JP2005132813A - 毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 - Google Patents
毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005132813A JP2005132813A JP2004048322A JP2004048322A JP2005132813A JP 2005132813 A JP2005132813 A JP 2005132813A JP 2004048322 A JP2004048322 A JP 2004048322A JP 2004048322 A JP2004048322 A JP 2004048322A JP 2005132813 A JP2005132813 A JP 2005132813A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- hair
- cell
- composition
- epithelial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 title claims abstract description 79
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 56
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 220
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 claims abstract description 99
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims abstract description 46
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 13
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 51
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 24
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 abstract description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 40
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 230000003661 hair follicle regeneration Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 19
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 7
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 7
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 2
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000005598 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010059480 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000000185 follicular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037306 mature skin Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920005644 polyethylene terephthalate glycol copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】 従って、本発明は、毛乳頭細胞及び上皮系細胞を含んで成り、当該毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比が1:10〜10:1であることを特徴とする毛包を再生するための組成物を提供する。好ましくは、本発明は、毛乳頭細胞及び上皮系細胞を含んで成る毛包を再生するための組成物であって、皮膚組織から表皮組織を取り除くことで得た真皮組織画分をコラーゲン処理して細胞懸濁物を調製し、次いで当該細胞懸濁物を凍結保存することで毛包上皮細胞を死滅させることで調製された毛乳頭細胞調製品及び上皮系細胞を含んで成り、ここで当該毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比が1:10〜10:1である、毛包を再生するための組成物を提供する。
【選択図】 なし
Description
Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), Vol.96, pp. 7336-7341 Weinberg et al., J. Invest. Dermatol. (1993), Vol.100, pp. 229-236 Prouty et al., American J. Pathol. (1996) Vol.148, No.6, pp.1871-1885
1.哺乳動物の表皮を用意する。
2.この表皮を、必要ならタンパク質分解酵素溶液、例えばトリプシン溶液の中に適当な時間、例えば一晩静置し、その後表皮部分をピンセットなどで取り除き、残った真皮をコラゲナーゼで処理し、細胞懸濁液を調製する。
3.必要ならセルストレーナーにより懸濁液をろ過し、静置により沈殿物を除去する。
4.細胞数を計測し、適当な細胞密度、好ましくは1x105〜1x108/ml程度の細胞密度にて凍結保護液で再懸濁し、必要なら小分け分注し、通常の細胞保存方法に従い、凍結保存する。
5.適当な期間保存後、融解し、使用する。
1.哺乳動物の表皮を用意する。
2.この表皮を、必要なら0.25%トリプシン/PBS中で4℃下で一晩静置することでトリプシン処理する。
3.ピンセットなどにより表皮部分のみ剥離し、細切後、適当な培養液(例えばケラチノサイト用培養液)中で4℃で約1時間懸濁処理する。
4.この懸濁物を適当なポアサイズを持つセルストレーナーに通し、次いで遠心分離器にかけて上皮系細胞を回収する。
5.この細胞調製品をKGMあるいはSFM培地に所望の細胞密度で懸濁し、使用直前まで氷上に静置しておく。
移植は、例えば直径約1cmの円に対し、毛乳頭細胞が1×106〜108個/cm2、好ましくは1.0〜1.5×107個/cm2の移植量、より好ましくは1.27×107個/cm2の移植量で移植されるように行うのが好ましい。
ヒト線維芽細胞を0.1%コラーゲン溶液/DMEM/10%FBSに適当量分散させ、シャーレに分注し、ただちに37℃のCO2インキュベータに静置する。ゲル化後、シャーレ壁面および底面よりゲルを剥がし、シャーレの中で浮遊するようにさせる。コラーゲンゲルを揺らせながら培養し、ゲルを約5分の1に収縮させ真皮モデルとする。真皮モデルをステンレスグリッドの上に置き、その上にガラスリングをセットし、KGM(表皮細胞培養用培地)に分散したヒト培養表皮細胞(1.0X106 細胞数/ml)を0.4ml、ガラスリング内に注入し、培養する。このとき、毛乳頭細胞画分を同時に混合して注入する。ヒト培養表皮細胞の代替としてマウス新生児表皮細胞を用いることもできる。シャーレ内にDMEM―KGM―5%FBS+Ca2+の培地を、真皮モデルの上部が空気に晒される程度に入れ、培養し、約一週間後に皮膚モデルを観察し、毛包原基形成の有無と再現性を判定する。
(1−1) バーシカン−LacZ TGマウスから生まれた新生仔(生後4日以内に使用)のうち、LacZ陽性の個体を選別した。バーシカン−LacZ TGマウスは、例えばKishimotoら(前掲)に記載の方法により作製することができる。
(1−2) 各個体をエタノールとリン酸緩衝生理食塩水(以下「PBS」)で洗浄後、背部皮膚を剥離し、0.25%トリプシン/PBS中で4℃下で一晩静置した。
(1−3) 翌日、ピンセットなどにより表皮と真皮を分離し、真皮側を0.35%コラゲナーゼ/DMEM(ダルベッコ変法イーグル最少培地。以下「DMEM」)により37℃下で約1時間ほど処理した。
(1−4) (1−3)の細胞を念入りに懸濁操作を行ったのち、セルストレーナーに通し、次いで遠心分離器(900g、10分)によって細胞を集めた。
(1−5) 細胞数を計測し、1x105〜 1x108/mlの細胞密度にて細胞凍結保護液(セルバンカ−2(BLC−2)、日本全薬工業製)で再懸濁し、凍結チューブに分注、通常の細胞保存方法に従い、液体窒素内で保存した。
(1−6) 約1週間後に融解し、これを以下のフローサイトメトリー解析に用いた。
実験材料
・フルオロレポーター LacZフローサイトメトリーキット(FluoroReporter lacZ flow cytometry kits) Molecular Probe社、カタログNo.F-1930(50反応分)/F-1931(250反応分))
・試薬の準備:
反応液:キット中のFDG試薬(Component A)をMiliQ水で1:10に希釈した。1サンプル当り50μLを使用した。
停止液:キット中のPI試薬(Component D)をキット付属の緩衝液で1:100に希釈した。1サンプル当り0.9mlを使用した。使用するまで氷中において4℃に冷やしておいた。染色媒体としては、上皮細胞を特異的に染色する特的抗体であるCD49fモノクローナル抗体(セロテック社製、MCA699)、死細胞を特異的に染色する7-ADD(ベックマンコールター製、PN-IM 3422)を用いた。
(2−2) 3000回転で5分間遠心し、上澄みを捨てた。細胞ペレットを100μLの染色媒体に再懸濁した。この懸濁物を37℃の恒温槽で10分間プレインキュベーションした。
(2−3) 37℃の恒温槽で10分間プレインキュベーションしておいた反応液を50μL加えて、正確に1分間、37℃で反応を行った。
(2−4) 0.9ml の停止液を加え、氷中に保存した。
(2−5) 10分後に40μLの50mM PETG(Component B)を加えて反応を完全に阻害した。
(2−6) すみやかにFACSで蛍光強度を測定した。フローサイトメーター(FACS)の操作方法はメーカーの取扱説明書によった。FACSの測定装置は例えば、ベックマン・コールター社のXL−MCLを用いることができる。本キットに使用されている蛍光色素Fluorescein(フルオロセイン)に適した検出設定で細胞の蛍光強度の分布を測定した。
LacZ及び7-AADに基づくFACS解析は、凍結融解した細胞中のLacZ+細胞の大半が、凍結融解を経ても生細胞であることを示した(図1)。従って、毛乳頭細胞は凍結融解によって死滅しないこと明らかとなった。また、CD-49及び7-AADに基づくFACS解析では、CD-49+細胞(上皮系細胞)の大半が凍結融解後、7-AAD+画分(死画分)に存在することが示された(図2)。従って、凍結融解した細胞調製品中の生細胞はLacZ+、CD-49-、7-AAD-、即ち、毛乳頭細胞(LacZ+)且つ非上皮系細胞(CD-49-)であり、しかも生細胞(7-AAD-)である。以上の結果をまとめると、生細胞は大半が上皮系細胞ではなく、毛乳頭細胞であることが明らかとなった。よって、凍結融解により上皮系細胞を特異的に死滅させることができ、活性細胞として毛乳頭細胞のみ含む毛乳頭細胞調製品を調製できることが明らかとなった。
I.各種細胞の調製
(1)マウス由来上皮細胞
(1−1) 手術前日、ICR系統マウスの新生仔より各個体をエタノールとリン酸緩衝生理食塩水(以下「PBS」)で洗浄後、背部皮膚を剥離し、0.25%トリプシン/PBS中で4℃下で一晩静置することで皮膚をトリプシン処理した。
(1−2) ピンセットにより表皮部分のみ剥離し、細切後、ケラチノサイト用培養液(以下「KGM」)中で4℃で約1時間懸濁処理した。
(1−3) セルストレーナーに通した(1−2)の懸濁物を遠心分離器(×900g、10分)にかけて上皮系細胞を回収した。
(1−4) レシピエント動物1個体あたり、2匹の新生仔由来に相当する量の上皮系細胞(細胞数として約1x107)を手術に用いた。相当量の細胞をKGMあるいはSFM培地で懸濁して、使用直前まで氷上に静置した。これを「マウス由来上皮細胞」調製品とする。
(2−1) 手術前日、ICR系統マウスの新生仔より上記(1−1)、(1−2)と同様の方法により皮膚をトリプシン処理した。
(2−2) ピンセットにより表皮部分を剥離し、残った真皮を細切後、0.35%のコラゲナーゼを含んだ適当な培養液DMEM+10%FBS中で37℃で約1時間懸濁処理した。
(2−3) セルストレーナーに通した懸濁物(2−2)を遠心分離器にかけて真皮細胞を回収した。
(2−4) レシピエント動物1個体あたり、細胞数として約1x107の真皮細胞を手術に用いた。相当量の細胞をDMEM+10%FBSなどで懸濁して、使用直前まで氷上に静置した。これを「用時調製」マウス由来真皮細胞調製品とする。
(3−1) 新生仔ICR系統マウス背部皮膚を剥離し、表皮を採取した。
(3−2) トリプシン溶液で一晩静置し、翌日表皮をピンセットで取り除き、残った真皮をコラゲナーゼで処理、細胞懸濁液を調製した。
(3−3) セルストレーナーにより上記懸濁物をろ過し、そして静置により沈殿物を除去した。
(3−4) 細胞数を計測し、1x105〜 1x108/mlの細胞密度に凍結保護液で再懸濁し、凍結チューブに分注、通常の細胞保存方法に従い、液体窒素内で保存した。
(3−5) 約1週間後に融解し、移植実験に1x107個/移植を用いた。これを「凍結保存」マウス由来真皮細胞調製品とする。
上記マウス由来上皮細胞調製品(1−4)を「用時調製」マウス由来真皮細胞調製品(2−4)又は「凍結保存」マウス由来真皮細胞調製品(3−5)と混合した。これらの混合物を以下の「再構成毛包作成手順」の「細胞懸濁液」として用いた。
用意するもの:
レシピエント動物(Balb−c nu/un系統ヌードマウス。5週齢以上)、
シリコーン製の直径1センチ程度のドーム状キャップ(以下バルブと呼称)、
麻酔薬、
手術用ハサミ、ピンセット、縫合器、
マイクロピペッター
細胞懸濁液(培養液DMEM+10%FBS約150μlに懸濁)
(i) ヌードマウスを麻酔した。
(ii) 背部皮膚を直径1センチ弱に切り取った。
(iii)傷口にバルブを挿入し、縫合器で固定した。
(iv) バルブ内に、細胞懸濁液をピペッターを用いて注入した。
(v) そのまま約1週間飼育し、バルブをはずした。
(vi) バルブをはずした後、1〜6週間後(通常は2週間後)、かさぶたが取れた跡に、再構成毛包の生育を観察した。
「凍結保存」マウス由来真皮細胞調製品と、実施例2記載のマウス由来上皮細胞と同様の処理により調製したラット新生児皮膚由来上皮系細胞とをそれぞれ、0、 1x106 、3×106、1x107の細胞数に調整し、混合し、上述の再構成毛包作成手順によりヌードマウス背部皮膚に移植して毛包再構成の有無を調べた。その結果を以下の表2に示す。
成熟したマウス皮膚由来(10週齢以降)の上皮系細胞の調製を、実施例2に記載の新生児マウス由来上皮系細胞の調製に準じて行った。成熟マウス皮膚由来の上皮系細胞として、生後10週齢以降のマウスの休止期毛の表皮から調製したもの(休止期毛上皮系細胞含有系)と、休止期毛の皮膚をワックス塗布による除毛処理により機械的刺激し、発毛を促したマウスの表皮から調製したもの(成長期誘導毛上皮系細胞含有系)の二種類を用いた。これら成熟マウス皮膚由来上皮系細胞をそれぞれ「凍結保存」マウス由来真皮細胞調製品と細胞数が1:1となるように混合し、上述の再構成毛包作成手順によりマウスの背部に移植した。その結果を以下の表3に示す。
「凍結保存」マウス由来真皮細胞調製品とラット新生児皮膚由来上皮系細胞とをそれぞれ約1x107個混合し、上述の再構成毛包作成手順によりヌードマウス背部皮膚に移植して毛包再構成の有無を調べた。その結果は以下の表4及び図4にも示す。
割礼などにより得られたヒト新生児包皮より表皮細胞を調製し、凍結保存マウス毛乳頭細胞調製品と混合し、上述の再構成毛包作成手順によりヌードマウス背部皮膚に移植して毛包再構成の有無を調べた。
上記培地中の包皮組織(人種を問わず利用できる)をPBS(組織培養用、カルシウム、マグネシウムフリー)にストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗生物質が添加された溶液で満たされたペトリデッシュ中で30分間、反応させた。さらに10分間、新しいPBSと抗生物質で満たされたペトリデッシュに移し、10分間反応させた。過剰の脂肪組織を除去した後に、約1cm2程度の皮膚片に裁断し、デスパーゼ溶液(合同清酒製:濃度1000U〜5000U)中に浮遊させた状態で4℃、約18時間反応させた。反応後、再びPBS溶液で洗った後に、表皮部分を慎重にピンセットでつまみ剥がした。剥がした表皮シートを5mlの0.05%トリプシン−0.5mMEDTA溶液に懸濁し、37℃で15分間反応させた。
包茎除去等の術時に得られた成人包皮組織(20歳代)より表皮細胞を調製し、凍結保存マウス毛乳頭細胞調整品と混合し、上述の再構成毛包作製手順によりヌードマウス背部皮膚に移植して毛包再構成の有無を調べた。
実施例6及び7において、ヒト新生児あるいは成人包皮由来の異なる人種の上皮細胞を異なる継代数、培養後にマウス毛乳頭と組合わせて、毛包再構成の実験に供した場合の、再構成の効率について、以下の表7に示す。
再構成された毛包が毛乳頭細胞と上皮系細胞との組み合わせにより構成されているかどうかを確認するには、例えば種特異的な抗体を用いる方法や種特異的な遺伝子配列(ヒトAlu配列など)を用いることができる。もっとも簡便には、毛包再生のための本発明に係る組成物として異種系組成物を使用し(例えば毛乳頭細胞をマウス由来とし、上皮系細胞をラット又はヒト由来とする、又はその逆)、核染色に用いられるヘキスト(Hoechst)#33258試薬(Molecular Probe社)による染色によって、異種系のマウスの場合は核内に複数のドット(点)が明瞭に観察されるのに対し、ヒト、ラットではそれが認められないことで容易に組織学的観察により判別することができる(Miller GJ & Ferrara JA、Stain Technol. 63(1):15-21,1988)。
移植部位の組織を薄切したパラフィン切片をスライドガラス(4-6μmが望ましい)に載せ、通常の脱パラフィン処理し(キシレン洗浄2回→99.9%エタノール洗浄→80%エタノール洗浄→70%エタノール洗浄→水洗)、PBS溶液に移した(この状態でしばらく置いておくことができる)。
ヘキスト#33258 (モレキュラープローブ社)4mgを1mLのPBS溶液に溶解した(アルミで遮光)。出来上がったヘキスト#33258溶液10μLを10mlのPBSで希釈し(1000倍希釈、最終濃度4μg/mL)、その数滴を平置したスライドの組織切片の上を完全に覆うように添加した。その後、室温で遮光しながら15分反応させ、5分間水洗した後、GVA Mounting Solution(グリセロール系封入剤、Zymed Lab.製、フナコシ薬品扱い)とカバーグラスで封入した。UV領域の励起が観察可能な蛍光顕微鏡の下、観察を行った。
この方法によれば、マウス細胞の核は明るく、複数のドットが観察され、その他のラット、ヒト細胞はドットが見えないので、組織の起源の種を識別できる。
図5は毛乳頭細胞がマウスに由来し、上皮系細胞がヒト(ヒト新生児包皮由来)に由来する毛包再構成系を移植した場合の蛍光顕微鏡写真の結果を、通常の組織染色、即ちヘマトキシリン−エオジン(HE)染色(「染色法のすべて」医歯薬出版株式会社、p2〜7, 1988年)した組織像との対比において示す。その図から、毛包は毛乳頭細胞(マウスに由来する明るいドットを多数有する部分)と上皮系細胞(ヒトに由来するドットを有しない部分)の双方から構成されることが明らかとなった。
ヒト線維芽細胞を0.1%コラーゲン溶液/DMEM/10%FBSに適当量分散させ、シャーレに分注し、ただちに37℃のCO2インキュベータに静置した。ゲル化後、シャーレ壁面および底面よりゲルを剥がし、シャーレの中で浮遊するようにさせた。コラーゲンゲルを揺らしながら培養し、ゲルを約5分の1に収縮させ真皮モデルとした。真皮モデルをステンレスグリッドの上に置き、その上にガラスリングをセットし、KGM(表皮細胞培養用培地)に分散したヒト培養表皮細胞(1.0 X 106 細胞数/ml)を0.4mlガラスリング内に注入し培養した。このとき、「凍結保存」マウス由来真皮細胞調製品を同時に混合して注入した。シャーレ内にDMEM―KGM―5%FBS+Ca2+の培地を、真皮モデルの上部が空気に晒される程度に入れ、培養し、約一週間後に皮膚モデルを観察し、毛包原基形成の有無と再現性を、ヘマトキシリン−エオジン染色及び上記ヘキスト染色により判定した。その結果を図6に示す。
Claims (28)
- 毛乳頭細胞及び上皮系細胞を含んで成り、ここで当該毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比が1:10〜10:1であることを特徴とする、毛包を再生するための組成物。
- 毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比が約1:1である、請求項1記載の組成物。
- 皮膚組織から表皮組織を取り除くことで得た真皮組織画分をコラーゲン処理して細胞懸濁物を調製し、次いで当該細胞懸濁物を凍結保存することで毛包上皮細胞を死滅させることで調製された毛乳頭細胞調製品及び上皮系細胞を含んで成り、ここで当該毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比が1:10〜10:1である、毛包を再生するための組成物。
- 毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比が約1:1である、請求項3記載の組成物。
- 前記細胞懸濁物の細胞密度を1×105〜1×108/mlに調整してから凍結保存を行う、請求項3又は4記載の組成物。
- 前記凍結保存を−80℃以下の温度で行う、請求項3〜5のいずれか1項記載の組成物。
- 前記凍結保存を液体窒素の中で行う、請求項3〜6のいずれか1項記載の組成物。
- 前記凍結保存を1週間以上の期間にわたって行う、請求項3〜7のいずれか1項記載の組成物。
- 毛乳頭細胞及び上皮系細胞が共にマウスに由来する、又は共にラットに由来する、又は共にヒトに由来する、請求項1〜8のいずれか1項記載の組成物。
- 毛乳頭細胞及び上皮系細胞が異種細胞であり、各々がマウス、ラット又はヒトに由来する、請求項1〜8のいずれか1項記載の組成物。
- 上皮系細胞がヒト包皮に由来する、請求項1〜10のいずれか1項記載の組成物。
- ヒトに請求項1〜11のいずれかに記載の組成物を移植し、毛包を再生する方法。
- レシピエント動物に請求項1〜11のいずれかに記載の組成物を移植し、毛包を再生する方法。
- レシピエント動物が免疫系の抑制された動物である、請求項13記載の方法。
- レシピエント動物がヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットからなる群より選ばれる免疫系が抑制された動物である、請求項13又は14記載の方法。
- 前記組成物を、毛乳頭細胞が1×106〜108個/cm2の移植量で移植されるように移植する、請求項12〜15のいずれか1項記載の方法。
- 前記組成物を、毛乳頭細胞が1.0〜1.5×107個/cm2の移植量で移植されるように移植する、請求項12〜15のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の組成物を含む皮膚三次元モデルを作製し、毛包を再生する方法。
- 毛乳頭細胞を1×106〜108個/cm2の量で前記皮膚三次元モデルに含ませる、請求項18記載の方法。
- 毛乳頭細胞を1.0〜1.5×107個/cm2の量で前記皮膚三次元モデルに含ませる、請求項18記載の方法。
- レシピエント動物に請求項1〜11のいずれかに記載の組成物を移植し、こうして再構成毛包を担持することになったキメラ動物。
- レシピエント動物が免疫系の抑制された動物である、請求項21記載のキメラ動物。
- レシピエント動物がヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットからなる群より選ばれる免疫系が抑制された動物である、請求項21又は22記載のキメラ動物。
- 前記組成物を、毛乳頭細胞が1×106〜108個/cm2の移植量で移植されるように移植した、請求項21〜23のいずれか1項記載のキメラ動物。
- 前記組成物を、毛乳頭細胞が1.0〜1.5×107個/cm2の移植量で移植されるように移植した、請求項21〜23のいずれか1項記載のキメラ動物。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の組成物を含む皮膚三次元モデルを作製し、こうして再構成毛包を担持することになった皮膚三次元モデル。
- 毛乳頭細胞を1×106〜108個/cm2の量で含む、請求項26記載の皮膚三次元モデル。
- 毛乳頭細胞を1.0〜1.5×107個/cm2の量で含む、請求項26記載の皮膚三次元モデル。
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004048322A JP4689175B2 (ja) | 2003-10-06 | 2004-02-24 | 毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 |
US10/574,697 US7718426B2 (en) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | Preparation method of a hair dermal papilla cell preparation, composition and method for regenerating hair follicles, and animal having regenerated hair follicles |
CN2004800291374A CN1863907B (zh) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | 毛乳头细胞制品的制备方法、用于再生毛囊的组合物、方法、以及附载着经再生毛囊的动物 |
KR1020117016054A KR101156797B1 (ko) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | 재생된 모포를 담지하는 동물 |
PCT/JP2004/014779 WO2005033302A1 (ja) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | 毛乳頭細胞調製品の調製方法、毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 |
EP04788471.3A EP1688484B1 (en) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | Method of preparing hair papilla cell preparation, composition and method for regenerating hair follicle and animal having regenerated hair follicle |
KR1020117016056A KR101156868B1 (ko) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | 모포 재생용 조성물 |
KR1020067008767A KR101082621B1 (ko) | 2003-10-06 | 2004-09-30 | 모유두 세포 조제품의 조제 방법 |
TW093130247A TWI346697B (en) | 2003-10-06 | 2004-10-06 | Method for preparing papilla cells-containing preparation |
TW100108596A TWI502069B (zh) | 2003-10-06 | 2004-10-06 | 皮膚三次元模型 |
US12/782,284 US20100227397A1 (en) | 2003-10-06 | 2010-05-18 | Preparation method of a hair dermal papilla cell preparation, composition and method for regenerating hair follicles, and animal having regenerated hair follicles |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003346939 | 2003-10-06 | ||
JP2003346939 | 2003-10-06 | ||
JP2004048322A JP4689175B2 (ja) | 2003-10-06 | 2004-02-24 | 毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005132813A true JP2005132813A (ja) | 2005-05-26 |
JP4689175B2 JP4689175B2 (ja) | 2011-05-25 |
Family
ID=34655913
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004048322A Expired - Lifetime JP4689175B2 (ja) | 2003-10-06 | 2004-02-24 | 毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4689175B2 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008029331A (ja) * | 2006-06-27 | 2008-02-14 | Shiseido Co Ltd | 体性に由来する複数の細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊 |
JP2008125540A (ja) * | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Lion Corp | 人工皮膚 |
JP2010534072A (ja) * | 2007-07-20 | 2010-11-04 | ドングク・ユニヴァーシティー・インダストリー−アカデミック・コーオペレーション・ファンデーション | 間葉系幹細胞を利用して毛乳頭組職を製造する方法 |
JP2010275256A (ja) * | 2009-05-29 | 2010-12-09 | Shiseido Co Ltd | Cd36発現性結合組織鞘細胞を含有する毛包を再生するための組成物 |
WO2012042618A1 (ja) * | 2010-09-29 | 2012-04-05 | 株式会社資生堂 | Cd36発現性結合組織鞘細胞を含有する毛包を再生するための組成物 |
JP2018504200A (ja) * | 2015-01-12 | 2018-02-15 | ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ | 多層皮膚代替製品、ならびにそれを作製および使用する方法 |
WO2020105643A1 (ja) * | 2018-11-19 | 2020-05-28 | 株式会社 資生堂 | 毛包を有するヒト皮膚組織を再構成するための組成物、ヒト皮膚組織モデル動物およびその製造方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003070466A (ja) * | 2001-09-05 | 2003-03-11 | Shiseido Co Ltd | 人工毛球部及びその製造方法、並びに、人工毛球部を用いた薬剤の評価方法 |
-
2004
- 2004-02-24 JP JP2004048322A patent/JP4689175B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003070466A (ja) * | 2001-09-05 | 2003-03-11 | Shiseido Co Ltd | 人工毛球部及びその製造方法、並びに、人工毛球部を用いた薬剤の評価方法 |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008029331A (ja) * | 2006-06-27 | 2008-02-14 | Shiseido Co Ltd | 体性に由来する複数の細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊 |
JP2008125540A (ja) * | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Lion Corp | 人工皮膚 |
JP2010534072A (ja) * | 2007-07-20 | 2010-11-04 | ドングク・ユニヴァーシティー・インダストリー−アカデミック・コーオペレーション・ファンデーション | 間葉系幹細胞を利用して毛乳頭組職を製造する方法 |
JP2010275256A (ja) * | 2009-05-29 | 2010-12-09 | Shiseido Co Ltd | Cd36発現性結合組織鞘細胞を含有する毛包を再生するための組成物 |
WO2012042618A1 (ja) * | 2010-09-29 | 2012-04-05 | 株式会社資生堂 | Cd36発現性結合組織鞘細胞を含有する毛包を再生するための組成物 |
KR101730216B1 (ko) * | 2010-09-29 | 2017-04-25 | 가부시키가이샤 시세이도 | Cd36 발현성 결합조직초 세포를 함유하는 모포를 재생하기 위한 조성물 |
US10172332B2 (en) | 2010-09-29 | 2019-01-08 | Shiseido Company, Ltd. | Method for regenerating hair follicles using CD36-expressing dermal sheath cells |
JP2018504200A (ja) * | 2015-01-12 | 2018-02-15 | ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ | 多層皮膚代替製品、ならびにそれを作製および使用する方法 |
US10751448B2 (en) | 2015-01-12 | 2020-08-25 | Wake Forest University Health Sciences | Multi-layer skin substitute products and methods of making and using the same |
US11806445B2 (en) | 2015-01-12 | 2023-11-07 | Wake Forest University Health Sciences | Multi-layer skin substitute products and methods of making and using the same |
WO2020105643A1 (ja) * | 2018-11-19 | 2020-05-28 | 株式会社 資生堂 | 毛包を有するヒト皮膚組織を再構成するための組成物、ヒト皮膚組織モデル動物およびその製造方法 |
CN113038830A (zh) * | 2018-11-19 | 2021-06-25 | 株式会社资生堂 | 用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物、人皮肤组织模型动物及其制造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4689175B2 (ja) | 2011-05-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Medina | The mammary gland: a unique organ for the study of development and tumorigenesis | |
JP4814226B2 (ja) | 移植用臓器の調製方法 | |
US20090093054A1 (en) | Cryopreservation of human blastocyst-derived stem cells by use of a closed straw vitrification method | |
EP1624751A2 (en) | Cryopreservation of human blastocyst-derived stem cells by use of a closed straw vitrification method | |
US20100227397A1 (en) | Preparation method of a hair dermal papilla cell preparation, composition and method for regenerating hair follicles, and animal having regenerated hair follicles | |
US20090186004A1 (en) | Method For Preparing An Organ For Transplantation | |
KR101730216B1 (ko) | Cd36 발현성 결합조직초 세포를 함유하는 모포를 재생하기 위한 조성물 | |
JP4689175B2 (ja) | 毛包を再生するための組成物、方法及び再生された毛包を担持する動物 | |
Medvinsky et al. | Analysis and manipulation of hematopoietic progenitor and stem cells from murine embryonic tissues | |
CN1968713B (zh) | 通过抑制具有毛囊形成抑制能力的基因或通过活化具有毛囊形成诱导能力的基因而再生毛囊的方法 | |
JP2007274949A (ja) | 毛乳頭細胞培養方法 | |
JP5164439B2 (ja) | 毛乳頭細胞培養方法 | |
JP4264322B2 (ja) | 毛乳頭細胞調製品の調製方法 | |
JPH06503001A (ja) | 免疫不全宿主における原基移植物 | |
WO2023176017A1 (ja) | 卵子成熟促進剤及びその用途 | |
JP6582044B2 (ja) | 凍結間葉系細胞の製造方法、及び、移植用治療材の製造方法 | |
JP2010275256A (ja) | Cd36発現性結合組織鞘細胞を含有する毛包を再生するための組成物 | |
PL211680B1 (pl) | Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MIC-1 z rosnących poroży jeleniowatych (Cervidae) | |
JP2010094076A (ja) | 哺乳動物の組織の凍結保存方法、非ヒト哺乳動物の核移植胚及びクローン非ヒト哺乳動物 | |
Reding | Thy1 is a Conserved Marker of Spermatogonial Stem Cells in the Pre-pubertal Bull Testis | |
JP2005095031A (ja) | クローン動物の作製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060710 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100223 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100412 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110208 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110216 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4689175 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140225 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |