CN1863907B - 毛乳头细胞制品的制备方法、用于再生毛囊的组合物、方法、以及附载着经再生毛囊的动物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备毛乳头细胞制品的方法，所述方法的特征在于：用胶原处理自皮肤组织去除表皮组织而得到的真皮组织部分，制备细胞悬浮液，然后将该细胞悬浮液冻结保存以杀死毛囊上皮细胞。本发明还提供了用于再生毛囊的组合物，其特征在于包含毛乳头细胞和上皮系细胞，且毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比为1∶10至10∶1。

Description

毛乳头细胞制品的制备方法、用于再生毛囊的组合物、方法、以及附载着经再生毛囊的动物

技术领域

本发明提供了制备包含活性毛乳头细胞和经失活的上皮系细胞的毛乳头细胞制品的方法、包含毛乳头细胞和上皮细胞的用于毛囊再生的组合物、使用所述组合物再生毛囊的方法，本发明还提供了通过所述方法而产生的附载有经再生毛囊的动物或三维皮肤模型。

背景技术

毛囊为在成熟生物体的几乎一生中反复自我再生的例外器官。对该自我再生结构的阐明对于临床应用高度需求的通过组织或细胞移植进行脱毛治疗、含有毛囊或皮脂腺的接近天然机能的极好的皮肤片的构建等来讲是期待的。近年，随着对干细胞研究的广泛关注，对毛囊上皮干细胞(上皮细胞)的研究也得以快速发展，且对作为毛囊特异的间叶系细胞的毛乳头细胞的性质也逐渐了解。毛乳头细胞具有为了毛囊自我再生而向毛囊上皮干细胞递送活化信号的可以说是司令塔的作用，认为在毛囊重组的评价体系中，其与毛囊上皮干细胞一同为不可缺少的细胞(Kishimoto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，96卷，7336-7341页)。

对于毛囊的再生，至今为止，通过多种方法进行了动物模型的毛囊重组实验。Weinberg等人，J.Invest.Dermatol.(1993)，100卷，229-236页描述了通过细胞移植法进行的毛囊重组的方法。Weinberg等人的移植体系为除了毛乳头细胞、新生仔上皮系细胞(包含毛囊上皮干细胞)外，还含有小鼠3T3细胞的复杂组成。根据Weinberg等人的方法，即使不将包含毛囊上皮干细胞的新生仔上皮系细胞加至移植体系，毛囊也可再生。但是，认为这是由于自毛乳头细胞部分完全去除未分化上皮系细胞(毛囊上皮干细胞)或毛囊原基困难所导致的现象。此后，Kishimoto等人(如前述)首次成功地分离纯化了毛乳头细胞，使用分离纯化的毛乳头细胞，通过动物模型的细胞移植法进行毛囊重组实验，结果发现移植含有组合的毛乳头细胞和上皮细胞的细胞部分可重组毛囊，观察到生毛，移植只含有任一毛乳头细胞或上皮细胞的细胞部分时，没观察到生毛。

但是，Kishimoto等人的毛乳头细胞纯化方法利用了毛乳头细胞特异性表达多功能蛋白聚糖(硫酸软骨素蛋白聚糖类)的性质，使用连接有报告基因的多功能蛋白聚糖基因而获得的DNA制备的转基因小鼠模型，以多功能蛋白聚糖的表达为指标进行的分离和浓缩。因此所述方法需要制备转基因小鼠、通过细胞分选仪纯化毛乳头细胞。特别地，在毛囊重组的方法中，为了使毛囊确实再生并生毛需要大量的毛乳头细胞(例如每次移植500万个细胞)，因此该方法需要制备大量的转基因小鼠和长时间使用高速细胞分选仪，存在经济上和操作时间、劳动力方面的问题。虽然在例如Prouty等人，American J.Pathol.(1996)148卷6期，1871-1885页描述了毛乳头细胞的分离，但所述方法为反复通过离心分离而分级的复杂、纯度低且回收量低的方法。

因此，通过至今为止的毛乳头细胞纯化法获得例如用于移植的足够量的经分离纯化的活性毛乳头细胞是困难的，而且不能完全阐明在毛囊再生体系中活性毛乳头细胞的作用。特别地，通过现有技术的纯化法而确定在再生毛囊的毛囊重组体系中毛乳头细胞和上皮系细胞的合适比例实际上是不可能的。

发明的公开

本发明提供了不使用转基因小鼠而简单地制备只含有作为活性细胞成分的毛乳头细胞的毛乳头细胞制品的制备方法。

本发明人令人吃惊地发现冻结保存自皮肤组织采取的真皮组织部分的细胞悬浮液后，可特异杀灭该悬浮液中混杂的毛囊上皮细胞，而大多数的毛乳头细胞仍然有活性。结果，可获得只含有作为活性细胞成分的毛乳头细胞的细胞制品。另外，由于这样获得的细胞制品只含有作为活性细胞成分的毛乳头细胞，可用于确定对于毛囊再生有效的毛乳头细胞与上皮系细胞的比例。结果，本发明人可确定用于毛囊再生最适的毛囊重组体系中毛乳头细胞与上皮系细胞的比例。

因此，第一方面，本发明提供了制备毛乳头细胞制品的方法，所述方法的特征在于：用胶原处理自皮肤组织去除表皮组织而得到的真皮组织部分，制备细胞悬浮液，然后将该细胞悬浮液冻结保存以杀死毛囊上皮细胞。

优选地将上述细胞悬浮液的细胞密度调整为1×10⁵～1×10⁸/ml后进行冻结保存。更优选地，上述冻结保存在-80℃或以下的温度例如在液氮中，优选地进行一周或更长的时间期间。

在合适的实施方案中，上述皮肤组织可来源于小鼠、大鼠或人。

在其他方面，本发明提供了用于毛囊再生的组合物，其特征在于包含毛乳头细胞和上皮系细胞，且毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比为1∶10至10∶1。

更优选地，本发明提供了包含毛乳头细胞和上皮系细胞的用于毛囊再生的组合物，其为包含通过自皮肤组织去除表皮组织、用胶原处理所得到的真皮组织部分而制备细胞悬浮液、然后将该细胞悬浮液冻结保存以杀死毛囊上皮细胞而制备的毛乳头细胞制品和上皮系细胞，其中毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比为1∶10至10∶1的用于毛囊再生的组合物。

优选地，上述毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比为1∶3至10∶1，更优选地为1∶1至10∶1，进一步更优选地为1∶1至3∶1，最优选地为1∶1。

本发明进一步提供了使用上述组合物对动物或三维皮肤模型再生毛囊的方法，并提供了经如此再生毛囊的动物或三维皮肤模型。

本发明提供了不使周转基因小鼠而简单地制备只含有作为活性细胞成分的毛乳头细胞的毛乳头细胞制品的制备方法。所述毛乳头细胞制品可用于以毛囊再生为目的的移植手术以及毛囊重组的研究和开发。特别地，由于所述毛乳头细胞制品中没有混杂活性上皮干细胞，可以精确地调节毛囊再生所使用的活性毛乳头细胞和活性上皮毛干细胞的细胞数的比，而且利于大量需要细胞的情况。

附图简述：

图1显示了冻结融解的真皮细胞部分基于LacZ和7-AAD的FACS分析结果。

图2显示了冻结融解的真皮细胞部分基于CD-49和7-AAD的FACS分析结果。

图3显示了通过冻结融解毛乳头细胞和上皮系细胞的混合移植的毛囊再生结果。

图4显示毛乳头细胞和上皮系细胞为不同种(小鼠-大鼠)时的毛囊重组结果。

图5显示毛乳头细胞和上皮系细胞为不同种(大鼠-人)时的毛囊重组的Hoechst核染色结果。

图6显示将本发明的毛囊再生体系向三维皮肤模型移植时的毛囊原基形成。

实施发明的最佳方式：

本发明提供了制备毛乳头细胞制品的方法。

本发明还提供了包含毛乳头细胞和上皮系细胞的用于毛囊再生的组合物、使用所述组合物再生毛囊的方法，并提供了附载有经如此再生的毛囊的动物或三维皮肤模型。

“毛乳头细胞”是指作为间叶系细胞位于毛囊最底部，是为了毛囊自我再生而向毛囊上皮干细胞递送活化信号的可以说是司令塔作用的细胞。仅含有活性化毛乳头细胞的毛乳头细胞制品可例如使用转基因小鼠的Kishimoto(见上文)的方法制备。但是，从收获量等点来看，优选地可通过例如自皮肤组织去除表皮组织，用胶原处理所得到的真皮组织部分而制备细胞悬浮液，然后将该细胞悬浮液冻结保存以杀死毛囊上皮细胞而制备。

本发明的通过上述冻结保存的方法具体而言可例如如下实施。

1.准备哺乳动物的表皮。

2.将所述表皮根据需要于蛋白质分解酶溶液如胰蛋白酶溶液中静置合适的时间如一晚，然后将表皮部分使用镊子等去除，留下的真皮使用胶原酶处理，制备细胞悬浮液。

3.根据需要，使用细胞滤过器过滤悬浮液，通过静置去除沉淀物。

4.记数细胞数，使用冻结保护液以合适的细胞密度，优选地以1×10⁵至1×10⁸/ml进行重悬，根据需要分装为小份，并按照常规的细胞保存方法进行冻结保存。

5.经适当的保存期间后，融解并使用。

对冻结方法没有特定的限制，在-20℃或以下，优选地在-50℃或以下，更优选地在-80℃或以下的超低温冷冻库中或在液氮中保存。对冻结保存期间也没有特定的限制，为了杀死上皮细胞，冻结保存期间可为例如1天或更长，优选地为3天或更长，更优选地为1周或更长的时间期间。而且，经确认即使在液氮中保存4个月，毛乳头细胞可继续生存。作为冻结保护液，可使用在细胞保存中使用的常规保护液，例如セルバンカ一2细胞冻结保存液(目录号BLC-2)(日本全药工业制)。

可通过本领域技术人员公知的方法计数细胞数。例如细胞数的计数为向血球计算板(SLGC公司，EOSINOPHIL COUNTER)提供使用等量的0.4％台盼蓝染色液(No.15250-061，Invitrogen)稀释的细胞悬浮液，可按照随血球计算板提供的使用说明书所述方法算出细胞数。

对本发明中使用的毛乳头细胞的来源哺乳动物表皮没有特定的限制，可来自所有哺乳动物例如人、黑猩猩、其它灵长类、家畜动物如狗、猫、兔子、马、绵羊、山羊、牛、猪、实验用动物如大鼠、小鼠、豚鼠，更优选地为裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠的表皮。此外，对动物的系统也没有限定。

本发明用于毛囊再生的组合物中的“上皮系细胞”是指构成皮肤的表皮或上皮的大部分的细胞，其自挨着真皮的1层基底细胞产生。以小鼠为例，作为上皮系细胞可优选使用来自新生仔(或胎儿)的上皮系细胞，但也可使用即使是来自成熟的皮肤例如休止期毛的表皮或成长期毛的表皮的细胞，具有角质形成细胞的形态的细胞培养物。这样的细胞，可通过技术人员公知的方法自目的供体动物的皮肤制备。

在合适的方案中，上皮系细胞可如下制备。

1.准备哺乳动物的表皮。

2.将所述表皮根据需要于0.25％胰蛋白酶/PBS中4℃静置一晚，由此进行胰蛋白酶处理。    

3.通过镊子等仅剥离表皮部分，细切后，于合适的培养液(如角质形成细胞用培养液)中4℃约1小时悬浮处理。

4.将该悬浮物通过具有合适孔径的细胞滤过器，然后通过离心分离机回收上皮系细胞。

5.将该细胞制品在KGM或SFM培养基中以目的细胞密度悬浮，直至使用前于冰上静置。

本发明的上皮系细胞与毛乳头细胞同样地可来源于所有哺乳动物例如人、黑猩猩、其它灵长类、家畜动物如狗、猫、兔子、马、绵羊、山羊、牛、猪、实验用动物如大鼠、小鼠、豚鼠，更优选地为裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠的表皮。此外，所述表皮部位可为有毛部位如头皮，也可为无毛部位如周皮。

本发明人通过上述冻结保存获得的只含有作为活性细胞的毛乳头细胞且上皮系细胞死亡的毛乳头细胞制品与除去了毛乳头细胞且只含有活性上皮系细胞的上皮系细胞制品以多种细胞比率混合，移植至受体动物并研究毛囊再生时，发现毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比和毛囊再生之间具有一定的关系。即当欲再生较多毛囊时，发现活性毛乳头细胞与活性上皮系细胞的细胞数之比应为1∶3至10∶1，更优选地为1∶1至10∶1，进一步更优选地为1∶1至3∶1，最优选地为1∶1。换言之，如果适当调整活性毛乳头细胞与活性上皮系细胞的比率并移植至受体动物，可调节毛囊再生。

毛乳头细胞与上皮系细胞的组合可为同种系和异种系。例如毛乳头细胞制品为来自小鼠时，上皮系细胞可为小鼠来源(同种系)或者为其它种如大鼠、人来源(异种系)。因此，本发明的用于再生毛囊的组合物可为例如毛乳头细胞与上皮系细胞均来自小鼠的组合、均来自大鼠的组合、或均来自人的组合(上述的同种)；此外，毛乳头细胞来自小鼠且上皮系细胞来自大鼠的组合、毛乳头细胞来自大鼠且上皮系细胞来自小鼠的组合、毛乳头细胞来自小鼠且上皮系细胞来自人的组合、毛乳头细胞来自大鼠且上皮系细胞来自人的组合、毛乳头细胞来自人且上皮系细胞来自小鼠的组合、毛乳头细胞来自人且上皮系细胞来自大鼠的组合(上述的异种)等也可以。

将本发明的用于毛囊再生的组合物向受体动物移植的方法可为本身已知的移植方法。例如参照Weinberg等人，J.Invest.Dermatol.100卷(1993)，229-236页。例如对裸小鼠进行移植时，将所准备的细胞在移植时至移植前1小时混合，通过离心(9000×g，10分钟)去除培养液，成为50至100μl左右的细胞块后，快速注入在裸小鼠背部皮肤中埋入的硅制圆顶型小室内。一周后仔细卸下小室，然后第2周后可肉眼观察移植部位有无毛发形成。为了发毛，对包括人在内的动物进行移植时也可类似地进行，合适的方法可由医师或兽医作出恰当的决定。

例如对于直径约1cm的圆，毛乳头细胞以1×10⁶～10⁸个/cm²，优选地以1.0～1.5×10⁷个/cm²的移植量，更优选地以1.27×10⁷个/cm²的移植量移植。

将上述组合物移植至受体动物时，所述移植可为同种移植，即自体移植、同种同系移植或同种异系移植，也可为异种移植。当为同种移植时，毛乳头细胞制品和上皮系细胞均与受体同种。当为异种移植时，有时毛乳头细胞制品或上皮系细胞的任一方与受体异种，而另一方与受体同种；有时两方均与受体异种。作为受体动物，例如可为所有哺乳动物例如人、黑猩猩、其它灵长类、家畜动物如狗、猫、兔子、马、绵羊、山羊、牛、猪、实验用动物如大鼠、小鼠、豚鼠，更优选地为裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠。

此外，通过将本发明的上述组合物移植至合适的受体动物，可提供附载有再生毛囊的嵌合动物。所涉及的嵌合动物可提供例如用于研究和阐明毛囊再生机制、或者用于筛选毛囊再生或发毛或脱毛的有效药剂和生药的有力动物模型。受体动物不限于向该动物移植的体系中包含的各细胞的来源动物，优选免疫系统受抑制的动物。此外，作为动物种，可使用作为实验动物的动物种，只要遵循本发明的目的，任一动物均可，优选地可列举小鼠、大鼠等。在这些动物中，作为免疫系统受抑制的动物，以小鼠为例，可列举裸小鼠这样的具有象胸腺缺陷的特性的动物。另外，考虑到本发明的目的，特别优选的受体动物可列举市售的裸小鼠(如Balb-c nu/nu系统)、SCID小鼠(如Balb/c-SCID)、裸大鼠(如F344/N Jc1-rnu)。

进一步地，使本发明的组合物包含于三维皮肤模型中，可提供附载有再生毛囊的三维皮肤模型。三维皮肤模型通过技术人员公知的方法(Exp.Cell Res.，Amano S.等人(2001)，271卷，249-262页)，例如可如下述制备。三维皮肤模型包含的毛乳头细胞量为1×10⁶～10⁸个/cm²，优选地为1.0～1.5×10⁷个/cm²，更优选地为约1.27×10⁷个/cm²。

三维皮肤模型的制备方法：

人成纤维细胞以适当量分散于0.1％胶原溶液/DMEM/10％FBS中，分注入培养皿，立即于37℃的CO₂孵箱中静置。凝胶化后，自培养皿壁面和底面剥下凝胶，使其在培养皿中悬浮。边摇胶原凝胶边培养，使凝胶收缩至约5分之1，成为真皮模型。将真皮模型置于不锈钢栅网上，其上设置玻璃环，并将KGM(表皮细胞培养用培养基)中分散的人培养表皮细胞(1.0×10⁶细胞数/ml)0.4ml注入玻璃环内并培养。此时同时混合毛乳头细胞部分并注入。作为人培养表皮细胞的替代物，也可使用新生小鼠的表皮细胞。以真皮模型的上部暴露于空气的程度向培养皿内注入DMEM-KGM-5％FBS+Ca²⁺的培养基，培养，约1周后观察皮肤模型，判定有无毛囊原基的形成和再现性。

附载有重组毛囊的三维皮肤模型与附载有上述再生毛囊的嵌合动物同样地，可用于研究和阐明毛囊再生机制、用于筛选发毛或脱毛的有效药剂和生药。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

鉴于确认了通过对真皮细胞部分的冻结保存，可得到杀死上皮细胞且只含有作为活性细胞的毛乳头细胞的细胞制品，将自导入了在多功能蛋白聚糖(Versican)启动子下游连接有标记蛋白LacZ结构基因的表达载体的转基因小鼠(以下称为多功能蛋白聚糖-LacZ TG小鼠)采取的皮肤组织获得的细胞部分冻结保存，对融解的细胞制品进行流式细胞术分析。

(1)制备来自多功能蛋白聚糖-LacZ TG小鼠的真皮细胞的“冻结保存”毛乳头细胞制品

(1-1)自多功能蛋白聚糖-LacZ TG小鼠所生出的新生仔(出生后4天或以内使用)中选择LacZ阳性个体。多功能蛋白聚糖-LacZ TG小鼠例如可通过Kishimoto等人(见上述)所述的方法制备。

(1-2)将每一个体用乙醇和磷酸缓冲生理盐水(下文中称为PBS)洗净后，剥离背部皮肤，于0.25％胰蛋白酶/PBS中4℃静置一晚。

(1-3)第二天，通过镊子等分离表皮和真皮，将真皮侧于0.35％胶原酶/DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle基本培养基，下文中称为“DMEM”)中37℃处理约1小时。

(1-4)仔细地将(1-3)的细胞进行悬浮操作后，通过细胞滤过器，然后使用离心机(900g，10分钟)收集细胞。

(1-5)计测细胞数，使用细胞冻结保护液(セルバンカ一2(BLC-2)，日本全药工业制)以1×10⁵～1×10⁸/ml的细胞密度进行重悬，分装于冻结管中，并按照常规的细胞保存方法于液氮中保存。

(1-6)约1周后融解，对其使用以下的流式细胞术分析。

(2)荧光报道分子LacZ的流式细胞术分析

实验材料

荧光报道分子LacZ流式细胞术试剂盒(FluoroReporter lacZ flowcytometry kits，Molecular Probe公司，目录号F-1930(50次反应)/F-1931(250次反应))

试剂的准备：

反应液：试剂盒中的FDG试剂(组分A)以MiliQ水1∶10稀释。一个样品使用50μl。

终止液：试剂盒中的PI试剂(组分D)以试剂盒所带的缓冲液1∶100稀释。一个样品使用0.9ml。直至使用时于冰水中冷却至4℃。作为染色剂，使用特异性染色上皮细胞的特异性抗体CD49f单克隆抗体(Serotec公司制，MCA699)、特异性染色死细胞的7-AAD(Beckman coulter公司生产，PN-IM 3422)。

(2-1)将来自多功能蛋白聚糖-LacZ TG小鼠的真皮细胞的悬浮液调节为细胞数约1×10⁷细胞数，加入750μl的染色剂，并移入1.5ml的离心小管。

(2-2)以3000旋转离心5分钟，弃上清。将细胞沉淀重悬于100μl的染色剂。将该悬浮液于37℃的恒温槽中预孵育10分钟。

(2-3)加入50μl于37℃的恒温槽中预孵育10分钟的反应液。在37℃准确进行1分钟的反应。

(2-4)加入0.9ml终止液，于冰水中保存。

(2-5)10分钟后加入40μl 50mM PETG(组分B)，以完全阻止反应。

(2-6)立即通过FACS测定荧光强度。流式细胞术(FACS)的操作方法按照厂商的说明书进行。FACS的测定装置例如可使用Beckmancoulter公司的XL-MCL。通过与本试剂盒中使用的荧光素fluorescein(荧光素)相应的检测设定来测定细胞中荧光强度的分布。

(3)分析结果

基于LacZ和7-AAD的FACS分析显示经冻结融解的细胞中，大部分LacZ⁺细胞即使经历冻结融解，也仍为活细胞(图1)。因此，表明毛乳头细胞并不经冻结融解死亡。另外，基于CD49和7-AAD的FACS分析显示大部分CD49⁺细胞(上皮系细胞)冻结融解后，以7-AAD⁺部分(死部分)存在(图2)。因此，表明经冻结融解的细胞制品中的活细胞为LacZ⁺、CD49^-、7-AAD^-，即为毛乳头细胞(LacZ⁺)而非上皮系细胞(CD49^-)，并且为活细胞(7-AAD^-)。总结以上结果，可见大部分活细胞不为上皮系细胞，而为毛乳头细胞。因此，明确了通过冻结融解可特异地杀死上皮系细胞，可制备只含有作为活性细胞的毛乳头细胞的毛乳头细胞制品。

实施例2

试验通过冻结融解的毛乳头细胞和上皮系细胞的混合移植而致的毛囊再生

I.各种细胞的制备

(1)小鼠来源的上皮细胞

(1-1)手术前一天，将来自ICR系统小鼠的新生仔个体用乙醇和磷酸缓冲生理盐水(下文中称为PBS)洗净后，剥离背部皮肤，于0.25％胰蛋白酶/PBS中4℃静置一晚，由此进行皮肤的胰蛋白酶处理。

(1-2)通过镊子仅剥离表皮部分，细切后，在角质形成细胞用培养液(下文中为“KGM”)中4℃悬浮处理约1小时。

(1-3)将通过细胞滤过器的(1-2)的悬浮液使用离心机(×900g，10分钟)回收上皮系细胞。

(1-4)对每个受体动物，将相当于2个新生小鼠来源的上皮系细胞量(细胞数约1×10⁷)用于手术。将所述相当量的细胞悬于KGM或SFM培养基中，直至使用前静置于冰上。此即“小鼠来源的上皮细胞”制品。

(2)“用时制备”的小鼠来源的真皮细胞制品(比较例)的制备

(2-1)手术前一天，将来自ICR系统小鼠的新生仔通过上述(1-1)、(1-2)同样的方法进行皮肤的胰蛋白酶处理。

(2-2)通过镊子剥离表皮部分，将剩下的真皮细切后，于含有0.35％胶原酶的合适培养液DMEM+10％FBS中37℃悬浮处理约1小时。

(2-3)将通过细胞滤过器的(2-2)的悬浮液使用离心机回收真皮细胞。

(2-4)对每个受体动物，将细胞数约1×10⁷的真皮细胞用于手术。将所述相当量的细胞悬浮于DMEM+10％FBS等中，直至使用前静置于冰上。此即“用时制备”的小鼠来源的真皮细胞制品。

(3)制备包含毛乳头细胞部分的“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品

(3-1)剥离新生仔ICR系统小鼠背部皮肤，收集表皮。

(3-2)使用胰蛋白酶溶液静置一晚，第二天通过镊子去除表皮部分，将剩下的真皮使用胶原酶处理，制备细胞悬浮液。  

(3-3)使用细胞滤过器过滤上述悬浮液，然后通过静置去除沉淀物。

(3-4)记数细胞数，使用冻结保护液以1×10⁵～1×10⁸/ml进行重悬，分装于冻结管中，并按照常规的细胞保存方法于液氮中保存。

(3-5)约1周后融解，对移植实验使用1×10⁷个/移植。此即“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品。

II.毛囊重组方法(向动物的移植方法)    

上述小鼠来源的上皮细胞制品(1-4)与“用时制备”的小鼠来源的真皮细胞制品(2-4)或“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品(3-5)混合。这些混合物作为以下“重组毛囊制备步骤”的“细胞悬浮液”使用。

“重组毛囊的制备步骤”

准备的材料：

受体动物(Balb-c nu/nu系统的裸小鼠，5周龄或以上)

硅氧烷制的直径1厘米左右的圆顶形帽(以下称为球形物)

麻醉药

手术用剪子、镊子、缝合器

微量加样器

细胞悬浮液(培养液DMEM+10％FBS约150μl中悬浮)

“步骤”

(i)麻醉裸小鼠。

(ii)切取直径不足1厘米的背部皮肤。

(iii)将球形物插入伤口，用缝合器固定。

(iv)使用加样器向球形物内注入细胞悬浮液。

(v)这样培养约1周，取出球形物。

(vi)取出球形物后，过1-6周后(通常为2周后)观察掉痂后的痕迹处重组毛囊的生长。

毛囊重组实验的结果如下表1和图3所示。即使在仅移植“用时制备”的小鼠来源真皮细胞制品时也观察到毛囊再生，与此相反，仅移植“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品时没有观察到毛囊再生。此结果与Kishimoto等人(见前述)的使用自转基因小鼠来源的真皮细胞部分通过细胞分选而钝化的毛乳头细胞的结果一致，证明了“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品中仅包含作为活性细胞成分的毛乳头细胞。

表1  

实施例3

毛乳头细胞部分和上皮系细胞部分的细胞比率对毛囊重组效率的影响

将“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品与通过实施例2所述的小鼠来源上皮细胞同样的处理而制备的新生大鼠皮肤来源的上皮系细胞分别调节细胞数为0、1×10⁶、3.3×10⁶、1×10⁷的细胞数，混合，按照上述的毛囊重组操作步骤移植至裸小鼠背部皮肤，观察有无毛囊重组。结果如下表2所示。

表2

毛乳头细胞部分和上皮系细胞部分的比率对毛囊重组效率的影响

从表2的结果可见，毛乳头细胞和上皮系细胞的混合比为1∶10至10∶1的范围内观察到毛囊再生，以1∶1至3∶1，尤其是以1∶1比例的细胞混合物移植时，可看到产生显著的毛囊再生。

实施例4

上皮系细胞为自成熟的小鼠皮肤来源时的毛囊重组

自成熟的小鼠皮肤来源的(10周龄或以上)的上皮系细胞的制备根据实施例2所述的新生小鼠来源上皮系细胞的制备而进行。作为成熟的小鼠皮肤来源的上皮系细胞，使用自出生10周或以上小鼠的休止期毛的表皮制备而得的细胞(休止期毛上皮系细胞含有系)和使用通过石蜡涂布而对休止期毛的皮肤进行除毛处理的机械刺激并促进发毛的小鼠表皮制备而得的细胞(成长期诱导毛上皮系细胞含有系)这两种。这些自成熟小鼠皮肤来源的上皮系细胞分别与“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品以细胞数为1∶1进行混合，按照上述重组毛囊制备步骤移植至小鼠背部。结果如下表3所示。

表3

+++观察到以高密度发毛

++ 观察到发毛

+  观察到移植组织内的毛囊形成

有无毛囊原基的形成是通过制备来自移植部位组织的薄切片，使用苏木精曙红染色等常规染色后，通过观察形态对表皮层的凹陷和真皮成纤维细胞在表皮凹陷部分正下面的凝集而判定的。

自该结果可见，移植休止期毛上皮系细胞含有系、成长期诱导毛上皮系细胞含有系中的任一种，均可观察到发毛。因此，明确了上皮系细胞不限于来自新生仔表皮，当来自成熟表皮如休止期毛或成长期毛的表皮时也可有效再生毛囊。

实施例5

毛乳头细胞和上皮系细胞为异种系时的毛囊重组

将“冻结保存”的小鼠来源真皮细胞制品和新生大鼠皮肤来源的上皮系细胞分别约1.0×10⁷个混合，按照上述重组毛囊的制备步骤移植至裸小鼠背部皮肤，调查有无毛囊重组。结果如下面的表4及图4所示。

表4

+++ 观察到以高密度发毛

++  观察到发毛

+   观察到移植组织内的毛囊形成

由该结果可见，即使毛乳头细胞和上皮系细胞的混合物为异种系，也和同种系同样可有效使毛囊再生。

实施例6

上皮系细胞为人新生儿周皮来源时的毛囊重组

通过割礼等得到的新生儿周皮制备表皮细胞，与冻结保存的小鼠毛乳头细胞制品混合，按照上述重组毛囊的制备步骤移植至裸小鼠背部皮肤，调查有无毛囊重组。

周皮组织在常规的成纤维细胞培养用培养基(DMEM培养基等)和角化细胞培养用培养基(角质形成细胞-SFM培养基；Invitrogen等)中冷藏保存3～1周左右，从而实施保存。

周皮来源的培养细胞按照下述方法制备。

将上述培养基中的周皮组织(与人种无关，均可用)于充满在PBS(组织培养用，无钙镁)中添加有链霉素、青霉素等抗生素的溶液的培养皿中反应30分钟。接下来的10分钟，移至充满有新的PBS和抗生素的培养皿中反应10分钟。除去过剩的脂肪组织后，截成约1cm²左右的皮肤片，在デスパ一ゼ溶液(合同清酒制；浓度1000U～5000U)中使悬浮，于4℃反应约18小时。反应后，重复用PBS溶液洗后，将表皮部分小心地用镊子剥离。剥离的表皮片悬于5ml 0.05％胰蛋白酶-0.5mM EDTA溶液中，37℃反应15分钟。

加入胰蛋白酶抑制剂停止反应后，于900转离心10分钟后，弃上清。重悬于10ml角质形成细胞-SFM培养基(Invitrogen公司)，计数细胞数。将约1×10⁶～10⁷个细胞用于进行一次移植实验。为了移植，在制备传代的培养表皮细胞时，将约1×10⁶个表皮细胞接种于I型或IV型胶原溶液包被的100mm培养皿或75cm²的烧瓶中，使用角质形成细胞-SFM培养基，于CO₂孵箱中按照常规方法培养。细胞达到汇片时通过胰蛋白酶剥离回收，重新调整为1×10⁶的细胞密度，继续培养直至达到所需的细胞数、传代数。

上述移植的结果如下表5所示。

表5

+  观察到移植组织内的毛囊形成

由以上结果可见，即使将人来源的上皮系细胞作为上皮系细胞与小鼠毛乳头细胞组合，也可有效地再生毛囊。此外，令人感兴趣的是，尽管周皮细胞为没有毛囊和毛根的皮肤部位来源的上皮系细胞，其与毛乳头细胞组合也可使毛囊再生。因此，可见在使毛囊再生的体系中，可与毛乳头细胞组合的上皮系细胞不限于来自有毛部位的皮肤，还可来自无毛部位的皮肤。

实施例7

上皮系细胞为成人周皮来源时的毛囊重组

通过包茎除去等手术得到的成人周皮组织(20岁)制备表皮细胞，与冻结保存的小鼠毛乳头细胞制品混合，按照上述毛囊重组的制备步骤移植至裸小鼠背部皮肤，调查有无毛囊重组。

成人周皮组织在常规的成纤维细胞培养用培养基(DMEM培养基)和角化细胞培养用培养基(角质形成细胞-SFM培养基；Invitrogen等)中冷藏保存1周左右时间，从而实施保存。

成人周皮组织来源的培养细胞的制备方法可按照实施例6的新生儿周皮来源的培养细胞的制备方法进行。

上述移植的结果如下表6所示。

表6

+  观察到移植组织内的毛囊形成

由以上结果可见，即使将成人来源的上皮系细胞作为上皮系细胞与小鼠毛乳头细胞组合，也可有效地再生毛囊。由此可见在使毛囊再生的体系中，可与毛乳头细胞组合的上皮系细胞与发育过程、已成熟的组织无关，均可利用。

实施例8

人周皮来源的培养细胞的传代数对毛囊重组的影响

在实施例6和7中，将人新生儿或成人周皮来源的不同人种的上皮细胞经不同的传代数培养后，与小鼠毛乳头细胞组合，提供用于毛囊重组的实验时，关于重组的效率如以下表7所示。

表7

+    观察到移植组织内的毛囊形成

-    未观察到移植组织内的毛囊形成

由以上结果可见，作为上皮系细胞，与人种无关，传代数越少，越可重组毛囊。

实施例9  对经重组毛囊的研究

为了确证重组的毛囊是否为经毛乳头细胞和上皮系细胞组合而组成的，可例如使用种特异性抗体的方法或使用种特异性基因序列(人A1u序列等)。更简单地，作为用于毛囊再生的本发明的组合物，使用异种系组合物(例如毛乳头细胞为小鼠来源，而上皮系细胞为大鼠或人来源，或者为相反情况)，通过核染色用Hoechst#33258试剂(Molecular Probe公司)染色，当为异种系的小鼠时，核内可明确观察到多个点，而人、大鼠均没有观察到此现象，因此易于通过组织学观察而判断(Miller GJ&Ferrara JA，Stain Technol.63(1)：15-21，1988)。

Hoechst#33258核染色法

将经薄切的移植部位组织的石蜡切片置于载玻片上(优选为4-6μm)，经常规的脱石蜡处理(二甲苯洗2次→99.9％乙醇洗→80％乙醇洗→70％乙醇洗→水洗)，转移至PBS溶液中(可以这种状态暂时放置)。

将Hoechst#33258(Molecular Probe公司)4mg溶解于1mL PBS溶液中(用铝避光)。将所制得的Hoechst#33258溶液10μl用10ml PBS稀释(1000倍稀释，终浓度为4μg/ml)，添加数滴至平置的载玻片的组织切片上至完全覆盖。然后，室温避光反应15分钟，用水洗5分钟后，使用GVA Mounting Solution(甘油体系封入剂，使用Zymed Lab.生产，フナコシ药品)和盖玻片封入。在可观察UV区激发的荧光显微镜下进行观察。

根据该方法，观察到小鼠细胞的核为亮的多个点，而其它的大鼠、人细胞未观察到点，由此可鉴别组织的来源物种。

图5显示的是将毛乳头细胞来源于小鼠且上皮系细胞来源于人(来源于人新生儿周皮)的毛囊重组体系移植时的荧光显微镜照片的结果与经常规的组织染色即苏木精曙红(HE)染色(参见：“所有染色法”，医齿药出版株式会社，p2-7，1988年)的组织图像的比较。由该图可见，毛囊是由毛乳头细胞(具有多个来自小鼠的亮点的部分)和上皮系细胞(人来源的不具有点的部分)两者构成的。

实施例10

在三维皮肤模型上的毛囊原基再生

人成纤维细胞以适当量分散于0.1％胶原溶液/DMEM/10％FBS中，分注入培养皿，立即于37℃的CO₂孵箱中静置。凝胶化后，自培养皿壁面和底面剥下凝胶，使其在培养皿中悬浮。边摇胶原凝胶边培养，使凝胶收缩至约5分之1，成为真皮模型。将真皮模型置于不锈钢栅网上，其上设置玻璃环，并将KGM(表皮细胞培养用培养基)中分散的人培养表皮细胞(1.0×10⁶细胞数/ml)0.4ml注入玻璃环内并培养。此时同时混合注入“冻结保存”的小鼠来源的真皮细胞制品。以真皮模型的上部暴露于空气的程度向培养皿内注入DMEM-KGM-5％FBS+Ca²⁺的培养基，培养，约1周后观察皮肤模型，通过苏木精曙红染色及上述Hoechst染色判定有无毛囊原基的形成和再现性。结果如图6所示。

由图6结果可明确，即使将本发明的毛囊再生体系移植至三维皮肤模型，也可观察到毛囊原基形成。

工业可利用性

本发明的用于毛囊再生的组合物可用于毛囊移植和毛囊重组相关的研究和开发。

Claims (28)

1.制备毛乳头细胞制品的方法，所述方法的特征在于：用胶原处理自皮肤组织去除表皮组织而得到的真皮组织部分，制备细胞悬浮液，然后将该细胞悬浮液冻结保存以杀死毛囊上皮细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中将上述细胞悬浮液的细胞密度调整为1×10⁵～1×10⁸/ml后进行冻结保存。

3.权利要求1或2所述的方法，其中上述冻结保存是于-80℃或以下的温度进行的。

4.权利要求1或2所述的方法，其中上述冻结保存是于液氮中进行的。

5.权利要求1或2所述的方法，其中将上述冻结保存进行一周或更长的时间期间。

6.权利要求1或2所述的方法，其中皮肤组织来源于小鼠。

7.权利要求1或2所述的方法，其中皮肤组织来源于大鼠。

8.权利要求1或2所述的方法，其中皮肤组织来源于人。

9.用于毛囊再生的组合物，其包含这样的毛乳头细胞制品和上皮系细胞，且毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比为1∶10至10∶1，其中所述毛乳头细胞制品是通过用胶原处理自皮肤组织去除表皮组织而得到的真皮组织部分，制备细胞悬浮液，然后将该细胞悬浮液冻结保存以杀死毛囊上皮细胞而制备的。

10.权利要求9所述的组合物，其中毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比约为1∶1。

11.权利要求9或10所述的组合物，其中将上述细胞悬浮液的细胞密度调整为1×10⁵～1×10⁸/ml后进行冻结保存。

12.权利要求9或10所述的组合物，其中上述冻结保存是于-80℃或以下的温度进行的。

13.权利要求9或10所述的组合物，其中上述冻结保存是于液氮中进行的。

14.权利要求9或10所述的组合物，其中将上述冻结保存进行一周或更长的时间期间。

15.权利要求9或10所述的组合物，其中毛乳头细胞和上皮系细胞均来源于小鼠、或者均来源于大鼠、或者均来源于人。

16.权利要求9或10所述的组合物，其中毛乳头细胞和上皮系细胞为不同物种的细胞，分别来源于小鼠、大鼠或者人。

17.权利要求9或10所述的组合物，其中上皮系细胞来源于人周皮。

18.再生毛囊的方法，其包括制备包含权利要求9至17中任意一项所述的组合物的皮肤三维模型。

19.权利要求18所述的方法，其中毛乳头细胞以1×10⁶～10⁸个/cm²的量包含于所述皮肤三维模型中。

20.权利要求18所述的方法，其中毛乳头细胞以1.0～1.5×10⁷个/cm²的量包含于所述皮肤三维模型中。

21.权利要求9至17中任意一项所述的组合物的用途，用于制备移植至受体动物从而获得附载着重组毛囊的嵌合动物的制品。

22.权利要求21所述的用途，其中受体动物为免疫系统受到抑制的动物。

23.权利要求21或22所述的用途，其中受体动物为选自由裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠组成的组中的免疫系统受到抑制的动物。

24.权利要求21或22所述的用途，其中以毛乳头细胞为1×10⁶～10⁸个/cm²的移植量进行移植。

25.权利要求24所述的用途，其中以毛乳头细胞为1.0～1.5×10⁷个/cm²的移植量进行移植。

26.皮肤三维模型，其是通过制备包含权利要求9至17中任意一项所述的组合物的皮肤三维模型从而获得附载着重组毛囊的皮肤三维模型。

27.权利要求26所述的皮肤三维模型，其中毛乳头细胞以1×10⁶～10⁸个/cm²的量包含于所述皮肤三维模型中。

28.权利要求26所述的皮肤三维模型，其中毛乳头细胞以1.0～1.5×10⁷个/cm²的量包含于所述皮肤三维模型中。

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