BR112015003839B1

BR112015003839B1 - Método para produzir lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

Info

Publication number: BR112015003839B1
Application number: BR112015003839-5A
Authority: BR
Inventors: Masayo Takahashi; Hiroyuki KAMAO
Original assignee: Riken
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2021-12-28
Also published as: CA2882802A1; CN104755611A; EP2889374B1; CN113088481A; US20150250828A1; WO2014030749A1; BR112015003839A2; KR20150047538A; AU2013306720A1; KR102254082B1; US11033586B2; ZA201501976B; JPWO2014030749A1; AU2013306720B2; JP6292557B2; EP2889374A1; CA2882802C; SG11201501319PA; HK1210496A1; EP2889374A4

Abstract

método para produzir lâmina de células do epitélio pigmentar da retina. a invenção refere-se a um método para produzir uma lâmina de células incluindo uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula angiogênica, o método incluindo uma etapa para laminar uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula angiogênica construída de células constituintes de vaso sanguíneo ou células-tronco tendo potência angiogênica; e fornece uma lâmina de células obtido por este método. a invenção também fornece uma lâmina de células para transplante incluindo uma camada de célula formada por células do epitélio pigmentar da retina obtidas induzindo-se a diferenciação in vitro de células-tronco ou células progenitoras, uma membrana basal secretada destas células, e uma camada de célula angiogênica construída de células constituintes de vaso sanguíneo ou células-tronco tendo potência angiogênica.

Description

Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um método de produção de uma lâmina de células, compreendendo laminar uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de células que constituem vasos sanguíneos depois do transplante. A presente invenção também refere-se a uma lâmina de células para transplante, compreendendo uma camada de célula formada de células do epitélio pigmentar da retina, uma membrana basal, e uma camada de células que constituem um vaso sanguíneo depois do transplante.

Fundamentos da Técnica

[0002] Um método de tratar doenças de degeneração da retina transplantando-se células do epitélio pigmentar da retina na forma de uma lâmina de células, que é próximo à forma in vivo. Por exemplo, um transplante de tecido autólogo incluindo transplante de uma lâmina de células de células do epitélio pigmentar da retina cortadas (como uma camada que acompanha a coroide) de um tecido da retina de um paciente com degeneração macular relacionada à idade para uma área macular danificada está sendo praticado (por exemplo, documentos que não de patente 1 a 3). A lâmina de células derivado do tecido do paciente é problemático em que um risco de invasão devido a uma cirurgia de excisão na retina do paciente, além da cirurgia de transplante, é criado, a taxa de incidência de complicação é alta, a taxa eficiente de melhora e manutenção estável da função macular depois do transplante são baixas e semelhantes.

[0003] Como um método de utilizar células do epitélio pigmentar da retina cultivadas ex vivo, sem contar com a coleta da retina do paciente, um método usando uma lâmina de células obtido cultivando-se células do epitélio pigmentar da retina em uma membrana artificial ou membrana amniótica para transplante, de modo a cobrir uma falta de firmeza do epitélio de monocamada muito frágil, é conhecido. Entretanto, membranas artificiais não são adequadas para o transplante visto que elas são diferentes da membrana basal produzida in vivo pela célula do epitélio pigmentar da retina por si só na composição, propriedades, firmeza e semelhantes, e facilmente induzem inflamação e rejeição associadas com estas. Em relação a isto, os presente inventores relataram um método de formar facilmente uma lâmina de células composto de células do epitélio pigmentar da retina cultivadas ex vivo e uma membrana basal produzida pelas células por si só (por exemplo, documento de patente 1 e semelhantes). Visto que uma lâmina de células obtido por este método tem uma membrana basal composta de componentes similares como aqueles do organismo vivo, ele é facilmente enxertado, tem firmeza, é superior em propriedade de manejo e é preferível para tratamentos de transplante.

[0004] Transtornos de epitélio pigmentar da retina algumas vezes desenvolvem fibrilação coroidal e atrofia como complicações, e defici- ência de microvasos coroidais, e mostram o fornecimento indisponível de nutrientes ao epitélio pigmentar da retina e células visuais. O transplante de uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina tendo uma membrana basal em tais sintomas apresenta um problema que um efeito de tratamento desejado é difícil de obter devido à ausência de microvasos coroidais, que impede o fornecimento suficiente de nutrientes e oxigênio ao epitélio pigmentar da retina depois do transplante e exibição suficiente de função in vivo das células transplantadas.

[0005] Por outro lado, como um método de tratamento utilizando regeneração vascular, um método incluindo transplantar células progenitoras endoteliais, formar vasos sanguíneos in vivo e tratar uma doença da retina é conhecido. Por exemplo, o documento de patente 2 relata que células progenitoras endoteliais derivadas da medula óssea injetadas no corpo vítreo são localizadas nos astrócitos da retina, vascularmente incorporadas para formar vasos sanguíneos da retina normais. Entretanto, pelo método do documento de patente 2 que regenera um vaso sanguíneo da retina utilizando-se a localização de células progenitoras endoteliais com o astrócito, foi impossível formar um vaso sanguíneo coroidal que protege células do epitélio pigmentar da retina e células visuais separadamente localizadas.

Lista de Documentos documentos de patente

[0006] documento de patente 1: WO2011/142364

[0007] documento de patente 2: JP-A-2005-538742 documentos que não de patente

[0008] documento que não de patente 1: Am J Ophthalmol. 2012 Jan; 153(1):120-7

[0009] documento que não de patente 2: Acta Ophthalmol. 2011 Sep; 89(6):e490-5

[0010] documento que não de patente 3: Br J Ophthalmol. 2011 Mar; 95(3):370-5

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problemas a serem Resolvidos pela Invenção

[0011] O problema da presente invenção é desenvolver um novo método de produzir uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina convenientemente e estavelmente sem usar uma membrana artificial, fornecendo assim uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina para transplante, que mostra uma taxa de enxerto alta e é superior em funcionalidade mesmo para pacientes com doenças tais como doenças de degeneração da coriorretina, particularmente, miopia alta, uveíte severa e semelhantes associadas com atrofia coriorre- tiniana.

Meios de Resolver os Problemas

[0012] Os presentes inventores conduziram estudos intensos e desenvolveram um método de produção de uma lâmina de células, compreendendo laminar uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e células tendo uma capacidade de formar vaso sanguíneo depois do transplante. Eles descobriram que uma lâmina de células obtido por tal método contém tanto uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina quanto uma camada de célula de formação vascular, e portanto, quando transplantado a um paciente, ele reconstrói não apenas o tecido da retina mas também a coroide através de formação vascular, e é útil para o tratamento de doenças de degeneração da coriorretina, particularmente doenças degenerativas da retina associadas com transtornos da coroide. Além disso, quando a camada de célula do epitélio pigmentar da retina foi preparada semeando-se células do epitélio pigmentar da retina em uma camada de gel de colágeno e cultivando-se as mesmas, a camada de célula do epitélio pigmentar da retina obtida manteve uma membrana basal entre o gel de colágeno e a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina, teve capacidade de secreção da citocina e adesividade entre células similares àquelas de células do epitélio pigmentar da retina in vivo, a camada de célula do epitélio pigmentar da retina pode ser facilmente destacada do substrato da cultura celular decompondo-se o gel de colágeno com colage- nase, enquanto mantendo a membrana basal. Além disso, as células que constituem a camada de célula do epitélio pigmentar da retina manteve a expressão de um marcador específico de célula do epitélio pigmentar da retina. Com base nestas descobertas, eles conduziram outros estudos e concluíram a presente invenção. Consequentemente, a presente invenção fornece o seguinte: [1] Um método de produzir uma lâmina de células compre-endendo uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular, compreendendo uma etapa de laminar a camada de célula do epitélio pigmentar da retina e a camada de célula de formação vascular. [2] O método de produção de [1], em que a camada de célula do epitélio pigmentar da retina e a camada de célula de formação vascular são laminadas tal que a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. [3] O método de produção de [1] ou [2], em que a camada de célula de formação vascular é composta de pelo menos uma célula selecionada do grupo consistindo em hemangioblasto, célula progenitora endotelial vascular, e célula endotelial vascular. [4] O método de produção de [1] ou [2], em que a camada de célula de formação vascular é composta de um tecido ou célula de-rivados de um paciente a ser transplantado com a lâmina de células, ou uma célula derivada de um doador tendo um tipo de HLA combinado com o tipo de HLA do paciente. [5] O método de produção de qualquer um de [1] a [4], em que a camada de célula do epitélio pigmentar da retina é uma lâmina de células produzido por um método compreendendo as etapas seguintes: semear e cultivar células do epitélio pigmentar da retina em um gel de colágeno para formar uma lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina, e decompor o gel de colágeno com colagenase para destacar a lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina. [6] O método de produção de qualquer um de [1] a [5], em que a célula do epitélio pigmentar da retina é obtida induzindo-se a diferenciação de célula ES, célula iPS ou célula progenitora. [7] Uma lâmina de células produzido pelo método de qualquer um de [1] a [6]. [8] Uma lâmina de células para transplante, compreendendo uma camada de célula formada com células do epitélio pigmentar da retina obtidas induzindo-se diferenciação de células-tronco ou células progenitoras ex vivo, uma membrana basal secretada das ditas células, e uma camada de célula de formação vascular.

Efeito da Invenção

[0013] De acordo com a presente invenção, é possível produzir facilmente e estavelmente uma lâmina laminado de células do epitélio pigmentar da retina, que tem uma camada de célula constituinte vascular capaz de complementar um vaso sanguíneo coroidal deficiente no organismo vivo e fornecer oxigênio e nutrientes à retina depois do transplante. A lâmina de células da presente invenção é extremamente útil, visto que ele é superior na taxa de enxerto e funcionalidade, e também pode tratar doenças de degeneração da coriorretina severas, para as quais o transplante de célula do epitélio pigmentar da retina simples não pode fornecer facilmente um efeito de tratamento suficiente, tais como doenças de degeneração da coriorretina, particularmente, miopia alta e uveíte severa e semelhantes, que são associadas com atrofia coriorretiniana.

Breve Descrição dos Desenhos

[0014] A figura 1 mostra a coloração imuno-histoquímica de uma seção tecidual de um hospedeiro transplantado com a lâmina de células da presente invenção.

[0015] A figura 2 mostra (A) um gráfico que mostra o número de vasos formados por células progenitoras endoteliais vasculares em cada meio, e (B) um gráfico que mostra o número de vasos formados por células progenitoras endoteliais vasculares em cada meio usando matrigel.

[0016] A figura 3 mostra os resultados do teste da capacidade de secreção da citocina da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina.

Descrição das Modalidades

[0017] A presente invenção é explicada em detalhe no seguinte.

[0018] A presente invenção fornece um método de produzir uma lâmina de células compreendendo uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular, compreendendo uma etapa de laminar a camada de célula do epitélio pigmentar da retina e a camada de célula de formação vascular (o mé-todo de produção da presente invenção).

Camada de célula de formação vascular

[0019] A camada de célula de formação vascular na presente in venção é composta de células tendo capacidade de formação vascular (células de formação vascular). Quando a lâmina de células obtido pelo método de produção da presente invenção é transplantado em um sítio com defeito na coroide de um paciente com degeneração da retina, as células de formação vascular contidas na lâmina de células reconstituem um vaso sanguíneo (preferivelmente, vaso sanguíneo co- roidal) no sítio transplantado, que fornece oxigênio e nutrientes às células do epitélio pigmentar da retina, e semelhantes. Portanto, a lâmina de células obtido pelo método de produção da presente invenção pode exibir um efeito de tratamento superior por ser transplantado em, particularmente, um sítio com defeito na coroide de um paciente com uma doença degenerativa da retina associada com um defeito na coroide.

[0020] Embora a célula de formação vascular na presente inven ção possa ser uma célula derivada de qualquer mamífero contanto que ela seja derivada de um mamífero (por exemplo, ser humano, macaco, camundongo, rato, cão, bovino, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, co-elho, hamster, porquinho-da-índia etc.), ela é preferivelmente uma cé- lula derivada de ser humano.

[0021] Exemplos da célula de formação vascular a ser usada na presente invenção incluem hemangioblasto, célula progenitora endote- lial vascular, célula endotelial vascular e semelhantes. Entre estas, cé-lula progenitora endotelial vascular e semelhantes são preferíveis como a célula de formação vascular, visto que as células são consideradas como sendo facilmente incorporadas na rede vascular sanguínea existente, no processo de formação vascular in vivo depois do trans-plante. A camada de célula de formação vascular pode conter células exceto a célula de formação vascular e componentes exceto células, e pode ser composta de uma população de células ou tecido contendo as células de formação vascular. Geralmente, não menos do que 70 % (preferivelmente não menos do que 80 %, mais preferivelmente não menos do que 90 %, o mais preferivelmente 100 %), das células que constituem a camada de célula de formação vascular são células de formação vascular (preferivelmente, vascular células progenitoras en- doteliais).

[0022] A célula progenitora endotelial vascular refere-se a uma cé lula tendo uma capacidade de diferenciar em uma célula endotelial vascular e comprometida em diferenciar em uma célula endotelial vas-cular. Padrões de expressão múltiplos de marcadores da superfície celular foram relatados para célula progenitora endotelial vascular, e é conhecido que pelo menos uma definição unificada com base no padrão de expressão do marcador de superfície celular é difícil. Exemplos do padrão de expressão do marcador de superfície de células progenitoras endoteliais vasculares relatadas anteriormente incluem CD34+, CD44+, VEGFR2+ (KDR) para célula endotelial vascular CD34 positiva derivada de célula mononuclear do sangue periférico (Science. 14 de Fev de 1997; 275 (5302): 964 - 7); CD31+, VEGFR2+, eNOs+, CD105+, CD34+/-, CD133-, CD45-, CD14-, CD117- para célula progeni- tora endotelial vascular derivada de célula mononuclear do sangue do cordão umbilical (célula de formação de colônia endotelial humana (ECFCs (marca registrada), fabricada por Takara Bio)); e semelhantes. Embora elas sejam consideradas resultar da diferença nos tecidos dos quais elas são derivadas, estágio de diferenciação, método de coleta e semelhantes, elas são comuns em que todas elas têm uma capacidade de diferenciar em células endoteliais vasculares. Como usado aqui, portanto, a célula progenitora endotelial vascular é definida como "uma célula tendo uma capacidade de diferenciar em uma célula endotelial vascular, e comprometida em diferenciar em uma célula endotelial vascular", e o padrão de expressão do marcador de superfície celular tolera a presença de combinações múltiplas.

[0023] É conhecido que as células progenitoras endoteliais vascu laresestão contidas no saco vitelínico, sangue periférico, medula óssea, sangue do cordão umbilical, células mononucleares destes e se-melhantes, e podem ser preparadas destes tecidos ou células por um método de isolamento conhecido. Exemplos do método de isolamento incluem um método de isolamento usando expressão de marcadores da superfície celular tais como CD34, receptor 2 de VEGF (KDR) e semelhantes como um índice e usando pérolas magnéticas e FACS; um método utilizando unidades de formação de colônia de célula en- dotelial (CFU-ECs) comercialmente disponíveis (N Engl J Med. 2003; 348: 593 - 600) e semelhantes. Como exemplos específicos do método de produção de células progenitoras endoteliais vasculares derivadas de célula mononuclear do sangue periférico ou célula mononuclear da medula óssea, um método incluindo cultivar células mononuclea- res separadas do sangue periférico ou medula óssea por um método convencionalmente usado em um meio de promoção de diferenciação endotelial vascular contendo citocinas tais como VEGF e semelhantes, e recuperar células progenitoras endoteliais vasculares como células aderidas; um método de separar e recuperar células progenitoras en- doteliais vasculares, do sangue periférico como uma célula CD34 posi-tiva, que foram recrutadas da medula óssea usando-se G-CSF (Yaku- gaku Zasshi 2007 125(5) 841 - 845 etc.) e semelhantes são conhecidos.

[0024] Além disso, a diferenciação da célula progenitora endotelial vascular de várias células pode ser induzida. Por exemplo, um método de induzir a diferenciação de fibroblasto através de desdiferenciação; um método de induzir a diferenciação de célula-tronco pluripotente tal como célula ES, célula iPS e semelhantes em célula progenitora endo- telial vascular (WO 2008/056779, WO 2009/035217 e semelhantes) e semelhantes são conhecidos. Estas células progenitoras endoteliais vasculares podem ser usadas sozinhas ou tipos múltiplos destas podem ser usados em combinação. Como a célula progenitora endotelial vascular na presente invenção, uma mistura de células contendo ou-trascélulas pode ser usada. Por exemplo, células da medula óssea, célula mononuclear do sangue periférico, célula mononuclear da me-dulaóssea e semelhantes contendo célula progenitora endotelial vascular também podem ser usadas diretamente.

[0025] Células endoteliais vasculares podem ser preparadas por um método conhecido tal como um método incluindo separar as células de um tecido vascular no organismo vivo usando-se a expressão de um marcador de superfície celular tal como CD31 e semelhantes como um índice e usando-se pérolas magnéticas e FACS; um método de induzir diferenciação cultivando-se a célula progenitora endotelial vascular mencionada acima na presença de um indutor tal como VEGF e semelhantes, e semelhantes. Além disso, diferenciação de várias células nas células endoteliais vasculares também pode ser induzida, e é conhecido, por exemplo, diferenciação nas células endote- liais vasculares pode ser induzida de células-tronco somáticas tais como células-tronco mesenquimais, células-tronco derivadas de tecido adiposo e semelhantes; células progenitoras tais como células proge-nitoras do músculo cardíaco, células precursoras neuronais e seme-lhantes;células-tronco pluripotentes tais como células ES, células iPS e semelhantes; e semelhantes. Além disso, como um produto comer-cialmentedisponível de células endoteliais vasculares, células endote- liais microvasculares humanas (HMVEC), células endoteliais vasculares do cordão umbilical humanas (HUVEC), células endoteliais aórti- cas humanas (HAEC, HAOEC) e semelhantes podem ser obtidas.

[0026] Hemangioblasto é uma célula de origem comum da célula progenitora endotelial vascular e célula-tronco hematopoiética, e pode ser preparada de um tecido vascular no organismo vivo usando-se a expressão de marcador de superfície celular tal como CD133, CD144, CD45 e semelhantes como um índice por um método conhecido tal como um método de separação usando pérolas magnéticas e FACS e semelhantes. Como padrões de expressão de marcador de superfície celular de hemangioblasto, por exemplo, uma combinação de CD133+, CD144+, CD45+, CD34+, VEGFR2+, CD31- foi relatada (Stem Cells Dev. Jun de 2004;13(3):229 - 42.).

[0027] Como a célula de formação vascular a ser usada na pre sente invenção, um tecido ou célula derivados de um paciente a ser transplantado com a lâmina de células obtido pelo método de produção da presente invenção, ou uma célula derivada de um doador tendo tipo de HLA combinado com o tipo de HLA do paciente e semelhantes podem ser utilizados. Como a célula de formação vascular a ser usada na presente invenção, uma célula progenitora endotelial vascular é particularmente preferível.

[0028] Como uma célula de formação vascular preferível para uso de transplante autólogo, por exemplo, um tecido do paciente, uma célula coletada deste, e uma célula derivada da célula iPS estabelecida da célula somática do paciente (célula iPS do paciente) são preferi-velmente usadas, visto que uma sobrecarga no paciente é pequena. Sendo menos invasivo, sangue periférico do paciente, uma célula mo-nonuclear coletada deste, uma célula derivada da célula mononuclear do sangue periférico do paciente, uma célula derivada da célula iPS do paciente e semelhantes são preferivelmente usadas. Estas podem ser preparadas usando uma célula derivada do paciente pelo método an-teriormente mencionado.

[0029] Como uma célula de formação vascular preferível para alo- transplante, por exemplo, uma célula derivada de um doador tendo tipo de HLA combinado com o tipo de HLA do paciente é preferivelmente usada para suprimir a rejeição. A célula derivada de um doador tendo tipo de HLA combinado com o tipo de HLA do paciente inclui um tecido do doador combinando o tipo de HLA do paciente, uma célula coletada deste, células derivadas de célula iPS estabelecidas do doador tendo tipo de HLA combinado com o tipo de HLA do paciente (célula iPS doadora combinada de HLA) e semelhantes. O tecido e célula com tipo de HLA combinado também podem ser obtidos do banco de medula óssea, banco de célula e semelhantes. Em particular, uma célula tendo 3 locos (HLA-A, HLA-B, HLA-DR) homozigotos mostrando rejeição baixa com outros tipos de HLA é preferível como uma célula doadora visto que ela combina com muitos tipos de HLA de pacientes.

[0030] A camada de célula de formação vascular é preferivelmente laminada na camada de célula do epitélio pigmentar da retina tal que a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. A camada de célula de formação vascular apenas precise ser laminada em pelo menos uma parte da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. A densidade das células de formação vascular em relação à camada de célula do epitélio pigmentar da retina não é particularmente limitada, e pode ser determinada como apropriada em consideração do estado do transtorno da coroide no sítio transplantado, afinidade para rede vascular sanguínea existente e semelhantes. A densidade da célula de formação vascular em relação à camada de célula do epitélio pigmentar da retina é, por exemplo, cerca de 1*102 a 1*106 céluias/cm2, preferivelmente cerca de 1*103 a 1*105 células/cm2, visto que células de formação vascular são facilmente incorporadas nos vasos sanguíneos existentes no organismo vivo quando a densidade das células de formação vascular é baixa. Quando o transplante em um paciente com dano grande na coroide e número acentuadamente pequeno de vasos sanguíneos remanescentes é desejado, uma camada de célula de formação vascular tendo uma densidade alta das células de formação vascular é preferível.

[0031] Como uma etapa de laminar uma camada de célula do epi- télio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular (etapa de laminação), um método conhecido pode ser utilizado como um método de laminar camadas de células múltiplas. Exemplos de tal método incluem um método de laminar camadas de células múltiplas semelhantes a lâmina, um método incluindo semear células que constituem uma camada de célula, nas outras camadas de célula se-melhantes a lâmina, um método incluindo colocar uma camada de células semelhante a lâmina na outra camada de célula cultivada em um recipiente de cultura, um método incluindo semear células que consti-tuem uma camada de célula, na outra camada de célula cultivada em um recipiente de cultura e semelhantes. Na presente invenção, é preferível laminar duas camadas de célula tal que a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. Por exemplo, uma camada de células semelhante a lâmina do epitélio pigmentar da retina é colocada em uma camada de célula de formação vascular cultivada em um recipien- te de cultura, por meio da qual a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. Uma lâmina de células obtido laminando-se camadas em um recipiente de cultura pode ser diretamente colocado para uso.

[0032] Em uma modalidade preferível da etapa de laminação na presente invenção, células de formação vascular são semeadas usando um meio em um recipiente de cultura e cultivadas para formar uma camada de célula de formação vascular no recipiente de cultura, uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina formado separada-menteé colocado na camada de célula de formação vascular, e o meio é aspirado, por meio do qual ambas as camadas de célula são laminadas tal que a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. O meio anteriormente mencionado não é particularmente limitado contanto que ele seja uma composição capaz de manutenção da cultura de células de formação vascular e células do epitélio pigmentar da retina. Geralmente, tanto um meio para cultura de célula de formação vascular quanto um meio para cultura de célula progenitora endotelial vascular podem ser usados. Por exemplo, como um meio para cultura de célula progenitora endotelial vascular, produtos comercialmente disponíveis tais como meio EGM-2 (fabricado por Takara Bio) e semelhantes podem ser usados. Depois da semeadura de células de formação vascular, é preferível repousar as células por pelo menos o tempo necessário para que as células adiram à superfície do recipiente de cultura e formem uma camada de célula de formação vascular (por exemplo, cerca de 10 h a 24 h) e, onde necessário, um período de cultura de cerca de 1 dia a 3 dias pode ser determinado para obter crescimentoaté atingir um número de célula desejado.

[0033] O método de produção da presente invenção pode conter ainda uma etapa de recuperar uma lâmina de células em que uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular são laminadas (etapa de recuperação). Um método de recuperar a lâmina de células é não particularmente limitado contanto que ele possa recuperar a lâmina enquanto mantendo a estrutura da lâmina, e um método conhecido pode ser usado. Exemplos de tal método incluem um método de destacar uma lâmina de células de um recipiente de cultura por um tratamento enzimático, um método usando um recipiente de cultura não adesivo de célula, um método incluindo laminar as camadas de célula usando-se um recipiente de cultura tratado na superfície para ser adesivo de célula, e destacar a lâmina de células formado por tratamento com uma enzima etc., e semelhantes. Na presente invenção, quando células de formação vascular aderem a uma superfície de um recipiente de cultura e são fixadas na etapa de laminação, a camada de célula do epitélio pigmentar da retina é facilmente laminada na camada de célula de formação vascular. Portanto, um método incluindo laminar camadas de célula usando-se um recipiente de cultura tratado na superfície para ser adesivo de célula e destacar a lâmina de células formado do recipiente de cultura é preferível. Em uma modalidade, uma lâmina de célulasé formado em um recipiente de cultura tratado na superfície com um polímero responsivo à temperatura, e a lâmina de células é destacado por um tratamento da mudança de temperatura. O polímero res- ponsivo à temperatura refere-se a um polímero tendo uma força de hidratação que muda em uma maneira dependente da temperatura e, por exemplo, um polímero responsivo à temperatura tendo uma força de hidratação que muda em uma faixa de temperatura de 0 a 80 °C é descrito em JP-A-2-211865. Para ser específico, por exemplo, ele pode ser obtido por homopolimerização ou copolimerização dos monô- meros seguintes. Exemplos do monômero utilizável incluem composto de (met)acrilamida, derivado de (met)acrilamida substituído por N-(ou N,N-di)alquila, e derivado de éter vinílico. No caso de um copolímero, quaisquer dois ou mais tipos destes podem ser usados. Além disso, monômeros exceto os monômeros mencionados acima, a copolimeri- zação com monômero iônico para melhorar a adesividade e o cresci-mento de células, enxerto ou copolimerização de polímeros, ou uma mistura de polímero e copolímero pode ser usada. O polímero respon- sivo à temperatura passa por hidratação e desidratação em resposta à mudança de temperatura, e a faixa de temperatura desta é 0 °C a 80 °C, preferivelmente 10 °C a 50 °C, mais preferivelmente 20 °C a 45 °C. Um polímero responsivo à temperatura preferível é, por exemplo, po- li(N-isopropilacrilamida). Poli(N-isopropilacrilamida) é um polímero tendo uma temperatura de solução crítica mais baixa de 31 °C. Quando ele está em uma forma livre, ele passa por desidratação em água em não menos do que 31 °C, em que a cadeia de polímero coagula e o polímero é turvo. Reciprocamente, em uma temperatura de menos do que 31 °C, a cadeia de polímero é hidratada e o polímero é dissolvido em água. Quando poli(N-isopropilacrilamida) é fixada na superfície de um recipiente de cultura, poli(N-isopropilacrilamida) é desidratada em não menos do que 31 °C, e a superfície do recipiente de cultura adquire hidrofobicidade e mostra adesividade às células (por exemplo, célula de formação vascular, célula do epitélio pigmentar da retina). Em uma temperatura de menos do que 31 °C, poli(N-isopropilacrilamida) é hidratada, e a superfície do recipiente de cultura adquire hidrofilicidade e mostra não adesividade às células. Utilizando tal responsividade à temperatura, as células são cultivadas em uma temperatura (por exemplo, 37 °C) não menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa (31 °C para poli(N-isopropilacrilamida)) na etapa de lami- nação para obter adesão da lâmina de células ao recipiente de cultura, uma temperatura menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa (por exemplo, 20 °C) é fornecida na etapa de recuperação para permitir o destacamento e isolamento da lâmina de células do recipiente de cultura sem aplicando um tratamento enzimático. Recipientes de cultura revestidos com tal polímero responsivo à temperatura são des-critos em JP-A-2-211865, JP-A-05-192138, JP-A-2008-220354 e se-melhantes.Além disso, tal recipiente de cultura é comercialmente dis-ponível como um recipiente de cultura sensível à temperatura (fabricado por Cellseed, UpCell (marca registrada)). Células de formação vascular semeadas em um recipiente de cultura são preferivelmente aderidas sobre o recipiente de cultura de modo que elas serão certamente transferidas para a camada de célula do epitélio pigmentar da retina.

[0034] Em uma modalidade preferível, células de formação vascu lar são cultivadas em adesão em um recipiente de cultura responsivo à temperatura revestido com poli(N-isopropilacrilamida) em uma tempe-ratura (por exemplo, 37 °C) não menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa (31 °C) para formar uma camada de célula de formação vascular. Depois, uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina separadamente preparada (lâmina de células do epitélio pigmentar da retina) é laminada na camada de célula de formação vascular enquanto mantendo uma temperatura (por exemplo, 37 °C) não menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa, tal que a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. Depois da incubação em uma temperatura (por exemplo, 37 °C) não menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa por um tempo suficiente para que a camada de célula de formação vascular e a camada de célula do epitélio pigmentar da retina fossem aderidas entre si, a cultura é resfriada a uma temperatura (por exemplo, 20 °C) menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa, por meio da qual a lâmina de células formado é destacado do recipiente de cultura. Resfriamento e destacamento são realizados, por exemplo, aspirando-se o meio, adicionando-se um meio com uma temperatura (por exemplo, 20 °C) menos do que a temperatura de solução crítica mais baixa ao recipiente de cultura, deixando o mesmo repousar por um tempo necessário para destacar a lâmina de células do recipiente de cultura (por exemplo, não menos do que 30 min), e recuperando-se a lâmina de células laminado. O meio é o mesmo como aqueles relatados como exemplos na modalidade preferível da etapa de laminação. Quando o tempo de repouso depois da adição do meio de resfriamento é muito longo, o destacamento da lâmina de células torna-se difícil. Assim, é preferível recuperar a lâmina dentro de um dia a partir da adição do meio.

[0035] O método de produção da presente invenção também pode compreender uma etapa de aplicar um tratamento de formação vascular à camada de célula de formação vascular. A etapa de tratamento de formação vascular pode ser uma pré-etapa ou uma etapa subsequente da etapa de laminar uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular. O tratamento de formação vascular pode ser realizado por um método conhecido e, por exemplo, um método conhecido de induzir formação de tubo tal como um método de cultivar células de formação vascular em um gel de colágeno na presença de um fator tal como VEGF, IGF-1, PDGF e semelhantes, um método de contatar uma camada de célula de formação vascular com matrigel e semelhantes pode ser aplicado. Visto que a célula do epitélio pigmentar da retina secreta VEGF, o so- brenadante da cultura de célula do epitélio pigmentar da retina também pode ser usado para a formação vascular.

[0036] Quando um tratamento de formação vascular é aplicado, todas as células de formação vascular que constituem a camada de célula de formação vascular podem ter uma estrutura vascular, ou apenas uma parte destas pode ter uma estrutura vascular. Na camada de célula de formação vascular, é desejável constituir um vaso san guíneo tendo uma estrutura adequada para o ambiente do sítio de transplante in vivo. Por exemplo, quando a lâmina de células obtido pelo método de produção da presente invenção é transplantado sem nenhum tratamento de formação vascular ex vivo e sem uma estrutura vascular, células de formação vascular transplantadas formam espontaneamente um vaso sanguíneo in vivo, durante o processo este que o vaso sanguíneo é ligado a vasos sanguíneos existentes para formar facilmente uma rede vascular sanguínea funcional. Por outro lado, quando o dano sobre a coroide é grande e os vasos sanguíneos re-manescentessão acentuadamente pequenos em número, a reconstrução de uma rede vascular sanguínea com base na estrutura vascular transplantada pode ser preferivelmente promovida aplicando-se o tratamento de formação vascular à camada de célula de formação vascular.

[0037] A camada de célula de formação vascular pode conter um ou tipos múltiplos de células exceto as células de formação vascular, por exemplo, células que sustentam formação vascular ou angiogêne- se tal como célula-tronco hematopoiética e semelhantes, células constituintes de vaso sanguíneo exceto a célula endotelial vascular tais como célula do músculo liso vascular, célula sanguínea e semelhantes. A camada de célula de formação vascular pode conter ainda componentes exceto célula, por exemplo, um fator que promove angiogê- nese, e semelhantes.

2. Camada de célula do epitélio pigmentar da retina

[0038] A célula do epitélio pigmentar da retina a ser usada na pre sente invenção pode ser uma célula primária diretamente coletada de um globo ocular, ou uma célula depois de várias passagens. As células primárias do epitélio pigmentar da retina podem ser isoladas por um método conhecido. Por exemplo, no caso de células do epitélio pigmentar da retina derivadas do globo ocular, um globo ocular cada- vérico é isolado, rapidamente dividido no seguimento equatorial, o cor-povítreo e a retina são removidos e tratados com colagenase, hialuro- nidase e semelhantes conforme necessário, as células são coletadas raspando-se com um raspador de células, ou tratamento com tripsina ou solução de EDTA para liberar as células da membrana de Bruch, deixadas repousar em um meio de cultura para induzir a adesão à placa de cultura e crescimento, e as células cultivadas no número reque-ridosão apropriadamente migradas com um tratamento com tripsina etc. para suficientemente assegurar o número de célula.

[0039] Além disso, estas células também podem ser as células obtidas induzindo-se a diferenciação de células-tronco pluripotentes indiferenciadas tais como célula-tronco embrionária (célula ES), célula- tronco pluripotente induzida (célula iPS) e semelhantes, células-tronco incluindo células-tronco somáticas tais como célula-tronco neural e semelhantes, ou células progenitoras incluindo célula progenitora neural e célula progenitora retiniana. A célula ES também pode ser uma célula ES produzida por reprogramação nuclear de uma célula somática.Além disso, como a célula-tronco, a célula alvo pode ser preparada induzindo-se diferenciação de célula-tronco pluripotente induzida (célula iPS) relatada nos últimos anos. A célula iPS é uma célula-tronco induzida derivada de célula somática tendo propriedades equivalentes àquelas da célula ES, que pode ser produzida introduzindo-se uma substância de reprogramação nuclear particular (ácido nucleico, proteína, composto de peso molecular baixo etc.) em uma célula somática [Takahashi, K. e Yamanaka, S., Cell, 126: 663 - 676 (2006); Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861 - 872 (2007)]. As condições e meio usados para diferenciação da célula-tronco anteriormente mencionada na célula diferenciada alvo pode seguir condições e meio convencionalmente conhecidos, ou pode ser apropriadamente determinada por aqueles de habilidade comum na técnica. Na presente invenção, uma célula obtida induzindo-se diferenciação de célula-tronco ou célula progenitora, preferivelmente célula-tronco pluripotente, é preferivelmente usada como a célula do epitélio pigmentar da retina a ser usada para a lâmina de células, visto que uma célula do epitélio pigmentar da retina em um estágio de maturação apropriado pode ser preparada, e particu-larmente,células do epitélio pigmentar da retina comparativamente imaturas podem ser preparadas e uma lâmina de células pode ser vantajosamente formado. Além disso, quando a lâmina de células a ser produzido pela presente invenção é para o transplante, o uso de uma célula iPS é preferível visto que uma lâmina de células obtido usando uma célula somática do indivíduo, que recebe transplante, como uma fonte de célula iPS não tem antigenicidade contra o indivíduo. Quando uma célula-tronco é induzida para diferenciar, por exemplo, célula ES ou célula-tronco pluripotente humanas tais como célula iPS e semelhantes são cultivadas em um meio de diferenciação de célula ES adicionado com antagonista Wnt tais como Dkk-1, CKI-7 e semelhantes e antagonista Nodal tais como Lefty A, SB-431542 e semelhantes. Quando cultivados por um dado período, Rx, Pax6 e Mitf, que são marcadores de célula progenitora retiniana, são expressados, e células do epitélio pigmentar da retina humanas podem ser obtidas por observação morfológica com um microscópio óptico, confirmando-se as células tendo uma forma poligonal e pigmento [Neuroscience Letters 24 de Jul de 2009 458(3) 126 - 31, Journal of Cell Science 1 de Set de 2009 122(Pt 17) 3169 - 79].

[0040] A camada de célula do epitélio pigmentar da retina na pre sente invenção é composta de uma camada de células do epitélio pigmentar da retina arranjadas em uma superfície plana e, por exemplo, pode ser composta como uma lâmina de células compreendendo células do epitélio pigmentar da retina produzidas por um método conhecido. Como um método de produção de tal lâmina de células (ca- mada de célula do epitélio pigmentar da retina), por exemplo, o método descrito em WO 2011/142364 é conhecido.

[0041] Uma modalidade preferível da lâmina de células da presen te invenção é uma lâmina de células em que a camada de célula do epitélio pigmentar da retina é produzida por um método incluindo as etapas seguintes (em seguida a ser referido como "o método do colá- geno"): semear e cultivar células do epitélio pigmentar da retina em um gel de colágeno para formar uma lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina, e decompor o gel de colágeno com colagenase para destacar a lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina.

[0042] Embora a célula do epitélio pigmentar da retina a ser se meada na etapa (1) possa ser uma célula derivada de qualquer mamífero contanto que ela seja derivada de um mamífero (por exemplo, ser humano, macaco, camundongo, rato, cão, bovino, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, coelho, hamster, porquinho-da-índia etc.), ela é prefe-rivelmente uma célula derivada de ser humano.

[0043] No método do colágeno, as células do epitélio pigmentar da retina são cultivadas semeando-se em um gel de colágeno. O coláge- no usado para o gel de colágeno pode ser qualquer um contanto que ele seja derivado de um mamífero (por exemplo, ser humano, macaco, camundongo, rato, cão, bovino, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, co-elho, hamster, porquinho-da-índia etc.) e, por exemplo, colágeno deri-vado de ser humano ou suíno é usado. Exemplos do tecido do qual o colágeno é derivado incluem tendão, pele e semelhantes. Embora o tipo do colágeno possa ser qualquer um, um exceto o colágeno que constitui a membrana basal humana é preferível, um exceto colágeno tipo IV é especificamente preferível. Destes, o colágeno tipo I é prefe- rivelmente usado. Embora um gel de colágeno possa ser produzido por, por exemplo, um método de produção convencionalmente conhecido, na presente invenção, um composto de gel de uma rede de fibra de colágeno é produzido induzindo-se a fibrogênese do colágeno, como descrito no Exemplo mencionado abaixo. Visto que o colágeno fi- brótico tem resistência e flexibilidade em combinação, ele é fácil de manejar, mostra boa manutenção de proliferação celular e diferenciação celular, e é preferível como o gel de colágeno a ser usado na presente invenção. Além disso, o colágeno a ser usado na presente invenção é necessário para manter as células, que são semeadas no gel de colágeno, na superfície do gel sem deixá-las penetrar na camada de gel. Como o colágeno, portanto, preferido é um em que o gel tem a resistência necessária para proliferação celular e, por exemplo, o colá- geno tendo uma quantidade grande de reticulação intermolecular é preferível. Como tal colágeno, o colágeno derivado do tendão pode ser mencionado.

[0044] Embora a concentração de colágeno do gel de colágeno anteriormente mencionado possa estar em qualquer faixa contanto que ela possa fornecer um gel tendo resistência que permita o enxerto e crescimento de células do epitélio pigmentar da retina, e que satisfaça a solubilidade facilitando a decomposição pela colagenase, viscosidade que permita manejo fácil e semelhantes, ela é preferivelmente 0,1 % (P/V) a 0,5 % (P/V), mais preferivelmente 0,2 % (P/V) a 0,3 % (P/V). Quando a concentração de colágeno do gel de colágeno for menos do que 0,1 % (P/V), a resistência do gel de colágeno torna-se insuficiente, e portanto, a taxa de colonização e taxa de proliferação celular de células do epitélio pigmentar da retina diminuem. Quando a concentração de colágeno do gel de colágeno excede 0,5 % (P/V), o tempo de um tratamento com colagenase para decompor o gel de co- lágeno torna-se longo, que é temido para exercer uma influência ad- versa sobre as células.

[0045] Embora o volume de uma solução mista de gel de colágeno usada para a produção do gel de colágeno anteriormente mencionado varie dependendo da área de cultura e forma de um substrato de cultura a ser usado para a cultura celular, ele é preferivelmente cerca de 100 μl a cerca de 250 μl, mais preferivelmente cerca de 150 μl a cerca de 200 μl, por área unitária (cm2). Quando a quantidade da solução mista de gel de colágeno é muito pequena, uma camada de gel de colágeno tendo uma parte central fina devido à influência de uma tensão superficial aplicada à superfície do gel é formada, e a lâmina tende a ser danificado durante a ablação da lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina, visto que as células diretamente contatam com um substrato de cultura para quando as células do epitélio pigmentar da retina são cultivadas. Quando a quantidade da solução mista de gel de colágeno está em excesso, uma camada de gel de colágeno espessa é formada em um substrato de cultura, que relativamente reduz a quantidade do meio de cultura, e, portanto, a manutenção da cultura não é fácil de realizar, o tratamento com colagenase leva tempo, e danos sobre a lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina são temidos.

[0046] Na etapa (1), uma lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina pode ser produzido semeando-se e cultivando-se as células do epitélio pigmentar da retina anteriormente mencionadas no gel de colágeno de um substrato da cultura celular. O substrato da cultura celular na presente invenção não é particularmente limitado contanto que ele seja para cultura celular. Exemplos deste incluem recipientes de cultura tendo uma membrana porosa tal como transwell e semelhantes, frasco, frasco de cultura de tecido, placa, placa de petri, placa de cultura de tecido, multi placa, microplaca, placa de microrreservatórios, multiplaca, placa de reservatórios múltiplos, lâmina da câmara, placa de petri, tubo, bandeja, bolsa de cultura e garrafa cilíndrica. Recipientes de cultura tendo uma membrana porosa são preferíveis, visto que um tratamento com colagenase e uma operação de corte da lâmina de células são convenientemente realizados. Por exemplo, um transwell comercialmente disponível é preferivelmente usado. Exemplos do material do substrato da cultura celular no presente relatório descritivo incluem, mas são não limitados a, materiais inorgânicos tais como metal, vidro, cerâmica, silício e semelhantes, materiais orgânicos representados por elastômero, plástico (por exemplo, resina de poliéster, resina de polietileno, resina de polipropileno, resina de ABS, náilon, resina acrílica, fluororresina, resina de policarbonato, resina de poliuretano, resina de metilpenteno, resina de fenol, resina de melamina, resina de epóxi, resina de cloreto de vinila).

[0047] O número das células do epitélio pigmentar da retina a se rem semeadas pode estar em qualquer faixa contanto que ele seja uma densidade celular capaz de formar uma lâmina de células. Entretanto, quando a densidade celular é muito baixa, a forma da célula é ruim, o tempo de cultura antes de atingir confluência é longo, e além disso, o tempo necessário para a maturação e coloração celulares é longo. Quando a densidade celular é muito alta, similarmente, a proliferação celular é suprimida, o tempo de cultura antes de atingir confluência tende a ser longo, e as células podem parar de serem aglomeradas excessivamente. Portanto, a densidade das células a serem semeadas é preferivelmente cerca de 4,5x104 células/cm2 a cerca de 8,5x105 células/cm2, mais preferivelmente cerca de 8,5xio4 céiu- las/cm2 a cerca de 8,5x105 células/cm2, o mais preferivelmente cerca de 4,5x105 células/cm2.

[0048] Uma população de células de monocamada (lâmina de cé lulas) composta de células do epitélio pigmentar da retina pode ser formada cultivando-se as células do epitélio pigmentar da retina seme- adas em gel de colágeno em um meio de cultura. Um meio de cultura pode ser usado sem limitação particular contanto que ele seja um meio de cultura celular geralmente usado no campo pertinente. Por exemplo, meios basais descritos em "Japan tissue culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rd edition"página 581, publicado por Asakura Shoten, tal como meio F-10, meio F12, MEM, meio BME, DMEM, αMEM, meio IMD, meio ES, meio DM-160, meio Fisher, meio WE, meio RPMI1640 e semelhantes, podem ser usados. Além disso, soro (soro bovino fetal etc.), vários fatores de crescimento (EGF, FGF, HGF, PDGF etc.), antibiótico, aminoácido e semelhantes podem ser adicionados ao meio basal. O pH do meio é preferivelmente cerca de 6 a cerca de 8. Como para cultura, por exemplo, uma cultura primária é realizada geralmente em torno de 30 a cerca de 40 °C por cerca de 15 a cerca de 60 h até que as células do epitélio pigmentar da retina tornem-se confluentes. Posteriormente, uma cultura secundária é realizada por cerca de 1 semana a cerca de 2 meses enquanto mudando o meio, depois do que a cultura é realizada enquanto aerando e agitando onde necessário até a formação de uma lâmina de células. As células que constituem a lâmina de células obtidas por tal cultura são mantidas como células do epitélio pigmentar da retina. A manutenção das células como células do epitélio pigmentar da retina pode ser confirmada detectando-se BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP ou semelhantes como um marcador de diferenciação específico.

[0049] Visto que a lâmina de células formado na etapa (1) é aderi do ao gel de colágeno, por exemplo, quando ele é diretamente usado para transplante e semelhantes, o gel de colágeno é temido de impedir o enxerto em um receptor de transplante. Além disso, é temido que o gel de colágeno possa impedir a ligação e adesão de uma camada de célula de formação vascular e uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina. Se o gel de colágeno pode ser removido antecipa- damente, ele é conduzível para a solução de tal problema. Na etapa (2) da presente invenção, o gel de colágeno que adere aa lâmina de células formado na etapa (1) é decomposto por colagenase. Aqueles de habilidade comum na técnica podem selecionar a colagenase apropriada de acordo com o tipo do colágeno usado para preparar o gel de colágeno. Embora a colagenase a ser usada para a decomposição do gel de colágeno não seja particularmente limitada contanto que ela tenha uma atividade para digerir gel de colágeno, uma que não facilmente decomponha o colágeno que constitui a membrana basal humana (por exemplo, colágeno Tipo IV etc.) é preferível. Por exemplo, a cola- genase derivada de um microorganismo induzido de Clostridium (Clos-tridium histolyticum) ou Streptomyces (Streptomyces parvulus), que estão disponíveis em um nível comercial, seguros e têm uma atividade enzimática alta, pode ser usada.

[0050] Como a atividade da colagenase mencionado acima, a ati vidadeespecífica em relação ao peso do colágeno no gel de colágeno é importante ao invés da atividade por peso unitário de colagenase e a atividade por volume unitário de uma solução de colagenase aquosa. A atividade específica da colagenase a ser usada para dissolver o gel de colágeno (atividade de colagenase/peso de colágeno) é preferivel-mentenão menos do que 0,1 U/mg. Quando a atividade específica da colagenase é menos do que 0,1 U/mg, a dissolução do gel de coláge- no pode não preferivelmente tomar muito tempo ou o gel pode ser não preferivelmente dissolvido insuficientemente. Ela esta mais preferivel-mente dentro da faixa de 0,1 a 10.000 U/mg, mais preferivelmente 1 a 3.000 U/mg.

[0051] No método do colágeno, um método de agir a colagenase em gel de colágeno não é particularmente limitado. Uma solução de colagenase preparada usando, como um solvente, um meio ou uma solução isotônica tendo uma capacidade de tamponamento pode ser adicionada a um meio, ou um gel de colágeno ligado à célula destacado de uma placa de cultura celular pode ser imerso na solução de co- lagenase anteriormente mencionada. Visto que um transwell é usado como um substrato da cultura celular na presente invenção, uma camada de gel de colágeno pode ser exposta recuperando-se uma inserção e removendo-se a membrana no fundo da inserção, e o gel de colágeno exposto é preferivelmente imerso diretamente na solução de colagenase mencionada acima.

[0052] No método do colágeno, o tempo de dissolver o gel de co- lágeno por colagenase não é particularmente limitado. Quando o tempo de agir a colagenase for muito longo, funções da célula tais como capacidade de adesão, capacidade proliferativa e semelhantes podem não preferivelmente ser decompostas. Embora o tempo de dissolução por colagenase esteja sujeito à mudança devido à atividade específica da colagenase, temperatura, a forma do gel de colágeno, método de tratamento de colagenase e semelhantes, ele é geralmente de 15 min a 60 min. O tratamento com colagenase pode ser um único tratamento ou realizado várias vezes.

[0053] A temperatura durante o tratamento de gel de colágeno por colagenase no método do colágeno é preferivelmente ajustada dentro da faixa de 10 a 42 °C, mais preferivelmente 30 a 40 °C, mais preferi-velmente 36 a 38 °C, visto que a fluxibilidade do citoplasma da célula geralmente diminui e a capacidade metabólica diminui quando a tem-peratura dentro de organismos vivos torna-se mais baixa em não menos do que 10 °C (cerca de 30 °C em ser humano), a proteína é desnaturada e a função da célula diminui quando a temperatura excede 42 °C, e a temperatura ideal da colagenase é no máximo 37 °C e uma temperatura abaixo deste nível prolonga o tempo de dissolução.

[0054] No método do colágeno, quando a dissolução do gel de co- lágeno procede, a lâmina de células é gradualmente destacado do gel, e finalmente liberado na solução de colagenase. Para recuperar a lâmina de células, a lâmina de células pode ser mecanicamente destacado do gel remanescente, ou pode ser recuperado depois da dissolução completa do gel. Embora o destacamento mecânico encurte o tempo até a recuperação da lâmina de células, visto que a lâmina de células pode ser destruído, ele é preferivelmente recuperado depois da dissolução completa do gel.

[0055] Embora a lâmina de células recuperado como mencionado acima possa ser diretamente usado para a etapa de laminação com uma camada de célula de formação vascular, visto que a colagenase residual pode inibir a adesividade à camada de célula de formação vascular, ele é preferivelmente lavado com um meio ou uma solução isotônica tendo uma capacidade de tamponamento. A temperatura durante a limpeza pode ser determinada de acordo com o tratamento de dissolução de gel de colágeno por colagenase. Para remover suficientemente a colagenase residual, a lâmina é preferivelmente lavado uma ou mais vezes com um meio ou uma solução isotônica tendo uma capacidade de tamponamento.

[0056] Na lâmina de células composto de células do epitélio pig mentar da retina obtido pelo método do colágeno, a citocina específica para uma célula do epitélio pigmentar da retina é secretada com a po-laridade similar àquela em organismos vivos, e resistência elétrica transepitelial (TER) como sendo um índice de ligação iônica de adesão próxima entre as células elevado como em organismos vivos. Portanto, ele tem uma função de barreira de camada de célula similar àquela em organismos vivos. De acordo com o método do colágeno, uma lâmina de células composto de células do epitélio pigmentar da retina e tendo funções similares àquelas em organismos vivos pode ser obtido.

[0057] Na lâmina de células obtido pelo método do colágeno, um junção estreita é formada entre células do epitélio pigmentar da retina, e uma membrana basal é formada em uma superfície de contato com o gel de colágeno. No presente relatório descritivo, a "membrana basal"é uma membrana formada dos componentes produzidos a partir de células do epitélio pigmentar da retina, e significa uma membrana contendo pelo menos uma parte do componente da membrana basal (em seguida a ser referida como uma "membrana basal de células do epitélio pigmentar da retina"). A membrana basal da célula do epitélio pigmentar da retina em organismos vivos está presente como uma película fina entre uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de colágeno interna que constitui a membrana de Bruch, e é uma matriz extracelular tendo colágeno Tipo IV, laminina, sulfato de heparana proteoglicano (perlecan), nidogen e semelhantes como componentes representativos. A membrana de Bruch é uma película fina entre a camada de célula do epitélio pigmentar da retina e coroide, e tem uma estrutura de 5 camadas de uma membrana basal de células do epitélio pigmentar da retina, uma camada de colágeno interna, uma camada de elastina, uma camada de colágeno externa, e uma membrana basal de lâmina capilar da coroide. Uma lâmina de células composto de células do epitélio pigmentar da retina obtido pelo método do colágeno contém uma parte (membrana basal de célula do epitélio pigmentar da retina) da estrutura da membrana de Bruch. A formação da junção estreita pode ser confirmada observando-se a forma de célula intimamente aderida hexagonalmente formada, e expressão de ocludina, ZO-1 e semelhantes entre células por imunocolo- ração. A formação da membrana basal pode ser confirmada observando-se a expressão de marcadores da membrana basal tais como laminina, sulfato de heparana proteoglicano (perlecan), nidogen, ou colágeno Tipo IV e semelhantes em uma superfície celular por imu- nocoloração, ou observação com um microscópio eletrônico de varredura.

[0058] Geralmente, células do epitélio pigmentar da retina cultiva das em uma placa de cultura produzem componentes da membrana basal, mas é extremamente difícil destacar as células na forma de uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina utilizável destacado de uma placa de cultura (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381 - 390). De acordo com o método do colágeno, células do epitélio pigmentar da retina junto com uma membrana basal produzida a partir de células do epitélio pigmentar da retina podem ser recuperadas como uma lâmina sem utilizar uma membrana artificial. Visto que células do epitélio pigmentar da retina formam uma estrutura de monocamada, quando elas são manejadas isoladamente, a estrutura da lâmina é desintegrada e as células são dispersas em unidades celulares. Assim, o transplante destas como uma lâmina é extremamente difícil. Por outro lado, visto que uma lâmina de células composto de células do epitélio pigmentar da retina obtido pelo método do colágeno acompanha uma membrana basal e tem firmeza suficiente, ele não é facilmente enrugado durante a recuperação, que torna o manejo deste extremamente fácil. Consequentemente, visto que a operação de laminação da camadas de célula de formação vascular pode ser realizada tranquilamente, e a montagem em um dispositivo de transplante de célula e uma operação de transplante podem ser realizadas tranquilamente, o transplante de célula pode ser realizado com invasão mínima, e espera-se que tanto o efeito quanto o prognóstico sejam melhorados. Além disso, visto que uma lâmina de células composto de células do epitélio pigmentar da retina obtido pelo método do colágeno acompanha uma membrana basal, é extremamente vantajoso para o transplante em uma doença em que a membrana basal é simultaneamente desordenada. Por exemplo, degeneração macular relacionada à idade algumas vezes acompanha transtorno de membrana de Bruch. Quando uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina obtido pelo mé- todo do colágeno é usado como uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina no método de produção da presente invenção mencionado acima, uma membrana basal da lâmina de células produzido pelo método compensa pela parte desordenada, por meio da qual a taxa de enxerto da lâmina de células pode ser melhorada, e um efeito de tratamento desta também pode ser esperado. Consequentemente, no método de produção da presente invenção, quando uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina obtido pelo método do colá- geno é usado como uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina, a lâmina de células produzido é preferível como uma lâmina para o transplante do que recebe uma doença com uma membrana basal desordenada, e pode ser preferivelmente utilizado como uma lâmina para o transplante particularmente alvejando degeneração macular relacionada à idade.

[0059] O método do colágeno pode conter ainda a etapa (3) se guinte: confirmar a presença ou ausência de uma membrana basal na superfície de contato entre a lâmina de células destacado e o gel de colágeno.

[0060] Na etapa (3), a formação de uma lâmina de células tendo uma camada de célula composta de células do epitélio pigmentar da retina e uma membrana basal pode ser determinada confirmando-se a presença ou ausência da membrana basal da lâmina de células. A presença ou ausência da membrana basal pode ser confirmada por um método similar à confirmação anteriormente mencionada da formação da membrana basal, por exemplo, expressão de um marcador de membrana basal, observação com um microscópio eletrônico de varredura e semelhantes. Para a detecção da membrana basal, a expressão de um marcador de membrana basal pode ser confirmada em qualquer sítio da célula (por exemplo, citoplasma, membrana celular, membrana nuclear e semelhantes). Preferivelmente, um marcador ex-pressado em uma superfície de contato com o gel de colágeno é alve-jado.

[0061] O marcador de membrana basal no presente relatório des critivo inclui um produto de transcrição, um produto de tradução ou um produto de decomposição de um gene especificamente expressado na membrana basal. Exemplos de tal gene incluem laminina, sulfato de heparana proteoglicano (perlecan), nidogen, colágeno Tipo IV e seme-lhantes. Destes, laminina, colágeno Tipo IV e semelhantes, que são os componentes principais da membrana basal, são preferivelmente usados.

[0062] Uma amostra a ser usada para "confirmar a presença ou ausência de uma membrana basal na superfície de contato entre a lâmina de células destacado e o gel de colágeno" não é particularmente limitada contanto que ela contenha um marcador de membrana basal (por exemplo, RNA, proteína, produto de decomposição deste e semelhantes) derivado da lâmina de células (ou célula) destacado na etapa (2).

[0063] A expressão do gene marcador de membrana basal quando a amostra mencionada acima é RNA pode ser examinada preparando- se uma fração de RNA (por exemplo, RNA total, mRNA) da célula da lâmina de células destacado na etapa (2) e detectando-se um produto de transcrição do gene marcador contido na fração, ou diretamente detectando-se um produto de gene marcador na célula sem extrair o RNA da célula.

[0064] Quando uma fração de RNA (por exemplo, RNA total, mRNA) é preparada a partir da célula, ela pode ser preparada usando um método conhecido tal como método de ultracentrifugação de gua- nidina-CsCl, método AGPC e semelhantes. Usando um kit de extração de RNA comercialmente disponível (por exemplo, RNeasy Mini Kit; fa- bricado por QIAGEN etc.), RNA total com pureza alta pode ser preparado rapidamente e convenientemente a partir de uma quantidade traço de uma amostra. Exemplos do método para detectar um produto de transcrição de um gene marcador de membrana basal em uma fração de RNA incluem um método usando hibridização (Northernblot, dot blot, análise de fragmento de DNA etc.), um método usando PCR (RT- PCR, PCR competitiva, PCR em tempo real etc.) e semelhantes. Métodos de PCR quantitativos tais como PCR competitiva, PCR em tempo real e semelhantes são preferíveis visto que a variação da expressão de um gene marcador de membrana basal pode ser detectada rapidamente e convenientemente a partir de uma quantidade traço de uma amostra, e análise de fragmento de DNA é preferível visto que a variação da expressão de genes marcadores múltiplos pode ser coletivamente detectada e o desempenho de quantificação também pode ser também melhorado selecionando-se um método de detecção e semelhantes.

[0065] Quando hibridização por Northernblot ou dot blot é utilizada, o gene marcador de membrana basal pode ser detectado usando um ácido nucleico (sonda) capaz de hibridizar com um produto de transcrição do gene. Exemplos de tal ácido nucleico incluem ácido nucleico capaz de hibridizar com um produto de transcrição de um gene marcador de membrana basal sob condições severas altas. Exemplos das "condições severas altas" incluem reação de hibridização a 45 °C em 6xSSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguido por lavagem uma vez ou mais a 65 °C em 0,2*SSC/0,1 % SDS e semelhantes. Aqueles de habilidade comum na técnica podem ajustar facilmente a uma severidade desejada mudando-se apropriadamente a concentração de sal de uma solução de hibridização, temperatura da reação de hibridiza- ção, concentração da sonda, comprimento da sonda, número de má combinação, tempo de reação da hibridização, concentração de sal da lavagem, temperatura da lavagem e semelhantes. O ácido nucleico pode ser DNA, RNA ou quimera de DNA/RNA, com preferência dada ao DNA.

[0066] O ácido nucleico a ser usado como uma sonda pode ser de filamento duplo ou de filamento único. Quando de filamento duplo, ele pode ser DNA de filamento duplo, RNA de filamento duplo ou híbrido de DNA:RNA. Quando de filamento único, um filamento anti-sentido pode ser usado. Embora o comprimento do ácido nucleico não seja particularmente limitado contanto que ele possa hibridizar especifica-mente com o ácido nucleico alvo, ele é, por exemplo, não menos do que cerca de 15 bases, preferivelmente não menos do que cerca de 30 bases. Para permitir a detecção e quantificação do ácido nucleico alvo, o ácido nucleico a ser usado como uma sonda é preferivelmente rotulado. Exemplos do agente de rotulagem incluem radioisótopo, en-zima,substância fluorescente, substância luminescente e semelhantes. Exemplos do radioisótopo incluem , [3H], e semelhantes. Como a enzima, uma enzima estável tendo uma atividade específica alta é preferível, por exemplo, β-galactosidase, β-glucosidase, fosfatase alcalina, peroxidase, ácido málico desidrogenase e semelhantes. Exemplos da substância fluorescente incluem fluorescamina, isotiocianato de flu- oresceína e semelhantes. Exemplos da substância luminescente incluem luminol, derivado de luminol, luciferina, lucigenina e semelhantes.Além disso, biotina-(estrept)avidina também pode ser usada para ligar uma sonda e um rótulo.

[0067] Quando a hibridização Northern é utilizada, uma fração de RNA preparada como mencionado acima é separada por eletroforese em gel, transferida para uma membrana de nitrocelulose, náilon, diflu- oreto de polivinilideno e semelhantes, hibridizada sobe as "condições severas altas" mencionadas acima em um tampão de hibridização contendo uma sonda de rotulagem preparada como mencionado acima, e a quantidade do rótulo ligado à membrana é medida para cada faixa por um método adequado, por meio do qual o nível de expressão de cada gene marcador de membrana basal pode ser medido. Também no caso de dot blot, uma membrana manchada com uma fração de RNA é submetida a uma reação de hibridização similar (realizada para cada gene marcador), e a quantidade do rótulo na mancha é medida, por meio da qual o nível de expressão de cada gene marcador pode ser medido.

[0068] Quando análise de fragmento de DNA é utilizada, por exemplo, cDNA introduzido com um promotor adequado tal como pro-motor T7 e semelhantes por uma reação de transcrição reversa é sin-tetizado de uma fração de RNA preparada como mencionado acima, cRNA é sintetizado usando RNA polimerase (neste caso, cRNA rotuladoé obtido usando-se um mononucleotídeo rotulado com biotina e semelhantes como um substrato). O cRNA rotulado é contatado com um fragmento tendo a sonda mencionada acima imobilizada neste para realizar uma reação de hibridização, e a quantidade do rótulo ligado com cada sonda na fase sólida é medida, por meio da qual o nível de expressão de cada gene marcador de membrana basal pode ser medido. Este método é vantajoso em termos de rapidez e conveniência visto que o número dos genes marcadores diferenciados detectados (portanto, sondas como sendo de fase sólida) aumenta.

[0069] Por outro lado, quando um gene marcador é detectado sem extrair o RNA da célula, hibridização in situ pode ser usada como o meio de detecção. Neste método, a célula é imobilizada tratando-se a célula com um agente de fixação, preferivelmente um agente de fixação de precipitação, por exemplo, acetona, ou incubando-se a célula por um tempo curto em uma solução de formaldeído tamponante, ao invés de extrair o RNA da célula. Depois do imrecruitment, a célula é embutida em parafina para formar um bloco, e uma fatia cortada desta pode ser usada como uma amostra. Uma amostra embutida em parafina bem preparada pode ser preservada na temperatura ambiente por muitos anos. Como o ácido nucleico a ser usado como uma sonda, aqueles similares aos exemplos mencionados acima podem ser usa-dos.Hibridização in situé preferivelmente usada na presente invenção visto que a expressão de um marcador de membrana basal na superfície de contato entre a célula e gel de colágeno pode ser diretamente confirmada.

[0070] Alternativamente, a expressão de um marcador de mem brana basal na lâmina de células destacado na etapa (2) pode ser con-firmada preparando-se uma fração de proteína da lâmina de células (ou célula), e detectando-se um produto de tradução (isto é, proteína marcadora) do gene marcador contido na fração, ou diretamente de-tectando-se um produto de tradução do gene marcador na lâmina de células (ou célula), sem extrair a proteína da lâmina de células (ou cé-lula). Uma proteína marcadora pode ser detectada por um método de medição imunológico (por exemplo, ELISA, FIA, RIA, Western blot etc.) usando um anticorpo para cada proteína e, no caso de uma proteína que mostra uma atividade fisiológica mensurável tal como uma enzima e semelhantes, ela pode ser detectada medindo-se a atividade fisiológica de cada proteína marcadora por um método conhecido. Alternativamente, uma proteína marcadora também pode ser detectada por um método de espectrometria de massa tal como MALDI-TOFMS e semelhantes.

[0071] Um anticorpo para cada proteína marcadora pode ser obti do de acordo com uma técnica de produção de anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal geralmente usada e usando uma proteína mar-cadora ou proteína, ou um peptídeo parcial desta como um antígeno de imunização.

[0072] Quando métodos de medição imunológicos respectivos são aplicados à presente invenção, o ajuste de condições, operações es-peciais e semelhantes não é necessário. Um sistema de medição da proteína marcadora de membrana basal pode ser construído adicionando-se a consideração técnica geral daquele de habilidade comum na técnica a condições e métodos de operação gerais em cada método. Como para o detalhe destes meios técnicos gerais, compêndios, livros e semelhantes podem ser referidos. Por exemplo, "Radioimmunoassay" editado por Hiroshi Irie (Kodansha, publicado em 1974), "cont. Radioimmunoassay" editado por Hiroshi Irie (Kodansha, publicado em 1979), "Enzyme Immunoassay" editado por Eiji Ishikawa et al. (Igaku-Shoin, publicado em 1978), "Enzyme Immunoassay" editado por Eiji Ishikawa et al. (2a edição) (Igaku-Shoin, publicado em 1982), "Enzyme Immunoassay"editado por Eiji Ishikawa et al. (3a edição) (Igaku-Shoin, publicado em 1987), "Methods in ENZYMOLOGY", Vol. 70 (Immunochemical Techiniques (Part A)), ibidem, Vol. 73 (Immuno-chemical Techiniques (Part B)), ibidem, Vol. 74 (Immunochemical Te- chiniques (Part C)), ibidem, Vol. 84 (Immunochemical Techiniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibidem, Vol. 92 (Immunochemical Techiniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem, Vol. 121 (Immunochemical Techiniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (todos publicados por Academic Press) e semelhantes podem ser referidos.

[0073] Uma camada de célula de formação vascular pode ser dire tamente laminada na camada de célula do epitélio pigmentar da retina anteriormente mencionada, ou uma camada de célula de formação vascular pode ser laminada por intermédio de outra camada. Na presente invenção, uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular são preferivelmente laminadas diretamente.

[0074] A presente invenção também refere-se a uma lâmina de células compreendendo uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular, obtido pelo método de produção mencionado acima da presente invenção. A lâmina de células da presente invenção preferivelmente contém uma camada de célula formada de células do epitélio pigmentar da retina obtidas por indução de diferenciação ex vivo de células-tronco ou células progenitoras e uma camada de célula de formação vascular. Quando a camada de célula do epitélio pigmentar da retina é produzida pelo método do colágeno mencionado acima, a lâmina de células da presente invenção contém ainda membrana basal secretada da camada de célula do epitélio pigmentar da retina. A lâmina de células da presente invenção é preferível como um material de transplante para o tratamento da retina de pacientes com doenças oftálmicas. Exemplos da doença oftálmica incluem doenças de degeneração da coriorretina tais como degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, destacamento da retina, oculsão da artéria central da retina, oculsão da veia central da retina, atrofia coriorretiniana, destacamento do epitélio pigmentar da retina, uveíte (doença de Behcet, doença de Harada etc.), miopia excessiva (miopia patológica) e semelhantes.

[0075] Visto que a lâmina de células da presente invenção contém uma camada de célula de formação vascular, ele pode ser transplantado com uma taxa de enxerto alta para uma doença que envolve si-multaneamente a coroide afetada. Portanto, a lâmina de células obtido pelo método de produção da presente invenção é preferivelmente usado para o tratamento de, entre as doenças de degeneração da co- riorretina relatadas acima como exemplos, particularmente, doenças oftálmicas associadas com atrofia coriorretiniana, para as quais o transplante exclusivo de células do epitélio pigmentar da retina pode não fornecer um efeito de tratamento com facilidade (degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, atrofia coriorretinia- na, destacamento do epitélio pigmentar da retina, uveíte (doença de Behcet, doença de Harada etc.) e miopia excessiva (miopia patológica) etc.).

[0076] Além disso, visto que a lâmina de células da presente in venção tem uma membrana basal fabricada de componentes similares àqueles em organismos vivos, ela também pode ser utilizada para vá-riospropósitos de triagem tais como triagem de eficácia, avaliação de toxicidade e semelhantes nas doenças oftálmicas anteriormente men-cionadas. Para a triagem de eficácia para as doenças oftálmicas ante-riormente mencionadas, por exemplo, a lâmina de células da presente invenção pode ser aplicado para triagem quanto a uma substância tendo eficácia para as doenças oftálmicas anteriormente mencionadas, de acordo com o método descrito em JP-A- 2007-500509. Para ser específico, a lâmina de células da presente invenção é cultivado na presença ou ausência de uma substância candidata tendo eficácia sob as condições de estresse que causam possivelmente as doenças of-tálmicasanteriormente mencionadas (por exemplo, luz (por exemplo, luz branca, luz azul; luz induz a morte de células da retina, particular-mentecélulas fotorreceptoras, e pode ser um fator incitante de dege-neraçãomacular), A2E [retinoide N-retinilideno-N-retinil-etanolamina] (acúmulo de A2E é considerado contribuir para a neurodegeneração relacionada à idade de células da retina, particularmente expressão de degeneração macular), agregado ao fumo de cigarro (o fumo é consi-derado como sendo um fator de risco de degeneração macular), pressão externa (por exemplo, pressão hidrostática; aumento na pressão intraocular é suspeito de estar envolvido no glaucoma)), e a avaliação pode ser realizada com base no número de fotorreceptor que expressa rodopsina, e por imunocoloração usando anticorpo anti-caspase 3. Para avaliação de toxicidade, a lâmina de células da presente invenção pode ser aplicado para triagem quanto a uma substância tóxica de acordo com o método descrito em JP-A-2007-517210. Para ser espe-cífico, a lâmina de células da presente invenção é cultivado na presença ou ausência de uma substância candidata à toxicidade e usando o peptídeo marcador de integrina descrito em JP-A-2007-517210, esti-mulado com um laser em um comprimento de onda de 488 nm, e a fluorescência em 520 nm é detectada para avaliação. Além disso, a lâmina de células da presente invenção também pode ser utilizado como um modelo in vitro para a avaliação de várias funções in vivo da célula do epitélio pigmentar da retina tal como a função referindo-se à manutenção de células visuais tal como a capacidade fagocítica do segmento externo do fotorreceptor, ação neuroprotetiva e semelhan-tes,função de barreira do vaso sanguíneo da retina tal como ação de bombeamento, junção estreita, e semelhantes.

[0077] A lâmina de células para transplante da presente invenção pode ser usado para o tratamento das doenças mencionadas acima no ser humano e mamíferos exceto o ser humano (por exemplo, macaco, camundongo, rato, cão, bovino, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, co-elho, hamster, porquinho-da-índia etc.).

[0078] A faixa da área de doença à qual a lâmina de células para transplante da presente invenção pode ser aplicado é apropriadamente determinada dependendo da doença alvo, da espécie do animal, idade, sexo, peso corporal e sintoma do indivíduo em administração, e semelhantes.

[0079] A lâmina de células for transplante da presente invenção pode ser transplantado de uma vez ou em várias porções. O número de aplicação do transplante é determinado por profissionais de cuidado da saúde de acordo com a doença e a diretriz. Por exemplo, quando a doença é degeneração macular relacionada à idade, a lâmina de células para transplante da presente invenção pode ser transplantado duas ou mais vezes dependendo da severidade desta. Quando o transplante é realizado várias vezes, o intervalo não é particularmente limitado, e um período de vários dias a várias semanas pode ser colo-cado.

[0080] A lâmina de células para transplante da presente invenção é transplantado por profissionais de cuidado da saúde de acordo com um método de transplante apropriado de acordo com a diretriz. Quando a lâmina de células para transplante da presente invenção é transplantado sob a retina, um método de transplante incluindo liberar a lâmina em um fluxo de água a partir de uma agulha para injeção perfurada,até o sítio de transplante sob a retina do globo ocular, pode ser utilizado ou um aparelho terapêutico exclusivo para transplante também pode ser usado.

Exemplos

[0081] A presente invenção é explicada em mais detalhes a seguir, referindo-se aos Exemplos, que são meras exemplificações e não limi-tam o escopo da presente invenção de nenhum modo.

Exemplo de Produção 1. Preparação de células do epitélio pigmentar da retina

[0082] Como as células do epitélio pigmentar da retina a serem usadas no Exemplo de Produção 2 seguinte, usadas foram células do epitélio pigmentar da retina maduras (253G1, K11PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, 46a, K21EV15, 101EV3, K11EV9, 454E2) obtidas in-duzindo-se a diferenciação da célula iPS humana, e células do epitélio pigmentar da retina (hES, CMK6) obtidas induzindo-se a diferenciação da célula ES, de acordo com o método descrito em Neuroscience Letters 458 (2009) 126 - 131.

[0083] Células do epitélio pigmentar da retina derivadas de iPS humana 253G1 é uma célula do epitélio pigmentar da retina obtida por indução de diferenciação de célula iPS humana (253G1) derivada de ser humano saudável como descrito em Nature Biotechnology 26, 101 - 106, 2008.

[0084] 59SV2, 59SV3 e 59SV9 são células do epitélio pigmentar da retina obtidas induzindo-se a diferenciação de células iPS humanas derivadas do mesmo paciente com retinite pigmentosa. As células iPS foram estabelecidas por um método incluindo introduzir Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc em fibroblastos derivados da pele humana usando-se o vírus Sendai, de acordo com o método descrito em Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348 - 362.

[0085] K21EV15, 101EV3, K11EV9 e 454E2 são células do epitélio pigmentar da retina obtidas induzindo-se a diferenciação de células iPS humanas derivadas de pacientes com retinite pigmentosa diferentes um do outro. As células iPS foram estabelecidas por um método incluindo introduzir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc e LIN28 humanos em fibroblastos derivados da pele humana usando-se vetor epissômico, de acordo com o método descrito em Nat Methods. Maio de 2011; 8(5): 409 - 12).

[0086] Células do epitélio pigmentar da retina derivadas de iPS de macaco 46a é uma célula do epitélio pigmentar da retina obtida indu-zindo-sediferenciação de célula iPS de macaco (macaco cinomolgo), de acordo com o método descrito em Jpn. J. Transplant. 44 (2009) 231 - 235.

[0087] Células do epitélio pigmentar da retina derivadas de ES hES é uma célula do epitélio pigmentar da retina obtida induzindo-se diferenciação da linhagem de célula ES humana khES-1. CMK6 é uma célula do epitélio pigmentar da retina obtida induzindo-se a diferenciação de célula ES de macaco, de acordo com o método descrito em Neuroscience Letters 458 (2009) 126 - 131.

Exemplo de Produção 2. Método de produção de lâmina de células do epitélio pigmentar da retina Preparação da solução mista de gel de collagen

[0088] A SOLUÇÃO A, SOLUÇÃO B e SOLUÇÃO C seguintes foram preparadas.

[0089] solução A: colágeno Tipo I solúvel em ácido derivado do tendão de suíno Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3,0 mg/ml),

[0090] solução B: meio de cultura concentrado em concentração de 5 vezes DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 g) foi dissolvido em água MilliQ, e o volume total (50 ml) foi tratado com filtro, e

[0091] solução C: tampão para reconstituição

[0092] [NaOH 1N (50 mM, 5 ml), NaHCO3 (260 mM, 2,2 g) e HEPES (200 mM, 4,77 g) foram dissolvidos em água MilliQ, e o volume total (100 ml) foi tratado com filtro]

[0093] Sob resfriamento, a solução B (2 vol) foi misturada (amarelo claro) com solução A (7 vol) sem borbulhamento. Depois, a solução C (1 vol) foi adicionada e a mistura foi misturada (rosa claro) para fornecer uma solução mista de gel de colágeno a 0,21 %.

[0094] Preparação da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

[0095] A solução mista de gel de colágeno a 0,21 % (200 μl) foi adicionada na inserção de uma inserção de transwell de 12 mm (membrana de poliéster de poro de 0,4 μm; Corning, 3460), e a mistura foi incubada a 37 C por 30 min. Depois, F10-10 % FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 ml), FBS (50 ml), Penicilina-Estreptomicina (Invitrogen, 15140-122, 5 ml)] foi adicionada em 1500 μl ao exterior da inser- ção e 500 μl ao interior da inserção, e o transwell foi incubado a 37 C por 24 h. Posteriormente, o interior e exterior da inserção foram lavados uma vez com F10-10 % FBS, as células do epitélio pigmentar da retina obtidas no Exemplo de Produção 1 foram semeadas a 5×105 células (F10-10 % FBS, 500 μl) dentro da inserção, e F10-10 % FBS (1500 μl) foi adicionado ao exterior da inserção. As células do epitélio pigmentar da retina foram cultivadas em F10-10 % FBS até a confluência. Depois de atingir a confluência, o meio foi mudado para SFRM-B27 [DMEM (Sigma, D6046, 350 ml), F12 HAM (Sigma, N6658, 150 ml), B27 (Invitrogen, 17504 - 044, 10 ml), 200 mM de L-Glutamina (Sigma, G7513, 5 ml), Penicilina-Estreptomicina (Invitrogen, 15140- 122, 5 ml), bFGF (wako, 060-04543, 10 ng/ml)] (1500 μl ao exterior da inserção, 500 μl ao interior da inserção, meio mudança foi 3 vezes/semana), e as células do epitélio pigmentar da retina foram cultivadas até que elas mostrassem cor e forma adequadas.

Ablação

[0096] Depois de progredir por 6 semanas a partir do início da cul tura, a membrana da inserção foi removida, colagenase L (Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 U/ml, 100 μl) foi adicionada sob a inserção, e a inserção foi incubada a 37 °C por 60 min e lavada 3 vezes com PBS(+). SFRM-B27 foi adicionado às gotas de modo que a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina não fosse seco e cortado em um tamanho desejado com PALM MicroBeam (ZEISS).

Propriedade

[0097] Por imuno-histoquímica da seção tecidual, foi confirmado que a lâmina de células preparado teve uma estrutura em que uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina, em que junção estreita (ZO-1 positivo) é formada, é revestido internamente por membrana basal (laminina, colágeno tipo IV positivo), e colágeno tipo I usado para a formação da lâmina não permaneceu (colágeno tipo I negativo).

[0098] Exemplo 1 Produção de lâmina de células laminado de ca mada de célula progenitura endotelial vascular e camada de célula do epitélio pigmentar da retina

Preparação da célula progenitora endotelial vascular

[0099] Usando o kit-2 de cultura de célula endotelial (meio EGM-2 (contendo 2 % FBS); fabricado pela Takara Bio, B3162), células pro-genitoras endoteliais vasculares humanas (ECFCs; fabricadas por Ta- kara Bio, PT056) foram semeadas em 1,3x104 células/cm2 em uma placa de cultura responsiva à temperatura (placa de 3,5 cm; fabricada por Cellseed, CS3007).

[00100] Laminação de células progenitoras endoteliais vasculares na lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

[00101] Depois do lapso de 15 h, a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina derivado de célula iPS humana obtido no Exemplo de Produção 1 foi colocado nas células progenitoras endoteliais vasculares na placa de cultura responsiva à temperatura. O meio foi suavemente aspirado, e a lâmina de células foi arranjado para ser colocado no centro da placa de cultura responsiva à temperatura. Posteriormente, para impedir a secagem, 100 μl de meio EGM-2 a 20 °C foram adicionados, e a mistura foi deixada repousar por 30 min para converter o polímero responsivo à temperatura na superfície da placa de cultura para ser hidrofílico, por meio do qual a lâmina de células foi destacado.

[00102] A lâmina de células foi lavado uma vez com meio EGM-2, e a lâmina de células obtido foi transferido para uma placa de cultura para células aderentes (placa Lumox 35; fabricada por Greiner, 077331; superfície de fundo é removível cortando-se com um bisturi). Usando microdissecção a laser (PALM MicroBeam; fabricada por ZEISS), e a lâmina de células foi cortado em um tamanho desejado para fornecer uma lâmina de células em que células progenitoras en- doteliais vasculares humanas e células do epitélio pigmentar da retina humanas foram laminadas.

Exemplo 2 Transplante de Lâmina de células

[00103] A lâmina de células laminado obtido no exemplo 1 foi sub- cutaneamente transplantado ao músculo grande dorsal de camundongo NOD/SCID. Seções de tecido foram preparadas uma semana mais tarde. Por imuno-histoquímica usando anticorpo anti-CD31 (célula en- dotelial), anticorpo anti-HLA-1 (célula humana transplantada), e DAPI, enxerto da lâmina de células transplantado e formação de uma estrutura vascular derivada das células transplantadas foram observados (na figura 1, seta "capilar (doador)"). A partir dos resultados, foi confirmado que as células progenitoras endoteliais vasculares amadureceram em células endoteliais depois do transplante, e podem formar um vaso sanguíneo.

Exemplo 3 Transplante de Lâmina de células

[00104] A lâmina de células laminado obtido no exemplo 1 é trans-plantado para a subretina de um coelho com células do epitélio pigmentar da retina e coroide parcialmente suprimidas. Seções de tecido são preparadas uma semana mais tarde. Por imuno-histoquímica usando anticorpo anti-CD31 (célula endotelial), anticorpo anti-HLA-1 (célula humana transplantada), e DAPI, enxerto da lâmina de células transplantado e formação vascular derivada das células transplantadas podem ser confirmados.

Exemplo Comparativo 1

[00105] A lâmina de células do epitélio pigmentar da retina humano obtido no Exemplo de Produção 2 (sem nenhuma célula progenitora endotelial vascular humana) é transplantado para a subretina de um coelho com células do epitélio pigmentar da retina e coroide parcialmente suprimidas. Seções de tecido são preparadas uma semana mais tarde. Por imuno-histoquímica usando anticorpo anti-CD31 (célula endotelial), anticorpo anti-HLA-1 (célula humana transplantada), e DAPI, é descoberto que a estrutura da lâmina é destruída, um pequeno número das células transplantadas é detectado em uma maneira dispersa e, quando comparado ao Exemplo 3, um fenômeno de taxa de enxerto acentuadamente diminuída das células transplantadas é observado.

Exemplo de Referência 1. Formação vascular

[00106] Formação de vasos por células progenitoras endoteliais vasculares cultivadas em um meio contendo VEGF foi confirmada pelo método seguinte. (meio)

[00107] "EM": meio EGM-2 (contendo 2 % FBS; fabricado por Taka- ra Bio, B3162)

[00108] "F10": F10-10 % FBS (F-10 (Sigma, N6908) 445 ml, FBS 50 ml, Penicilina-Estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) 5 mL). Os resul-tados obtidos usando-se este meio como um meio de formação vascular são mostrados como "F10" na figura 2.

[00109] "F10-1": A lâmina de células do epitélio pigmentar da retina produzido no Exemplo de Produção 2 foi colocado na inserção de uma inserção de transwell de 12 mm (membrana de poliéster de poro de 0,4 μm; Corning, 3460), e F10-10 % FBS foi adicionado dentro e fora da inserção por 500 μl, 1500 μl, respectivamente. A lâmina de células foi cultivado por um dia, e o sobrenadante da cultura foi recuperado. Os resultados obtidos usando-se o sobrenadante da cultura como um meio de formação vascular são mostrados como "F10-1" na figura 2.

[00110] "F10-2": A lâmina de células do epitélio pigmentar da retina produzido no Exemplo de Produção 2 foi colocado na inserção de uma inserção de transwell de 12 mm (membrana de poliéster de poro de 0,4 μm; Corning, 3460), e F10-10 % FBS foi adicionado dentro e fora da inserção por 500 μl, 1500 μl, respectivamente. A lâmina de células foi cultivado por 2 dias, e o sobrenadante da cultura foi recuperado. Os resultados obtidos usando-se o sobrenadante da cultura como um meio de formação vascular são mostrados como "F10-2" na figura 2.

Formação vascular

[00111] Usando os 4 tipos de meio mencionados acima, células progenitoras endoteliais vasculares humanas (ECFCs; fabricadas por Takara Bio, PT056) foram semeadas em cada placa de cultura em 1,3x104 células/cm2. As células foram incubadas a 37°C, 5 % de CO2 e 4 h mais tarde, o número de vasculares formados foi contado sob um microscópio. Os resultados do número de vasculares formados obtidos em 3 repetições do experimento são mostrados na figura 2(A) para cada meio usado (*P<0,001; ANOVA, teste de Scheffe). A formação vascular pode ser morfologicamente confirmada para cada um deles por fotografia do microscópio óptico e fotografia do microscópio fluorescente.

[00112] A concentração de VEGF em 4 tipos de meios usados foi medida. Como um resultado, EM foi 1,44 ng/ml, F10 foi 0 ng/ml, F10-1 foi 2,64 ng/ml, e F10-2 foi 2,80 ng/ml. F10 livre de VEGF mostrou um número acentuadamente pequeno de formação vascular. Os meios exceto F10 mostraram muita formação vascular, que confirma que VEGF promove a formação vascular por células progenitoras endoteli- ais vasculares. Também, a partir dos resultados, pode ser confirmado que um tratamento de formação vascular pode ser aplicado à forma de uma lâmina de células em que uma camada de célula progenitura en- dotelial vascular e uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina são laminadas, visto que um sobrenadante de cultura de células do epitélio pigmentar da retina pode promover a formação vascular.

Exemplo de Referência 2. Uso de matrigel

[00113] Pelo mesmo método como aquele no Exemplo de Referência 1 exceto que uma placa de cultura revestida com matrigel foi usada, 4 tipos de meios foram usados para cultivar células progenitoras endoteliais vasculares humanas e o número de vasculares formados foi contado. Os resultados do número de vasculares formados obtidos nas 3 repetições do experimento são mostrados na figura 2(B) para cada meio usado (*P<0,01 **P<0,05; ANOVA, teste de Scheffe). A formação vascular pode ser morfologicamente confirmada para cada um deles por fotografia do microscópio óptico e fotografia do microscópio fluorescente.

[00114] Quando comparado ao Exemplo de Referência 1, o número de formação vascular foi acentuadamente melhorado em todos os meios usando matrigel. Particularmente, F10 livre de VEGF mostrou um número acentuadamente pequeno de formação vascular (Exemplo de Referência 1), mas a formação vascular foi promovida usando-se matrigel. Estes resultados confirmam que a formação vascular pode ser promovida utilizando-se matrigel, independente da presença de VEGF.

[00115] Condições da produção da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

Exemplo de Referência 3. Método de produção de lâmina de células do epitélio pigmentar da retina (tipo de colágeno)

[00116] Na mesma maneira como no Exemplo de Produção 2 exceto que, na etapa de produzir uma lâmina de células usando 253G1 (células do epitélio pigmentar da retina de iPS) no Exemplo de Produção 2, (A) colágeno Tipo I derivado da pele de suíno TE (produto de ordem especial: principalmente contendo colágeno Tipo I, uma quantidade pequena de colágeno Tipo III, Nitta Gelatin, 5 mg/ml) foi usado como 0,35 % de solução mista de colágeno/reservatório, (B) colágeno Tipo I derivado de tendão de suíno T-1002 (produto de ordem especial: colá- geno Tipo I, Nitta Gelatin, 5,1 mg/ml) foi usado como 0,35 % de solução mista de colágeno/reservatório, (C) colágeno I rotulado com FITC (Chondrex, 1 mg/ml) foi usado como 0,07 % de solução mista de colá- geno/reservatório, (D) colágeno I rotulado com FITC (ordem especial, Chondrex, 3 mg/ml) foi usado como 0,21 % de solução mista de colá- geno/reservatório, (E) atelocolágeno (KOKEN, 3 mg/ml) foi usado como 0,21 % de solução mista de colágeno/reservatório, e (F) membrana de colágeno com permeabilidade para cultura celular (KOKEN) foi usada, respectivamente, ao invés de colágeno Tipo I derivado de tendão de suíno solúvel em ácido Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3 mg/ml) como 0,21 % de solução mista de colágeno/reservatório, lençóis de células foram produzidos e cortados para fornecer lençóis de células do epitélio pigmentar da retina.

[00117] Os resultados de teste do Exemplo de Produção 2 e os casos usando cada um dos colágenos anteriormente mencionados foram comparados e avaliados em termos dos 4 itens [1. resistência do gel; 2. adesão celular; 3. proliferação celular; 4. segurança]. Como um re-sultado, (A) {1. inferior; 2. equivalente; 3. inferior; 4. bom}, (B) {1. bom (5,1 mg/ml); 2. equivalente; 3. inferior; 4. bom}, (C) {1. inferior (1 mg/ml); 2. inferior; 3. desconhecido; 4. desconhecido}, (D) {1. equivalente (3 mg/ml); 2. equivalente; 3.inferior; 4. desconhecido}, (E) {1. equivalente (3 mg/ml); 2. inferior; 3. desconhecido; 4. bom}, e (F) {foi não lisado por colagenase, assim não utilizável}. Como para a resistência do gel, um certo nível de resistência é necessário para permitir o crescimento de células do epitélio pigmentar da retina. A partir de tal aspecto, o tipo e concentração particularmente preferíveis de colágeno foram o colágeno Tipo I derivado de tendão de suíno solúvel em ácido Cellmatrix I-A do Exemplo de Produção 2 e (B) colágeno Tipo I derivado de tendão de suíno T-1002 usado na concentração mencionada acima. Quando o substrato não tem um certo nível de resistência, o epitélio pigmentar da retina não cresce e não pode ser usado para a presente invenção.

Exemplo de Referência 4. Método de produção de lâmina de células do epitélio pigmentar da retina (quantidade de colágeno)

[00118] Na mesma maneira como no Exemplo de Produção 2 exceto que, na etapa de produzir uma lâmina de células usando 253G1 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) do Exemplo de Produção 2, a quantidade da solução mista de gel de colágeno a ser usada foi mu- dada para 100 μl ou 300 μl a partir de 200 μl, lençóis de células foram produzidos e cortados, por meio dos quais lençóis de células do epité- lio pigmentar da retina foram recuperados.

[00119] Quando comparado ao Exemplo de Produção 2, quando a quantidade da solução mista de gel de colágeno usada foi 100 μl, uma camada fina de gel de colágeno foi formada na parte central devido a uma influência da tensão superficial causada pela quantidade pequena da solução mista de gel de colágeno e, conforme a cultura procedeu, as células do epitélio pigmentar da retina semeadas diretamente contataram a membrana de fundo com facilidade, o que causou quebra da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina durante uma operação para cortar a lâmina. Quando a quantidade da solução mista de gel de colágeno usada foi 300 μl, visto que a quantidade da solução mista de gel de colágeno foi alta, uma camada de gel de colágeno espessa foi formada, que relativamente reduziu a quantidade do meio que pode ser retido na inserção, e portanto, a manutenção da cultura não foi fácil de realizar, o tratamento com colagenase levou tempo, e danos sobre a lâmina de células foram temidos a se tornarem maiores.

Exemplo de Referência 5. Método de produção de lâmina de células do epitélio pigmentar da retina (quantidade de colagenase e tempo de tratamento)

[00120] Na mesma maneira como no Exemplo de Produção 2 exceto que, na etapa de produzir uma lâmina de células usando 253G1 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) do Exemplo de Produção 2, 1 % de Colagenase L (Nitta Gelatin) ou colagenase Tipo I (Roche) foi contatado com a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina por 10 min em uma quantidade de 10 μl, 20 min em uma quantidade de 10 μl, 30 min em uma quantidade de 10 μl, 60 min em uma quantidade de 10 μl, 20 min em uma quantidade de 20 μl, 60 min em uma quantidade de 20 μl, e 50 min em uma quantidade de 30 μl, ao invés de 30 min em uma quantidade de 30 μl, os lençóis de células foram produzidos e cortados, por meio dos quais os lençóis de células do epitélio pigmentar da retina foram recuperados.

[00121] Como um resultado, quando um tratamento com colage- nase foi realizado por 60 min em uma quantidade de 10 μl ou 60 min em uma quantidade de 20 μl, a decomposição do colágeno do mesmo nível como com 30 μl por 30 min foi observada.

Exemplo de Referência 6. Método de produção de lâmina de células do epitélio pigmentar da retina (número de células semeadas)

[00122] Na mesma maneira como no Exemplo de Produção 2 exceto que, na etapa de produzir uma lâmina de células usando 253G1 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) do Exemplo 1, o número das células a serem semeadas dentro da inserção foi mudado para (A) 5x104 células/500 μl, (B) 1xio5/5oo μ| ou (C) ixio6/5oo μ| a partir de 5x105 células/500 μl, lençóis de células foram produzidos e cortados, por meio dos quais os lençóis de células do epitélio pigmentar da retina foram recuperados.

[00123] Quando comparado ao Exemplo de Produção 2, (A) e (B) exigiram um tempo mais longo para atingir a confluência de célula devido ao número pequeno de células, e (C) mostrou crescimento lento e também tenderam a existir um tempo mais longo para atingir a con-fluência de célula.

Exemplo de Referência 7. Membrana basal formada sobre a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

[00124] Uma Crio seção (seção congelada) foi produzida a partir da lâmina de células produzido a partir de 253G1 (célula do epitélio pig-mentar da retina de iPS) no Exemplo de Produção 2, e submetida à coloração imuno-histoquímica. A formação de uma junção estreita foi confirmada pela expressão de ZO-1, e a formação de uma membrana basal foi confirmada pela expressão de laminina e colágeno Tipo IV. Para a detecção de cada proteína, anticorpos respectivos de coelho anti-ZO-1 fabricados pela Zymed (diluição a 1:100), laminina de coelho fabricada por Abcam (diluição a 1:200), e anticorpo anti-colágeno tipo IV humano de camundongo fabricado pela Calbiochem (1:40) foram usados. Além disso, a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina foi confirmado como tendo uma forma epitelial de monocamada a partir do estado de coloração nuclear usando 4’,6-diamidino-2-fenilindol fabricado pela Molecular Probes (DAPI; 1 μg/ml).

[00125] Avaliação da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

Avaliação 1. Perfil de expressão de gene específico do epitélio pigmentar da retina da lâmina de células

[00126] Na etapa de produzir uma lâmina de células de 59SV3, 59SV9 (células do epitélio pigmentar da retina de iPS) no Exemplo de Produção 2, a expressão de BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP nas células que constituem os lençóis depois do lapso de 1 semana, 4 semanas, 2 meses, em que o dia quando o meio foi mudado para SFRM- B27 depois da confluência de célula foi o dia 0, foi confirmada por RT- PCR. Como um resultado, a expressão do mesmo nível como aquele do controle positivo (RNA total de célula do epitélio pigmentar da retina humana (fabricado pela ScienCell, Cat No 6545)) foi observada. Aqui, BEST1, RPE65, MERTK são genes especificamente expressados em células do epitélio pigmentar da retina. CRALBP é um gene expressado em células do epitélio pigmentar da retina e células de Muller.

Avaliação 2. Medição do colágeno residual na lâmina do epitélio pigmentar da retina

[00127] Crio seções (seção congelada) foram produzidas por ablação, antes e depois do tratamento com colagenase, a partir de lençóis de células respectivos produzidos a partir de 253G1 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) no Exemplo de Produção 2, e submetidas à coloração imuno-histoquímica. O núcleo foi colorido com 4’,6- diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 μg/ml) fabricado pela Molecular Probes, e o colágeno Tipo 1 foi colorido com anticorpo anti-colágeno tipo I humano de coelho (diluição a 1:40) fabricado pela Calbiochem. Como um resultado, o colágeno foi não detectado dos lençóis depois do tratamento com colagenase, e foi confirmado que a colagenase removeu o colágeno revestido na placa de cultura. Por outro lado, o colágeno foi detectado dos lençóis cortados antes do tratamento com colagenase.

Avaliação 3. Capacidade de secreção da citocina da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

[00128] Os meios de cultura no lado Apical e no lado Basal no transwell foram recuperados antes da etapa de ablação dos lençóis de células do epitélio pigmentar da retina dos lençóis de células produzidos a partir de 253G1 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) e 454E2 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) no Exemplo de Produção 2, e as quantidades de produção de VEGF e PEDF foram detectadas por ELISA de acordo com o método descrito em Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612 - 3624. Como um resultado, foi confirmado que, similar ao epitélio pigmentar da retina derivado de embrião humano relatado em Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612 - 3624, VEGF foi principalmente secretado no lado Basal, e PEDF foi principalmente se- cretado no lado Apical (figura 4). Foi mostrado que a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina produzido a partir de 253G1 e 454E2 no Exemplo de Produção 2 tem capacidade secretória de citocina similar àquela em organismos vivos, e é superior em funcionalidade.

Avaliação 4. Resistência elétrica transepitelial da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina

[00129] Uma correlação forte é observada entre a função de barreira de uma camada de célula e impedância, isto é, resistência elétrica transepitelial/transendotelial (TER). Uma sonda foi colocada nos meios dentro e fora da inserção de acordo com o método descrito por MILLI-PORE (usando Millicell ERS-2), antes da etapa de ablação da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina produzido a partir de 454E2 (célula do epitélio pigmentar da retina de iPS) no Exemplo de Produção 2, e TER foi eletricamente medida. Como um resultado, TER foi 640Q-cm2, e mostrou um valor de TER alto como o epitélio pigmentar da retina derivado de embrião humano relatado em Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009), Fig 10. Foi mostrado que a lâmina de células do epitélio pigmentar da retina da presente invenção produzido no Exemplo de Produção 2 tem uma função de barreira alta similar àquela em organismos vivos.

Avaliação 5. Transplante de lâmina de células do epitélio pigmentar da retina derivado de célula ES de macaco

[00130] Uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina de macaco produzido a partir de células do epitélio pigmentar da retina derivadas de célula ES de macaco, CMK6 no Exemplo de Produção 2 foi transplantado em um olho de um macaco de acordo com o método descrito em Invest Ophthalmol Vis Sci. Fev de 1995; 36(2): 381 - 90. Antes do transplante, a fotocoagulação da retina foi realizada para afetar a retina do olho a ser submetida ao transplante. No dia 28 do transplante em um olho do macaco tendo mácula de fotocoagulação da retina formada neste, fotografias do fundo do olho foram tiradas, e imagens das seções do fundo ocular foram produzidas como seções histológicas usando-se OCT (tomografia de coerência óptica), com base na qual a condição da retina foi confirmada. Como um resultado, nenhuma perda de fluorescência foi encontrada por angiografia por fluoresceína, o enxerto sobreviveu, e um transtorno tal como adelgaçamento da retina sensorial e semelhantes não foi encontrado.

Avaliação 6. Transplante da lâmina de células do epitélio pigmentar da retina derivado de célula iPS de macaco

[00131] Uma lâmina de células do epitélio pigmentar da retina de macaco produzido a partir de células do epitélio pigmentar da retina derivadas de célula iPS de macaco, 46a no Exemplo de Produção 2 foi transplantado sob a retina de um olho para o transplante autólogo e três olhos para transplante cruzado de acordo com o método descrito em Invest Ophthalmol Vis Sci. Fev de 1995; 36(2): 381 - 90. Até um ano após o transplante, fotografias do fundo do olho foram tiradas, e imagens das seções do fundo ocular foram produzidas como seções histológicas usando-se OCT (tomografia de coerência óptica), com base na qual a condição da retina foi observada com o lapso de tempo. No transplante cruzado, reações de rejeição claras tais como mudanças fibrosas na periferia o enxerto, perda de fluorescência de angio- grafia por fluoresceína, e lesão com brilho alto sob a retina por OCT foram encontradas. Por outro lado, no transplante autólogo, tal rejeição clara não foi observada, nenhuma perda de fluorescência foi encontrada por angiografia por fluoresceína, o enxerto sobreviveu, e um transtorno tal como adelgaçamento da retina sensorial e semelhantes não foi encontrado.

Aplicabilidade Industrial

[00132] De acordo com a presente invenção, é possível facilmente e estavelmente produzir uma lâmina laminado de células do epitélio pigmentar da retina, que tem uma camada de célula constituinte vascular capaz de complementar um vaso sanguíneo coroidal deficiente no organismo vivo e fornecer oxigênio e nutrientes à retina depois do transplante. A lâmina de células da presente invenção é extremamente útil, visto que ele é superior na taxa de enxerto e funcionalidade, e também pode tratar doenças de degeneração da coriorretina severas, para as quais o transplante de célula do epitélio pigmentar da retina simples não pode facilmente fornecer um efeito de tratamento suficiente, tais como doenças de degeneração da coriorretina, particularmen- te, miopia alta e uveíte severa e semelhantes, que são associadas com atrofia coriorretiniana.

[00133] Os conteúdos divulgados em qualquer publicação citada no presente relatório descritivo, incluindo patentes e pedidos de patente, são por meio desta incorporados em suas totalidades por referência, à medida que eles fossem divulgados aqui.

[00134] Este pedido é fundamentado em um pedido de patente No 2012-185932 depositado no Japão (data de depósito: 24 de Agosto de 2012), os conteúdos do qual são incorporados completamente neste documento.

Claims

1. Método de produção de uma lâmina de células compreendendo uma camada de célula do epitélio pigmentar da retina e uma camada de célula de formação vascular, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de laminar a camada de célula do epitélio pigmentar da retina e a camada de célula de formação vascular.

2. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a camada de célula do epitélio pigmentar da retina e a camada de célula de formação vascular são laminadas tal que a camada de célula de formação vascular contata uma superfície basal da camada de célula do epitélio pigmentar da retina.

3. Método de produção de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a camada de célula de formação vascular é composta de pelo menos uma célula selecionada do grupo consistindo em hemangioblasto, célula progenitora endotelial vascular, e célula endotelial vascular.

4. Método de produção de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a camada de célula de formação vascular é composta de um tecido ou célula derivados de um paciente a ser transplantado com a lâmina de células, ou uma célula derivada de um doador tendo um tipo de HLA combinado com o tipo de HLA do paciente.

5. Método de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a camada de célula do epitélio pigmentar da retina é uma lâmina de células produzido por um método compreendendo as etapas seguintes: (1) semear e cultivar células do epitélio pigmentar da retina em um gel de colágeno para formar uma lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina, e (2) decompor o gel de colágeno com colagenase para destacar a lâmina de células composto das células do epitélio pigmentar da retina.

6. Método de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula do epitélio pigmentar da retina é obtida induzindo-se a diferenciação de célula ES, célula iPS ou célula progenitora.