DE60027768T2

DE60027768T2 - Behandlung von metastatischer krankheit

Info

Publication number: DE60027768T2
Application number: DE60027768T
Authority: DE
Inventors: Scott Michael Lafayette KINCH; Katherine E. Chapel Hill KILPATRICK; D. Nicole Silver Springs ZANTEK; W. Patrick San Francisco HEIN
Original assignee: Glaxo Group Ltd; University of North Carolina at Chapel Hill; Purdue Research Foundation; University of North Carolina System
Current assignee: Glaxo Group Ltd; University of North Carolina at Chapel Hill; Purdue Research Foundation; University of North Carolina System
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: WO2001012172A1; EP1242060B1; ATE324877T1; EP2289940A2; EP2289940A3; ES2261230T3; JP2003516930A; DK1242060T3; PT1242060E; WO2001012172B1; CA2380888A1; EP1242060A4; AU6784400A; DE60027768D1; JP2007306938A; EP1242060A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Tyrosinkinase aus epithelialen Zellen, die in metastatischen Tumorzellen überexprimiert ist, als Ziel für die Behandlung von metastatischer Krankheit. Ganz besonders betrifft diese Erfindung die Verwendung von Verbindungen, die mit der Tyrosinkinase aus den epithelialen Zellen interagieren oder deren Expression verändern.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
Krebs ist eine Krankheit mit aberranter Signaltransduktion. Die gefährlichsten Krebsformen sind maligne Zellen, die an entfernte Stellen in einem Körper metastasieren. Metastatische Zellen haben die Fähigkeit erworben, vom Primärtumor weg zu brechen, sich an entfernte Stellen zu begeben und entfernte und fremde Mikroumgebungen zu besiedeln. Die Metastase von Krebszellen erfordert die Fähigkeit der Zelle 1) sich von einem Primärtumor zu lösen, 2) zu migrieren und durch lokale Gewebe zu wandern, 3) sich an entfernte Stellen im Körper zu begeben (über Lymphe oder Blut), 4) eine fremde Stelle zu besiedeln und 5) in dieser fremden Umgebung zu wachsen und zu überleben. Alle diese Verhaltensweisen sind mit Zelladhäsionen verknüpft. Zelladhäsionen kontrollieren die physikalischen Interaktionen von Zellen mit ihrer Mikroumgebung. Zelladhäsionen initiieren auch Signale, die Wachstum, Tod und Differenzierung von Tumorzellen diktieren. Auf der zellulären Ebene haben metastatische Zellen Beschränkungen bezüglich Zellwachstum und Migration überwunden, die aus physischen Verbindungen und Signalen resultieren, die durch Zell-Zell-Kontakte übermittelt werden. Maligne Zellen weisen häufig vermehrte Interaktionen mit Proteinen der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) auf, die Verbindungen und Signale bereitstellen, die verschiedene Aspekte der Metastase fördern.
Die Spiegel der Tyrosinphosphorylierung in Proteinen regulieren ein Gleichgewicht zwischen Zell-Zell- und Zell-ECM-Adhäsion in epithelialen Zellen. Erhöhte Tyrosinkinaseaktivität schwächt Zell-Zell-Kontakte und fördert ECM-Adhäsionen. Es wird angenommen, dass eine Änderung der Spiegel der Tyrosinphosphorylierung wichtig ist für die invasive Eigenschaft von Tumorzellen. Die Tyrosinphosphorylierung wird kontrolliert durch Zellmembran-Tyrosinkinasen und es ist bekannt, dass in metastatischen Krebszellen eine vermehrte Expression von Tyrosinkinasen auftritt.
EphA2 ist eine 130-kDa-Rezeptortyrosinkinase, die auf adulten Epithelien exprimiert wird. Als Mitglied der Familie der Eph-Tyrosinkinasen, bekannt als Ephrine, ist EphA2 eine transmembrane Rezeptortyrosinkinase mit einem zellgebundenen Liganden. Es wurde gefunden, dass die EphA2-Expression in vielen metastatischen Zellen, einschließlich Lungen-, Brust-, Kolon- und Prostatatumoren, verändert ist. Außerdem ist die Verteilung und/oder Phosphorylierung von EphA2 in metastatischen Zellen verändert. Darüber hinaus zeigen Zellen, die transformiert wurden, um EphA2 zu überexprimieren, malignes Wachstum und die Stimulation von EphA2 ist ausreichend, um malignes Wachstum und die invasive Eigenschaft umzukehren. EphA2 ist ein starkes Onkoprotein. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verwendungen, wie hier beschrieben, die auf EphA2 zur Behandlung von metastatischen Krebserkrankungen zielen.
Ein Ansatz der Krebstherapie ist die Verabreichung von vorgebildeten Antikörpern gegen vorbestimmte Tumorantigene. Dieses Verfahren ist bekannt als passive Antikörperbehandlung. Ein Beispiel für eine passive Antikörperbehandlung ist die Verwendung von Herceptin^® zur Behandlung von Brustkrebs. Herceptin^® ist eine humanisierte Form eines murinen monoclonalen Antikörpers, spezifisch für die extrazelluläre Domäne von Her2/Neu. Die Basis für eine Behandlung mit Herceptin^® ist, dass in 25–30% der metastatischen Brustkrebserkrankungen die Her2/Neu-Rezeptortyrosinkinase überexprimiert wird. Herceptin^® wurde in klinischen Studien gut vertragen und zeigt sich als vielversprechend für die Erhaltung und Regression von metastatischem Brustkrebs.
Eine wirksame passive Immuntherapie zur Behandlung von Tumoren erfordert die Isolierung und Herstellung eines Antikörpers, der: 1) zielgerichtet ist auf ein Antigen, das in metastatischen Tumoren überexprimiert ist, 2) zielgerichtet ist auf ein extrazelluläres Epitop dieses Antigens, 3) mit keinem anderen Antigen in der Zirkulation eines Patienten kreuzreagiert und 4) tumorzerstörende oder tumorstatische Aktivität zeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft diese Erfindung die Auswahl und Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 sind. Die erfindungsgemäßen Verwendungen schließen die Herstellung, Auswahl und Verwendung von EphA2-spezifischen Antikörpern zur Krebstherapie ein.
Ein anderer Ansatz der Krebsbehandlung ist es, Agonisten zu verwenden, um Expression zu stimulieren. Zum Beispiel kann EphrinA1-F_c, die extrazelluläre Domäne von EphrinA1, verbunden mit einer schweren Immunglobulinkette (siehe Miao, H. et al: „EphA2 kinase associates with focal adhesion kinase and upon activation, inhibits integrin-mediated cell adhesion and migration", Nature Cell Biol (2000) 2: 62–69), verwendet werden, um den Phosphotyrosingehalt von EphA2 zu erhöhen. Folglich betrifft diese Erfindung in einer anderen Ausführungsform die Verwendung von Agonisten, um die Expression von EphA2 in metastatischen Zellen, wie hier beschreiben, zu verändern.
Folglich ist diese Erfindung auf die Verwendung von Agonisten gerichtet, um die Expression von EphA2, wie hier beschrieben, zu verändern. EphA2 kann durch Verwendung von artifiziellen oder hybriden Formen des Proteins, Proteinhibitoren, Antisense-Oligonucleotiden oder kleinen Molekülinhibitoren angesteuert werden. Während eine bevorzugte Ausführungsform auf die Verwendung von monoclonalen Antikörpern gerichtet ist, sind auf dem Fachgebiet auch polyclonale, artifizielle und hybride Antikörper bekannt. Es sollte verstanden werden, dass die Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Ansteuerungstechniken für EphA2 im erfindungsgemäßen Geltungsbereich liegen.
Ein erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung eines EphA2-Agonisten, ausgewählt aus (i) einer Verbindung, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 umfasst, und (ii) einem Antikörper, welcher spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 ist, mit mindestens einer biologischen Aktivität zum Reduzieren metastatischer Invasion oder von Proliferation eines Tumors, zum Reduzieren von Metastase von metastatischen Zellen, zum Verhindern von Proliferation von metastatischen Zellen, zum Erhöhen des Phosphotyrosin-Gehalts von EphA2 in metastatischen Zellen und/oder zum Reduzieren der invasiven Eigenschaft metastatischer Zellen im Vergleich zu unbehandelten metastatischen Zellen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines metastatischen Tumors oder Krebes bei einem Säuger einschließlich einer Population von Zellen, welche Tyrosinkinase EphA2 überexprimieren.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung eines EphA2-Agonisten, ausgewählt aus (i) einer Verbindung, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 umfasst, und (ii) einem Antikörper, welcher spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines metastatischen Tumors, umfassend eine Population von Zellen, welche EphA2 überexprimieren.
Noch ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung eines EphA2-Agonisten, ausgewählt aus (i) einer Verbindung, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 umfasst, und (ii) einem Antikörper, welcher spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten mit einem metastatischen oder potentiell metastatischen Krebs, umfassend eine Population von Zellen, welche EphA2 überexprimieren.
Entsprechend kann ein Patient mit einem metastatischen Tumor, der EphA2 überexprimiert, mit den Verwendungen, wie hier beschrieben, behandelt werden. Die Verwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutischen Menge einer Verbindung, die, wie hier beschrieben, an ein extrazelluläres Epitop von EphA2 bindet, an einen Patienten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung ein Antikörper.
Beschrieben wird auch ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern, welche die metastatische Tumorproliferation durch spezifische Bindung an ein extrazelluläres Epitop von EphA2 hemmen. Dieses Verfahren schließt das Injizieren Tyrosin-phosphorylierter Proteine in die Lymphknoten eines Säugers, Gewinnen der Lymphknoten, Fusionieren der Lymphknotenzellen mit Myelomzellen, um Hybridome zu bilden, und das Auswählen der Hybridome, welche EphA2-spezifische Antikörper produzieren, ein.
Zusätzliche erfindungsgemäße Eigenschaften werden durch Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen, welche das beste Verfahren zur Durchführung der Erfindung, wie es derzeit verstanden wird, beispielhaft veranschaulichen, für Fachleute offensichtlich werden.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 ist eine Übersicht über das RIMMS-Verfahren, mit dem die erfindungsgemäßen Antikörper hergestellt werden;
2A–C zeigen eine Serie von Western-Blots, welche die EphA2-Expression in menschlichen Zelllinien zeigen;
2A ist ein Western-Blot, welcher die EphA2-Expression in verschiedenen menschlichen Prostatakrebs-Zelllinien zeigt;
2B ist ähnlich wie 2A, außer dass die EphA2-Expression in einer menschlichen Prostataepithel-Zelllinie und die Expression in der Zelllinie nach Transformation durch onkogenes K-Ras oder Röntgenbestrahlung gezeigt ist;
2C ist ähnlich wie 2B, außer dass die EphA2-Expression in einer anderen menschlichen Prostataepithel-Zelllinie und die Expression in der Zelllinie nach Transformation durch onkogenes K-Ras oder Röntgenbestrahlung gezeigt ist;
3 ist ähnlich wie 2, außer dass die EphA2-Expression in Hunde-Prostatakrebszellen gezeigt ist und
4 zeigt die vorhergesagte Antikörperbindung, aufgetragen gegen die Zelldichte, in einem Screeningverfahren für Antikörper, welche spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
EphA2 wird in normalen und metastatischen Zellen unterschiedlich exprimiert. In normalen Brust- und Prostataepithelzellen ist EphA2 angereichert an Stellen der Zelladhäsion. Dagegen ist EphA2 in metastatischen Prostatazellen diffus verteilt und in metastatischen Brustkrebszellen wird EphA2 in die Membranfalten, umverteilt. Es ist auch bekannt, dass die EphA2-Expression in bösartigen Lungen- und Kolonerkrankungen verändert ist und es wird angenommen, dass eine veränderte EphA2-Expression in anderen Arten von Metastasen, besonders bei bösartigen epithelialen Erkrankungen, auftritt. Folglich können Techniken, die entwickelt wurden, um die EphA2-Expression zu verändern, genutzt werden, um metastatische Erkrankungen zu diagnostizieren und zu behandeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden Antikörper, die spezifisch für Tyrosin-phosphorylierte Proteine in Krebszellen sind, isoliert und verwendet, an Krebszellen bei der passiven Immuntherapie anzusteuern. Dieser Ansatz basiert auf der Tatsache, dass viele Tyrosinkinasen, z.B Her2/Neu, durch Onkogene exprimiert werden und daher in Krebszellen überexprimiert sind. Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Antikörpern gerichtet, die in der Lage sind, extrazelluläre Epitope der Tyrosinkinase EphA2 zu erkennen und spezifisch daran zu binden. Die Antikörper werden von ausgewählten Hybridomen hergestellt, die wiederum das Produkt der Fusion von Myelomzellen mit Lymphknotenzellen sind, die aus Tieren gewonnen wurden, die einem spezifischen Inokkulationsprotokoll unterzogen wurden, das entwickelt wurde, um erhöhte Sensitivität und Diversität der ansprechenden Hybridome zu erhalten.
Um diese Hybridome herzustellen, wurden Tyrosin-phosphorylierte Proteine aus Ras-transformierten menschlichen epithelialen Zellen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung vorhandener Phosphotyrosin-spezifischer Antikörper isoliert. Die Tyrosin-phosphorylierten Proteine werden dann als Immunogen zum Herstellen monoclonaler Antikörper gemäß dem in 1 dargestellten Verfahren verwendet. Niedrige Mengen Tyrosin-phosphorylierter Proteine werden über einen Zeitraum von 10 Tagen jeden zweiten Tag proximal von Lymphknoten eines Säugers injiziert (RIMMS-Strategie). B-Zellen von geschwollenen Lymphknoten werden dann isoliert und mit Bcl-2-überexprimierenden Myelomzellen fusioniert, um die Apoptose nach der Fusion zu minimieren. Dieses Verfahren führt zu erhöhter Diversität, Spezifität und Kosteneffizienz bei der Hybridomherstellung. Die Hybridome werden durchmustert, um die Hybridome zu identifizieren, welche Antikörper produzieren, die maligne von normalen Krebszellen unterscheiden.
Hybridome, die spezifische Antikörper gegen EphA2 produzierten, wurden ausgewählt. Die Verwendung der RIMMS-Technik resultierte in der Herstellung einer Vielzahl von Hybridomen, die monoclonale Antikörper produzierten, welche spezifisch EphA2 binden. Bis heute wurden mindestens 450 Hybridome identifiziert, welche Antikörper herstellen, die in der Lage sind, maligne von normalen Krebszellen zu unterscheiden. Von den ersten vier dieser Hybridome, die charakterisiert werden sollten, erkennen zwei unabhängige Epitope auf EphA2. Das erste, D7, stellt einen Antikörper her, der ein intrazelluläres Epitop erkennt. Das zweite, B2D6, stellt einen Antikörper her, der spezifisch an ein extrazelluläres Epitop von EphA2 bindet, eine Eigenschaft, die seine wirksame Verwendung zur Diagnose und Behandlung ausgewählter metastatischer Tumore ermöglicht.
Während sich die RIMMS-Strategie als wertvoll bei der Herstellung von EphA2-spezifischen Antikörpern erwiesen hat, sind auf dem Fachgebiet andere Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen ein spezifisches Antigen bekannt und diese Verfahren liegen innerhalb des erfindungsgemäßen Geltungsbereichs.
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, Antikörper zu verwenden, um die Anwesenheit oder die Überexpression eines spezifischen Proteins nachzuweisen. Weil EphA2 in metastatischen Zellen überexprimiert ist, könnten erfindungsgemäße EphA2-spezifische Antikörper verwendet werden, um diese Überexpression nachzuweisen und folglich um metastatische Erkrankungen nachzuweisen. Derartige Techniken schließen Western-Blot-Verfahren, Präzipitation, Agglutination und ELISA-Tests ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Diese Techniken sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Die Spezifität der erfindungsgemäßen EphA2-Antikörper für das extrazelluläre Epitop kann auch genutzt werden, um Veränderungen der EphA2-Lokalisation, welche mit Metastase assoziiert sind, nachzuweisen. In normalen Brust- und Prostataepithelzellen ist EphA2 innerhalb von Stellen der Zellädhäsion angereichert, während die EphA2 Verteilung in metastatischen Zellen verändert ist. In metastatischen Prostatazellen ist EphA2 diffus verteilt und in metastatischen Brustkrebszellen wird EphA2 in den Membranfalten („membrane ruffles") umverteilt. Es ist auch bekannt, dass die EphA2-Expression bei bösartigen Lungen- und Kolonerkrankungen verändert ist, und es wird angenommen, dass veränderte EphA2-Expression auch in anderen Arten von Metastasen vorkommt, besonders bei bösartigen epithelialen Erkrankungen. Techniken wie die immunhistologische Färbung oder die Immunfluoreszenzmikroskopie sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können verwendet werden, um die EphA2-Verteilung sichtbar zu machen. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5.514.554. Um eine Überexpression oder veränderte Verteilung von EphA2 nachzuweisen, können die EphA2-spezifischen Antikörper, wie auf dem Fachgebiet bekannt, kovalent oder nicht-kovalent mit jedem einer Reihe bekannter nachweisbarer Markierungen wie fluoreszenten oder radioaktiven Substanzen markiert sein. Alternativ wird ein Sekundärantikörper, der spezifisch für die erfindungsgemäßen Antikörper ist, mit einer bekannten nachweisbaren Markierung markiert und verwendet, um in den vorstehenden Techniken EphA2-spezifische Antikörper nachzuweisen. Folglich stellen die erfindungsgemäßen Antikörper Verfahren bereit, um metastatische Transformation nachzuweisen.
Die vorliegende Erfindung setzt auch spezifische Antikörper für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 in therapeutischen Verwendungen ein, wie hier beschreiben. Bei Verwendung für eine in vivo-Therapie ist ein Arzneimittel, wie in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Verwendungen beschrieben, einem Patienten zu verabreichen. Es umfasst EphA2-spezifische Antikörper in therapeutisch wirksamen Mengen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform wurden die EphA2-spezifischen Antikörper „humanisiert". Humanisierte Antikörper schließen „chimäre Antikörper" ein, die hergestellt werden durch Zusammenspleißen von Genen für einen Antikörper der Maus (oder eines anderen Säugers) mit geeigneter Antigenspezifität mit Genen für ein menschliches Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität. Derartige Techniken sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5.811.098. Neben Antikörpern können auch natürliche oder künstliche Liganden, Peptide, Antisense-Moleküle, ATP-Analoga oder andere kleine Moleküle, die spezifisch EphA2 ansteuern können, eingesetzt werden.
Ein Beispiel für einen anderen Weg, um EphA2 anzusteuern, ist die Verwendung von Ephrinen, um EphA2 zu aktivieren oder zu hemmen. Zum Beispiel erhöht EphrinA1-F_c, die mit der schweren Immunglobulinkette verbundene extrazelluläre Domäne von EphrinA1, den Phosphotyrosingehalt von EphA2. EphrinA1-F_c kehrt das bösartige Verhalten von EphA2-transformierten Zellen um. Folglich ist eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform die Verwendung von Ephrin oder einer hybriden Form von Ephrin für die Herstellung eines Arzneimittels, wie hier beschrieben, welches in einer therapeutisch wirksamen Menge zu verabreichen ist.
Therapeutische Mengen sind Mengen, welche die Tumorlast eines Patienten eliminieren oder reduzieren oder welche die Proliferation von metastatischen Zellen verhindern oder reduzieren. Die Dosierung wird von vielen Parametern abhängen einschließlich der Art des Tumors, der Patientengeschichte, der Verfassung des Patienten, der möglichen gleichzeitigen Verwendung anderer onkolytischer Mittel und den Verabreichungsverfahren. Verabreichungsverfahren schließen die Injektion (z.B. parenteral, subcutan, intravenös, intraperitoneal etc.) ein, wobei die Antikörper in einem nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen Träger wie Wasser, Kochsalzlösung, Ringerlösung, Dextroselösung, 5%iges menschliches Serumalbumin, fette Öle, Ethyloleat oder Liposome bereitgestellt werden. Typische Dosierungen können von etwa 0,01 bis etwa 20 mg/kg oder mehr reichen, noch genauer von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg. Andere Verabreichungsverfahren schließen die orale und transdermale Verabreichung ein. Verträgliche Träger für die orale Aufnahme in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet anerkannten Verfahren in pharmazeutisch verträgliche Flüssigträger oder in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen festen Trägern in Form von Tabletten, Kapseln, oder Gelversiegelungen formuliert werden. Andere wirksame Verabreichungsverfahren und Dosierungen können durch Routineversuche bestimmt werden und befinden sich innerhalb des erfindungsgemäßen Geltungsbereich.
Therapeutische Verwendungen, bei denen EphA2-spezifische Antikörper eingesetzt werden, können mit Chemotherapien, Operationen und Bestrahlungstherapien, abhängig von der Art des Tumors, dem Zustand des Patienten, anderen Gesundheitsaspekten und einer Vielzahl von Faktoren, kombiniert werden. Die Verfahren können auch Immunkonjugate für zielgerichtete Immuntoxin-vermittelte Therapien einschließen, worin erfindungsgemäße Antikörper kovalent oder nicht-kovalent an verschiedene cytotoxische Mittel konjugiert sind, was die Toxizität gegenüber den Zielzellen weiter steigert. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5.872.223. Derartige Mittel schließen verschiedene bakterielle Toxine (z.B. Pseudomonas Exotoxin), die Ricin A-Kette, Daunorubicin, Methotrexat und Ribosomeninhibitoren (z.B. Trichosantin) ein. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch mit Alpha-, Beta- oder Auger-Elektronen-Strahlern markiert sein, was in Immunkonjugaten für die zielgerichtete Radiotherapie resultiert.
Folglich können EphA2-spezifische Antikörper in einer Vielzahl von Verwendungen zum Behandeln metastatischer Krankheit verwendet werden.
BEISPIEL 1
Charakterisierung der EphA2-Expression in metastatischen Zellen
Nach der RIMMS-Strategie wurden unter Verwendung von Tyrosin-phosphorylierten Proteinen aus Ras-transformierten menschlichen epithelialen Zellen Hybridome durchmustert und es wurde ein für EphA2 spezifischer Antikörper isoliert. Dieser Antikörper wurde verwendet, um die Spiegel der EphA2-Expression in nichttransformierten Prostataepithelzellen und Prostatatumorzellen zu untersuchen. In nichttransformierten Prostataepithelzellen wurden niedrige Spiegel der EphA2-Expression gefunden, aber diese EphA2-Expression war vermehrt an Stellen des Zell-Zell-Kontaktes und interagierte mit zellgebundenem Liganden. Verglichen mit nichttransformierten Zellen unterscheiden zwei Eigenschaften EphA2 in metastatischen Prostatakrebszellen: 1) EphA2 ist überexprimiert, 2) EphA2 ist diffus verteilt und scheint nicht mit einem Liganden zu interagieren. Um diese Daten zu bestätigen, wurden Western-Blots unter Verwendung der EphA2-spezifischen Antikörper hergestellt. Die EphA2-Überexpression in menschlichen Prostatakrebszellen (LNCAP, DU145, PC3) korreliert direkt mit deren invasiver Eigenschaft in vitro und in vivo. Von den drei getesteten Zelllinien ist LNCAP die am wenigsten aggressive, DU145 ist aggressiver und PC3 ist die aggressivste. Wie in 2 zu sehen, weisen DU145 Zellen höhere Spiegel an EphA2-Expression auf als LNCAP und PC3-Zellen weisen noch höhere Spiegel an EphA2-Expression auf. Ähnlich ist, wie in 2B und 2C gezeigt, die EphA2-Expression in Varianten von menschlichen Prostataepithelzellen, die durch onkogenes K-Ras oder durch Röntgenstrahlung transformiert wurden, erhöht. Die drei Spuren in 2B zeigen „normale" MCL Prostataepithelzellen und daraus entstandene, durch K-Ras und Röntgenstrahlen transformierte Zelllinien. Ähnlich zeigen die drei Spuren in 2C „normale" 267B1-Prostataepithelzellen und daraus entstandene, durch K-Ras und Röntgenstrahlen transformierte Zelllinien. Wie in 2B und 2C zu sehen ist, weisen die transformierten Zellen alle erhöhte EphA2-Spiegel auf. 3 zeigt ähnliche Western-Blots außer dass Prostatakrebs-Zelllinien von Hunden verwendet wurden. Wie in 3 gezeigt und übereinstimmend mit den Ergebnissen aus menschlichen Zellen, wird EphA2 in metastatischen Prostatakarzinomzellen, die aus Hunden mit spontanem Prostatakrebs erhalten wurden, überexprimiert.
Die metastatischen Prostatazelllinien können in drei Kategorien unterteilt werden: 1) Zellen, die aus primären Prostatatumoren erhalten wurden, 2) Zellen, die aus Metastasen erhalten wurden, die in vivo schlecht metastatisch sind, 3) Zellen, die aus Metastasen erhalten wurden, die in vivo hochmetastatisch sind. Die Western-Blots unter Verwendung von EphA2-spezifischen Antikörpern haben gezeigt, dass die EphA2-Expression in allen Zellen, die aus Metastasen erhalten wurden, erhöht ist, mit der höchsten EphA2-Expression in Zellen, die in vivo ihr metastatisches Potential beibehalten (wie unter Verwendung von athymischen Mausmodellen gezeigt). Interessanterweise haben B2D6-Untersuchungen gezeigt, dass EphA2 in Zellen aus Prostatakrebs-Metastasen verglichen mit Linien, die aus dem Primärtumor des gleichen Patienten etabliert wurden, überexprimiert wird. Zusammenfassend zeigen all diese Ergebnisse die EphA2-Überexpression in metastatischen Prostatatumorzellen.
Ähnliche EphA2-Expressionsmuster wurden mit Brustkrebszellen gefunden. In normalen Brustepithelzellen ist EphA2 innerhalb von Zell-Zell-Verbindungen angereichert. Dagegen exprimieren nichtmetastatische Brustkrebszellen EphA2 nicht, während metastatische Brustkrebszellen EphA2 überexprimieren. In metastatischen Brustkrebszellen wird EphA2 in die Membranfalten umverteilt und ist folglich für die Antikörperbindung verfügbar.
BEISPIEL 2
Ansteuerung von metastatischen Zellen in vitro
Die EphA2-Überexpression macht metastatische Zellen empfindlich für die selektive, Antikörper-vermittelte Zerstörung durch die vorliegenden Antikörper, die spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 sind. Obwohl normale Zellen EphA2 exprimieren, wird angenommen, dass Ligandenbindung oder Clusterbildung an Stellen des Zell-Zell-Kontaktes extrazelluläre Epitope in normalen Zellen verschließt und diese unerreichbar macht für Antikörper, die spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 sind. Es wird angenommen, dass die Tumorselektivität der erfindungsgemäßen Antikörper bei der Ansteuerung von metastatischem Krebs der von Herceptin^® gleichkommt oder diese sogar übertrifft.
Die EphA2-Überexpression stellt eine Basis für die Ansteuerung metastatischer Krebszellen mit EphA2-spezifischen Antikörpern bereit. Antikörper, die spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 sind, wie die, welche vom Hybridom B2D6 hergestellt werden, können verwendet werden, um das proliferative oder invasive Verhalten von metastatischen Krebszellen selektiv (gegenüber normalen Zellen) zu verändern. Sowohl bei der auf Metastase zurückzuführenden als auch bei der im Labor induzierten Transformation korreliert die EphA2-Überexpression mit der invasiven Eigenschaft, während nichtinvasive Zellen niedrigere Spiegel der EphA2-Expression zeigen.
Um den Effekt von B2D6 auf das Zellwachstum zu messen, werden Zellen mit gereinigtem B2D6 inkubiert und die Zellproliferation wird durch mikroskopische Zellzählung (unter Verwendung eines Hämocytometers) und durch Messen der DNA-Synthese gemessen. Zum Beispiel wird normalem Wachstumsmedium B2D6 und BrdU zugegeben und die BrdU-Aufnahme wird über die folgenden vier Stunden gemessen. Um die Effekte von B2D6 über längere Zeiträume zu messen, werden Proben in Intervallen von 24 Stunden gezählt, wobei BrdU dem Kulturmedium für die letzten vier Stunden der Inkubation zugegeben wird. Als eine dritte Messung des Zellwachstums wird der Effekt von B2D6 auf das Wachstum von metastatischen Zellen in Softagar bestimmt. Es werden Softagar-Plattierungsversuche verwendet, in denen 2 × 10⁴ metastatische Zellen in An- oder Abwesenheit von B2D6 (0–10 nM) auf Agar ausplattiert werden, und das Koloniewachstum wird dann in Intervallen von drei Tagen bestimmt.
Es wird angenommen, dass B2D6 das Wachstum von metastatischen Zellen verringert. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass B2D6 EphA2 aggregiert und etwa 50 % des Wachstums von metastatischen Brustkrebszellen (welche ebenfalls EphA2 überexprimieren) während der ersten vier Stunden der Inkubation blockiert. Obwohl EphA2 in metastatischen Brustkrebszellen nicht Tyrosin-phosphoryliert ist, wird die Tyrosin-Phosphorylierung in diesen mit B2D6 behandelten Zellen wiederhergestellt. Folglich wird angenommen, dass B2D6 die normale EphA2-Funktion wiederherstellt.
Zusätzliche Studien mit Prostatakrebszellen werden durchgeführt, um zu bestimmen, ob längere Inkubationen mit B2D6 das metastatische Zellwachstum weiter inhibieren. Nichttransformierte epitheliale Zellen exprimieren etwas EphA2, obgleich viel weniger als metastatische Zellen, und geringe Toxizität gegenüber nichttransformierten Zellen ist möglich. Die minimalen wirksamen und maximalen nichttoxischen Dosierungsmengen von Antikörpern in Übereinstimmung mit einem erfindungsgemäßen Aspekt können durch Routineversuche identifiziert werden, aber vorzugsweise werden typische Dosen von etwa 0,1 bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht des Patienten reichen. Die bevorzugte Dosis wird von vielen Parametern abhängen, einschließlich der Art des Tumors, der Patientengeschichte, der Verfassung des Patienten, der möglichen gleichzeitigen Verwendung anderer onkolytischer Mittel und von Verabreichungsverfahren. Bei der Behandlung von metastatischen Tumoren, die EphA2 Proteine überexprimieren, werden Antikörperspiegel verwendet werden, die am besten zwischen normalen und metastatischen Zellen unterscheiden.
BEISPIEL 3
Antikörper-vermittelte Cytotoxizität in vitro
Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass EphA2-Antikörper metastatisches Zellwachstum verhindern. Um die Antikörper-vermittelte Cytotoxizität zu messen, werden vorzugsweise nichtradioaktive Versionen von ⁵¹Cr-Freisetzungsversuchen unter Verwendung von Zielzellen (normale oder metastatische Prostataepithelzellen), die mit Europiumchlorid (EuCl₃) und Diethylentriamin-Pentaessigsäure (DTPA) markiert sind, verwendet. Nach dem Entfernen von nichteingebautem Eu³⁺ durch Waschen werden Naphthoyltriflouraceton (NTA) und Trioctylphosphinoxid mit den cytolytischen Mitteln und den Versuchsüberständen inkubiert. Die Lumineszenz des resultierenden ternären Komplexes (Eu³⁺/NTA/Trioctylphosphinoxid) wird unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerätes gemessen. Es wurde berichtet, dass die Sensitivität dieses Eu³⁺-Freisetzungsversuchs für Komplement-vermittelte Cytolyse fünffach besser ist als ⁵¹Cr-Freisetzungsversuche. Um die spezifische Lyse zu bestimmen, werden Parallelproben durch Zugeben von destilliertem Wasser hypotonisch lysiert. Unbehandelte Proben und Antikörper mit übereinstimmendem Isotyp dienen als Negativkontrollen.
Um den Komplement-vermittelten Tod in vitro nachzustellen, werden Zellen mit B2D6 markiert und nicht-hitzeinaktiviertem Serum ausgesetzt. Für Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität („ADCC") werden sowohl Kontroll- als auch B2D6-behandelte Prostatazellen mit mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC; E/T-Verhältnis 10:1) inkubiert.
Es wird angenommen, dass sowohl Komplement als auch ADCC die spezifische Zerstörung von Metastasen unterstützen. Die Antikörperdosis kann variiert werden, um LD₅₀-Messungen für metastatische und normale Zellen zu erstellen. Antikörperkonzentrationen, welche die spezifische Zerstörung von metastatischen Zellen (PC3, 267-Ras, 267-X) maximieren, während sie den Tod von nicht-transformierten Prostataepithelien (267, MLC) minimieren, werden durch Routineversuche bestimmt. ADCC kann auch mit Komplement kombiniert werden, um die Tumorzerstörung durch Behandeln der Proben mit Tumornekrosefaktor (TNF) noch zu verstärken. Es gibt Hinweise, dass TNF die Zerstörung von Tumorzellen durch EGFR- und Her2-spezifische Antikörper potenziert. Es wird erwartet, dass die Humanisierung der erfindungsgemäßen Antikörper bessere Komplement- oder ADCC-Ergebnisse bereitstellt.
Es wird angenommen, dass B2D6 Tumorzellen durch die Komplementkaskade oder ADCC zerstört. Allerdings kann die kovalente oder nichtkovalente Bindung der vorliegenden Antikörper an auf dem Fachgebiet bekannte cytotoxische Mittel die Toxizität gegenüber Zielzellen weiter verstärken. Beispiele für Toxine, die für die Immunkonjugation geeignet sind, schließen Pseudomonas Exotoxin oder die Ricin A-Kette ein.
BEISPIEL 4
Ansteuern von metastatischen Zellen in vivo
Die vorliegenden EphA2-Antikörper, besonders die, welche vom Hybridom B2D6 hergestellt werden, sind wirksam beim Blockieren des Wachstums und der invasiven Eigenschaft von Prostatakrebszellen in vivo. Die Wirksamkeit von B2D6 beim Blockieren des Wachstums von primären Prostatatumoren unter Verwendung subkutaner Implantation von PC3-Tumorzellen in Mäuse wird durch die Verwendung von subkutanen Modellen bestimmt. Die Hauptvorteile von subkutanen Modellen sind die Einfachheit der Implantation und der nachfolgenden Untersuchung der Tumorgröße. 5 × 10⁵ PC3-Zellen werden unter sterilen Bedingungen subkutan in den rechten craniolateralen Thorax (Achselhöhle) inokuliert. Die Tumoren werden unter Verwendung von Messschiebern alle 3–4 Tage gemessen, bis sie ein Volumen von 0,2–0,3 cm³ erreichen. Zu diesem Zeitpunkt werden die Mäuse in vier Gruppen aufgeteilt (jeweils 8–10 Mäuse): Gruppe 1 (Vehikelkontrolle), die Gruppen 2–4 werden zweimal pro Woche mit 0,1, 1,0 oder 10 mg/kg B2D6, das intraperitoneal verabreicht wird, behandelt. Die Mäuse werden dann alle 3 Tage untersucht, um das Tumorvolumen (mit Messschiebern), das Körpergewicht und die Lebensdauer zu bestimmen. Nach nicht mehr als 60 Tagen nach der Implantation werden die Tiere getötet und es werden postmortem Bestimmungen der Tumorgenese einschließlich Messung und Gewichtsbestimmung implantierter Tumore und proximaler Lymphknoten, makroskopische Bestimmung von Weichteilen bezüglich Tumoren (Lymphknoten und Lunge) und Formalinfixierung der Primärtumore und Gewebe durchgeführt. Die Gewebe werden durch Immunhistochemie unter Verwendung von D7 (ein anderer EphA2-spezifischer Antikörper, der für die Immunhistochemie eingesetzt werden kann) beurteilt, um den Spiegel der EphA2-Expression in den Tumoren zu bestimmen. Insbesondere werden Tumorzellen, die der B2D6-Behandlung entgehen, untersucht, um zu bestimmen, ob diese niedrige Spiegel der EphA2-Expression aufweisen. Die EphA2-Expression der einzelnen Tiere wird auch mit der invasiven Eigenschaft des Tumors korreliert.
Als Ziel-Negativkontrollen für die Spezifität werden Parallelversuche unter Verwendung von DU145-Zellen, welche sehr niedrige EphA2-Spiegel exprimieren, durchgeführt. Während angenommen wird, dass das Wachstum von PC3-Tumoren empfindlich gegenüber B2D6 ist, wird angenommen, dass durch DU145 hervorgerufene Tumore unempfindlich sind. Die statistische Signifikanz der B2D6-Inhibition der Tumorgenität, der gesamten metastatischen Häufigkeit und der Häufigkeit von entfernten Metastasen wird unter Verwendung computergestützter Statistikpakete (PC/SAS Ver. 6.04) getestet, wobei Unterschiede als signifikant bewertet werden, wenn p < 0,05 ist.
Während die subkutane Implantation ein verbreitetes und nützliches Verfahren Zur Nachbildung von Tumorzellwachstum ist, können Unterschiede in der Mikroumgebung der Haut und Prostata ziemlich dramatische Unterschiede im Zellverhalten verursachen. Zum Beispiel metastasieren PC3-Zellen selten, wenn sie subkutan implantiert werden, während die intraprostatische Implantation (orthotopisch) die Metastase erleichtert. Folglich werden PC3-Zellen durch Freilegen der Prostata durch Laparotomie und Inokulieren von Tumorzellen in Prostatadrüsen unter Verwendung eines chirurgischen Mikroskops in die Prostata implantiert. Nach sieben Tagen wird mit der Behandlung der Mäuse mit B2D6, wie vorstehend beschrieben, begonnen und die Tiere werden nicht später als 60 Tage nach Implantation (oder falls die Tiere moribund werden) getötet. Die Tumoren werden in Intervallen von 3–5 Tagen abgetastet, wobei Daten zu Tumorgröße, Gewicht und Überleben der Tiere gesammelt werden. Postmortem-Bestimmungen werden ebenfalls, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit Schwerpunkt auf der Wirkung von B2D6 auf das metastatische Potential (auf Lungen und regionale Lymphknoten). Es wird angenommen, dass B2D6 den Primärtumor und das metastatische Potential von PC3-Zellen in einer dosisabhängigen Weise blockiert.
Um die Indentifikation von Stamm- oder Clon-spezifischen Effekten zu minimieren, können identische Untersuchungen unter Verwendung anderer Modellsysteme verwendet werden. Zum Beispiel können die Effekte von B2D6 auf das Wachstum oder die Metastase von Tumoren, die durch die Implantation von K-Ras- oder Röntgenstrahlen-transformierten 267B1-Zellen hervorgerufen werden, mit den Effekten auf menschliche MLC-Prostataepithel-Zelllinien verglichen werden.
BEISPIEL 5
Entwicklung von EphA2-basierten Antikörpertherapika der „zweiten Generation"
Während die EphA2-Überexpression in metastatischen Prostatakrebszellen einen Grad der Selektivität bereitstellt, der vergleichbar ist mit Herceptin^® bei Brustkrebs, wird angenommen, dass einzigartige Eigenschaften von EphA2 eine sogar noch selektivere Ansteuerung erlauben. Insbesondere liegt EphA2 auf der Oberfläche von nicht-transformierten Epithelien dichtgepacht innerhalb von Zell-Zell-Kontakten vor, während EphA2 auf metastatischen Zellen diffus verteilt ist. Es ist folglich wahrscheinlich, dass einige der Epitope von EphA2 in Metastasen zugänglich sind, aber in normalen Prostataepithelien vom Liganden geschützt sind. Die EphA2-Antikörper, welche die optimale Unterscheidung zwischen normalen und metastatischen Prostataepithelien bereitstellen, werden ausgewählt.
Die Palette der zuvor hergestellten Antikörper wird auf Epitope von EphA2, die auf der Zelloberfläche zu finden sind, durchmustert. Unter Verwendung von Durchflusscytometrie wird die EphA2-Expression in einer Vielzahl von „normalen" (z.B. 267B- oder MLC-Zellen) und metastatischen Zellen (PC3-Zellen) verglichen. Zum Beispiel werden konfluente Einzelschichten von normalen und metastatischen Zellen mit B2D6 markiert. Um sicherzustellen, dass Antikörper ausgewählt werden, die spezifisch für Epitope sind, die unzugänglich in normalen Zellen, aber zugänglich in metastatischen Zellen sind, werden Antikörper ausgewählt, deren Bindung in normalen Zellen mit zunehmender Zelldichte abnimmt, aber deren Bindung in metastatischen Zellen konstant bleibt, wie in 4 gezeigt. Nach der Markierung mit Fluorescein-Sekundärantikörpern wird die EphA2-Expression unter Verwendung der Durchflusscytometrie bestimmt. Die Antikörper, welche am besten zwischen normalen und metastatischen Zellen unterscheiden, werden ausgewählt. Die Spezifität für EphA2 wird mit Western-Blot-Verfahren und Immunpräzipitationsversuchen bestätigt. Antikörper, welche die beste Selektivität zeigen, werden dann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken humanisiert.
BEISPIEL 6
Veränderte EphA2-Expression durch Transfektion
Um die Folgen von EphA2-Überexpression zu untersuchen, wurden MCF-10A-Zellen mit menschlicher EphA2-cDNA (EphA2) oder einer Vektorkontrolle (Vektor) transfiziert. Nach der Etablierung von Kulturen von MCF-10A-Zellen mit stabiler Überexpression von EphA2 zeigte die mikroskopische Bestimmung Unterschiede in der Zellmorphologie verglichen mit Vektor-transfizierten Kontrollzellen (nicht gezeigt). Nichttransformierte MCF-10A-Zellen zeigen eine epitheliale Morphologie und interagieren miteinander, sogar bei geringer Zelldichte. Dagegen nehmen EphA2-überexprimierende MCF-10A-Zellen (MCF^EphA2) eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie an und bilden keine Zell-Zell-Kontakte, sogar bei hoher Zelldichte. Um zu bestätigen, dass die mesenchymale Morphologie keine clonale Veränderung darstellt, führte eine getrennte Probe von mit EphA2-cDNAs transfizierten MCF-10A-Zellen zu identischen Ergebnissen.
Zell-ECM-Adhäsionen wurden bestimmt durch Inkubieren von Zellen auf ECM bei 37°C für 30 Minuten, gefolgt von heftigem Waschen, um schwach adhärente Zellen zu entfernen. Diese Untersuchungen zeigten eine 24-fache Zunahme der Anheftung an ECM in MCF^EphA2-Zellen relativ zu Vektor-transfizierten Kontrollen (P < 4 × 10^–4). Zell-Zell-Adhäsionen wurden durch Inkubieren von Zellen in Suspension und Bestimmung der Durchschnittsgröße von Zellkolonien untersucht. Während Vektor-transfizierte MCF-10A-Zellen miteinander in Kolonien mit einer Durchschnittsgröße von 4,1 Zellen interagieren, ist die durchschnittliche Koloniegröße von MCF^EphA2-Zellen auf 1,3 Zellen reduziert (P < 3 × 10^–5).
Da stabile Zell-Zell-Kontakte dazu führen, dass EphA2 innerhalb der Stellen des Zell-Zell-Kontaktes angereichert wird, wurde die subzelluläre Lokalisation von EphA2 durch Immunfärbung mit spezifischen Antikörpern untersucht. EphA2 auf nichttransformierten MCF-10A Zellen war beschränkt auf eine enge Linie, wo angrenzende Zellen in direkten Kontakt kamen, mit geringer Färbung von Membran, die nicht in Kontakt mit benachbarten Zellen war. Dagegen war das Muster der EphA2-Färbung von MCF^EphA2-Zellen diffus, mit einer geringen Färbung von Zell-Zell-Kontakten.
Das Fehlen von EphA2 innerhalb von Zell-Zell-Kontakten in MCF^EphA2-Zellen war interessant, da EphA2 durch Liganden stimuliert wird, die auf der Zellmembran verankert sind. Um die EphA2-Stimulation zu messen, wurde der Phosphotyrosingehalt von immunpräzipitiertem EphA2 durch Western-Blot-Analyse mit Phosphotyrosin-spezifischen Antikörpern gemessen. Während EphA2 in Vektor-transfizierten MCF-10-Zellen Tyrosin-phosphoryliert war, war EphA2 in MCF^EphA2-Zellen nicht Tyrosin-phosphoryliert. Der verminderte Phosphotyrosingehalt wurde durch Verwendung mehrerer EphA2-Antikörper zur Immunpräzipitation (D7, B2D6) und unterschiedlicher Phosphotyrosin-spezifischer Antikörper (4G10, PY20) für Western-Blot-Analysen bestätigt.
BEISPIEL 7
Bösartigkeit und Metastase durch EphA2-Transfektion
Die maligne Transformation wurde in vitro untersucht und es wurde gefunden, dass MCF^EphA2-Zellen in Softagar Kolonien bilden. Während Vektor-transfizierte MCF-10A-Zellen 0,3 Kolonien pro Hochleistungsfeld bildeten, zeigten MCF^EphA2-Zellen vermehrtes Koloniewachstum in Softagar, mit einem Durchschnitt von 3,0 Kolonien pro Hochleistungsfeld (P < 3 × 10^–7). Vektor und EphA2-überexprimierende MCF-10A-Zellen konnten mit Matrigel (Collaborative, Bedford, MA) interagieren. Nichttransformierte MCF-10A-Zellen organisierten sich schnell in kugelförmigen Kolonien, wenn sie auf Matrigel gezüchtet wurden, während MCF^EphA2-Zellen eine sternenförmige Organisation annahmen, die vom Verhalten metastatischer Zellen (z.B. MDA-MB-231, MDA-MB,435) nicht zu unterscheiden war.
Da in vitro-Untersuchungen der Transformation nicht immer das tumorigene Potential in vivo vorhersagen, wurden Kontroll- oder EphA2-überexprimierende MCF-10A-Zellen in athymische (nu/nu) Mäuse implantiert. Die subcutane Injektion von MCF^EphA2-Zellen verursachte die Bildung von tastbaren Tumoren innerhalb von vier Tagen in 19 von 19 Mäusen. Das mittlere Volumen resultierender Tumore stand in Zusammenhang mit der Anzahl implantierter Zellen und erreichte einen Durchschnitt von 300 mm³ (für Proben, in die mit 5 × 10⁶ Zellen injiziert wurden) innerhalb von 10 Tagen (Tabelle 1). Die Obduktion zeigte, dass die Tumore fest mit dem darunterliegenden axillären Muskel verbunden und von fibrösem Gewebe umgeben waren. Histologisch waren die neoplastischen Zellen invasiv und mit fibrösem Bindegewebe assoziiert. Diese neoplastischen Zellen zeigten einen moderaten cytoplasmatischen und nukleären Pleiomorphismus und bildeten dysplastische tubuläre und sekretierende Stukturen. In Kontrollexperimenten konnten mit Vektor-DNA transfizierte Zellen in athymischen Mäusen (0 von 13, Tabelle I) nicht wachsen und bei der Obduktion konnte kein Wachstum oder keine Invasion dieser Zellen identifiziert werden.
Da die höchsten Spiegel von EphA2 einheitlich in Brustkrebszellen, die in vivo metastatisch sind, gefunden wurden, wurden 1 × 10⁶ Kontroll- oder MCF^EphA2-Zellen in die Schwanzvene von athymischen Mäusen injiziert. Innerhalb von sieben Tagen zeigte die Obduktion Lungen-Mikrometastasen mit großen Gefäßen in 2 von 4 Mäusen, denen MCF^EphA2-Zellen injiziert worden waren (Tabelle I). Es wurde gefunden, dass die Metastasen allgemein große Blutgefäße verschlossen, aber nicht die Gefäßwand durchbrachen. Die immunhistochemische Färbung mit Cytokeratin-Antikörpern bestätigte die epitheliale Natur des Thrombus und ein Fehlen von Anti-Thrombin Färbung zeigte, dass der Thrombus nicht einen abnormalen oder atypischen Auswuchs von endothelialen Zellen darstellte. Es wurde keine Lungenbesiedelung in Mäusen, denen Kontroll-MCF-10A-Zellen injiziert wurden, beobachtet (Tabelle 1).
Tabelle 1: Tumorigenes und metastatisches Potential von EphA2-transformierten MCF-10A-Zellen
BEISPIEL 8
Ansteuerung von Metastasen unter Verwendung von EphA2-Agonisten
Um zu testen, ob EphA2 durch einen Agonisten stimuliert werden kann, wurden MCF^EphA2-Zellen mit oder ohne 0,5 mg/ml EphrinA1-F_c in Softagar suspendiert. EphrinA1-F_c erhöhte den Phosphotyrosingehalt von EphA2 und mit EphrinA1-F_c behandelte Zellen reduzierten die Koloniebildung in Softagar um 49% relativ zu Vehikel-behandelten Kontrollen (P < 5 × 10^–6). Um zu testen, ob die EphA2-Stimulation das Zellverhalten auf Matrigel ändern konnte, wurden die MCF^EphA2-Zellen mit 0,5 mg/ml EphrinA1-F_c behandelt, welches einen kugelförmigen Phänotyp wiederherstellte, der vergleichbar war mit nichttransformierten MCF-10A-Zellen. Folglich kehrt sie EphA2-Stimulation die Effekte der EphA2-Überexpression um. EphrinA1-F_c. Trotz dessen Unfähigkeit, mit seinen endogenen Liganden zu interagieren, reagierte EphA2 in MCF^EphA2-Zellen auf exogene Reize.
Obwohl die Erfindung detailliert mit Verweis auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, gibt es Variationen und Modifikationen innerhalb des Geltungsbereiches und des Geistes der Erfindung, wie in den folgenden Patentansprüchen beschreiben und definiert.

Claims

Verwendung eines EphA2-Agonisten, ausgewählt aus (i) einer Verbindung, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 umfasst, und (ii) einem Antikörper, welcher spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 ist, mit mindestens einer biologischen Aktivität zum Reduzieren metastatischer Invasion oder von Proliferation eines Tumors, zum Reduzieren von Metastase von metastatischen Zellen, zum Verhindern von Proliferation von metastatischen Zellen, zum Erhöhen des Phosphotyrosin-Gehalts von EphA2 in metastatischen Zellen und/oder zum Reduzieren der invasiven Eigenschaft metastatischer Zellen im Vergleich zu unbehandelten metastatischen Zellen für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines metastatischen Tumors oder Krebses bei einem Säuger einschließlich einer Population von Zellen, welche Tyrosinkinase EphA2 überexprimieren.
Verwendung eines EphA2-Agonisten, ausgewählt aus (i) einer Verbindung, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 umfasst, und (ii) einem Antikörper, welcher spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines metastatischen Tumors umfassend eine Population von Zellen, welche EphA2 überexprimieren.
Verwendung eines EphA2-Agonisten, ausgewählt aus (i) einer Verbindung, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 umfasst, und (ii) einem Antikörper, welcher spezifisch für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten mit einem metastatischen oder potentiell metastatischen Krebs umfassend eine Population von Zellen, welche EphA2 überexprimieren.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der EphA2-Agonist einen Antikörper umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der EphA2-Agonist einen monoclonalen Antikörper umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der EphA2-Agonist einen Antikörper mit Spezifität für ein extrazelluläres Epitop von EphA2 umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der EphA2-Agonist einen Antikörper, der selektiv an metastatische Zellen bindet, umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der EphA2-Agonist einen Antikörper umfasst, der an ein cytotoxisches Agens konjugiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei das cytotoxische Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem bakteriellen Toxin, einer RicinA-Kette, Daunorubicin, Methotrexat, einem Ribosomen-Inhibitor und einem Radioisotop.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das cytotoxische Agens ein Radioisotop ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Alpha-Strahler, einem Beta-Strahler und einem Auger-Elektronen-Strahler.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der EphA2-Agonist ein Ephrin umfasst, welches die Phosphorylierung von EphA2 beeinflusst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der EphA2-Agonist ein Peptid umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei der EphA2-Agonist eine Peptidsequenz umfasst, welche eine extrazelluläre Domäne von EphrinA1 definiert.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Peptidsequenz mit einer zweiten Peptidsequenz verknüpft ist, welche eine schwere Immunglobulin-Kette definiert.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der EphA2-Agonist ein Antisense-Oligonucleotid umfasst, welches die EphA2-Expression beeinflusst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Population an Zellen mindestens einen Teil eines Krebs-Tumors ausbildet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Brust-, Prostata-, Lungen-, und Dickdarm-Krebs-Tumoren.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Population der Zellen Zellen umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Brustkrebszellen, Prostatakrebszellen, Lungenkrebszellen und Dickdarmkrebszellen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen, welche EphA2 überexprimieren, epitheliale Zellen sind.