CN108982846B - 脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，该种方法通过对细胞亚群的建立和分离，以及体内和体外的检测试验，体外包括免疫荧光法、流式细胞术、ELISA实验、Transwell实验、CCK8测试、划痕试验、Adhesion assay和血管生成试验，通过多种手段和方向对细胞亚群的生物特性进行逐步确定，为肿瘤靶向治疗提供了非常好的技术支持和根据；同时通过基因技术对细胞亚群的RNA进行差异性检测，从而可以对治疗靶点的确定提供了很好的帮助。

Description

脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法。
背景技术
脑胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45%左右。在儿童恶性肿瘤中排第二位，近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2%，中老年人群尤为明显。中国脑胶质瘤年发病率为3-6人/10万人，年死亡人数达3万人。
脑胶质瘤在发生之初，通常没有典型的症状。随着肿瘤的不断增大，会表现出如下症状：一是颅内压增高和其他一般症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、癫痫发作和精神症状等。另一是脑组织受肿瘤的压迫、浸润、破坏所产生的局部症状，局部症状依肿瘤生长位置不同而异。
胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。
间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。
一类存在于多种组织，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能，细胞模型被应用于增殖、移植和分化研究，以及体外的免疫反应的鉴定。
胶质瘤的生长和快速繁殖与肿瘤内某种特异性细胞有关，所以对该种特异性细胞的生物特性的检测、确定在肿瘤医学研究中尤为重要，由于肿瘤的形成和生长因素和诱因非常复杂，需通过大量实验进行方法的筛选和优化才能确定肿瘤中不同细胞亚群具有的不同特性，因为不同生物特性对肿瘤的发展具有不同的促进作用，所以当这种细胞亚群的生物特性被确定后，会给肿瘤的靶向研究带来深远的意义。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出脑胶质瘤相关间充质干细胞（glioma-associated mesenchymal stem cells， gbMSCs）亚群生物特性的检测方法，通过对CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs两种细胞亚群进行体内和体外测试，确定其生物特性，为脑胶质瘤的医学治疗和研究提供了更有效的方法。
本发明提出脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，包括以下步骤：
（1）脑胶质瘤相关间充质干细胞的CD90high和CD90low两种细胞亚群采用免疫磁珠分离实验进行体外筛选分离，培养，鉴定；
（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行体外检测，包括CCK8实验、Transwell 实验、细胞划痕实验、Adhesion assay和促内皮细胞成管实验；
（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行动物体内对比实验，包括肿瘤大小，动物生存期，肿瘤组织内Ki-67和CD31表达；组织内CD90和CD105双标荧光免疫表达，生物信息学分析CD90表达和TCGA数据库内GBM患者预后；
（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群通过基因芯片技术进行差异性表达测试，同时通过ELISA实验对分泌生长因子进行测试。
本发明采用了体内和体外分别对CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs两种细胞亚群两种进行了实验研究，这样可以更有效的增加了实验结果的真实性和有效性。
通过对肿瘤标本的处理培养后，再采用免疫磁珠分离实验对细胞进行标记分离，最后分别得到CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs两种细胞亚群。鉴定后进行分离培养以备体内和体外实验使用。
本发明采用CCK8实验和Transwell 实验对CD90high和CD90low两种细胞亚群的促胶质瘤增殖能力和迁移能力进行测试，促胶质瘤增殖能力和迁移能力越强，说明该种细胞对肿瘤发展的正向促进作用、活跃能力以及促生成能力就越强。同时，本申请中还通过使用细胞划痕实验进一步的测定了两种细胞亚群的迁移能力。
本发明通过Adhesion assay来对 CD90high和CD90low两种细胞亚群的细胞粘附性测试，细胞与细胞以及细胞与基质之间的粘附作用是细胞信号传递以及多种细胞生物活动的基础，是研究细胞生物特性的关键性指标。
血管新生，是指新生毛细血管自成体血管出芽形成的复杂过程，包括内皮细胞的活化、迁移和增生。该过程对于正常生长发育、生殖、修复以及成血管性疾病（如关节炎、银屑病、血管瘤、糖尿病视网膜病)和肿瘤性疾病是必不可少的。血管新生是在一系列有着广泛相互作用的细胞和分子的共同调节下完成的。在血管出芽前，首先发生血管通透性增高和毛细血管基底膜的降解，随之趋化因子和丝裂原被激活以促进内皮细胞的迁移和增殖，最后是管状结构和基底膜的重建。基底膜的形成，标志着血管成熟的开始，主要是内皮细胞对周细胞的募集，从而形成有周细胞包绕的稳定的血管。具有中层的较大血管的形成还需要合适的信号以完成血管平滑肌细胞的募集。周细胞是调节血管形成、稳定和功能的关键因素。周细胞和内皮细胞间的相互作用在血管新生中具有极为重要的作用。
本申请通过促内皮细胞成管实验后，用荧光显微镜进行拍照记录，采用ImageJ进行了管状结构长度的分析。检测两种亚群的促血管生成能力。
免疫荧光法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。该方法可对确定是否发生周细胞分化以及分化后的定量分析。
miRNA修饰检测是通过基因技术来确定体外分化常规培养液和肿瘤条件培养液培养的血管周细胞miRNA的匹配和比对情况；体外分化后的细胞基因与体内成熟肿瘤血管细胞基因的比对，从基因的层面对周细胞分化加以证明；同时通过基因测序等技术可以确定基因被修饰的细胞，可以作为今后治疗研究的靶点。
ELISA检测的细胞因子为VEGF、bFGF、SDF-1α、CCL5、MMP9 和 IL-6。癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成，血管内皮生长因子（VEGF) 是最有效的促血管生长因子。bFGF的生物学效应分体内和体外两大部分。体内作用十分强烈，成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。
SDF-1α和CCL5为趋化因子，趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移。细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结。这些淋巴结中的趋化因子通过与这些组织中的抗原提呈细胞相互作用而监视病原体的入侵。这些被称为稳态趋化因子，其产生无需刺激而分泌。有些趋化因子在发育中起作用；他们能刺激新血管形成；提供具体的关键信号而促成细胞成熟。其他趋化因子可以因应对细菌感染、病毒感染由多种细胞释放；也可以因非感染性的刺激如二氧化硅吸入，尿路结石等而释放。趋化因子的释放还可刺激释放炎症细胞因子如白细胞介素1 （IL-1)。炎性趋化因子的主要作用是趋化白细胞（如单核粒细胞和中性粒细胞）从血循环到感染或组织损伤部位。有的趋化因子也可以促进伤口愈合。
MMP能分解呼吸道和肺内的结构复合物如ECM和基底膜，因此能参与呼吸道和肺的重建，它还能调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，它能降解α1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性，能加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP-13的溶胶原活动，并且MMP-9还能从白细胞介素8（CXCL8/CL8）上分解一个62氨基酸肽，使其向中性粒细胞的趋化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒细胞的趋化因子。此外，MMP-9结合CD44可释放储存的TGF-β1，另外，MMP-9可通过释放血管内皮生长因子（VEGF）以参与血管生成。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。这几种细胞因子均在新血管形成的过程中起到关键作用，将其作为检测指标，更具有一定的代表性和说服力。
IL-6为活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子。能使B细胞前体成为产生抗体的细胞；和集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能。
所以通过对以上细胞因子的含量的测定和比对可以更好的对两种细胞亚群的生物特性进行判断和分析研究。
进一步的，所述脑胶质瘤相关间充质干细胞还进行细胞分化培养实验。
进一步的，所述细胞分化培养包括成骨细胞的分化、脂肪细胞的分化和软骨细胞的分化。由于肿瘤环境中新血管的形成大部分为具有一定分化潜能的细胞分化而成，所以在体外对目标细胞进行诱导分化，确定其是否分化潜能，如具有分化潜能，即可进行进一步的检测研究。
进一步的，所述步骤（2）Adhesion assay中采用450nm处进行吸光度的检测。
进一步的，所述步骤（3）中采用小鼠进行注射式植入。
进一步的，小鼠注射坐标为前囟前0.5-1.5mm、中线偏右1.5-2.5mm，进针深度3-4mm。
进一步的，所述注射频率为每100-140秒一次，每次注射量为0.8-1.2微升。
进一步的，所述步骤（2）中的Transwell 实验采用Giemsa进行细胞染色。
进一步的，所述步骤（2）中的Adhesion assay和Transwell 实验的培养条件为35-39℃、二氧化碳浓度为4.5-5.5%。
本发明中的所用得到的条件培养液的储存条件为-20℃。
本发明的脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，通过对细胞亚群的建立和分离，以及体内和体外的检测试验，体外包括免疫荧光法、流式细胞术、ELISA实验、Transwell 实验、CCK8测试、划痕试验、Adhesion assay和血管生成试验，通过多种手段和方向对细胞亚群的生物特性进行逐步确定，为肿瘤靶向治疗提供了非常好的技术支持和根据；同时通过基因技术对细胞亚群的RNA进行差异性检测，从而可以对治疗靶点的确定提供了很好的帮助。
附图说明
图1为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs流式细胞仪识别、鉴定结果示意图；
图2为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs的Adhesion assay检测结果示意图；
图3为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs的迁移能力测试结果示意图；
图4为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs管生成试验及黏附能力结果示意图；
图5为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs的Elisa 实验测试结果示意图；
图6为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs 的体内试验结果示意图；
图7为CD90high gbMSCs和CD90low gbMSCs基因表达测试结果示意图。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例
肿瘤标本被转移到培养皿，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS，HyClone，美国）洗三次，剪成1mm3 瘤块，加入0.25% 胰蛋白酶（BIYUNTIAN，中国）。消化20分钟，用70µm 尼龙网（康宁， 美国）过滤，然后1000 rpm 离心15 分钟。单核细胞由 Ficoll （2:1 Genview，美国）密度梯度在 1500 rpm离心 20 分钟。单细胞在加入 DMEM（HyClone，美国）含有10% 胎牛血清（BI，以色列）和100µ/毫升青霉素/链霉素（GibcoBRL，大岛，纽约州， 美国）后，制得细胞悬液，并接种在 25 cm2 培养瓶（康宁，美国），细胞培养在37°C，5% CO2 的培养箱中进行。这个培养液每星期换1-3次。在70-80% 融合的细胞传代使用 Accutase（干细胞， 加拿大）。
胶质瘤细胞系 U87 是从American Type Culture Collection （ATCC， 盖士堡，美国马里兰州）购买的， U87-MGs在DMEM培养液（HyClone，美国）加10%胎牛血清（血清；BI，以色列），100 µ/毫升青霉素/链霉素 （GibcoBRL，大岛，纽约州，美国）培养，细胞培养在37℃，5% CO2 的培养箱中进行。
按照制造商的操作说明，使用现成的分化培养液（均来自Stemcell，加拿大），可使gb-MSCs 向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。用油红O染色法评价脂肪分化，用茜素红染色法评价成骨分化，阿利新蓝染色评价软骨分化（试剂全部来自美国西格玛公司）。具体步骤如下：
对于成骨细胞的分化，在普通培养液中培养，接种于6孔板生长，在37℃、5% CO2环境下的培养箱中进行培养，直至约70-80% 融合。然后吸弃普通培养液，更换为成骨分化培养液，在37℃培养，每3天更换一次培养液。分化试验大约需要3星期。茜素红S可检视成骨分化。
对于脂肪细胞分化，在普通培养液中培养，接种于6孔板生长，在37℃、5% CO2环境下的培养箱中进行培养，直至约90-100%融合。然后吸弃普通培养液，更换为成骨分化培养液，在37℃培养，每3天更换一次培养液。分化试验大约需要3星期。油红 O 染色可检视脂肪分化。
对于软骨细胞分化，在软骨诱导培养液中生长 21天，并在分化过程中改变一半培养液。通过在室温下（15-25℃）将分化产物固定在10％福尔马林中30分钟，随后的标准石蜡包埋方法和用阿辛蓝染色6μm切片，得到组织切片。
Gb-MSCs磁性活化细胞分离
用生长良好的 gb-MSCs 进行免疫磁珠分离实验。首先严格按照制造商的操作说明执行用 CD90 微珠（Miltenyi，德国）对细胞进行免疫标记。简单地说，gb-MSCs是使用Accutase（Stemcell，加拿大）消化，然后在 1500rpm 离心6 分钟，细胞颗粒被重新悬浮，每107总细胞加入80µL预冷缓冲液中和20µL CD90微珠。然后混合，孵化15分钟在避光的冰箱（2−8℃）。每107细胞加2毫升缓冲液洗涤细胞，1500rpm 离心6分钟。弃去上清液。离心所得细胞使用500μL 的缓冲液再次制成单细胞悬液。磁分离使用 autoMACS pro 分离器（德国Miltenyi）。最终获得了 CD90high gb mscs 和 CD90low gb mscs。
条件培养液
在所有实验中， U87-MGs、CD90high gb mscs 和 CD90low gb mscs 在的 T25 组织培养瓶中播种，使用DMEM培养液，含10%胎牛血清，含青霉素（100 U /ml）/链霉素（100 mg/mL）（GibcoBRL，大岛，纽约州，美国）。细胞密度在50-60% 融合，培养液被不含血清培养液（DMEM）和 DMEM 含10%胎牛血清取代，然后培养72h。培养瓶的条件培养液收集后，在1，000g下离心10分钟，以去除细胞和细胞碎片。随后，收集的条件培养液（CD90high CM， CD90lowCM， 0%gb-CM， S-gb-CM）存储在−20℃，直到使用。
流式细胞仪识别 GA-MSCs
应用荧光共轭抗体进行流式细胞仪分析。简单地说，不同通道的 gb-mscs、CD90high gb mscs 和 CD90low都用胰蛋白酶处理，在 PBS缓冲液洗涤去除胰蛋白酶，然后再用FACS缓冲液使细胞悬浮。这些单细胞悬浮液在4℃避光孵育30分钟，使用PE-， FITC， PE-Cy7， APC-Cy7， Percp- and APC- 标记的抗体CD73， CD105， CD90， CD44， CD13， CD34，CD31， Desmin 和α SMA（ebioscience，美国）以及NG2 和 PDGFRβ（来自R&D, USA）。然后，细胞被离心，加入PBS缓冲液使重新悬浮，使用流式细胞仪（BD 生物科学）进行分析。使用FlowJo（TreeStar、Ashland、OR）软件收集和分析数据。
请参见图1。Gb-mscs显示与 MSCs 一致的成纤维细胞形态学。细胞附着在培养瓶中，在标准培养液中生长（见图1中 A部分）。流细胞分析表明， CD73、CD105、CD44、CD90、CD31、CD34、CD14、NG2 等均表达了间充质干细胞表面标记物， 而且还轻度表达α SMA 和PDGFβ（见图 1中B部分）。在体外，通过特殊刺激试验，以促进成脂、成骨和软骨，将 gb-MSCs骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞、成骨和软骨细胞的潜力。用油红 O 染色观察脂肪分化，用茜素红染色观察成骨分化，阿利新蓝染色检视软骨分化（见图 1中C部分）。Gb-MSCs被证明能够分化成脂肪细胞、成骨和软骨。
CCK-8测试
用细胞计数 kit-8（CCK-8 试剂盒，日本 Dojindo 实验室）分析细胞活力。CD90lowgb-mscs （5000/孔），CD90high gb mscs （5000/孔），U87 细胞 （3000/孔） 被接种在96孔板，待细胞贴壁。然后， 用100µl 的无血清培养液 （0%DMEM）、无血清 CD90high gb mscs 条件培养液（CD90high CM）、无血清 CD90low gb-mscs 条件培养液（CD90low CM）取代 U87 细胞培养液，培养1、2、3、4天。无血清培养液视为对照组。CD90low gb-mscs 和 CD90high gb-mscs分别替换为100µl 的无血清培养液，辅以10%胎牛血清（10%DMEM）孵化 1、2、3、4 小时。在不同的时间点，10μl的 CCK-8 被添加到每个孔并在37℃，5% CO2 的培养箱中进行孵化2小时。然后，用微板块计数器 （PerkinElmer，美国）测量每一个孔在450 nm的吸光度。重复进行至少三次。
Transwell 实验
用 8-µm 孔径 Transwell 小室24孔板（美国 BD FALCON）进行U87 细胞迁移的评价。100µl 含U87 细胞 （5x104/毫升）的无血清 DMEM培养液接种到Transwell的上室， 800µl 的含有 0%DMEM培养液， CD90high CM培养液和 CD90low CM培养液的测试样本被放置在Transwell的下室。细胞迁移在37℃ 5% CO2条件下培养24小时。在孵化后， 培养液被吸弃，在聚碳酸酯膜上表面残留的细胞用棉签除去。迁移到下表面的细胞用Giemsa染色20分钟，两名研究人员分别在倒置显微镜下进行细胞计数。通过对5个随机视野（x200）中的细胞计数， 确定了迁移细胞的平均数量。无血清 DMEM培养液 单独用作对照组。
请参见图3和图4。通过 CCK-8 和 Transwell 实验分别进行了检测，以表明CD90high gb-MSCs能显著促进胶质瘤的生长、迁移。U87 细胞以无血清培养液、CD90low gbmscs 条件培养液和 CD90high gb-mscs 条件培养液（0%DMEM、CD90low CM、CD90high CM）进行孵化，并由 CCK-8 进行评价。我们发现，与在 CD90low gb-mscs 条件培养液和无血清培养液（CD90low CM， 0%DMEM）中孵化相比， U87 细胞增殖的能力在 CD90high gb-mscs 条件培养液（CD90high CM） 中显著增加（见图 4中C部分）。采用Transwell 室法对胶质瘤的迁移进行评估， 发现 CD90high CM 培养的 U87 细胞比培养 CD90low CM和0%DMEM 的细胞具有显著的迁移能力（见图3中C、D部分）。黏附力检测显示， CD90high CM 明显增强胶质瘤的粘附能力相比， CD90low CM 和 0%DMEM （见图4中D部分）。
Adhesion assay
U87 细胞分别用 CD90high CM培养液和 CD90lowCM 培养液处理。然后， 细胞按照1×104个/孔的密度接种在预涂基质胶粘剂96孔板上，并在CD90high CM培养液和 CD90lowCM培养液，37℃，5% CO2 的培养箱中进行孵化。用 PBS缓冲液 冲洗三次，将非黏附细胞去除，并在 100 ul 普通培养液中加入10 ul cck8孵化2小时。然后，用微板块计数器（PerkinElmer，美国） 测量每一个孔在450 nm的光密度（OD）来分析细胞黏附力。10%DMEM被用作对照组。重复进行至少三次。
请参见图2。CD90high gb-mscs 和 CD90low gb-mscs 都显示了典型的体外黏附生长（见图 2中 C、D部分）。通过流细胞分析验证了Gb MSCs 与CD90 分子表达相关相关 （见图 2中A、B部分）。此外，我们发现它们的生长有明显的不同，在体外，CD90low gb-mscs 的生长速度比 CD90high gb-MSCs 的培养的要快（见图 2中E部分）。
细胞划痕实验
采用细胞划痕实验对不同培养液中 CD90high gb-MSCs和 CD90low gb-MSCs 的迁移能力进行了评价。细胞接种在6孔板块孵化直到90-100%融合。然后， 用10µl 枪头尖端制造划痕十字线， 用PBS缓冲液洗去划痕产生的细胞碎片。然后，培养液被替换为无血清培养液（0%DMEM），标准培养液（10%DMEM）， 无血清胶质瘤条件培养液（0%gb CM）或标准胶质瘤条件培养液（S gb CM）。在0和8小时，用Olympus显微镜拍摄了划痕的面积。实验一式三份，重复进行至少三次。 并用Image-Pro Plus分析数据。
免疫荧光和免疫化学。
对于免疫荧光，人类的胶质瘤手术标本被收割，并固定于4% 多聚甲醛， 切片为染色做准备。这些切片在室温下，在山羊血清中用 PBS 稀释30分钟的预孵化阻断了非特异性染色。使用的主要抗体如下: 山羊anti-CD105 多克隆抗体 1:25，兔anti-CD90 单克隆抗体 1:25（Boster，武汉； 中国）。在4℃ 一夜间进行原发性抗体孵化后，切片经 PBS 缓冲液冲洗几次，室温下以适当的二级抗体孵化1小时。使用的二次抗体如下: Cy3-conjugated山羊抗兔 1:100， FITC 共轭山羊抗山羊抗体 1:100（全部来自武汉 Boster；中国）。经PBS 洗涤后，各切片用DAPI（Beyotime、武汉；中国）复染，并安装防褪色介质。对于抗原特异性控制，在相应的孵化步骤中，使用抗体稀释剂代替原发抗体或二次抗体。免疫荧光显微镜是用Olympus显微镜。
对于免疫化学，小鼠肿瘤组织标本固定在4% 多聚甲醛，嵌入石蜡后，组织切片并脱蜡，然后抗原检索。这些切片被 PBS冲洗，用稀释 anti-CD31（1:50），anti-ki67（1:800）抗体在4℃孵化过夜。接下来是使用染色套件（Biofavor 生物，武汉，中国）根据制造商的操作说明进行。
管生成试验
生长因子- reduced Matrigel（BD，美国）被添加到一个平底的预冷96孔板。在 37℃in 5% CO2 孵化后1h。CD90high gb-mscs 和 CD90low gb mscs 分别接种（2×104/孔）入含无血清培养液（0%DMEM）、标准培养液 （10%DMEM）、无血清胶质瘤条件培养液（0%gb CM）或标准胶质瘤条件培养液 （S gb CM），96孔板进一步孵化。三个孔分别用于每个条件培养液样品。6小时后，细胞使用 1uM Calcein AM（Tocris，美国）标记，管形成的照片用荧光显微镜记录。用 ImageJ 软件（美国 NIH）对管状结构的总段长度进行了三个随机视场分析。
请参见图3和图4。骨髓间充质干细胞的介入在新生血管中有很好的建立。重点研究了在胶质母细胞瘤条件培养液中 gb-MSCs 亚型血管形成能力。在不同培养液（0%DMEM、10%DEMM、0%gb CM、S gb）培养6 h后， CD90low gb-MSCs 的管形成明显增加，与 CD90high 对应的比较。对总管段长度也进行了量化，CD90low gb MSCs 的管段长度明显长于 CD90high对应（见图4中A、B部分）。通过细胞划痕试验评估迁移、在0%DMEM，10%DMEM，0%gb CM，S gbCM培养CD90low gb-mscs 和 CD90high gb-mscs 8h， 并发现 CD90low在不同的培养液（0%DMEM， 10%DEMM， 0%gb CM， s gb CM）的迁移能力显著大于培养的 CD90low gb-MSCs（见图3中A、B、E部分）。
Elisa 实验
各培养液（0%DMEM、CD90high CM和 CD90low CM）上清液中 VEGF、bFGF、SDF-1α、CCL5、MMP9 和 IL-6 的含量均由其各自的 ELISA 试剂盒 （Neobioscience，中国）测定。所有过程都按照制造商的操作说明进行。无血清培养液用作对照组。在450nm测定吸光度。重复进行三次。
请参见图5。为了分析不同培养液中几种因素的分泌情况， 采用 ELISA 法对上清液进行了采集和测定。我们发现 CD90low CM的 VEGF、FGF-2、IL-6 的水平高于 CD90high CM和 0%DMEM （见图 5 中A、B、C部分）。CD90+ CM的 CCL5、MMP9 和 SDF-1α水平高于 CD90lowCM和 0%DMEM（见图5中D、E、F部分）。
RNA 提取和 Clariom D 微阵列。
CD90high gb-mscs 和 CD90low gb-MSCs 在标准培养液中培养，当90% 融合时，总 RNA 从三个不同批次 CD90high gb-mscs 样品中提取，三个相应的 CD90low gb mscs样品使用加入Triozl 试剂 （Invitrogen，美国）标准培养液培养。在用Nanodrop （托马斯费舍尔）对总 RNA 质量进行分析后，用GeneChip WT PLUS Kit制备 cDNA，并用AffymetrixGeneChip® Clariom D arrays（Affymetrix， Santa Clara， CA， USA）杂交，根据Affymetrix 的说明（射流技术协议 FS450_0003）清洗并扫描。利用 Clariom D QC 工具软件（Affymetrix， 美国加州圣克拉拉）测量和总结了微阵列数据。
请参见图7。在标准培养液中培养的 CD90high gb mscs 和 CD90low gb mscs 的分析表明， CD90high 和CD90low 在 LncRNA和 mRNA 有不同的表达谱。随后进行了一项试验，以确定 CD90high 和 CD90low 之间的差异表达基因，共4977个基因（2055 上调和2922下调）被确定（见图7中 A部分）。利用 Targetscan、LncRNA.ORG 和 LnRDBA 数据库对差异表达mRNA 靶基因进行预测，并将结果应用于Gene Ontology （Go）术语分析（见图7中 B部分），包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和蜂窝组件（CC）。预测的靶基因被丰富的细胞迁移、增殖、黏附力和血管生成基因。此外，差异基因显示在散布图， 染色体热图（见图7中 C、D部分）。
体内实验
雄性 BALB/c- nu 小鼠（4-6周；北京生命河实验动物）保存在华中科技大学的动物设施中，并在特定的无病原体条件下进行维护。所有动物程序都是按照经批准的议定书规定的机构准则进行的。对于 BALB/c- nu小鼠脑中 U87 胶质瘤细胞的颅内植入，动物立体定向接种 10ul 5×105 U87细胞悬浮到右额叶（前囟前0.5-1.5mm、中线偏右1.5-2.5mm）使用汉密尔顿注射器（汉密尔顿公司）。悬浮液缓慢注射一次一微升，每两分钟注射一次。注射后等待5分钟。实验组分为 CD90high CM7、CD90low CM。每组有六只老鼠。
请参见图6。检查 CD90high CM和 CD90low CM是否显示肿瘤支持胶质瘤细胞在体内。U87 细胞分别与 CD90high CM， CD90low CM被植入同时进入小鼠的大脑（N = 6小鼠/组）。U87与 CD90high CM培养的小鼠的生存时间不明显短于 CD90low CM培养的小鼠（见图6中D部分）。但是， CD90high CM的肿瘤大小明显大于 CD90low CM， 表明 CD90high CM增加了U87 在体内的增殖和肿瘤的生成（见图 6中A、B、C部分）。此外， ki-67 在 CD90high CM和CD90low CM肿瘤标本中的表达被证实。
同时，在人类高等级胶质瘤标本中， CD90-CD105+ 的 gb-MSCs主要位于血管周围，紧紧附着在血管壁上。然而， CD90+CD105+ gb-mscs 大多远离血管， 提示 CD90+ gb-mscs 有极差的血管生成能力（见图 6中F部分）。
评价：Gb-MSCs作为人类高等级胶质瘤的基质细胞，在胶质瘤的生长发育中起着至关重要的作用。间充质干细胞被吸收入恶性胶质瘤的部位，通过分泌细胞因子或细胞直接接触效应的间接作用在基质细胞和肿瘤细胞之间建立持续的和双边的分子交叉关系。骨髓间充质干细胞 CD90 阳性表达，而实验表明 CD90 在gb-MSCs中的表达是轻微的，同时，我们还发现，CD90low gb-mscs 的数量比 CD90high gb mscs 多。CD90low gb-mscs 和CD90high 的起源还不清楚。两种分化趋势模型在 mRNA 表达模式上存在显著差异，表明CD90- 细胞与 CD90+ 型细胞相比，产生了更高的VEGF 和PGE2。本申请中 CD90low gb-mscs和 CD90high gb mscs 在胶质瘤的进展中发挥的重要的作用的以及 Clariom D 差异。
细胞因子是肿瘤细胞与肿瘤微环境间交叉活动的重要组成部分。本申请中检测的细胞因子包括 SDF-1α、 CCL5、MMP9在胶质瘤细胞的增殖和迁移中起着重要的作用。
肿瘤血管生成是肿瘤进展的重要因素。人胶质瘤相关的骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境中不仅诱导成毛细血管, 而且附着于内皮细胞, 并参与血管构建. 当然, 这种情况的发生需要脑胶质瘤微环境中分泌/分泌生长因子，如 VEGF、细胞因子β、TGFβ和 bFGF，它们与胶质瘤血管生成密切相关。IL-6 对肿瘤微环境肿瘤血管生成有促进作用。此外，MSCs 与肿瘤免疫抑制效应有积极的交互作用，IL-6 作为免疫抑制因子的主要肿瘤来源，在确定胶质瘤恶性肿瘤中起着至关重要的作用。因此，我们评价 vegf、bfgf、IL-6、MMP9、SDF-1α、CCL5 CD90high CM，CD90low CM和 0%DMEM，发现 vegf、bfgf、IL-6 在 CD90low CM高于 CD90high CM。相反，与 CD90low 表型细胞相比， CD90high 细胞产生更高的数量的MMP9、SDF-1α、CCL5。
分析了 CD90low gb-MSCs 和CD90high gb-MSCs 中 Clariom D 的差异，并对基因本体进行了预测。表明 G 蛋白偶联雌激素受体通路与肿瘤进展、血管生成和免疫系统调控有关。在未来的研究中，我们将确定特异的 mRNA 和目标基因对, 这是显着不同的 CD90lowgb-mscs 和 CD90high gb mscs, 以促进血管生成和肿瘤进展。
根据 CD90 表面标记的表达形式，我们从 gb mscs 中精心筛选 CD90low gb mscs和 CD90high gb mscs。我们的研究表明，CD90low gb-MSCs 在增殖、迁移和血管生成能力方面比 CD90high 更活跃。此外，CD90high CM在体内和体外显著促进胶质瘤细胞的生长。此外，我们提供了证据表明，CD90high 和 CD90low gb-MSCs 的Clariom D 表达模式的可能会影响肿瘤的增殖、迁移和入侵。所有这些结果表明，胶质瘤相关的骨髓间充质干细胞在胶质瘤进展中不同的 CD90 表达方式有所不同。靶向 CD90 分子可以提供一个潜在的选择，以抑制胶质瘤的生长, 并为胶质瘤患者提供好处。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）脑胶质瘤相关间充质干细胞的CD90high和CD90low两种细胞亚群采用免疫磁珠分离实验进行体外筛选分离，培养，鉴定，U87-MGs、CD90high gb-mscs 和 CD90low gb-mscs 在的T25 组织培养瓶中播种，使用DMEM培养液，含10%胎牛血清，含100U/ml的青霉素/100mg/mL的链霉素，细胞密度在50-60% 融合，培养液被不含血清培养液DMEM和 含10%胎牛血清DMEM取代，然后培养72h，培养瓶的条件培养液收集后，在1000g下离心10分钟，以去除细胞和细胞碎片，获取CD90high条件培养液，CD90low条件培养液，无血清胶质瘤条件培养液和标准胶质瘤条件培养液；
（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行体外检测，包括CCK8实验、Transwell 实验、细胞划痕实验、Adhesion assay和促内皮细胞成管实验，其中，促内皮细胞成管实验包括将CD90high gb-mscs 和CD90low gb-mscs 分别接种入含无血清培养液、标准培养液、无血清胶质瘤条件培养液或标准胶质瘤条件培养液孵化，6小时后，细胞标记，用荧光显微镜记录管形成的照片，用软件对管状结构的总段长度进行三个随机视场分析；CCK8实验将U87 细胞被接种在96孔板，待细胞贴壁，然后，用100µl 的无血清培养液、CD90high条件培养液、CD90low条件培养液取代 U87 细胞培养液，培养1、2、3、4天，CD90low gb-mscs 和 CD90high gb-mscs 分别替换为接种在100µl 的无血清培养液，辅以10%胎牛血清孵化 1、2、3、4 小时，在不同的时间点，10μl的 CCK-8 被添加到每个孔并在37℃，5% CO2 的培养箱中进行孵化2小时，然后，用微板块计数器测量每一个孔在450 nm的吸光度，重复进行至少三次；Transwell实验将5x
Figure DEST_PATH_IMAGE002
/毫升的100µl 含U87 细胞的无血清DMEM培养液接种到Transwell的上室，800 µl 的含有无血清培养液，CD90high条件培养液和CD90low条件培养液的测试样本被放置在Transwell的下室，细胞迁移在37℃ 5% CO2条件下培养24小时，在孵化后，培养液被吸弃，在聚碳酸酯膜上表面残留的细胞用棉签除去，迁移到下表面的细胞用Giemsa染色20分钟，在倒置显微镜下进行细胞计数，通过对x200的5个随机视野中的细胞计数，确定了迁移细胞的平均数量；细胞划痕实验为细胞接种在6孔板块孵化直到90-100%融合，然后，用10µl 枪头尖端制造划痕十字线，用PBS缓冲液洗去划痕产生的细胞碎片，然后，培养液被替换为无血清培养液，标准培养液，无血清胶质瘤条件培养液或标准胶质瘤条件培养液，在0和8小时，用Olympus显微镜拍摄了划痕的面积；Adhesionassay为将U87 细胞分别用CD90high条件培养液和CD90low条件培养液处理，然后，细胞按照
Figure 27783DEST_PATH_IMAGE002
个/孔的密度接种在预涂基质胶粘剂96孔板上，并在无血清培养液，CD90high条件培养液和CD90low条件培养液，37℃，5% CO2 的培养箱中进行孵化，用 PBS缓冲液冲洗三次，将非黏附细胞去除，并在100 ul普通培养液中加入10 ul cck8孵化2小时，然后，用微板块计数器测量每一个孔在450 nm的光密度来分析细胞黏附力；
（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行动物体内对比实验，包括肿瘤大小，动物生存期，肿瘤组织内Ki-67和CD31表达；组织内CD90和CD105双标荧光免疫表达，生物信息学分析CD90表达和TCGA数据库内GBM患者预后；
（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群通过基因芯片技术进行差异性表达测试，分析了脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群中Clariom D 的差异，同时通过对无血清培养液，CD90high条件培养液，CD90low条件培养液进行ELISA实验对分泌生长因子进行测试，所述ELISA检测的细胞因子为VEGF、bFGF、SDF-1α、CCL5、MMP9 和 IL-6。
2.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：所述脑胶质瘤相关间充质干细胞还进行细胞分化培养实验。
3.如权利要求2所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：所述细胞分化培养包括成骨细胞的分化、脂肪细胞的分化和软骨细胞的分化。
4.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）Adhesion assay中采用450nm处进行吸光度的检测。
5.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中采用小鼠进行注射式植入。
6.如权利要求5所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：小鼠注射坐标为前囟前0.5-1.5mm、中线偏右1.5-2.5mm，进针深度3-4mm。
7.如权利要求5所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：注射频率为每100-140秒一次，每次注射量为0.8-1.2微升。
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