫瘍細胞によって見られ、ＣＤ４４のヒト血清濃度が最大で１０倍まで増加する。高ＣＤ４４血清濃度は、悪性腫瘍（例外として卵巣癌）を示唆する。

標準型のＣＤ４４は、分子量が約３７ｋＤのものとして存在する。転写後修飾は、その分子量を８０〜９０ｋＤに増加させる。このような転写後修飾として、アスパラギン残基でのアミノ末端細胞外ドメインＮ結合型糖鎖合成と、細胞外ドメインのカルボキシル末端にあるセリン／スレオニン残基でのＯ結合型糖鎖合成と、グルコサミノグリカン付加とが挙げられる。スプライス変異体の大きさは、８０〜２５０ｋＤの範囲内である。
ＨＡ、哺乳類の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）上に位置した多糖類は、主要なＣＤ４４リガンドであると考えられている。しかし、ＣＤ４４がコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等にも結合するという知見もある。ＨＡ結合と糖鎖形成との間に相互関係があるように見える。不活性ＣＤ４４（ＨＡとは結合せず）は、高レベルの糖鎖形成を有し、活性ＣＤ４４（結合ＨＡ）では最も低い。その一方で、誘導型ＣＤ４４（サイトカイン、モノクローン抗体、成長因子等で活性化されない限り、ＨＡとは結合しないか結合しても弱い）は、糖鎖形成レベルが活性型と不活性型との間にある。
ＣＤ４４は、その機能のいくつかを細胞、刺激、および環境の相互作用に依存するシグナル伝達経路を介して調節することができる。このような経路のいくつかとして、ＮＦκＢシグナル伝達カスケード（炎症反応に関与）、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達経路（細胞周期および増殖の活性化と関連）、Ｒｈｏファミリー・タンパク質（細胞骨格再組織化および細胞遊走と関連）、ならびにＰＩ３−Ｋ関連シグナル伝達経路（細胞生存に関係）が挙げられる。前述の機能の全てが腫瘍疾患の開始および進行と密接に関連している。ＣＤ４４も、種々の付加的な機構によって癌に影響を与えることが示されている。そのようなものとして、悪性腫瘍に関与する受容体に対するＣＤ４４の細胞表面上に存在する細胞表面プロテオグリカンによって、成長因子、ケモカイン、およびサイトカインの表示が挙げられる。また、ＣＤ４４−ＨＡ複合体の内在化後のリソゾーム・ヒアルロニダーゼによるＨＡの細胞内分解は、腫瘍侵襲性の可能性とＥＣＭを介した血管形成の誘導とを潜在的に増加させることができる。加えて、生存またはアポトーシス・シグナルの伝達が、標準または可変的なＣＤ４４受容体を介して起こることが示された。ＣＤ４４もまた、細胞分化および細胞遊走に関与することが示唆されている。全てではないにしても、これらの機能の多くは環境および細胞依存性であり、いくつかは様々な知見をもたらす。したがって、何らかの結論が引き出される前に、より多くの研究が必要である。
癌でのＣＤ４４の潜在的な機能的役割を確認するために、受容体の差次的発現が疾患進行と相関するかどうか決定するためのＣＤ４４の発現研究が実施された。しかし、一貫性のない知見が大多数の腫瘍型で観察され、このことは、おそらく、研究者間での試薬の併用、技術、病理学的スコアリング、および細胞型の違いによるものだろう。腎細胞癌および非ホジキンリンパ腫が、高ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者で、生存期間が低もしくは非ＣＤ４４発現対応物よりも一貫して短かった。

ＣＤ４４は、癌との関連性があることから、抗癌薬物療法開発の標的であった。ＣＤ４４の標準型または変異体型が腫瘍進行にとって必要であるかどうかについての論争が今でもなお存在する。両方の見解を支持する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）動物データが存在し、それはまた腫瘍型さらには細胞型依存型である可能性もある。異なる治療的なアプローチには、可溶性ＣＤ４４タンパク質、ヒアルロナン合成ＤＮＡ、ヒアルロニダーゼの注射、ＣＤ４４アンチセンスおよびＣＤ４４特異的抗体の使用が含まれた。各アプローチは、ある程度の成功をもたらし、それによって抗ＣＤ４４癌薬物療法の支持が得られた。
モノクローン抗体に特異的な変異体および標準ＣＤ４４が実験的に作られた。しかし、ほとんどの場合、これらの抗体は、固有の生物学的活性を持たず、むしろそれらが認識するＣＤ４４の型に対して特異的に結合する。しかし、いくつかは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のいずれかで活性を示すが、両方では活性を示さないものであった。いくつかの抗ＣＤ４４抗体が細胞現象の媒介となることが示された。例えば、ヒト赤血球ルセラン抗原ＣＤ４４標準型に対するマウス抗体Ａ３Ｄ８は、ＣＤ２（９−１抗体）およびＣＤ３（ＯＫＴ３抗体）媒介Ｔ細胞活性化を強化することが示され、別の抗ＣＤ４４抗体が類似の効果を有した。Ａ３Ｄ８もまた、単球からのＩＬ−１放出およびＴリンパ球のＩＬ−２放出を誘導した。興味深いことに、ダウノルビジン、ミトキサントロン、およびエトポシド等の薬物と併用させたＡ３Ｄ８の使用は、二次メッセンジャー・セラミドの生成を抑制することによるＨＬ６０およびＮＢ４ＡＭＬ細胞でのアポトーシス誘導を阻害した。固有の活性を持たず、かつＣＤ４４の類似のエピトープに対するＪ１７３抗体は、薬物誘導アポトーシスを阻害しなかった。ＣＤ４４由来の８５−１１０ＫＤおよび２００ＫＤに対するＮＩＨ４４−１抗体は、ＣＤ４４の凝集または架橋結合のいずれかと著者が推測した経路を介して、Ｔ細胞増殖を増強した。ひとまとめにして考えると、癌に対するものではない（例えば、リンパ球の活性化）ことから、癌薬物療法としての使用に適している等の抗体は、細胞増殖を誘導し、あるいは細胞毒性の薬剤を使用した場合に癌細胞の薬物誘導死を阻害したという証拠はない。
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗腫瘍効果を示すいくつかの抗ＣＤ４４抗体が記述された。抗体１．１ＡＳＭＬ（ＣＤ４４のｖ６変異体に対するマウス抗ラットＩｇＧ１）は、ラット膵臓腺癌ＢＳｐ７３ＡＳＭＬのリンパ節および肺転移を減少させることが示された。処置された動物の生存性が同時に高まった。この抗体は、リンパ節転移増殖の前に投与された場合に効果的であり、リンパ節での細胞増殖に干渉すると推論された。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での腫瘍細胞に対して抗体が直接細胞毒性を示すことはなく、抗体は補体媒介細胞毒性または免疫効果細胞機能を高めることは無かった。ヒト細胞に対する抗体の有用性は、記載されなかった。

ブレイヤー（Ｂｒｅｙｅｒ）他は、ＣＤ４４に対する市販の抗体を使用して同所移植ラット・グリア芽細胞腫の進行を止めることを記載した。ラット・グリア芽細胞腫培養細胞株Ｃ６を前頭葉に移植し、１週間後、そのラットに対して脳内注射による抗体処置を３回おこなった。処置されたラットは、腫瘍成長の減少を示し、緩衝液またはイソタイプ対照処置ラットよりも高い体重を示した。抗体は、細胞外マトリックス成分によって被覆されたカバーガラスに対する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞粘着を阻害することが可能になった。しかし、細胞に対する直接的な細胞傷害効果は何ら有しなかった。ヒト細胞については、この抗体の試験がおこなわれなかった。
ＣＤ４４（ＩＭ−７．８．１）に対する抗体の有効性とＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）に対する抗体の有効性とを比較する研究を実施した。両方のイソ型を発現するＣＤ４４高転移性マウス黒色腫株Ｂ１６Ｆ１０を静脈注射（ｉ．ｖ．）によってマウスに移植した。２日後、研究期間中にわたって３日目毎に抗体を投与した。両方の抗体は、５０％を上回る肺転移数の著しい減少を生じ、２つの抗体間で有効性に関する有意差はなかった。抗体は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での増殖に影響を及ぼさなかったことから、著者であるザバズキ（Ｚａｗａｄｚｋｉ）他はＣＤ４４とそのリガンドとの相互作用を抗体が阻害することで腫瘍増殖の阻害が生じたと推測した。ＩＭ−７．８．１を用いた別の研究では、ザルカ（Ｚａｈａｌｋａ）他は抗体およびそのＦ（ａｂ’）_２フラグメントがマウスＴ細胞リンパ腫ＬＢによるリンパ節浸潤を阻害することが可能であることを証明した。このことは、マウスに対して生存上重要な利点を与えた。ヴァラッハ−ダヤン（Ｗａｌｌａｃｈ−Ｄａｙａｎ）等は、自発的に腫瘍を形成しないＬＢ−ＴＲマウス・リンパ腫をＣＤ４４ｖ４−ｖ１０によってトランスフェクションすることで腫瘍を形成する能力を与えられたことを示した。ＩＭ−７．８．１投与は、イソ型対照抗体と比較して、移植したトランスフェクト細胞の腫瘍サイズを減少させた。これらの研究のいずれもこの抗体の関するヒト有用性を示さなかった。
マウスＩｇＧ２ａであるＧＫＷ．Ａ３は、ヒトＣＤ４４に対して特異的であり、ＳＣＩＤマウス内のヒト黒色腫異種移植片の形成および転移を妨げる。抗体を転移性ヒト培養細胞株ＳＭＭＵ−２と混合して皮下注射した。処置を３週間続けた。４週間後、未処置の動物では１００％であったのに対して、１０匹のマウスのうちわずか１匹だけが注射部位に腫瘍を発現した。抗体のＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、腫瘍形成の同一阻害を示したことから、作用機序が補体または抗体依存型の細胞障害性に依存しないことが示唆された。第１回目の抗体注射の１週間前に腫瘍細胞を注射した場合、８０％の動物がその最初の部位で腫瘍を発現した。しかし、注目すべきことは、生存期間がそれでも著しく増加したことである。抗体遅延投与は原発腫瘍形成に無効であったにもかかわらず、肺、腎臓、副腎、肝臓、および腹膜への転移を完全に阻止した。この抗体は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養細胞株に対して何ら直接的な細胞障害性を持たず、またＳＭＭＵ−２細胞の増殖に干渉もしなかったことから、転移または増殖に悪影響を与えることで腫瘍形成に対するその主要な効果を持つように見える。この抗体の注目すべき特徴の一つは、ＣＤ４４のイソ型全てを認識することであり、このことは治療上の使用に対する可能性に限界があることを示唆している。

ストロベル（Ｓｔｒｏｂｅｌ）他は、抗ＣＤ−４４抗体（クローン５１５）を使用してマウス異種移植モデルでのヒト悪性腫瘍細胞の腹膜移植を阻害することを記載した。ヒト卵巣培養細胞株３６Ｍ２を、抗ＣＤ４４抗体または対照抗体の存在下、マウスに対して腹腔内（ｉ．ｐ．）移植し、それに続く２０日間にわたって処置を投与した。５週間後、抗体処置群の腹腔内の小結節が著しく少なかった。抗ＣＤ４４処置群および対照処置群の両方から得た小結節が同一の大きさであったことから、細胞がひとたび移植されると、抗体は腫瘍の成長に対しては何ら効果を示さないことが示唆される。細胞を皮下移植した場合、腫瘍成長にもなんら影響がなかったことから、抗体そのものは抗増殖性または細胞毒性効果を持たないことが示された。また、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での細胞増殖に対しても抗体の効力はみられなかった。
ＢＩＷＡ１と表されるＶＦＦ−１８もまた、ＣＤ４４のｖ６変異体に対する高親和性抗体であり、そのポリペプチドの３６０〜３７０領域に特異的である。この抗体は、患者１２人の第１相臨床実験で^９９ｍテクネチウム標識複合体として用いられた。抗体を、頭頸部の扁平上皮癌の患者で安全性および標的可能性について試験した。注射後４０時間で、注射投与量の１４％が腫瘍に取り込まれ、腎臓、脾臓、および骨髄での蓄積は最小であった。腫瘍結合選択性が高いことは、この抗体の非常に高い親和性が腫瘍のより深い層への浸透を防ぐにもかかわらず、放射免疫治療でのこの抗体の役割を示唆している。ＢＩＷＡ１の適用をさらに限定しているものは、マウス抗体の免疫原性（患者１２人のうち１１人がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を発現した）、腫瘍全体にわたる不均一な蓄積、および抗体可溶性ＣＤ４４複合体の形成である。ＷＯ０２／０９４８７９は、ＨＡＭＡ反応を克服するように設計されたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と称される）を開示している。ＢＩＷＡ４は、親ＶＦＦ１８抗体よりも抗原結合親和性が著しく低いことがわかった。驚くべきことに、低親和性ＢＩＷＡ４抗体は、高親和性ＢＩＷＡ８ヒト化ＶＦＦ−１８抗体よりも優れた腫瘍取り込み特性を有した。^９９ｍテクネチウム標識および^１８６レニウム標識ＢＩＷＡ４抗体を患者３３人の第１相臨床試験で評価することで、^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の場合の安全性、耐用性、腫瘍蓄積、および最大耐量を決定した。^９９ｍＴｃ標識ＢＩＷＡ４の腫瘍関連取り込みであると思われる。^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の全ての用量で、数は安定した疾患であったにもかかわらず、何ら腫瘍反応がみられなかった。用量規定毒性が６０ｍＣｉ／ｍ^２で生じた。深刻な有害事像（血小板減少症、白血球減少症、および発熱）を呈すると思われる患者３３人のうちの１２人による有害実像の率が５０〜６５％であり、またそれらのうちの６人（全員が^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４で処理）が疾患進行によって処置または追跡調査の過程で死亡した。患者２人がヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）を発現した。^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の用量を段階的に増大させる第１相試験を患者２０人で実施した。経口粘膜炎と用量規定血小板減少症および白血球細胞減少症とが観察され、１人の患者がＨＡＨＡ反応を発現した。安定した疾患は、最高用量６０ｍＣｉ／ｍ^２で処置された５人の患者で認められた。達成された効能についての安全性および耐溶性の両方で許容可能であると考えられるにもかかわらず、これらの研究は、臨床研究での他の非放射性同位元素複合生物学的療法と比較して高率の有害事像を持つ。米国特許出願第２００３／０１０３９８５号は、腫瘍治療で使用されるＢＩＷＩ１と称されるメイタンシドと複合化したＶＦＦ−１８のヒト化バージョンを開示する。ヒト化ＶＦＦ１８抗体（ＢＩＷＡ４）は、毒素と複合化する場合（すなわちＢＩＷＩ１）、ヒト表皮状外陰癌（咽頭または乳癌の扁平上皮癌）のマウス・モデルで顕著な抗腫瘍効果を持つことがわかった。非複合化バージョン（ＢＩＷＡ４）は、抗腫瘍効果を示さず、また複合化バージョン（ＢＩＷＩ１）はヒトでの安全性または有効性についての証拠を何ら示さなかった。

ＭａｂＵ３６は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂヒト下咽頭癌細胞免疫化ならびに癌および組織特異性の選択によって産生するマウスＩｇＧ１抗体である。ｃＤＮＡクローニングおよび配列分析を介した抗原の特徴付けは、ＭａｂＵ３６の標的としてケラチノサイト特異的ＣＤ４４スプライス変異体エピカンのｖ６ドメインを同定した。免疫組織化学研究は、細胞膜に限定されるエピトープを示す。さらにまた、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の９４％がＭａｂＵ３６によって強く標識され、これらの腫瘍の範囲内で細胞が均一に染色された。患者１０人での^９９ｍＴｃ標識ＭａｂＵ３６研究は、ＨＮＳＣＣ癌の選択的蓄積を示した（２日で２０．４＋／−１２．４％注入量／ｋｇ）。副作用は報告されなかったけれども、患者二人にＨＡＭＡが発現した。放射性ヨウ素化マウスＭａｂＵ３６での研究では、患者１８人中３人がＨＡＭＡの症状を呈し、ＨＮＳＣＣでの選択的同種取り込みがみられた。ＭａｂＵ３６の抗原性を減少させ、かつＨＡＭＡの率を低下させるために、キメラ抗体を作製した。キメラまたは本来のマウスＭａｂＵ３６はいずれもＡＤＣＣ活性を持たない。ＭａｂＵ３６の野生型機能活性の証拠はない。治療薬としてのＭａｂＵ４６の有用性を^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６を用いて判断した。この用量を段階的に増大させる第１相試験では、患者１３人がスカウティング用量（ｓｃｏｕｔｉｎｇ ｄｏｓｅ）の^９９ｍＴｃ標識キメラＭａｂＵ３６を受けた後に^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６を受けた。急性有害事象は報告されなかったが、患者３人のうち２人に、処置用量規制骨髄毒性（１．５ＧＢｑ／ｍ^２）後に急性有害事象がみられ、最大耐量（１．０ＧＢｑ／ｍ^２）で処置された１人の患者に血小板減少症が観察された。腫瘍サイズに対しては何らかの効果がみられたが、処置に対する目的反応に関する判定基準は満たさなかった。顆粒球コロニー刺激因子を用いる戦略を使用した^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６のさらなる研究は、全血再注入を刺激して、最大許容活性を２．８Ｇｙまで倍加させた。頭頸部の種々の腫瘍を有する９人の患者に対するこの研究では、３人が薬物関連貧血症のため輸血を必要とした。他の毒性として、グレード３の骨髄毒性とグレード２の粘膜炎とが挙げられる。安定した疾患が患者５人で３〜５ヶ月で達成されたにもかかわらず、目的腫瘍反応は何ら報告されなかった。したがって、ＭａｂＵ３６が高特異的抗体であるにもかかわらず、達成された臨床効果に関連した治療に伴う毒性のため、抗癌効果を達成するために放射性免疫複合体が必要であるという欠点がその有用性を制限する。
要約すると、ＣＤ４４ｖ６（１．１ＡＳＭＬ）およびＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）モノクローン抗体によって転移性膵臓腺癌を注射されたラットまたは悪性黒色腫を注射されたマウスでの転移活性がそれぞれ減少することが示された。別の抗ＣＤ４４ｖ６抗体（ＶＦＦ−１８およびその誘導体）は、メイタンシノイドまたは放射性同位元素と複合体を形成した場合のみに、抗腫瘍効果を持つことが示された。抗標準ＣＤ４４モノクローン抗体もまた、ラット・グリア芽細胞種（抗ＣＤ４４）による脳内進行、マウスＴ細胞リンパ腫（ＩＭ−７．８．１）によるリンパ節浸潤を抑制するほかに、ヌード・マウスのヒト卵巣癌培養細胞株（クローン５１５）の移植、マウス悪性腫瘍培養細胞株（ＩＭ−７．８．１）の肺転移、およびＳＣＩＤマウスでのヒト悪性腫瘍培養細胞株（ＧＫＷ．Ａ３）の転移を阻害することが示された。放射性同位元素は、ＭａｂＵ３６抗ＣＤ４４ｖ６抗体およびその誘導体と複合体を形成し、著しい毒性を伴う臨床試験で抗腫瘍活性を有した。これらの結果は、潜在的な癌治療として抗ＣＤ４４モノクローン抗体の開発を奨励し、かつ支持するものであるにもかかわらず、効果、安全性、またはヒト癌への適用性についての限界を示している。
したがって、もし癌細胞の細胞障害性を媒介する抗体組成物が単離された場合、その細胞上のＣＤ４４の細胞表面発現とのその親和性の機能として、有益な診断的および治療的手順が実現するであろう。

先行特許：
米国特許第５，７５０，１０２号は、患者由来の細胞または組織からクローニングすることが可能であるＭＨＣ遺伝子をその患者の腫瘍細胞にトランスフェクションする方法を開示している。次に、これらのトランスフェクト細胞を用いて患者に対するワクチン接種をおこなった。
米国特許第４，８６１，５８１号は、哺乳類の腫瘍細胞および正常細胞の、細胞外ではなく細胞内の構成要素に対して、特異的なモノクローン抗体を得るステップと、治療を受けた哺乳類組織に標識抗体を接触させて腫瘍細胞を殺すステップと、変性している腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する標識抗体の結合を測定することによって、治療の有効性を決定するステップとを有する方法を開示している。ヒト細胞内抗体に対する抗体を調製する際に、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の簡便な供給源を表すことを認識する。
米国特許第５，１７１，６６５号は、新規抗体とそれを生産するための方法とを提供する。具体的には、この特許はヒト腫瘍（例えば大腸および肺の腫瘍）に関連したタンパク質抗原に強く結合する一方で、正常細胞に対する結合がかなり小さい性質を持つモノクローン抗体の形成を示唆している。
米国特許第５，４８４，５９６号は、癌治療の方法を提供するもので、この方法は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に取り除くこと、腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を得ること、この腫瘍細胞に放射線照射して生存可能ではあるが非発癌性にすること、ならびに該細胞を用いて原発腫瘍の再発を阻害する一方で同時に転移を阻害することができる患者のためのワクチンを調製することを含む。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応するモノクローン抗体の開発を教示する。第４段落４５行（以下参照）に示されるように、特許権者はヒト腫瘍形成で活発な特異的免疫療法を発現するモノクローン抗体の開発に自発腫瘍細胞を利用している。
米国特許第５，６９３，７６３号は、ヒト癌に特有であり、起源である上皮組織に依存しない糖蛋白抗原を教示している。
米国特許第５，７８３，１８６号は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ培養細胞株、この抗体を用いて癌を処置する方法、およびこの抗体を含む医薬組成物に関する。
米国特許第５，８４９，８７６号は、腫瘍および非腫瘍組織源から精製されたムチン抗原に対するモノクローン抗体生産のための新規ハイブリドーマ培養細胞株を記載している。
米国特許第５，８６９，２６８号は、所望の抗原に対して特異的な抗体を産生するヒト・リンパ球を生産する方法、モノクローン抗体を産生する方法、さらにまたこの方法によって生産されるモノクローン抗体に関する。この特許は、より具体的には、癌の診断および処置に有用な抗ＨＤヒト・モノクローン抗体の生産に関する。
米国特許第５，８６９，０４５号は、ヒト癌細胞と反応する抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、および単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体が作用する機能は、それらの分子がヒト癌の表面に存在する細胞膜抗原と反応するという点で、さらに該抗体が、結合に続いて、癌細胞内に内在化することができるという点で、２倍であることから、これらの抗体が抗体薬物および抗体毒素複合体形成に特に有用となる。それらの非修飾型では、これらの抗体もまた特定の濃度で細胞毒性を示す。
米国特許第５，７８０，０３３号は、腫瘍治療および予防のための抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、高齢の哺乳類から得た抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見いだされる自然抗体の一種であると考えられる。自己抗体が「高齢の哺乳類」から生ずることから、処置されている患者から自己抗体が実際に生ずる必要はない。また、この特許は老いた哺乳類に由来する天然かつモノクローンの抗核自己抗体と、モノクローン抗核自己抗体を産生するハイブリドーマとを開示する。
米国特許第５，９１６，５６１号は、ＣＤ４４遺伝子の変異エクソンｖ６に対する特異的抗体ＶＦＦ−１８およびその変異体を開示している。この抗体は、ラットＣＤ４４ｖ６変異体よりもヒトＣＤ４４ｖ６変異体を認識する点で、比較抗体を凌ぐ改善である。また、この抗体はＣＤ４４ｖ６発現の診断用検査の方法を開示する。この抗体に関しては、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）機能はみられなかった。
米国特許第５，６１６，４６８号は、ＣＤ４４遺伝子のヒト・エクソン６Ａによってコードされた配列を含む合成ペプチドに対して産生されたモノクローン抗体Ｖａｒ３．１を開示している。具体的には、この抗体は９０ｋＤ型のヒトＣＤ４４には結合しないことから、Ｈｅｒｍｅｓ−３抗体と区別される。ＣＤ４４のｖ６変異体を検出する方法が提供されるとともに、この抗原に基づいた悪性形質転換をスクリーニングして検査する方法もまた、提供する。また、血清中に含まれる抗原の検出に基づいた炎症疾患のスクリーニング法も、提供する。
米国特許第５，８７９，８９８号は、４３アミノ酸ペプチドを産生するヒトＣＤ４４変異体６の１２９ｂｐエクソンに結合する特異的抗体を開示している。このモノクローン抗体は、いくつかのハイブリドーマ培養細胞株ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６で産生される。抗体は、新規ＣＤ４４ｖ６アミノ酸配列の少なくともヘキサペプチドを含む融合タンパク質から生ずる。さらに、癌診断用として用いることができるエクソン６変異体の検出のための免疫検査の方法が開示されている。注目に値すべきことは、この開示された抗体の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）機能が存在しないことである。
米国特許第５，９４２，４１７号は、ＣＤ４４様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドおよびその変異体を用いて組換え体タンパク質を製造する方法とを開示する。抗体は、これらのポリペプチドに対してクレームされるが、具体的な例がなく、また具体的もなく、そのような抗体を分泌する寄託クローンも存在しない。ノーザン・ブロットは、いくつかの種類の組織でポリヌクレオチドの外観を示すが、このポリペプチドの翻訳および発現があるという付随的な証拠は存在しない。したがって、このポリペプチドの遺伝子産物に対して作られる抗体があること、それらの抗体が生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）機能のいずれかを持つと思われるということ、ならびにそれらがヒト眼疾患に関連するかどうかについての証拠はない。
米国特許第５，８８５，５７５号は、ＣＤ４４の変異エピトープと反応する抗体と、この抗体を用いることで変異体を同定する方法とを開示している。この変異体は、コードする単離ポリヌクレオチドをラット細胞から単離されたものであり、この変異体に対する抗体ｍＡｂ１．１ＡＳＭＬは分子量１２０ｋＤ、１５０ｋＤ、１８０ｋＤ、および２００ｋＤのタンパク質を認識する。モノクローン抗体１．１ＡＳＭＬの投与は、同種同系のラットでラットＢｓｐ７３ＡＳＭＬの成長および転移を遅らせた。注目に値すべきことは、１．１ＡＳＭＬは、ＬＣＬＣ９７ヒト大細胞型肺癌に対する活性の欠如によって示されるように、ヒト腫瘍を認識しない。ヒト相同体は、ＬＣＬ９７から単離されたが、この相同体を認識する等価抗体は産生されなかった。したがって、ラットＣＤ４４の変異体に特異的な抗体が産生され、かつラット腫瘍の成長および転移に影響を及ぼすことが示されたにもかかわらず、ヒト腫瘍に対するこの抗体の効果についての証拠はない。より具体的には、発明者はこの抗体がヒト癌を認識しないと指摘している。
米国特許第５，７５０，１０２号 米国特許第４，８６１，５８１号 米国特許第５，１７１，６６５号 米国特許第５，４８４，５９６号 米国特許第５，６９３，７６３号 米国特許第５，７８３，１８６号 米国特許第５，８４９，８７６号 米国特許第５，８６９，２６８号 米国特許第５，８６９，０４５号 米国特許第５，７８０，０３３号 米国特許第５，９１６，５６１号 米国特許第５，６１６，４６８号 米国特許第５，８７９，８９８号 米国特許第５，９４２，４１７号 米国特許第５，８８５，５７５号

本発明者らは、以前に、癌疾患の処置に有用であるカスタマイズ化された抗癌抗体を個々に選択する方法に関する「個々の患者に特異的な抗癌抗体」と題した米国特許第６，１８０，３５７号の交付を受けた。この書類の目的のために、用語「抗体」および「モノクローン抗体」（ｍＡｂ）を同義的に用い、ハイブリドーマ（例えばマウスもしくはヒト）および免疫複合体によって産生される免疫グロブリン、必要に応じて免疫グロブリンのフラグメント、ならびに免疫グロブリン由来の組換えタンパク質、例えばキメラおよびヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖抗体、組換え免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）、融合タンパク質等のことをいう。いくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能に対して有意に作用することなくポリペプチド内で変化し得ることは、当該技術分野で十分認識されている。抗体の分子再配置では、主鎖領域の核酸もしくはアミノ酸配列での修飾が通常、許容的であり得る。これらは、限定されるものではないが、置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加が挙げられる。さらに、標準的な化学療法（例えば、放射性核種）を本発明のＣＤＭＡＢとともに活用することで、上記化学療法の使用に重点を置く。ＣＤＭＡＢもまた、毒素、細胞毒部分、酵素（例えばビオチン複合酵素）、または造血細胞と複合体を形成することができる。
この出願は、癌疾患修飾モノクローン抗体をコードするハイブリドーマ培養細胞株を単離するために、’３５７特許で教示されたように患者特異的抗癌抗体を生産するための方法を、実質的に利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍に対して特異的に作られるので、癌治療のカスタマイズが可能になる。この出願の文脈の中で、細胞致死（細胞毒性）または細胞成長阻害（細胞静止）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、「細胞毒性」という。これらの抗体を、癌の病期分類および診断の補助に用いることができ、腫瘍転移と同様に原発腫瘍の処置に用いることができる。
個別的な抗癌処置が期待されることで、患者を管理する方法にも変化がもたらされる。考えられる臨床シナリオは、診察時に腫瘍試料を得て、それを保存（バンク）することである。この試料を用いて、既存の癌疾患修飾抗体のパネルによる癌のタイプ分けができる。患者は、従来通りに病期分類されるが、利用可能な抗体を用いて患者をさらに病期分類することができる。患者を既存の抗体で直ちに処置することができる。さらに／あるいは、腫瘍に対して特異的な抗体のパネルを、本明細書中に概説される方法を用いて、またはファージ提示ライブラリを本明細書に開示したスクリーニング方法と組み合わせて用いることで、生産することができる。生ずるすべての抗体を抗原抗体のライブラリに加える。なぜなら、他の腫瘍は処置しているエピトープと同じエピトープのいくつかを持ち得るからである。この方法により生産さされる抗体は、該抗体に結合する癌を有する任意の数の患者での癌疾患処置に有用であると考えられる。

米国特許第６，１８０，３５７号の方法を実質的に用いると、マウス・モノクローン抗体Ｈ４６０−１６−２が、患者の肺腫瘍生検によって得られた細胞によるマウスの免疫化後に得られた。Ｈ４６０−１６−２抗原が、異なる組織に由来する広範囲のヒト培養細胞株の細胞表面上で発現した。乳癌培養細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）および皮膚癌細胞Ａ２０５８は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＨ４６０−１６−２の細胞毒性効果の影響を受けやすい。
培養中のＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１６−２の細胞毒性の結果は、該細胞がマウスに移植された場合、Ｈ４６０−１６−２の抗腫瘍活性が癌細胞に向けられることで、さらに拡大された（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に概説されたように）。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療効力の有効な予測手段と考えられる。
ヒト乳癌予防生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）モデルでは、Ｈ４６０−１６−２処置は、アイソタイプ対照抗体と比較して処置期間中の腫瘍成長抑制が有意に効果的（ｐ＜０．０００１）であった。このアイソタイプ対照抗体は、Ｈ４６０−１６−２と構造およびサイズが同一であるが、ＭＢ−２３１細胞と結合することができない。処置相の終了後、Ｈ４６０−１６−２を与えられたマウスの腫瘍は、対照群のわずか１．３パーセントまでしか成長しなかった。後処置追跡調査期間中、Ｈ４６０−１６−２の処置効果が持続し、処置群での平均腫瘍容積が、測定相の終わりまで対照群よりも有意に小さいままであった。抗体効力の測定として生残性を用い、後処理７０日目でＨ４６０−１６−２処置群での致死リスクが抗体緩衝液対照群の約７１パーセントであると推定された（ｐ＝０．０２８）。これらのデータは、対照処置群と比較して、Ｈ４０−１６−２によって延命効果が与えられることを証明した。体重減少および臨床苦痛等の毒性の兆候をなんら誘導しなかったことから、Ｈ４６０−１６−２処置は安全に見えた。したがって、Ｈ４６０−２処置は、ヒト乳癌の安定したモデルで対照処置群と比較して腫瘍成長を遅延させて生存を高めることから、有効であった。

さらに、Ｈ４６０−１６−２は、確立された生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデル（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に概説されるように）でＭＢ−２３１細胞に対する抗腫瘍活性を示した。Ｈ４６０−１６−２による処置を標準の化学療法薬であるシスプラチンと比較したところ、シスプラチンとＨ４６０−１６−２処置群とが、抗体希釈緩衝液またはアイソタイプ対照降誕のいずれかによって処置された群と比較して、腫瘍容積が有意に小さいこと（ｐ＜０．００１）が示された。Ｈ４６０−１６−２処置が腫瘍抑制を媒介した。この腫瘍抑制はシスプラチン化学療法による腫瘍抑制の約２／３であったが、有意な（１９．２％）体重減少は見られず（ｐ＜０．００３）、また臨床苦痛（例えば、シスプラチン処置で観察された２件の処置関連死を含む）が見られなかった。Ｈ４６０−１６−２の抗腫瘍活性およびその最小毒性から、Ｈ４６０−１６−２が魅力的な抗癌治療薬となる。
後処置期間では、Ｈ４６０−１６−２は有意な延命効果（ｐ＜０．０２）を示した。Ｈ４６０−１６−２群での致死リスクが、処置後７０日未満ではアイソタイプ対照抗体群での致死リスクの約半分であった。観察された延命効果は、後処理１２０日以上にわたって続き、アイソタイプ対照およびシスプラチン処置マウスの１００パーセントが死亡したのに対して、Ｈ４６０−１６−２処置群では６７パーセントであった。Ｈ４６０−１６−２は、アイソタイプ対照抗体群と比較して、腫瘍成長を２６パーセントまで遅らせることで腫瘍抑制を維持した。後処理３１日目で、Ｈ４６０−１６−２は、アイソタイプ対照群と比較して４８パーセントまで腫瘍成長を減少させることで（処置の終わりに観察された４９パーセント減少と同等）、腫瘍サイズを制限した。乳癌の定着腫瘍モデルでは、これらの結果は、処置相を超えて腫瘍抑制を保ち、かつ全身腫瘍組織量を減らして、哺乳類での生存を高める抗体の能力を示すＨ４６０−１６−２の可能性を示している。
薬物標的としてＨ４６０−１６−２を検証するために、正常ヒト組織でのＨ４６０−１６−２の発現は以前測定されている（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。この研究は、抗ＣＤ４４抗体（クローンＬ１７８）との比較によって拡大された。Ｈ４６０−１６−２によるＩＨＣ染色によって、肝臓、腎臓（管状上皮細胞の縁染色を除く）、心臓、および肺という不可欠な器官の細胞を含む大部分の組織は、再びＨ４６０−１６−２抗原を発現させることに失敗した。組織染色から得られた結果は、Ｈ４６０−１６−２の種々の細胞型に対する結合が制限されていることを示したが、浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に対する結合を有した。Ｌ１７８抗体は、類似の染色パターンを示した。しかし、重要ないくつかの違いがあった。すなわち、Ｈ４６０−１６−２に比べてリンパ球の染色がより強く、またＬ１７８による幅広い分布を呈することである。また、肝臓試料の１つでは、Ｌ１７８がクッパー細胞を染色し、その一方でＨ４６０−１６−２による染色はみとめられなかった。乳癌患者におけるＨ４６０−１６−２抗原の局在化およびその広がりは、患者に対するＨ４６０−１６−２免疫療法の有益性の評価および効果的臨床試験の設計で重要である。癌患者の乳房腫瘍でのＨ４６０−１６−２抗原発現に対処するために、個々の乳癌患者５０人から得た腫瘍試料をＨ４４６０−１６−２抗原の発現について事前にスクリーニングした（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。本研究は、Ｌ１７８に対してＨ４６０−１６−２の染色を比較した。本研究の結果は、以前の結果と類似しており、組織試料の６２パーセントがＨ４６０−１６−２抗原に関して陽性に染色され、乳房腫瘍組織の７６パーセントがＬ１７８エピトープに関して陽性に染色されることが示された。患者試料内でのＨ４６０−１６−２の発現は、染色が悪性細胞に限定されていたことから、癌細胞に対して特異的であるように見えた。対照的に、Ｈ４６０−１６−２は乳癌患者由来の正常組織の１０試料のうち４つの試料を染色し、一方Ｌ１７８は６つを染色した。Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８抗原の両方での乳房腫瘍発現は、主に悪性細胞の細胞膜に局在化するように見え、ＣＤ４４を治療のための魅力的な標的にする。Ｈ４６０−１６−２発現は、さらに乳房腫瘍の発生、処置、および予後に重要な役割を果たすホルモン・エストロゲンおよびプロゲステロンの受容体の乳房腫瘍発現に基づいて評価した。Ｈ４６０−１６−２抗原の発現とエストロゲンまたはプロゲステロンのいずれかに対する受容体の発現との間に、相互関係が存在しないことが明らかであった。腫瘍の病期分類または癌が進行する度合いに基づいて腫瘍を分析した場合も、Ｈ４６０−１６−２抗原と腫瘍病期分類との間に明らかな相関はなかった。同様の結果は、Ｌ１７８で得られた。

Ｈ４６０−１６−２の潜在的な治療上の利点をさらに広げるために、種々のヒト癌組織での抗原の頻度および局在化もまた、以前に測定されている（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。本研究は、Ｈ４６０−１６−２の染色をクローンＬ１７８と比較した。これらの腫瘍型の大部分もまた、Ｌ１７８抗原が陽性でもあった。ヒト乳房腫瘍組織と同様に、Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８局在化は、腫瘍細胞膜上でも生じた。しかし、Ｈ４６０−１６−２抗体と比較して、Ｌ１７８による実質的により多くの膜局在化があった。また、Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８の両方で染色された腫瘍型の組織の４３％が、Ｌ１７８抗体による染色がより強いことが示された。これらは、文献からのＩＨＣデータとの比較に基づいて、本明細書中に示されたＩＨＣデータと正確に一致するＣＤ４４の形態がないように見えた。ＣＤ４４の標準的形態は、通常、ヒト脳で発現され、Ｈ４６０−１６−２抗原は発現されない。汎ＣＤ４４イソフォームに対する抗体は、肝臓（クッパー細胞を含む）を染色せず、生殖周期のすべての相で子宮内膜腺を陽性染色する。Ｈ４６０−１６−２抗原は明らかにクッパー細胞上に存在し、生殖周期の分泌子宮内膜腺上のみに存在する。Ｈ４６０−１６−２抗原は、明らかに組織マクロファージ上に存在し、また変異体形態Ｖ４／５およびＶ８／９は副次的なマクロファージ染色を示す。抗ＣＤ４４Ｌ１７８と比較してＨ４６０−１６−２で見られる類似はしているが異なった結合パターンは、Ｈ４６０−１６−２抗原がＣＤ４４の固有のエピトープであることを示している。
本明細書中に概説されるように、追加の生化学的データもまた、Ｈ４６０−１６−２によって認識される抗原がＣＤ４４の形態の１つであることを示している。このことは、ＣＤ４４と反応するモノクローン抗体（Ｌ１７８）が、免疫沈降によってＨ４６０−１６−２に結合したタンパク質を同定することを示す研究によって、支持される。ウエスタン・ブロッティングによる研究もまた、Ｈ４６０−１６−２によって認識されたＣＤ４４のエピトープがｖ６またはｖ１０に存在しないことを示唆している。Ｈ４６０−１６−２エピトープもまた、炭水化物および立体配座依存性によって特徴づけられる一方で、多くの抗ＣＤ４４抗体がＣＤ４４のペプチド部分に向けられる。これらのＩＨＣおよび生化学的結果は、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４抗原の変異体と結合することを示す。したがって、証拠の優位性は、Ｈ４６０−１６−２が、ＣＤ４４変異体上に存在する固有の炭水化物依存型立体配座エピトープのライゲーションを介して抗癌効果を媒介する。
全体として、このデータは、Ｈ４６０−１６−２抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現され、さらに病理学的関連性のある癌標的であることを示している。さらに、このデータはヒト癌組織に対するＨ４６０−１６−２の結合を示し、診断、治療の予測、あるいは予後の検査法に適切に使用することができる。また、この抗原の細胞膜局在化は、ほとんどの非悪性腫瘍での抗原の発現を欠いているため細胞の癌病期分類を示すことができ、この観察によって、診断、治療の予測、または予後の検査法に使用されるこの抗原、その遺伝子または誘導体、およびそのタンパク質または変異体の使用を可能にする。

抗ＣＤ４４抗体の使用を伴う他の研究は、Ｈ４６０−１６−２によって示されない治療可能性の限界を有する。Ｈ４６０−１６−２は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗腫瘍活性を示す。既に説明した抗体、例えばＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６は、それらおよびＶＦＦ−１８に起因する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）細胞毒性を有するものではなく、またＶＦＦ−１８およびＭａｂＵ３６も内因性の腫瘍細胞毒性を示さなかった。さらに加えて、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍効果を持つ他の抗ＣＤ４４抗体もまた、Ｈ４６０−１６−２で明白でない特定の限界がある。例えば、ＡＳＭＬ１．１、Ｋ９２６、抗ＣＤ４４、およびＩＭ−７８．１は、ラット、マウス、異種移植モデルでのラットおよびマウス腫瘍成長に対する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗腫瘍活性をそれぞれ示す。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト癌モデルでの抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２もまた、ヒトＣＤ４４に向けられたものであり、一方ＡＳＭＬ１．１等の抗体はラットＣＤ４４のみを認識する。クローン５１５抗ＣＤ４４抗体は、ヒト卵巣培養細胞株の腹膜腫瘍移植を阻害するが、腫瘍成長を抑制または阻害しない。Ｈ４６０−１６−２は、ＳＣＩＤマウス異種移植モデルでのヒト乳房腫瘍成長を抑制することが可能である。ＧＫＷ．Ａ３は、抗ヒトＣＤ４４モノクローン抗体であり、予防的ではあるが確立されたものではないモデルで、マウスでのヒト転移性黒色腫の腫瘍成長を阻害することが可能である。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト乳癌の予防的および確立されたマウス異種移植モデルでの顕著な抗腫瘍活性を示した。その結果、Ｈ４６０−１６−２が既に記述された抗ＣＤ４４抗体と比較して優れた抗腫瘍特性を有することはまったく明瞭である。ＳＣＩＤマウスでのヒト乳房腫瘍に対する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗腫瘍活性の両方を示し、ヒトＣＤ４４に向けられる。ヒト乳癌の予防的および確立（より臨床的に関連）モデルでも活性を示す。

全体として、本発明はＨ４６０−１６−２抗原を治療薬の標的として使用することを教示しており、投与された場合、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減少させることができ、また処置された哺乳類の生存期間の延長に至ることもできる。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−１６−２）およびその誘導体を使用し、それの抗原を標的化し、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減少させ、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の生存を伸ばすことを教示している。さらに、この発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の診断、治療の予測、および予後に有用であり得る、癌細胞でのＨ４６０−１６−２抗原の検出方法を用いることを教示している。
もし患者が治療または転移発現の最初の過程に対して、患者が無反応である場合、その腫瘍に対する特異的抗体を生成するプロセスを繰り返して、再処置をおこなうことができる。さらに、その患者から得た赤血球細胞と抗癌抗体との複合体を作り、転移の処置のためそれを再注入することができる。転移癌および転移に対しては効果的な処置が殆どなく、大抵の場合、死に至る哀れな結果の兆しになる。しかし、転移によって血管新生がかなり生じるので、赤血球による抗癌抗体の送達によってその腫瘍部位に抗体を集中させる効果を奏することができる。
転移前であっても、大部分の癌細胞の生存は、宿主の血液供給に依存していることから、同様に、赤血球に結合させた抗癌抗体は元位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）の腫瘍に対して有効であるにちがいない。あるいは、そのような抗体と、他の造血細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、およびナチュラルキラー細胞とを結合させることも可能である。

一般に抗体には５つの種類があり、各々がそのＨ鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞致死によって、抗体依存型細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）のいずれかを通して媒介されると、一般に考えられている。例えば、ＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系Ｃ−１成分の結合によってヒト補体を活性化し得ることから、腫瘍溶解に至ることができる補体活性化の古典経路を活性化させることができる。ヒト抗体については、最も効果的な補体活性化抗体は、概ねＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、細胞毒性細胞を補充する場合に効果的であり、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞致死に至るＦｃ受容体を持つ。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣを媒介する。
抗体媒介癌致死の別の可能性のある機構は、抗体の使用を介するものと考えられ、それは細胞膜およびその関連糖蛋白または糖脂質（所謂触媒抗体）内の種々の化学結合の加水分解を触媒するために機能する。
より広く受け入れられている抗体媒介癌細胞致死の付加的機構が２つある。最初の１つは、癌細胞に存在する仮想抗原に対して免疫応答を生ずるように身体を誘導するため、ワクチンとして抗体を使用することである。第２は、標的成長受容体に対して抗体を用いることで、それらの機能と干渉するか、その機能が効果的に喪失されるようにして、上記受容体を下方制御することである。

したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ培養細胞株および該ハイブリドーマ培養細胞株がコードされる対応する単離モノクローン抗体およびその結合フラグメントを単離するため、癌細胞に関して細胞毒性があり、一方で同時に非癌細胞に対して非毒性である疾病患修飾抗体を、特定の個人に由来する細胞から産生することである。
本発明の別の目的は、ＡＴＣＣにＰＴＡ−４６２１として寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ４４の抗原性部分を発現する細胞の存在を決定するためにＡＴＣＣにＰＴＡ−４６２１として寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントを利用する方法を教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＡＴＣＣにＰＴＡ−４６２１として寄託されたクローンによってコードされ、ＣＤ４４の抗原性部分に対して抗体特異的に結合する単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を介して、癌患者を持つ患者の生存を高める方法を教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＣＤＭＡＢおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＡＤＣＣを介して細胞毒性が媒介されるＣＤＭＡＢを産生することである。
本発明のさらなる目的は、ＣＤＣを介して細胞毒性が媒介されるＣＤＭＡＢを産生することである。
本発明のさらなる目的は、細胞毒性が細胞化学結合の加水分解を触媒する能力の関数であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングにおける結合検査法において有用なＣＤＭＡＢを生産することである。
この発明の他の目的および利点は、図および実施例、この発明の特定の実施形態によって述べられる以下の記述から明らかになる。

（図面の簡単な説明）
図１は、Ｈ４６０−１６−２によって精査したＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜のウエスタン・ブロットである。レーン１：還元条件下で分離した膜タンパク質。
レーン２：非還元条件下で分離した膜タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。
図２は、Ｈ４６０−１６−２によって精査した膜のウエスタン・ブロット。レーン１：ＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜。レーン２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜。 分子量マーカーを左側に示す。
図３は、ＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜タンパク質の２次元ウエスタン・ブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ。パネルＡは、Ｈ４６０−１６−２で認識された２つのタンパク質の位置を示す。パネルＢは、アイソタイプ対照抗体を用いて精査した同様のブロットを示す。パネルＣは、ＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜のシプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ）染色ゲルを示す。矢印は、パネルＡに対応するタンパク質スポットの位置を示す。
図４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質の２次元ウエスタン・ブロット。主結合タンパク質を矢印で示す。
図５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜へのＨ４６０−１６−２の結合に対する脱グリコシル化の効果。パネルＡは、ウエスタン・ブロットでのＨ４６０−１６−２と、未処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞膜（レーン２）、３７℃、２４時間でグリコシダーゼ処理した膜（本文参照）（レーン３）、および２５℃、２４時間でグリコシダーゼ処理した膜（レーン４）との結合を示す。レーン１は、分子量マーカーの位置を示す。パネルＢは、同様のブロットへの高マンノース結合レクチンＧＮＡの結合を示す。
図６は、Ｈ４６０−１６−２で免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウエスタン・ブロット（パネルＢ）。レーン１：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質。レーン２：Ｈ４６０−１６−２免疫沈降タンパク質。矢印は、８０〜９０ｋＤのＨ４６０−１６−２結合タンパク質を示す。
図７は、Ｈ４６０−１６−２（パネルＡ）、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８、パネルＢ）、および抗ＨＳＰ９０（パネルＣ）を用いて精査したタンパク質のウエスタン・ブロット。レーン１：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質。レーン２：Ｈ４６０−１６−２免疫沈降タンパク質。レーン３：分子量標準。
図８は、Ｈ４６０−１６−２（パネルＡ、レーン２）を用いて精査したタンパク質のウエスタン・ブロット、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８、パネルＢ、レーン２）、抗ＣＤ４４ｖａｒ６（クローンＶＦＦ−７、パネルＣ、レーン２）、および抗ＣＤ４４ｖａｒ１０（クローンＶＦＦ−１４、パネルＤ、レーン２）。各ブロットのレーン１は、分子量標準を含む。
図９は、ＦＡＣＳによるＨ４６０−１６−２結合の典型的なヒストグラム。Ｈ４６０−１６−２（２０μｇ／ｍＬ）、１０７．３アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、および抗ＥＧＦＲ（５μｇ／ｍＬ）結合のヒストグラムを、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）ならびに正常（Ｈｓ５７８ＢｓｔおよびＣＣＤ−２７ｓｋ）培養細胞株について示した。
図１０は、正常ヒト・アレイから得た扁桃腺組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。リンパ小節（矢印）のマントルゾーンにより限定された染色であり、かつ弱く染まった芽中心（矢印）を残すＡＲ４６０−１６−２と比べて、Ｌ１７８によるリンパ球の染色が強くかつ幅広く分布している。倍率は２００倍である。
図１１は、正常ヒト組織アレイから得た肝臓組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８による肝類洞クッパー細胞染色（矢印）が示されるが、Ｈ４６０−１６−２によるものはない。倍率は２００倍である。
図１２は、乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）に対するＨ４６０−１６−２の典型的な顕微鏡写真。
パネルに示す矢印は、間質細胞および悪性細胞シートを示している。倍率は１００倍である。
図１３は、ヒト乳癌組織アレイから得られたベージェット病乳房組織に対するＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８によって悪性細胞（矢印）が膜染色されているのに対して、Ｈ４６０−１６−２による染色はネガティブである。倍率は２００倍である。
図１４は、ヒト多重腫瘍組織アレイから得た子宮頸部扁平上皮癌組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８よりもＨ４６０−１６−２のほうが強く悪性腫瘍を膜染色している。倍率は２００倍である。
図１５は、ヒト多重腫瘍組織アレイから得た腺癌肺組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８による悪性細胞（矢印）のスコアは＋＋＋であり、Ｈ４６０−１６−２によるスコアは±である。倍率は２００倍である。

（実施例１）

ウエスタン・ブロットによる結合タンパク質の同定
抗体Ｈ４６０−１６−２によって認識される抗原を同定するために、この抗原を発現する細胞膜をゲル電気泳動にかけ、さらに膜へ移した。ウエスタン・ブロットは、この抗体によって検出されるタンパク質を決定するために用いた。
１．膜調製
先行研究は、乳癌培養細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）に対するＨ４６０−１６−２のＦＡＣＳによる結合を示した。したがって、これら２種類の培養細胞株から得た膜試料を用いて抗原の同定をおこなった。全細胞膜は、ＭＢ−２３１またはＭＢ−４６８乳癌細胞の密集培養から調製した。培地をフラスコから取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。最終洗浄後、解離緩衝液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ、グランドアイランド、ＮＹ）、３７℃、５分間によって細胞を解離させた。細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心した。遠心後、細胞ペレットを、１ｍＬの低張緩衝液（１０μｇ／ｍＬロイペプチン、１０μｇ／ｍＬアプロトニン、および２５μｇ／ｍＬ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドを含有）に再懸濁した。次に、急速凍結および解凍を５回繰り返して細胞の溶解をおこなった。細胞溶解物を９，５００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心し、核粒子を取り除いた。上清を回収し、続いて７５，０００ｘｇで４℃、５７分間遠心した。管から上清を注意深く取り除き、ペレットを０．５ないし１ｍＬの高張溶解緩衝液（１パーセントのトリトンＸ１００を含有）に再懸濁した。次に、タンパク質含有量について膜を検査の方法し、−８０℃で保存した。
２．１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
膜タンパク質の分離を、１次元ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動でおこなった。２０μｇの膜タンパク質を１２パーセントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン上に載せた。前染色分子量マーカー（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）、ミシサーガ、ＯＮ）を参照レーンに加えた。ジチオスレイトル（ＤＴＴ）の非存在下、非還元条件下で電気泳動することで、試料の分離をおこなった。電気泳動は、１００Ｖで１０分間、続いて１５０Ｖで６５分間おこなった。４０Ｖで１６時間にわたりエレクトロブロッティングをおこなうことで、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ビルリカ、ＭＡ）膜に移した。ゲルからその膜への前染色マーカーの完全移動を示すことで、定量的な移動を評価した。
移動後、５パーセント・スキムミルク粉末含有トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水（０．５パーセントのツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）含む）（ＴＢＳＴ）で２時間にわたり、膜のブロッキングをおこなった。次に膜を、３パーセント・スキムミルク粉末含有ＴＢＳＴに希釈した２〜２．５μｇ／ｍＬのＨ４６０−１６−２で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ジャクソン・イムノロジカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）（ウエスト・グローブ、ＰＡ）から入手した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後にＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてＨＲＰ基質ＴＭＢ（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリントン、ＯＮから入手した基質キット）によるインキュベーションをおこなった。

図１は、記載どおりのウエスタン・ブロットの結果を示す。Ｈ４６０−１６−２は明らかに、ＭＢ−４６８膜タンパク質の２分子量（ＭＷ）領域に結合する（レーン２）。分子量標準と比較することで、抗体がＭＷ８０〜９０ｋＤおよびＭＷ１２０〜１５０ｋＤのタンパク質に結合する。抗体Ｈ４６０−１６−２によって認識されたエピトープは、立体配座エピトープであると考えられる。なぜなら、この抗体は、ＤＴＴ存在下、還元条件下でゲルから移されたスポットに結合することができなかったからである（レーン１）。図２は、Ｈ４６０−１６−２とＭＢ−４６８（レーン１）およびＭＢ−２３１（レーン２）細胞由来の膜との結合を比較する。ＭＢ−４６８膜では、Ｈ４６８−１６−２が８０〜９０ｋＤおよび１２０〜１５０ｋＤ両方のタンパク質と等しい強度で結合する。ＭＢ−２３１膜では、主結合タンパク質は８０〜９０ｋＤタンパク質であり、１２０〜１５０ｋＤの範囲内で同定された結合タンパク質の強度が劣る。
３．２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
結合実体の分解能をより良くし、かつさらに詳しくタンパク質を特徴づけるために、２次元電気泳動を実施した。上記のとおりに調製した全膜タンパク質（７０〜２００μｇ）を、プラスワン２−Ｄクリーンアップ・キット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）：ベー・ド・ウルフェ、ＱＣ）を用いて沈降させた後、ｐＨ範囲が３〜１０の両性電解質含有再水和緩衝液で再懸濁させた。試料を遠心して粒状物質を取り除き、続いて再水和溶液ＩＰＧストライプ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）：ベー・ド・ウルフェ、ＱＣ）上に載せた。以下のプロトコル、すなわちすなわち再水和１６時間；５００Ｖ、２５０Ｖ時間、１，０００Ｖ、５０Ｖ時間；５，０００Ｖ、７，５００Ｖ時間を用いて、タンパク質のフォーカシングをおこなった。次に、ストライプをストライプ・ホルダーから取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡緩衝液でインキュベートした。１５分後、ストライプを８パーセント・ゲル上に置き、アガロース溶液で密封した。前染色ＭＷマーカーをストライプの脇に載せた。電気泳動を１００Ｖで１０分間、続いて１５０Ｖで６５分間おこなった。複数のゲルのうちの１枚を１０パーセント・メタノール／７パーセント酢酸で３０分間にわたり固定した後、蛍光染料シプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ）（登録商標）（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージン、ＯＲ）で染色した。タンパク質スポットは、ＵＶ光下で可視化した。第２および第３のゲルについては、４０Ｖで１６時間にわたりエレクトロブロッティングをおこなうことで、それらのゲルからタンパク質をＰＶＤＦ（ミリポア）膜に移した。定量的移動の評価は、ゲルから膜への前染色マーカーの完全移動を測定することでおこなった。
移動後、５パーセント・スキムミルク粉末含有トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水（０．５パーセントのツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）含む）（ＴＢＳＴ）で２時間にわたり、膜のブロッキングをおこなった。次に、膜の１つを３パーセント・スキムミルク粉末含有ＴＢＳＴに希釈した２〜２．５μｇ／ｍＬのＨ４６０−１６−２で２時間にわたりインキュベートした。同様の膜を同様の濃度のアイソタイプ対照（マウス抗トリニトロフェノール、ＩｇＧ１、κ；クローン１０７．３（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ））でインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ジャクソン・イムノロジカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）（ウエスト・グローブ、ＰＡ）から入手した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後にＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてＨＲＰ基質ＴＭＢ（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリントン、ＯＮから入手した基質キット）によるインキュベーションをおこなった。

図３ａは、Ｈ４６０−１６−２でインキュベートしたＭＢ−４６８膜から得たウエスタン・ブロットを示す。２つの異なる結合スポットが観察され、１次元電気泳動で得られたものと分子量が一致する。１つは、ＭＷ標準に基づいた分子量が約８０〜９０ｋＤであり、ｐＩ３〜４と推定されるゲルの酸性部分に観察された。第２のスポットは、ＭＷ標準に基づいた分子量約１２０〜１５０ｋＤにあり、８０〜９０ｋＤタンパク質よりも塩基性側のｐＩを有している。図３ｂは、アイソタイプ対照抗体とインキュベートした膜から得たウエスタン・ブロットを示す。このブロットでは何らスポットが見えなかったことから、Ｈ４６０−１６−２の結合が非特異的結合ではなかったことを示している。図３ｃは、ＭＢ−４６８膜タンパク質のシプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ）（登録商標）染色２Ｄゲルを示す。注目すべきことは、同様のウエスタン・ブロットをＭＢ−２３１膜で流した場合、８０〜９０ｋＤスポットのみが観察されることである（図４）。

（実施例２）
Ｈ４６０−１６−２によって結合した抗体のグリコシル化の決定
抗体Ｈ４６０−１６−２によって認識された抗原が糖タンパク質であるかどうかを決定するために、製造元のプロトコル（デグリコプロ（ＤｅｇｌｙｃｏＰｒｏ）脱グリコシル化キット；プロザイム（Ｐｒｏｚｙｍｅ）、サンリアンドロ、ＣＡ）に従って、室温または３７℃で２４時間にわたり、ＭＢ−２３１膜をＰＮＧアーゼＦ、エンド−Ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼＡとインキュベートした。記載どおりに１−Ｄポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって膜を分離した後、記載どおりにウエスタン・ブロットをＨ４６０−１６−２で実施した。
ウエスタン・ブロットの結果を図５に示す。グリコシダーゼ処理していないＭＢ−４６８膜では、Ｈ４６０−１６−２は予測８５〜９５ｋＤバンドを認識した（図５、パネルＡ、レーン２）。２５℃でグリコシダーゼ処理された膜では、このバンドが明確に低分子側に移動している（レーン４）。３７℃でグリコシダーゼ処理された膜では、Ｈ４６０−１６−２の結合が取り除かれている（レーン３）。脱グリコシル化の完全性を決定するために、同様のブロットを、高マンノース結合ガランサス・ニバリス（ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）凝集素（ＧＮＡ）を用いて精査した。図５で観察された結果では、パネルＢは、２５℃（レーン４）では脱グリコシル化が不完全であり、また３７℃（レーン３）では本質的に完了していることを示す。したがって、完全脱グリコシル化の条件下で、Ｈ４６０−１６−２はそれの抗原に結合することは不可能である。
これらを合わせると、これらの結果は８０〜９０ｋＤバンドが糖タンパク質であることを示唆している。また、これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２によって認識されたエピトープが炭水化物依存型である証拠を示している。

（実施例３）
Ｈ４６０−１６−２によって結合した抗原の同定
１．免疫沈降
１ｍＬのプロテインＧダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ダイナル（ＤＹＮＡＬ））を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、洗浄済みのビーズに対して２，５００μｇのＨ４６０−１６−２を加えて、全量を５００μｌにした。この混合物を１時間にわたってやさしく混ぜ合わせながらインキュベートした。未結合抗体を除去し、Ｈ４６０−１６−２被覆ビーズを、０．１パーセントのツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む２．５ｍＬ容量の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。Ｈ４６０−１６−２被覆ビーズを５ｍＬの０．２Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．２）で２回洗浄した後、５ｍＬを加えた。２０ｍＭジメチルピメリミデートを含む５ｍＬの０．２Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．２）の存在下、３０分間にわたりやさしく混ぜ合わせることで、Ｈ４６０−１６−２をビーズに化学的に架橋させた。反応停止は、５ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を添加することによっておこなった。１５分間インキュベートした後、Ｈ４６０−１６−２架橋ビーズを０．１パーセントのツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。Ｈ４６０−１６−２架橋ビーズを０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３）で３分間インキュベートして前溶離させた後、０．１パーセント・ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
ＭＢ−２３１細胞から得た３ｍｇの全膜タンパク質を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（０．１パーセント・ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、５パーセント・グルコース、５パーセント・マンノース、５パーセント・ガラクトース、およびプロテアーゼ阻害剤）中で、Ｈ４６０−１６−２化学的架橋ビーズとともに、４℃で４時間にわたりインキュベートした。インキュべーション後、免疫沈降物を、１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１パーセント・ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。Ｈ４６０−１６−２架橋ビーズを０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３）で４分間インキュベートすることで、ビーズからタンパク質を溶離させた。溶離タンパク質を−８０℃で保存した。３ｍｇのタンパク質からの免疫沈降タンパク質を８パーセント非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの１つのレーンに載せた。前染色分子量マーカー（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）、ミシサーガ、ＯＮ）の試料を参照レーンに加えた。試料を、１００Ｖで１０分間、続いて１５０Ｖで６０分間にわたり電気泳動をおこなうことで分離した。タンパク質を、シプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ）（登録商標）で染色した。
平行のウエスタン・ブロットでは、記載どおりにＭＢ−２３１膜タンパク質１００μｇから免疫沈降させたタンパク質を電気泳動で分離した。４０Ｖで１６時間にわたり電気泳動をおこなうことで、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ（ミリポア、ビルリカ、ＭＡ）膜に移した。定量的移動の評価は、ゲルから膜への前染色マーカーの完全移動を測定することでおこなった。
移動後、５パーセント・スキムミルク粉末含有トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水（０．５パーセントのツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）含む）（ＴＢＳＴ）で２時間にわたり、膜のブロッキングをおこなった。次に、３パーセント・スキムミルク粉末含有ＴＢＳＴに希釈した５μｇ／ｍＬのＨ４６０−１６−２を用いて、膜を調べた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜を、適当な二次抗体、すなわちジャクソン・イムノロジカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）（ウエスト・グローブ、ＰＡ）から入手した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）で、１時間インキュベートした。このインキュベーションの後にＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてＨＲＰ基質ＴＭＢ（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリントン、ＯＮから入手した基質キット）によるインキュベーションをおこなった。
図６は、Ｈ４６０−１６−２によって免疫沈降したタンパク質から得たゲルおよびブロットを示す。ゲル（パネルＡ）上では、免疫沈降タンパク質を含むレーンに８０〜９０ｋＤ領域のバンドがある（レーン２、矢印参照）。高分子量のバンドは、無傷の抗体から構成される。この試料にはほかのタンパク質は存在しない。対応するウエスタン・ブロット（パネルＢ）では、Ｈ４６０−１６−２は免疫沈降タンパク質（レーン２）と強く反応し、全膜（レーン１）でみられたものと類似の結合プロフィールを伴う。

２．質量分析
Ｈ４６０−１６−２によって免疫沈降した８０〜９０ｋＤタンパク質に対応するゲルの領域（図６、パネルＡ、レーン２）を、滅菌したピペットのチップを用いて切り出した。次に、質量分析によるタンパク質の同定に、このゲル・プラグを用いた。
この試料を、トリプシン（プロゲスト（ＰｒｏＧｅｓｔ））を用いたロボット式のイン・ゲル消化にかけて、結果として生じた消化上清の一部をＭＡＬＤＩ／ＭＳ分析に用いた。スポッティングは、ジップチップ（ＺｉｐＴｉｐｓ）を用いて無人操作（ＰｒｏＭＳ）でおこなった。すなわち、６０パーセント・アセトニトリル、０．２パーセントＴＦＡに調製したマトリックス（α−シアノ４−ヒドロキシ桂皮酸）でＣ１８物質からペプチドを溶離させた。この試料の分析を、２００ｎＬ／分の流速で７５μｍＣ１８カラムを用いてマイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）Ｑ−Ｔｏｆ２上でナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによっておこなった。マスコット（ＭＡＳＣＯＴ）のローカル・コピーを用いて、ＭＳ／ＭＳデータを調べた。
Ｈ４６０−１６−２免疫沈降物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって同定されたタンパク質を表１に示す。割り当てられたスコアは、一致したペプチドの数と同一性のレベルとに基づいた複合スコアである。

試料中に存在する唯一のタンパク質がヒトＣＤ４４、すなわちリンパ球および複数の種類の癌細胞の細胞表面上にある８０ｋＤ糖タンパク質と一致した。

３．確認
推定上の抗原の確認は、既知の抗ＣＤ４４モノクローン抗体がＨ４６０−１６−２によって免疫沈降したタンパク質と反応するかどうかを決定することで、おこなった。全ＭＢ−２３１膜タンパク質およびＨ４６０−１６−２免疫沈降タンパク質を１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動およびウエスタン・ブロットは、上記のとおりに実施した。膜を、３パーセント・スキムミルク粉末含有のＴＢＳＴで希釈した５〜１０μｇ／ｍＬのＨ４６０−１６−２、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）または抗ＨＳＰ９０（負の対照、クローン１６Ｆ１（ストレスゲン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）、ビクトリア、ＢＣ））と２時間にわたってインキュベートした。図７は、記載したとおりのウエスタン・ブロットの結果を示す。パネルＡは、Ｈ４６０−１６−２と全膜タンパク質（レーン１）および免疫沈降タンパク質（レーン２）との結合を示す。主結合タンパク質は、８０〜９０ｋＤ領域にあるが、１２０〜１５０ｋＤ領域にあるバンドもまた全膜タンパク質に見られる。Ｌ１７８を用いて平行ブロットの精査をおこなった場合（パネルＢ）、類似のパターンが見られた。Ｌ１７８は、Ｈ４６０−１６−２によって免疫沈降したタンパク質に強く結合した。全膜タンパク質に対するＨ４６０−１６−２およびＬ１７８の結合パターンはかなり類似している（パネルＡおよびＢ、レーン１）、負の対照抗ＨＳＰ９０によって精査した平行ブロット（パネルＣ）は、この抗体が免疫沈降物質には結合しなかったが、全膜試料内の異なる９０ｋＤタンパク質には結合したことを示した。この結果は、ＨＳＰ９０が偏在かつ「粘着性」細胞シャペロン・タンパク質であることから、免疫沈降タンパク質に対する抗ＣＤ４４の結合が特異的であり、汚染タンパク質の存在によるものではないこと確証する。

図８は、Ｈ４６０−１６−２の特異性を既知抗ＣＤ４４抗体のものと比較した実験の結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜を電気泳動で分離し、記載どおりにＰＶＤＦ膜に移した。膜をＨ４６０−１６−２（パネルＡ）、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、パネルＢ）、抗ＣＤ４４ｖａｒ６（クローンＶＦＦ−７、ベンデル・メドシステムズ（Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）（サンブルノ、ＣＡ）、パネルＣ）、および抗ＣＤ４４ｖａｒ１０（クローンＶＦＦ−１４、ベンデル・メドシステムズ（Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）、パネルＤ）を用いて精査した。Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８は、８０〜９０ｋＤおよび１２０〜１５０ｋＤタンパク質と反応し、ウエスタン・ブロットで同一の結合パターンを有する。対照的に、ＣＤ４４変異体６および１０に特異的な抗体は、Ｈ４６０−１６−２および互いと、異なる結合を示す。両方の変異抗体は、より幅広い範囲のタンパク質と結合し、ゲルの８０ｋＤ領域との強い結合は示さない。したがって、Ｈ４６０−１６−２が変異体６または変異体１０に向けられることはありそうもない。
質量分析による同定は、既知の抗体を用いた確認と同様に、Ｈ４６０−１６−２に対する抗原がＣＤ４４の一形態であることを示している。このことはまた、ＣＤ４４が重量あたり約５０パーセントのＮ結合糖を有すると思われることから、実施例２の脱グリコシル化実験と整合している。これらの実験もまた、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４の炭水化物依存型エピトープに結合することを示す。

（実施例４）
ブダペスト条約にもとづいて、米国２０１１０−２２０９バージニア州（ＶＡ）マナサス、大学通り１０８０１の米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に２００２年９月４日、寄託番号ＰＴＡ−４６２１としてハイブリドーマ培養細胞株Ｈ４６０−１６−２を寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８によれば、寄託者は、寄託材料の公共性に対する有効性に課せられたすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確証する。
抗体生産：
Ｈ４６０−１６−２モノクローン抗体は、回収および再播種を２回／週おこなうとともにプロテインＧセファロース４ファスト・フロー（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ベー・ド・ウルフェ、ＱＣ）による標準的抗体精製手順を用いて、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）でハイブリドーマを培養することで産生された産生された。ヒト、ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローン抗体を用いることは、この発明の範囲内である。Ｈ４６０−１６−２を、細胞毒性検査法で、いくつかの正の対照（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、カッパ、１０μｇ／ｍＬ、イー・バイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、カッパ、１０μｇ／ｍＬ、インテル・メディコ（Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃｏ）、マークハム、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５μｇ／ｍＬ、セダルレーン（Ｃｅｒｄａｒｌａｎｅ）、ホーンビー、ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００μＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、オークビル、ＯＮ）、ＮａＮ_３（０．１パーセント、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、オークビル、ＯＮ））、および負の対照（１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、カッパ、２０μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）、ＩｇＧ緩衝液（２パーセント））と比較した（表３）。乳癌（ＭＢ−２３１、ＭＢ−４６８）、黒色種（Ａ２０５８、Ａ３７５）、大腸癌（ＨＩＴ−２９）、肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ５４９）、卵巣腫瘍（ＯＶＣＡＲ−３）、前立腺癌 （ＰＣ−３）、および非癌（ＣＣＤ−２７ｓｋ、Ｈｓ５７８．Ｂｓｔ、Ｈｓ８８８．Ｌｕ）培養細胞株を試験した（すべてをＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡから入手）。生／死細胞毒性検査法は、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ユージーン、ＯＲ）から得た。この検査法は、以下に概説する変更を加えて製造元の指示にしたがっておこなった。検査法をおこなう前に、所定の適当な密度で細胞をプレーティングした。２日後、１００μＬの精製抗体を培地に希釈した後、細胞プレートに移して５パーセントＣＯ_２インキュベータ内で５日間にわたりインキュベートした。次に、プレートを逆さまにして空にし、拭き取って乾かした。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含む室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル小型容器から各ウエルに分注し、３回軽くたたき、逆さまにして空にした後、拭き取って乾かした。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含むＤＰＢＳで希釈した５０μＬの生／死用蛍光色素を各ウエルに添加し、５パーセントＣＯ_２インキュベーターで３７℃、３０分間にわたりインキュベートした。パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーを用いてプレートの読み取りをおこない、データをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で分析し、さらに結果を一覧にして表２に示した。データは、三重反復試験した４回の実験の平均値を表し、以下のようにして定量的に示した。すなわち、閾値細胞毒性よりも高い値が得られた実験が４／４の場合（＋＋＋）、閾値細胞毒性よりも高い値が得られた実験が３／４の場合（＋＋）、および閾値細胞毒性よりも高い値が得られた実験が２／４の場合（＋）とした。表２中の印の無い細胞は、一貫性の無い閾値細胞毒性よりも低い効果のものを表した。Ｈ４６０−１６−２抗体はＡ２０５８黒色腫細胞およびＭＢー２３１乳癌細胞で選択的細胞毒性を示したが残りの癌細胞に対しては細胞毒性を生じなかったことから、癌細胞に対する特異的な細胞毒性があることが示される。重要なことは、単離抗体がいくつかの非癌細胞、例えばＣＣＤ−２７ｓｋ、Ｈｓ５７８．Ｂｓｔ、またはＨｓ８８８．Ｌｕに対して細胞毒性を生じなかったことである。細胞毒性化学剤は、期待される細胞毒性を誘導する一方で、比較のために挙げられるいくつかの他の抗体もまた、生物学的細胞検査法の限界を前提とすれば、予想通りに機能した。

細胞の単層をＤＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まない）で最初に洗浄することで、ＦＡＣＳ用に細胞を調製した。次に、細胞解離緩衝液（インビトロゲン（ＩＮＶＩＴＲＯＥＮ）、バーリントン、ＯＮ）を用いて、３７℃で細胞培養プレートから細胞を遊離させた。遠心後、細胞を収集し、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、および２５パーセントのウシ胎仔血清を含むＤＰＢＳ（洗浄用メジウム）に４℃で再懸濁して係数し、適当な細胞密度になるように等分割し、遠心して細胞をペレットにし、３０分間、氷上で試験抗体（Ｈ４６０−１６−２）または対照抗体（アイソタイプ対照、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたは抗ＥＧＦＲ）２０μｇ／ｍＬの存在下、染色用メジウム（ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、および２パーセントのウシ胎仔血清を含むＤＰＢＳ）に４℃で再懸濁した。アレクサ・フルオール（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合二次抗体を添加する前に、細胞を洗浄用メジウムで１回洗浄した。次に、アレクサ・フルオール４８８複合抗体含有染色用メジウムを２０分間にわたり添加した。次に、細胞を最後の時間に洗浄し、１μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム含有染色用メジウムに再懸濁した。細胞のフローサイトメトリーによる獲得を、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウエア（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル、ＯＮ）を用いたＤＡＣスキャン上に試料を流すことで評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器で電圧および振幅利得を調製することで設定した。３つの蛍光チャンネル（ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３）に対する検出器を、細胞が約１〜５単位の蛍光強度中央値を持つ均一なピークを持つようにして、精製アイソタイプ対照抗体で染色した後にアレクサ・フルオール４８８複合二次抗体で染色した細胞を流すことで調整した。生細胞は、ＦＳＣゲーティングおよびヨウ化プロピジウム排除によって獲得した。各試料について、約１０，０００個の生細胞を分析のために獲得し、その結果を表３に示した。
表３は、アイソタイプ対照群を上回る平均蛍光強度の倍増を一覧にしてまとめたものであり、また定量的に５未満（−）、５ないし５０（＋）、５０ないし１００（＋＋）、１００超（＋＋＋）として示し、括弧内は染色された細胞の割合である。

Ｈ４６０−１６−２抗体の典型的なヒストグラムを図９用に編集し、いくつかの例での図示された双ピークを包含する結合特性を明示する。黒色種および乳癌細胞を含むいくつかの細胞型に対しては、アイソタイプ対照の１００倍を上回ってＨ４６０−１６−２が結合し、肺、大腸、前立腺、および卵巣腫瘍細胞に対しては５ないし１００倍上回って結合した。これらは、Ｈ４６０−１６−２抗体の非癌細胞への結合であったが、そのような結合による細胞毒性は生じなかった。このことは、結合がその同種抗原への抗体結合の結果を必ずしも予測するものではなく、非自明的な知見であったことを明示している。このことは、異なる細胞での抗体結合の状況が抗体結合よりはむしろ細胞毒性の決定因子であったことを示唆した。

（実施例５）
正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究は、ヒトでのＨ４６０−１６−２抗原分布を特徴づけるために、既におこなわれた（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。本研究は、Ｈ４６０−１６−２をＣＤ４４に対する抗体（Ｌ１７８）と比較する。なぜなら、Ｈ４６０−１６−２抗原は、生化学的方法で既に決定されたように、ＣＤ４４の標準型の癌変異体であるかもしれないからである。５９の正常ヒト組織に対する抗体の結合を、ヒト、正常器官組織アレイ（イムジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンジエゴ、ＣＡ）を用いて実施した。すべての一次抗体（Ｈ４６０−１６−２、Ｌ１７８抗ＣＤ４４（抗ＨＣＡＭ、ＢＤファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、オークビル、ＯＮとしても知られている）、およびマウスＩｇＧ_１負対照（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント、ＯＮ））を抗体希釈緩衝液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント、ＯＮ）で希釈し、濃度を５μｇ／ｍｌとした（以前の最適化ステップで最適濃度であると見いだされた）。負対照抗体は、製造元によってすべての哺乳類組織に対して負（ネガティブ）であることが示されている。ＩＨＣに関する手順は以下の通りである。
組織切片を１時間にわたって５８℃のオーブンで乾燥させることで、脱パラフィン化処理を行い、ガラスドーゼ（コプリン・ジャー）内でキシレンに各回４分ずつ５回浸した。一連のエタノール勾配（１００％〜７５％）で洗浄した後、切片を水中で再度水和させた。スライドをｐＨ６の１０ｍＭクエン酸緩衝液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント、オンタリオ）に浸し、次に各回５分に設定して高、中、および低電力で電子レンジにかけ、最終的に冷ＰＢＳに浸した。次に、スライドを３％過酸化水素溶液に６分間浸し、ＰＢＳで各回５分ずつ３回洗浄し、乾燥し、汎用ブロッキング溶液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント、オンタリオ）で室温、５分間にわたりインキュベートした。Ｈ４６０−１６−２、Ｌ１７８、またはアイソタイプ対照抗体（アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコース・オキシダーゼに対する抗体であり、グルコース・オキシダーゼは哺乳類組織に存在せず、また誘導もされない）を抗体希釈緩衝液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント、オンタリオ）で希釈してその作用濃度（各抗体について５μｇ／ｍＬ）にし、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで各回５分ずつ３回洗浄した。一次抗体の免疫活性は、室温で３０分間にわたり、供給（ダコ・エンビジョン・システム（Ｄａｃｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、トロント、オンタリオ）されたとおりにＨＲＰ複合二次抗体で検出／可視化した。このステップの後で、スライドをＰＢＳで各回５分ずつ３回洗浄し、ＤＡＢ（３，３‘−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント、オンタリオ）色原体基質溶液を添加することによって呈色反応を引き起こして室温での１０分間の免疫ペロキシダーゼ染色をおこなった。スライドを水道水で洗うことで、呈色反応を停止させた。マイヤーのヘマトキシリン（シグマ・ダイアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、オークビル、ＯＮ）で対比染色をおこなった後に、スライドをエタノール勾配（７５〜１００％）で脱水させ、キシレンできれいにした。マウンティング用のメジウム（ダコ・ファラマウント（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ）、トロント、オンタリオ）を用いることで、スライドカバースリップを載せた。スライドをアキソバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００（ツワイス・カナダ（Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ）、トロント、ＯＮ）を用いて顕微鏡観察し、デジタル画像を獲得し、ノーザン・エクリプス・イメージング・ソフトウェア（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ミシサーガ、ＯＮ）を用いて保存した。結果の読み取り、スコアリング、および解釈を病理学者がおこなった。

表４は、正常ヒト組織のアレイをＨ４６０−１６−２およびＬ１７８抗ＣＤ４４で染色した結果をまとめたものを示す。Ｈ４６０−１６−２による組織染色は、既に記載されたもの（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）と同様である。再び注目すべきことは、抗原が一般に重要臓器（例えば、肝臓、腎臓、心臓、および肺）の細胞には存在しないことである。Ｈ４６０−１６−２抗体は、マクロファージおよびリンパ球に結合し、それらの存在はそれらの切片状態にある器官のいくつかで観察される。しかし、Ｌ１７８抗ＣＤ４４抗体によるリンパ球のより高強度の染色および広範囲な分布が見られた（図１０）。
Ｈ４６０−１６−２に対して正（ポジティブ）である組織もまた、Ｌ１７８抗ＣＤ４４（場合によっては強度が高い）に対しても一般に正（ポジティブ）である。例えば肝臓（図１１）および食道の一試料でわずかな例外があるにもかかわらず、Ｈ４６０−１６−２に対して負（ネガティブ）である組織もまた、Ｌ１７８抗ＣＤ４４に対して一般に負（ネガティブ）である。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２が、Ｌ１７８抗ＣＤ４４抗体によって認識される組織のわずかに小さいサブセットに結合し、組織内では染色の強度もしばしば弱いことを示している。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２に対する抗原が正常組織で幅広く発現され、抗体が特異的に限られた数のヒト組織に結合することを示している。また、これらのＩＨＣ研究で使用したＬ１７８抗ＣＤ４４によって認識されたものよりもわずかに異なる変異体に対するものであるにもかかわらず、ＣＤ４４のエピトープに対して、Ｈ４６０−１６−２が向けられている点で、生化学的データを支持している。

（実施例６）
ヒト乳房腫瘍組織染色
以前のＩＨＣの比較研究は、ヒト乳癌とのＨ４６０−１６−２抗原の癌関連性、およびＨ４６０−１６−２抗体がヒト癌を認識しようとするかについてを決定するためにおこなわれた（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。ここで、Ｌ１７８抗ＣＤ４４染色と、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコース・オキシダーゼに対する抗体と、哺乳類組織には存在せず、また誘導もされない酵素（負の対照）とを比較した。５０人の乳癌患者から得られた乳癌組織アレイと乳癌患者の非腫瘍性乳房組織に由来する９つの試料とを用いた（イムジェネックス・コーポレーション（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、サンジエゴ、ＣＡ）。以下の情報は、各患者について提供された。すなわち、年齢、性別、対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）腫瘍病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）状態。実施例５のＩＨＣの手順に従った。すべての抗体は作用濃度５μｇ／ｍｌで使用した。

表５および６は、それぞれ乳癌組織アレイのＨ４６０−１６−２およびＬ１７８抗ＣＤ４４抗体染色をまとめたものである。全体的に、試験した５０人の患者の６２パーセントがＨ４６０−１６−２抗原に対して正（ポジティブ）であり、ＣＤ４４に対しては７６パーセントであった。Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８抗ＣＤ４４がともに同一の組織を染色した場合では、４３％の試料で、Ｈ４６０−１６−２に比べて高強度の染色がＬ１７８抗ＣＤ４４によって得られた。Ｈ４６０−１６−２およびＣＤ４４抗原の両方について、乳癌患者由来の１０個の正常乳房組織試料のうち４および６個のみがそれぞれ正（ポジティブ）であった。エステロゲン受容体状態とプロゲステロン受容体状態との間に明らかな相関があることは証明されなかった。また、より高い腫瘍病期でＨ４６０−１６−２およびＣＤ４４抗原の正の発現が高くなる傾向があるようには見えなかった。

Ｈ４６０−１６−２染色は、間質細胞が明らかに負（ネガティブ）であり、悪性細胞シートがかなり正（ポジティブ）である図１２に示されるように、正常細胞と比較して、癌細胞に対して特異的であった。Ｈ４６０−１６−２抗原で見られる細胞局在化パターンは、大部分の例で細胞膜に限定された。Ｌ１７８抗ＣＤ４４抗体は、より多くの乳癌試料を染色し、Ｈ４６０−１６−２と比べて細胞質局在よりも膜局在の度合いが高いことを示した（表７）。Ｌ１７８抗ＣＤ４４はまた、Ｈ４６０−１６−２の場合ではみられなかったが、ぺージェット病の悪性細胞を染色した（図１３）。Ｌ１７８抗ＣＤ４４は、Ｈ４６０−１６−２と同様に乳癌患者由来の正常細胞の同じ試料を染色した（Ｈ４６０−１６−２試料について部分的に脱落（スラフ）した１つをプラス）。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２に対する抗原がほぼ乳癌患者の３分の２で発現される可能性があることを示唆している。染色パターンは、患者試料で、その抗体が悪性細胞に対する高い特異性を持ち、またＨ４６０−１６−２抗原が細胞膜に局在化していることから、それが魅力的かつ製薬化可能な（ｄｒｕｇａｂｌｅ）標的となることを示している。Ｈ４６０−１６−２対Ｌ１７８抗ＣＤ４４抗体の、類似しているにもかかわらずより制限された染色は、Ｈ４６０−１６−２エピトープがよりいっそう制限されたＣＤ４４の変異体である可能性を、ここでも示している。

（実施例７）

ヒト腫瘍組織染色
Ｈ４６０−１６−２が乳癌のみならず他のヒト癌組織で発現するかどうかを決定するために、既にＨ４６０−１６−２が多重ヒト腫瘍組織アレイで使用された（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００、イムジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンジエゴ、ＣＡ）。それらの研究を進める際に、Ｈ４６０−１６−２の染色パターンをＬ１７８抗ＣＤ４４の染色パターンと比較した。各患者について、年齢、性別、器官、および診断に関する情報を得た。使用した染色手順は、実施例５で概説したものと同様にした。同じ負の対照抗体をヒト乳房腫瘍組織アレイで説明したように用いた。すべての抗体は、作用濃度５μｇ／ｍＬで使用した。

表８に概説されるように、既に記載されたもの（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）と整合する結果が得られたことに加え、乳房のほかに多数の様々なヒト癌がＨ４６０−１６−２によって染色された。乳癌で見られるように、Ｈ４６０−１６−２染色は膜上に局在化（図１４）し、いくつかの癌では、癌細胞の細胞質内にも局在化した。Ｌ１７８抗ＣＤ４４抗体は、細胞質に比べて膜でより高かく、さらにまたＨ４６０−１６−２で観察されたものよりもより高い強度で正（ポジティブ）に腫瘍組織を染色する割合が高かった（図１５）。

したがって、Ｈ４６０−１６−２抗原は乳癌の膜のみに単に見いだされるだけではなく、かなり多様な腫瘍型の膜上にも見いだされると考えられる。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２が乳癌の他に広範囲の腫瘍型で治療薬としての可能性があることを示している。また、Ｌ１７８抗ＣＤ４４と比較してＨ４６０−１６−２が類似はしていても異なった染色パターンを持つことは、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４変異体上に存在するエピトープを認識することを意味している。
証拠の優位性は、ＣＤ４４の変異体に存在する炭水化物依存型立体配座エピトープの結合を介して、Ｈ４６０−１６−２が抗癌効果を媒介することを示している。実施例３では、Ｈ４６０−１６−２抗体を用いて、ＭＢ−２３１細胞等の発現細胞から同種Ｌ１７８抗ＣＤ４４を免疫沈降させることができることが明らかにされた。さらに、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって示される技術を用いて、特異的に結合するＣＤ４４抗原分を発現する細胞および／または組織の検出にＨ４６０−１６−２抗体が使用可能であることを示すことができた。
したがって、免疫沈降Ｈ４６０−１６−２抗原は、そのようなＦＡＣＳ，細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣ検査の方法を用いて、そのような細胞または組織に対するＨ４６０−１６−２の結合を阻害し得ることを示すことができた。さらに、Ｈ４６０−１６−２抗体と同様に、他の抗ＣＤ４４抗体を用いて、他の形態のＣＤ４４抗原の免疫沈降および単離をおこなうことができ、さらにその抗原を使用して、同一種類の検査の方法を用いて抗原を発現する細胞または組織に対する抗体の結合を阻害することもできる。また、もしすべての形態のＣＤ４４（すなわち汎ＣＤ４４抗体）を認識する抗ＣＤ４４抗体がその同種抗原を単離するために使用されるならば、その抗原はまた、該抗原を発現する細胞または組織に対するＨ４６０−１６−２の結合を阻止することができるので、その抗原を発現する細胞および組織上のＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合も示される。あるいは、両方の抗体が含まれる競合結合検査の方法、ＥＬＩＳＡ、細胞ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはその他の検査の方法でＨ４６０−１６−２と汎ＣＤ４４抗体とを比較することもまた、その抗体を発現する細胞および組織上でのＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合を示すことができる。

この明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本発明が関係する当該技術分野の当業者のレベルを示している。すべての特許および刊行物は、あたかも個々の刊行物が具体的および個別的に参照によって組み込まれることを示されるのと同等の範囲で、本明細書中に援用される。
本発明の一定の形態が例証される一方で、それが本明細書に記載および示された部分の特定の形態または配置に限定されるものではないことが理解される。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更をおこなうことが可能であり、また本発明は明細書に示されたものや、記載されたものに限定されることを考慮しているものではないことが、容易に理解されよう。当業者は、ここに内在されるものと同様に、本発明が目的を実行することや、指摘した結果および利点を得たりするのに十分適していることを、容易に理解し得る。本明細書中に記載されているいっさいのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術が、現在のところ好ましい実施形態の典型的なものであり、例示を意図したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。当業者は、本発明の精神の中に包含され、かつ添付した特許請求の範囲に定義されるその中での変更および他の用途を思いつくであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求の範囲に記載したように本発明はそのような特定の実施形態に、過度に限定されるものではないことを理解すべきである。実際、当業者に容易である本発明を実行するための記載されたモードの種々の修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。

Ｈ４６０−１６−２によって精査したＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜のウエスタン・ブロットである。レーン１：還元条件下で分離した膜タンパク質。レーン２：非還元条件下で分離した膜タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。 Ｈ４６０−１６−２によって精査した膜のウエスタン・ブロット。レーン１：ＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜。レーン２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜。 分子量マーカーを左側に示す。 ＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜タンパク質の２次元ウエスタン・ブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ。パネルＡは、Ｈ４６０−１６−２で認識された２つのタンパク質の位置を示す。パネルＢは、アイソタイプ対照抗体を用いて精査した同様のブロットを示す。パネルＣは、ＭＡＤＡ−ＭＢ−４６８膜のシプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ）染色ゲルを示す。矢印は、パネルＡに対応するタンパク質スポットの位置を示す。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質の２次元ウエスタン・ブロット。主結合タンパク質を矢印で示す。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜へのＨ４６０−１６−２の結合に対する脱グリコシル化の効果。パネルＡは、ウエスタン・ブロットでのＨ４６０−１６−２と、未処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞膜（レーン２）、３７℃、２４時間でグリコシダーゼ処理した膜（本文参照）（レーン３）、および２５℃、２４時間でグリコシダーゼ処理した膜（レーン４）との結合を示す。レーン１は、分子量マーカーの位置を示す。パネルＢは、同様のブロットへの高マンノース結合レクチンＧＮＡの結合を示す。 Ｈ４６０−１６−２で免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウエスタン・ブロット（パネルＢ）。レーン１：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質。レーン２：Ｈ４６０−１６−２免疫沈降タンパク質。矢印は、８０〜９０ｋＤのＨ４６０−１６−２結合タンパク質を示す。 Ｈ４６０−１６−２（パネルＡ）、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８、パネルＢ）、および抗ＨＳＰ９０（パネルＣ）を用いて精査したタンパク質のウエスタン・ブロット。レーン１：全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質。レーン２：Ｈ４６０−１６−２免疫沈降タンパク質。レーン３：分子量標準。 Ｈ４６０−１６−２（パネルＡ、レーン２）を用いて精査したタンパク質のウエスタン・ブロット、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８、パネルＢ、レーン２）、抗ＣＤ４４ｖａｒ６（クローンＶＦＦ−７、パネルＣ、レーン２）、および抗ＣＤ４４ｖａｒ１０（クローンＶＦＦ−１４、パネルＤ、レーン２）。各ブロットのレーン１は、分子量標準を含む。 ＦＡＣＳによるＨ４６０−１６−２結合の典型的なヒストグラム。Ｈ４６０−１６−２（２０μｇ／ｍＬ）、１０７．３アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、および抗ＥＧＦＲ（５μｇ／ｍＬ）結合のヒストグラムを、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）ならびに正常（Ｈｓ５７８ＢｓｔおよびＣＣＤ−２７ｓｋ）培養細胞株について示した。 正常ヒト・アレイから得た扁桃腺組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。リンパ小節（矢印）のマントルゾーンにより限定された染色であり、かつ弱く染まった芽中心（矢印）を残すＡＲ４６０−１６−２と比べて、Ｌ１７８によるリンパ球の染色が強くかつ幅広く分布している。倍率は２００倍である。 正常ヒト組織アレイから得た肝臓組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）によって得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８による肝類洞クッパー細胞染色（矢印）が示されるが、Ｈ４６０−１６−２によるものはない。倍率は２００倍である。 乳癌腫瘍（浸潤性導管癌）に対するＨ４６０−１６−２の典型的な顕微鏡写真。パネルに示す矢印は、それぞれ間質細胞および悪性細胞シートを示している。倍率は１００倍である。 ヒト乳癌組織アレイから得られたベージェット病乳房組織に対するＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８によって悪性細胞（矢印）が膜染色されているのに対して、Ｈ４６０−１６−２による染色はネガティブである。倍率は２００倍である。 ヒト多重腫瘍組織アレイから得た子宮頸部扁平上皮癌組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８よりもＨ４６０−１６−２のほうが強く悪性腫瘍を膜染色している。倍率は２００倍である。 ヒト多重腫瘍組織アレイから得た腺癌肺組織切片でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（Ｌ１７８）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｌ１７８による悪性細胞（矢印）のスコアは＋＋＋であり、Ｈ４６０−１６−２によるスコアは±である。倍率は２００倍である。

Claims (4)

1. ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンにより産生される単離モノクローン抗体に特異的に結合するＣＤ４４の抗原性部分を発現する細胞の存在を決定するための結合検査の方法であって、
   細胞試料を提供するステップと、
   単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、
   前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記発現されたＣＤ４４の抗原性部分と結合する単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
   前記抗原性部分は、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンにより産生されるモノクローン抗体と結合するという性質を有し、
   前記単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させるステップと、ならびに
   前記単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を判定するステップと、
   を有し、
   それにより、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＣＤ４４の抗原性部分を発現する細胞の存在を判定する、
   ことを特徴とする方法。
2. 前記細胞試料が、大腸、卵巣、肺、および乳房組織からなる群から選択される組織で生ずる腫瘍から得られる、ことを特徴とする請求項１に記載の結合検査の方法。
3. ＣＤ４４の抗原性部分を発現する試料内の細胞を単離またはスクリーニングするための方法であって、
   前記抗原性部分は、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合し、かつＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンにより産生されるモノクローン抗体と結合するという特性を有し、
   細胞試料を提供するステップと、
   単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、
   前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記発現されたＣＤ４４の抗原性部分と結合する単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
   前記抗原性部分は、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンにより産生されるモノクローン抗体と結合するという性質を有し、
   前記単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させるステップと、ならびに
   前記単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞試料との結合を判定するステップと、
   を有し、
   それにより、単離ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンにより産生されるモノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＣＤ４４の抗原性部分を発現する前記細胞が、前記結合によって単離され、ならびに前記細胞試料での前記細胞の存在が確認される、
   ことを特徴とする方法。
4. 前記細胞試料が、大腸、卵巣、肺、および乳房組織からなる群から選択される組織に生ずる腫瘍から得られる、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。

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