CN1480732A - 一种纳米放大检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米放大检测的方法，首先是蛋白质芯片的制备，采用硅烷化处理过的玻片为固相支持物，将阳性对照，用于检测蛋白质和阴性对照分别点于玻片上，一定温度和时间，室温下放置；其次是制备胶体金，将一定量胶体金调至pH值，分别加入系列稀释的等标蛋白，混匀，室温下静置后分别加入氯化钠溶液。利用银原子可被胶体金吸附的特点，以银显影液来定位胶体金沉积部位进行银加强，提高了检测灵敏度，成本低廉，方便快速。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质芯片检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种纳米放大检测的方法，该方法可应用在蛋白质芯片检测常见遗传和传染性疾病中。
背景技术
随着人类基因组(测序)计划(Human genome project)的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长[1]。然而，怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。生物芯片不仅在高通量基因测序、基因表达研究中已经发挥了重要作用，也将在后基因组时代研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用方面发挥极其重要的作用，也必将在临床基因诊断中占据重要的地位。生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破[2]。一般认为，生物芯片技术的开发与运用将在生物学和医学基础研究、农业、疾病诊断、新药开发、食品、环保等广泛的领域中。正像分子DNA技术成为现代生物学的象征一样，生物芯片技术作为新一代生物技术，将从根本上改变目前生物学和生物技术的观念和效率，它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值-破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。在这个生物学飞速发展的世纪，蛋白质的研究可能慢得使人恼火。它们复杂的化学结构以及精致的3D图像使它们很难于分析。但是最近的一个突破戏剧性地加速了它们的研究。在最近的Science上，研究人员报道了他们发明的一种蛋白芯片，它可以在一次同时分析5800个酵母蛋白[3]。这种芯片可以辅助研究以及做临床诊断，它可以迅速揭示参与成千上万的蛋白质相互作用的物质。
随着人类基因组测序工作的完成，后基因组计划的启动，人们越来越关注能够反映基因信息的蛋白质。蛋白质功能一旦出现异常，就可引发疾病，研究其组成及性质是提示基因和疾病连结链中的关键一环[4]，有关蛋白质的研究以前往往采用色谱分离纯化、电泳、质谱等方法，这些分析研究方法，技术条件要求高，仪器设备昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适应大规模的筛选和临床检测。
上世纪90年代兴起的生物芯片技术，特别是蛋白质芯片技术可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者和生物技术公司的瞩目，如美国塞弗根生物技术有限公司的蛋白质芯片技术(WO 98-59362)，以及中国军事医学科学院和深圳益生堂生物企业有限公司合作研制的“丙型肝炎分片段抗体检测试剂盒”，但是这些蛋白质芯片检测试剂盒，需要价格昂贵的检测仪器设备，检测成本较高，而且不适合医院，特别是野外工作如人口疾病普查以及战时伤员救护。
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发明内容
本发明的目的是提供一种纳米放大检测的方法，该方法可将普通的蛋白质芯片信号放大，成本低廉，方便快速。
一种纳米放大检测的方法，其技术方案是：使用胶体金标记的抗体或抗原与已与结合在蛋白质芯片上特异探针反应的体内指标蛋白进行免疫反应，通过含有硝酸银的显色液作用，形成肉眼可见目标。在本发明中，结合在蛋白质芯片上特异探针是指人体内疾病标志性蛋白，这些标志性蛋白包括抗原，抗体，受体，配体。优选抗原和抗体。如体内肝肿瘤标志性蛋白-甲胎蛋白；乙肝患者的表面抗原(HBsAg)和表面抗体(HBsAb)、e抗原(HBeAg)和e抗体(HBeAb)、核心抗体(HBcAb)和核心抗原(HBcAg)；艾滋病患者HIVAg或HIVAb；丙肝病人的HCVAb和性病患者的如TPAb等抗原或抗体。本发明中蛋白质芯片使用的固相支持物是常用的，并且也通过常规的处理，以保持固相支持物与特异探针的结合。常用的固相支持物包括硝酸纤维素膜，玻璃片等。在本发明中，体内指标蛋白是人体患病后与正常体内不同的一类蛋白，这些蛋白有的是人体机体应对疾病正常免疫反应产物，有的是病原生物的物质，如各种抗体等。因此本发明适用于多种疾病检测，例如乙肝、丙肝、艾滋病以及多种性病的检测等。
本发明中使用的显色液为硝酸银水溶液。优选地，本发明中使用的显色液由染色液和硝酸银水溶液按体积比49-99∶1混合而成。以重量百分比计，染色液含有0.255％柠檬酸、0.235％柠檬酸三钠、1.7％对苯二酚，余量为蒸馏水。硝酸银水溶液是指含2％的硝酸银的水溶液(以重量百分比计)。
本发明按以下步骤进行：
①检测体内疾病的特异性蛋白质芯片的制备：采用硅烷化处理过的玻片为固相支持物，将阳性对照、用于检测的蛋白质和阴性对照分别点于玻片之上，温度32℃-40℃，湿度70％-90％的条件下固定1-2小时，以10-30ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤除去未结合的蛋白和杂质，4℃保存。使用前于室温下放置约20-30分钟。
②蛋白质芯片的使用：首先制备胶体金，即先将0.1-0.2mg/ml氯金酸(HAuCl4)溶液100ml-200ml放入微波炉中，在高档沸腾2-3min，迅速一次加入6.0-12.0ml 10-20mg/ml柠檬酸三钠水溶液，放入微波炉中在中档保持2-3min，即为约10-20nm的胶体金。放置于4℃保存。
制备胶体金后，确定胶体金与待标记蛋白的用量比，即取10-20管各0.5ml-1ml的胶体金，调至pH值为6-10，分别加入5-40mg待标记蛋白，混匀，室温下静置5-10分钟后加入总体积1/10-1/20量的的氯化钠(NaCl)溶液，室温下放置1-2小时，观察其颜色变化，记下未变色管中所加最少待标记抗体量，实际标记中以此量增加10％-20％为实验用量。
取10-20μl胶体金标记蛋白质溶液，加入20-40μl待检样品，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至500-1000μl，32-40℃下轻轻振荡备用。
将以上配置的杂交缓冲液覆盖于玻片之上，32-40℃杂交5-15分钟后弃去，以10-30ml 80×磷酸盐洗液(PBN)洗涤2-5次后，再以10-30ml 1×磷酸盐洗液(PBN)洗涤1-3次，每次1-3分钟。
将染色液和硝酸银水溶液以49-99∶1的比例混合均匀，覆盖于玻片之上，显色时间为2-5分钟，观察结果。
其基本原理是：首先让携带有胶体金且与体内指标特异性结合的蛋白质与体内特异性指标蛋白质结合，再覆盖于蛋白质芯片上，洗涤，最后通过硝酸银水溶液显色，形成肉眼可见的目标。
本发明提供的检测方法除了具有一般胶体金标记检测试纸的快速、简单的优点外，不具有除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果等特点。本发明采用了免疫金银染色法，即利用银原子可被胶体金吸附的特点，以银显影液来定位胶体金沉积部位进行银加强，不仅提高了检测灵敏度，而且降低了金标试剂的用量，节省了费用。此外它在检测多元化方面进一步的改善，可以一次检测同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值，如血站急需的HBsAg、抗HCVIgG、艾滋病病毒抗体和抗原、梅毒抗体的检测组合对献、输血安全性检查较为方便。本发明采用免疫金-银显色法，可以设计同时测定HBsAg、HIVAg或HIVAb、HCVAb、TPAb等血液传染病的组合式检测芯片。与传统方法相比，它具有以下优点：
1.快速、简便：耗时短；
2.灵敏度高：其灵敏度可与荧光免疫技术和酶免疫技术相当；
3.多指标性：一次可检测多种病原疾病组合；
4.随机组合：可以根据需求进行一种或几种疾病的检测；
5.成本低廉；
6.样本用量少。
本发明还提供了纳米放大检测的方法在应用蛋白质芯片检测疾病中的应用。
附图说明
图1为一种纳米放大检测蛋白质芯片检测乙肝表面抗原阳性结果示意图
上排：阳性对照点；中排：检测点；下排：阴性对照点图2为一种纳米放大检测蛋白质芯片检测乙肝表面抗原阴性结果示意图
上排：阳性对照点；中排：检测点；下排：阴性对照点图3为一种纳米放大检测蛋白质芯片检测丙肝抗体阳性结果示意图
上排：阳性对照点；中排：检测点；下排：阴性对照点图4为一种纳米放大检测蛋白质芯片检测丙肝抗体阴性结果示意图
上排：阳性对照点；中排：检测点；下排：阴性对照点图5为一种纳米放大检测蛋白质芯片检测梅毒抗体阳性结果示意图
上排：阳性对照点；中排：检测点；下排：阴性对照点图6为一种纳米放大检测蛋白质芯片检测梅毒抗体阴性结果示意图
上排：阳性对照点；中排：检测点；下排：阴性对照点
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。检测乙肝表面抗原蛋白质芯片1各种试剂的配制氯金酸水溶液：氯金酸购自上海试剂一厂。称取0.01g氯金酸，溶解于100ml水中，形成浓度为0.1mg/ml氯金酸水溶液。柠檬酸三钠水溶液：称取1g柠檬酸三钠，溶解于100ml水中，形成浓度为10mg/ml柠檬酸三钠水溶液。磷酸盐缓冲液(PBS)：用800ml蒸馏水溶解8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)和0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，用盐酸(HCl)调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。氯化钠(NaCl)溶液：称取10g氯化钠，溶于100ml蒸馏水中，形成100mg/ml氯化钠溶液。磷酸盐洗液(PBN)：1000ml蒸馏水中溶解102g硝酸钠(NaNO3)，1.56g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，3.58g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，调pH值至7.0。抗_乙肝表面抗原(HBsAg)：两株鼠抗-乙肝表面抗原(HbsAg)单克隆抗体(MA00301、MA00303，均购自昆明云大生物技术公司)，原液浓度分别为6.98mg/ml和2.65mg/ml，MA00301用PBS稀释300-800倍。人免疫球蛋白(IgG)：原液浓度为1.0mg/ml，用PBS稀释1000倍。葡萄球菌A蛋白(SPA)溶液：浓度为1mg/ml，用蒸馏水稀释100000倍。小牛血清白蛋白(BSA)溶液：称取0.5g小牛血清白蛋白，溶解于10ml水中，形成浓度为50mg/ml的水溶液。柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸2.55g、柠檬酸三钠2.35g，加蒸馏水100ml溶解。染色液：柠檬酸缓冲液10ml，对苯二酚1.7g，蒸馏水90ml，混合。显色液：硝酸银(AgNO3)0.05g，加蒸馏水2ml溶解。血清标本2芯片的制备
采用硅烷化处理过的玻片为固相支持物，抗体(MA00301)和葡萄球菌A蛋白(SPA)(阳性对照)固定于玻片之上，同时采用人免疫球蛋白(IgG)作为阴性对照，温度37℃，湿度90％的条件下固定2小时，以一定量PBS缓冲液洗涤除去未结合的抗体和杂质，4℃保存。使用前于室温下放置约20-30分钟。3胶体金-蛋白质结合物的制备(1)胶体金的制备
先将0.1mg/ml氯金酸(HAuCl4)溶液100ml放入微波炉中，在高档沸腾2min，迅速一次加入6.0ml的10mg/ml柠檬酸三钠水溶液，放入微波炉中在中档保持3min，即为约10nm的胶体金。其它直径的胶体金也按上述方法制备，只改变1％柠檬酸三钠的用量即可。放置于4℃保存。(2)胶体金与抗-乙肝表面抗原(HBsAg)用量比的确定
选用鼠抗-乙肝表面抗原(HBsAg)单克隆抗体(MA00303)制备金标抗体。取10管各1ml的胶体金，调节pH值至7.5，分别加入系列稀释的待标记抗体，混匀，室温下静置5分钟后加入100μl 100mg/ml的氯化钠溶液，室温下放置2小时，观察其颜色变化，以未变色管中所加最少待标记抗体量为最佳标记量，实际标记中以此量增加10％-20％为实验用量。(3)胶体金-抗-乙肝表面抗原(HBsAg)结合物的制备
取1ml的胶体金，调节pH值至7.5，加入已确定的最佳待标记抗体量约5μl，混匀，室温下静置5-10分钟后加入50mg/ml的小牛血清白蛋白(BSA)溶液至其终浓度为10mg/ml，放置4℃保存。4杂交液的配置
取10μl胶体金标记的抗体，加入20μl待检样品，用磷酸盐缓冲液稀释至1000μl，37℃下轻轻振荡备用。5杂交
将杂交缓冲液覆盖于玻片之上，37℃杂交5分钟后弃去，以20ml 8×磷酸盐洗液(PBN)洗涤2次后，再以20ml 1×磷酸盐洗液(PBN)洗涤1次，每次约3分钟。6显色
将染色液和显色液以99∶1的比例混合均匀(注意！动作迅速！)，覆盖于玻片之上，显色时间为2-3分钟，观察结果。检测丙肝抗体蛋白质芯片1各种试剂的配制
氯金酸(HAuCl4)水溶液：氯金酸购自上海试剂一厂。称取0.01g氯金酸，溶解于100ml水中，形成浓度为0.1mg/ml氯金酸水溶液。柠檬酸三钠水溶液：称取1g柠檬酸三钠，溶解于100ml水中，形成浓度为10mg/ml柠檬酸三钠水溶液。磷酸盐缓冲液(PBS)：用800ml蒸馏水溶解8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)和0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，用盐酸(HCl)调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。氯化钠(NaCl)溶液：称取10g氯化钠，溶于100ml蒸馏水中，形成100mg/ml氯化钠溶液。磷酸盐洗液(PBN)：1000ml蒸馏水中溶解102g硝酸钠(NaNO3)，1.56g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，3.58g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，调pH值至7.0。丙肝抗原(HCVAg)：原液浓度为0.5mg/ml，用PBS稀释100000倍。葡萄球菌A蛋白(SPA)溶液：浓度为1mg/ml，用蒸馏水稀释100000倍。小牛血清白蛋白(BSA)溶液：称取0.5g小牛血清白蛋白，溶解于10ml水中，形成浓度为50mg/ml的水溶液。柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸2.55g、柠檬酸三钠2.35g，加蒸馏水100ml溶解。染色液：柠檬酸缓冲液10ml，对苯二酚1.7g，蒸馏水90ml，混合。显色液：硝酸银(AgNO3)0.05g，加蒸馏水2ml溶解。血清标本2芯片的制备
采用硅烷化处理过的玻片为固相支持物，丙肝抗原(HCVAg)和葡萄球菌A蛋白SPA(阳性对照)固定于玻片之上，同时采用蒸馏水作为空白对照，温度37℃，湿度90％的条件下固定2小时，以20ml磷酸盐缓冲液洗涤除去未结合的抗体和杂质，4℃保存。使用前于室温下放置约20-30分钟。3胶体金-蛋白质结合物的制备(1)胶体金的制备
先将0.1mg/ml氯金酸(HAuCl4)溶液100ml放入微波炉中，在高档沸腾2min，迅速一次加入6.0ml的10mg/ml柠檬酸三钠水溶液，放入微波炉中在中档保持3min，即为约10nm的胶体金。其它直径的胶体金也按上述方法制备，只改变1％柠檬酸三钠的用量即可。放置于4℃保存。(2)胶体金与SPA用量比的确定
选用葡萄球菌A蛋白(SPA)制备金标探针。取10管各1ml的胶体金，调节pH值至7.5，分别加入系列稀释的待标记抗SPA，混匀，室温下静置5分钟后加入100μl 10％的氯化钠溶液，室温下放置2小时，观察其颜色变化，以未变色管中所加最少待标记抗体量为最佳标记量，实际标记中以此量增加10％-20％为实验用量。(3)胶体金-葡萄球菌A蛋白(SPA)结合物的制备
取1ml的胶体金，调节pH值至6.0，加入已确定的最佳待标记葡萄球菌A蛋白(SPA)量(原液)约10μl，混匀，室温下静置5-10分钟后加入5％的小牛血清白蛋白(BSA)溶液至其终浓度为1％，放置4℃保存。4杂交液的配置
取10μl胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，加入20μl待检样品，用PBS缓冲液稀释至1000μl，37℃下轻轻振荡备用。5杂交
将杂交缓冲液覆盖于玻片之上，37℃杂交5分钟后弃去，以20ml 8×磷酸盐洗液(PBN)洗涤2次后，再以20ml 1×磷酸盐洗液(PBN)洗涤1次，每次约3分钟。6显色
将染色液和显色液以99∶2的比例混合均匀(注意！动作迅速！)，覆盖于玻片之上，显色时间为2-3分钟，观察结果。检测梅毒抗体蛋白质芯片1各种试剂的配制氯金酸(HAuCl4)水溶液：氯金酸购自上海试剂一厂。称取0.01g氯金酸，溶解于100ml水中，形成浓度为0.1mg/ml氯金酸水溶液。柠檬酸三钠水溶液：称取1g柠檬酸三钠，溶解于100ml水中，形成浓度为10mg/ml柠檬酸三钠水溶液。磷酸盐缓冲液(PBS)：用800ml蒸馏水溶解8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)和0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，用盐酸(HCl)调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。氯化钠(NaCl)溶液：称取10g氯化钠，溶于100ml蒸馏水中，形成100mg/ml氯化钠溶液。磷酸盐洗液(PBN)：1000ml蒸馏水中溶解102g硝酸钠(NaNO3，1.56g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，3.58g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，调pH值至7.0。梅毒47抗原(TP47Ag)：原液浓度为0.6mg/ml，用PBS稀释100000倍。葡萄球菌A蛋白(SPA)溶液：浓度为1mg/ml，用蒸馏水稀释100000倍。小牛血清白蛋白(BSA)溶液：称取0.5g小牛血清白蛋白，溶解于10ml水中，形成浓度为50mg/ml的水溶液。柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸2.55g、柠檬酸三钠2.35g，加蒸馏水100ml溶解。染色液：柠檬酸缓冲液10ml，对苯二酚1.7g，蒸馏水90ml，混合。显色液：硝酸银(AgNO3)0.05g，加蒸馏水2ml溶解。血清标本2芯片的制备
采用硅烷化处理过的玻片为固相支持物，梅毒47抗原(TP47Ag)和葡萄球菌A蛋白(SPA)(阳性对照)固定于玻片之上，同时采用蒸馏水作为空白对照，温度37℃，湿度90％的条件下固定2小时，以一定量PBS缓冲液洗涤除去未结合的抗体和杂质，4℃保存。使用前于室温下放置约20-30分钟。3胶体金-蛋白质结合物的制备(1)胶体金的制备
先将0.1mg/ml氯金酸(HAuCl4)溶液100ml放入微波炉中，在高档沸腾2min，迅速一次加入6.0ml的10mg/ml柠檬酸三钠水溶液，放入微波炉中在中档保持3min，即为约10nm的胶体金。其它直径的胶体金也按上述方法制备，只改变1％柠檬酸三钠的用量即可。放置于4℃保存。(2)胶体金与葡萄球菌A蛋白(SPA)用量比的确定
选用葡萄球菌A蛋白(SPA)制备金标探针。取10管各1ml的胶体金，调节pH值至7.5，分别加入系列稀释的待标记抗SPA，混匀，室温下静置5分钟后加入100μl 10％的氯化钠溶液，室温下放置2小时，观察其颜色变化，以未变色管中所加最少待标记抗体量为最佳标记量，实际标记中以此量增加10％-20％为实验用量。(3)胶体金-葡萄球菌A蛋白(SPA)结合物的制备
取1ml的胶体金，调节pH值至6.0，加入已确定的最佳待标记葡萄球菌A蛋白(SPA)量(原液)约10μl，混匀，室温下静置5-10分钟后加入5％的小牛血清白蛋白(BSA)溶液至其终浓度为1％，放置4℃保存。4杂交液的配置
取10μl胶体金标记SPA，加入20μl待检样品，用PBS缓冲液稀释至1000μl，37℃下轻轻振荡备用。5杂交
将杂交缓冲液覆盖于玻片之上，37℃杂交5分钟后弃去，以20ml 8×磷酸盐洗液(PBN)洗涤2次后，再以20ml 1×磷酸盐洗液(PBN)洗涤1次，每次约3分钟。6显色
将染色液和显色液以99∶2的比例混合均匀(注意！动作迅速！)，覆盖于玻片之上，显色时间为2-3分钟，观察结果。
Claims (1)
1、一种纳米放大检测的方法，它包括下列步骤：
A、检测体内疾病的特异性蛋白质芯片的制备：采用硅烷化处理过的玻片为固相支持物，将阳性对照、用于检测的蛋白质和阴性对照分别点于玻片之上，温度32℃-40℃，湿度70％-90％的条件下固定1-2小时，以10-30ml磷酸缓冲盐溶液洗涤除去未结合的蛋白和杂质，4℃保存，使用前于室温下放置20-30分钟；
B、蛋白质芯片的制备：首先制备胶体金，先将0.1-0.2mg/ml氯金酸溶液100ml-200ml放入微波炉中，在沸腾2-3min，一次加入6.0-12.0ml 10-20mg/m1柠檬酸三钠水溶液，放入微波炉中保持2-3min，为10-20nm的胶体金，放置于4℃保存，制备胶体金后，确定胶体金与待标记蛋白的用量比，取10-20管各0.5ml-1ml的胶体金，调至pH值为6-10，分别加入5-40mg待标记蛋白，混匀，室温下静置5-10分钟后加入总体积1/10-1/20量的的氯化钠溶液，室温下放置1-2小时，观察其颜色变化，记下未变色管中所加最少待标记抗体量，实际标记中以此量增加10％-20％为实验用量，取10-20μl胶体金标记蛋白质溶液，加入20-40μl待检样品，用磷酸盐缓冲液稀释至500-1000μl，32-40℃下振荡备用，将以上配置的杂交缓冲液覆盖于玻片之上，32-40℃杂交5-15分钟后弃去，以10-30ml 8×磷酸盐洗液洗涤2-5次后，再以10-30ml 1×磷酸盐洗液洗涤1-3次，每次1-3分钟；
C、将染色液和硝酸银水溶液以49-99∶1的比例混合均匀，覆盖于玻片之上，显色时间为2-5分钟，观察结果。
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|---|---|---|---|
| CN 03128319 CN1214245C (zh) | 2003-07-15 | 2003-07-15 | 一种纳米放大检测的方法 |
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