CN115768559A - 用于提高灵敏度的诱导聚集测定 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于快速和准确地测量分析物颗粒结合诱导的报告颗粒聚集的系统、设备和方法。在存在感兴趣的分析物颗粒的情况下，报告颗粒形成聚集体，其平均颗粒大小随着分析物浓度的增加而增加。根据对从样品帧中确定的平均颗粒大小的分析，可以确定分析物的存在和/或浓度。

Description

用于提高灵敏度的诱导聚集测定
本申请要求2020年4月9日提交的美国临时申请号63/007,701的优先权权益，其披露内容特此通过引用并入，就像完整地写在本文中一样。
定点照护诊断和可在实地执行的其他测定是一项迫切的需要。如果可以消除将测定(如诊断测试、特别是血液测试)送到专用实验室以进行分析所带来的延迟和费用，则可以更高效且有效地做出响应。临床实验室通过在精密台式仪器上执行生化测定来提供诊断测试。用于使这些仪器小型化或在移动电子设备上复现其功能的工作是充满困难的。在许多情况下，结果是无法使用的。
例如，需要的是为医生及其患者提供迅速且准确的结果的廉价但准确的定点照护测定，如诊断测试。
发明内容
本文提供了用于通过测定结合事件来快速和准确地测量分析物颗粒的系统、设备和方法。传感器设备包含一种或多种报告颗粒，这些颗粒包括大分子或纳米级成分，如纳米颗粒。报告颗粒(或可替代地“报告基因”)产生足够大的光学信号，因此可以对单个报告颗粒进行成像，并作为可单独检测的对象出现在样品帧中。在存在感兴趣的分析物(例如分子、病毒颗粒或细菌)的情况下，报告颗粒形成包含多个报告颗粒的聚集体，因此在样品帧中显示为较大的对象。随着分析物浓度的增加，聚集程度和聚集体的大小都会增加。根据图像中可辨别的特征，比如从样品图像帧确定的平均对象大小、周长、形状、颜色等，可以确定分析物的存在和/或浓度。这种检测策略的关键是应用图像处理和滤波过程，这旨在去除图像中的错误和噪声，并选择可行的对象进行分析，然后对结果求和以确定分析物的浓度。
本文提供了一种用于确定样品中分析物颗粒的存在或浓度的方法，该方法包括以下步骤：
将该样品与一定数量的一种或多种类型的报告颗粒组合在检测器体积中；
记录该检测器体积的一个或多个帧；
在该一个或多个帧中，识别与报告颗粒的聚集体相对应、以及可选地与单个未聚集的报告颗粒相对应的对象的图像；
确定一个或多个对象特性；以及
根据该对象特性，确定该分析物的存在和/或浓度；
其中：
该分析物的存在诱导聚集体的形成，每个聚集体包含至少两个报告颗粒和至少一个分析物颗粒。
附图说明
图1示出了具有2个结合位点的报告颗粒的设计原理。
图2示出了具有4个结合位点的报告颗粒的设计原理。
图3示出了使用与C2抗体和C6抗体缀合的金纳米颗粒的抗原检测。
图4示出了柠檬酸盐封端的金纳米颗粒与抗体缀合的过程。
图5示出了与(a)C2抗体和(b)C6抗体缀合的金纳米颗粒的吸收光谱。(i)裸GNP(金纳米颗粒)；(ii)GNP-抗体缀合物；(iii)GNP-抗体缀合物+CRP(C反应蛋白)。
图6示出了GNP的暗场帧。(a)对照，不存在CRP；(b)添加CRP，示出聚集体形成。
图7示出了单个簇的放大视图。
图8示出了帧处理的实例。(a)原始帧；(b)去除了伪影后；(c)对象分割后；(d)簇大小的量化。
图9示出了帧清除过程的实例。(a)原始帧；(b)背景；(c)清除后的灰度。
图10示出了边界形成过程的实例。(a)清除后的灰度帧；(b)边界帧；(c)B/W帧。
图11示出了特征识别过程的实例。(a)清除后的灰度帧；(b)去噪前的B/W帧；(c)去噪后的B/W帧。
图12示出了CRP的滴定。(a)带DF检测的聚集测定，横轴＝CRP浓度(mg/L)，纵轴＝平均聚集体大小(μm2/簇)；(b)传统的等离激元感测，横轴＝CRP浓度(mg/L)，纵轴＝散射强度(A.U.)。
图13示出了在全血中执行的测定。(a)(i)0.1mm以及(ii)0.05mm深度的毛细血管。还示出了(b)0.1mm、(c)0.05mm以及(d)0.01mm厚的毛细血管中的血液的暗场图像。
图14示出了全血中纳米颗粒的暗场成像，成像深度为(a)0.11mm、(b)0.05mm以及(c)0.01mm。还示出了强度(亮度)分布曲线，水平刻度＝距颗粒中心的像素距离，垂直刻度＝16位强度，成像深度为(a)0.11mm、(b)0.05mm以及(c)0.01mm。
图15示出了在全血中执行的CRP测定。横轴＝CRP浓度(mg/dL)；纵轴＝平均簇大小(像素)。
图16示出了检测如(iii)示意性展示的SARS-CoV-2抗体的设计原理。(i)和(v)分别对应于从Au纳米颗粒到(ii)抗人抗体以及(iv)SARS-CoV-2刺突RBD的PEG接头。
图17示出了在全血中执行的SARS-CoV-2测定。(a)聚集体显微镜检查；(b)校准曲线：横轴＝SARS-CoV-2抗体(mg/dL)，纵轴＝聚集大小(像素)。
图18示出了直接病毒检测测定的成分。(a)冠状病毒的细节，突出显示了(i)刺突蛋白的多样性。三部分纳米抗体(ii)与刺突蛋白(i)之间相互作用的(b)俯视图和(c)侧视图。
图19示出了SARS-CoV-2病毒的检测。(a)设计原理：(i)SARS-CoV-2刺突纳米抗体，(ii)PEG接头，(iii)Au纳米颗粒。(b)和(c)不同病毒浓度水平下聚集体的显微镜检查。其他地方针对较小生物分子描述的聚集机制对完整病毒来说显然是有效的。
图20示出了图像处理的流程图。
具体实施方式
本披露内容涉及以改进的速度、准确度、精度和可负担性进行生化测定的方法。该方法利用了聚集过程，由此多个报告颗粒与感兴趣的分析物颗粒的结合诱导聚集成大分子集合体，从而有助于通过现成的光学设备进行直接成像。
在移动电子设备上进行生化测定的需求很大，这有可能提高诊断测试的速度、准确度、灵敏度和可负担性。存在用于捕获三维对象的二维(X/Y)图像的大量技术。技术已经从基于胶片的相机发展到摄像机、图像板、电荷耦合器件和互补金属氧化物(“CMOS”)芯片。这些图像是三维对象在二维平面上的投影。通常，二维帧被细分为称为像素的图片单元以进行处理和下游操纵，这些图片单元可以通过双坐标寻址系统方便地引用。举例来说，正方形帧可以细分为512×512的瓦片阵列，每个瓦片都可以通过一对有序的整数(x,y)来寻址，其中x和y的范围都可以是从1到512，包括端值。
观察溶液中的常见“小分子”有机化合物和较小生物分子通常是不可行的，原因有二：(a)检测器的空间分辨率比这些小分子的大小粗糙得多，使得每个像素捕获来自大量溶质分子的信号，并且(b)这种大小的单个分子的信号通常太弱，无法检测到高于噪声的信号。尽管已经开展了对单个分子进行成像的工作，但迄今为止的过程通常缓慢、乏味和/或昂贵。相比之下，有技术可用于对纳米级或更大大小的溶质进行成像，不仅因为其颗粒大小较大，而且通常可从这些较大颗粒获得增强的信号。
本发明通过利用包含大分子或纳米级成分的报告颗粒(如纳米颗粒)解决了分析物颗粒信噪比差的问题。报告颗粒(或替代地，“报告基因”)足够大，使得可以对单个报告颗粒进行成像，并且在一些实施例中，作为具有有限大小的颗粒出现在样品帧中。在存在感兴趣的分析物颗粒的情况下，报告颗粒形成包含多个报告基因的聚集体，因此在样品帧中显示为较大的颗粒。随着分析物浓度的增加，聚集程度和聚集体的大小都会增加。根据从样品帧中确定的平均颗粒大小，可以确定分析物的存在和/或浓度。
本文提供了实施例1：一种用于确定样品中分析物颗粒的存在或浓度的方法，该方法包括以下步骤：
将该样品与一定数量的一种或多种类型的报告颗粒组合在检测器体积中；
记录该检测器体积的一个或多个帧；
在该一个或多个帧中，识别与报告颗粒的聚集体相对应、以及可选地与单个未聚集的报告颗粒相对应的对象的图像；
确定一个或多个对象特性；以及
根据该对象特性，确定该分析物的存在和/或浓度；
其中：
该分析物的存在诱导聚集体的形成，每个聚集体包含至少两个报告颗粒和至少一个分析物颗粒。
还提供了以下实施例：
实施例2：如实施例1所述的方法，其中这些颗粒图像对应于报告颗粒的聚集体和单个未聚集的报告颗粒。
实施例3：如实施例1所述的方法，其中这些颗粒图像对应于报告颗粒的聚集体。
实施例4：如实施例1-3中任一项所述的方法，其中该一个或多个帧中的每一个都由像素阵列组成。
实施例5：如实施例1-4中任一项所述的方法，其中聚集体的形成是由该一种或多种类型的报告颗粒中的至少一种上的结合位点与该分析物颗粒上的结合位点之间的结合引起的。
实施例6：如实施例1所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒中的每一种包括纳米颗粒或量子点。
实施例7：如实施例6所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒中的每一种包括纳米颗粒。
实施例8：如实施例7所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒中的每一种包括金纳米颗粒(“GNP”)。
实施例9：如实施例1-8中任一项所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒中的每一种包含两个或更多个结合位点。
实施例10：如实施例9所述的方法，其中，该一种或多种类型的报告颗粒中的每一种包含两种或更多种相同类型的结合位点。
实施例11：如实施例9所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒中的至少一种包含两个或更多个不同的结合位点。
实施例12：如实施例10和11中任一项所述的方法，其中至少一种类型的结合位点位于报告颗粒中所包含的抗体或纳米抗体上。
实施例13：如实施例12所述的方法，其中至少一种类型的结合位点位于报告颗粒中所包含的抗体上。
实施例14：如实施例12和13中任一项所述的方法，其中至少一种类型的结合位点位于报告颗粒中所包含的纳米抗体上。
实施例15：如实施例9所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒是单一类型的报告颗粒。
实施例16：如实施例15所述的方法，其中该单一类型的报告颗粒包含单一类型的结合位点。
实施例17：如实施例16所述的方法，其中该单一类型的结合位点位于该单一类型的报告颗粒中所包含的抗体或纳米抗体上。
实施例18：如实施例17所述的方法，其中该单一类型的结合位点位于该单一类型的报告颗粒中所包含的抗体上。
实施例19：如实施例17所述的方法，其中该单一类型的结合位点位于该单一类型的报告颗粒中所包含的纳米抗体上。
实施例20：如实施例15-19中任一项所述的方法，其中该单一类型的报告颗粒可以同时与两个或更多个分析物颗粒结合。
实施例21：如实施例15-20中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒可以同时与两个或更多个报告颗粒结合。
实施例22：如实施例9所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒是两种类型的报告颗粒。
实施例23：如实施例22所述的方法，其中，该一种或多种类型的报告颗粒中的每一种包含一种或多种相同类型的结合位点。
实施例24：如实施例23所述的方法，其中该两种类型的报告颗粒中的每一种包含与另一种类型的报告颗粒不同类型的结合位点。
实施例25：如实施例24所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的每一种都位于该两种类型的报告颗粒中的每一种所包含的抗体或纳米抗体上。
实施例26：如实施例25所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的至少一种位于该两种类型的报告颗粒中的一种所包含的抗体上。
实施例27：如实施例26所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点位于该两种类型的报告颗粒所包含的抗体上。
实施例28：如实施例25和26中任一项所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的至少一种位于该两种类型的报告颗粒中的一种所包含的纳米抗体上。
实施例29：如实施例25所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点位于该两种类型的报告颗粒所包含的纳米抗体上。
实施例30：如实施例22-29中任一项所述的方法，其中该两种类型的报告颗粒中的每一种可以同时与两个或更多个分析物颗粒结合。
实施例31：如实施例22-30中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒可以同时与该两种类型的报告颗粒中的每一种的一个或多个结合。
实施例32：如实施例13、18和26中任一项所述的方法，其中至少一个结合位点位于报告颗粒中所包含的人类抗体上。
实施例33：如实施例13、18和26中任一项所述的方法，其中至少一个结合位点位于报告颗粒中所包含的抗人抗体上。
实施例34：如实施例13、18和26中任一项所述的方法，其中至少一个结合位点位于报告颗粒中所包含的抗C反应蛋白上。
实施例35：如实施例34所述的方法，其中至少一个结合位点位于报告颗粒中所包含的C2抗C反应蛋白上。
实施例36：如实施例34所述的方法，其中至少一个结合位点位于报告颗粒中所包含的C6抗C反应蛋白上。
实施例37：如实施例9-36中任一项所述的方法，其中至少一个结合位点位于报告颗粒中所包含的生物分子上。
实施例38：如实施例37所述的方法，其中该生物分子来自病毒的蛋白病毒包膜。
实施例39：如实施例38所述的方法，其中该生物分子选自膜蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白。
实施例40：如实施例39所述的方法，其中该生物分子是来自病毒的蛋白病毒包膜的刺突蛋白。
实施例41：如实施例38-40中任一项所述的方法，其中该病毒是冠状病毒。
实施例42：如实施例41所述的方法，其中该病毒是SARS-CoV-2。
实施例43：如实施例1-42中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒是抗体。
实施例44：如实施例43所述的方法，其中该分析物是针对病毒的病毒包膜中生物分子的抗体。
实施例45：如实施例44所述的方法，其中该分析物是针对病毒的病毒包膜中生物分子的抗体，该生物分子选自膜蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白。
实施例46：如实施例45所述的方法，其中分析物是针对刺突蛋白的抗体。
实施例47：如实施例46所述的方法，其中分析物是针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体。
实施例48：如实施例1-36中任一项所述的方法，其中该分析物是血液学蛋白。
实施例49：如实施例48所述的方法，其中该血液学蛋白是C反应蛋白(“CRP”)。
实施例50：如实施例1-42中任一项所述的方法，其中该分析物选自病毒、古菌和细菌。
实施例51：如实施例50所述的方法，其中该分析物是病毒。
实施例52：如实施例51所述的方法，其中该分析物是冠状病毒。
实施例53：如实施例52所述的方法，其中该分析物是SARS-CoV-2。在某些实施例中，这些结合位点与刺突蛋白结合。
实施例54：如实施例1-42中任一项所述的方法，其中该分析物是细菌。
实施例55：如实施例54所述的方法，其中结合位点与该细菌上的表面糖蛋白结合。
实施例56：如实施例1-55中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒包含两个或更多个结合位点。
实施例57：如实施例56所述的方法，其中该分析物颗粒包含两个或更多个相同的结合位点。
实施例58：如实施例56所述的方法，其中该分析物颗粒包含两个或更多个不同的结合位点。
实施例59：如实施例1-58中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性允许从与分析物相对应的信号中分离噪声、伪影、不可用图像特征和/或背景。
实施例60：如实施例59所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性允许从与分析物相对应的信号中分离噪声。
实施例61：如实施例59和60中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性允许从与分析物相对应的信号中分离伪影。
实施例62：如实施例59-61中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性允许从与分析物相对应的信号中分离不可用图像特征。
实施例63：如实施例59-62中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性允许从与分析物相对应的信号中分离背景。
实施例64：如实施例1-63中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性能够去除非分析物颗粒的一个或多个图像、一个或多个不可用图像、和/或一个或多个背景特征。
实施例65：如实施例64所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性能够去除非分析物颗粒的一个或多个图像。
实施例66：如实施例64和65中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性能够去除一个或多个不可用图像。
实施例67：如实施例64-66中任一项所述的方法，其中，通过在用于处理和滤波对象图像的算法中设置预定限制，该对象特性能够去除一个或多个背景特征。
实施例68：如实施例1-67中任一项所述的方法，其中该对象特性随聚集体大小而单调增加。
实施例69：如实施例68所述的方法，其中该对象特性与聚集体大小成比例地增加。
实施例70：如实施例68和69中任一项所述的方法，其中该对象特性与该聚集体的中值大小有关。
实施例71：如实施例68和69中任一项所述的方法，其中该对象特性与该聚集体的平均大小有关。
实施例72：如实施例68和69中任一项所述的方法，其中该对象特性与该聚集体的RMS大小有关。
实施例73：如实施例1-72中任一项所述的方法，其中该平均聚集体大小可以通过校准曲线根据该对象特性来确定。
实施例74：如实施例73所述的方法，其中该方法进一步包括获得校准曲线的步骤。
实施例75：如实施例1-74中任一项所述的方法，其中，该对象特性选自如直接观察或估计的该聚集体大小、如直接观察或估计的该聚集体的周长、如直接观察或估计的该聚集体的面积、该聚集体的形状、该聚集体的颜色、该聚集体的亮度、该聚集体的反射率、该聚集体的荧光性、以及该聚集体的磷光性。
实施例76：如实施例75所述的方法，其中，该对象特性选自如直接观察或估计的该聚集体的大小、如直接观察或估计的该聚集体的周长、以及如直接观察或估计的该聚集体的面积。
实施例77：如实施例75所述的方法，其中，该对象特性选自该聚集体的亮度、该聚集体的荧光性以及该聚集体的磷光性。
实施例78：如实施例77所述的方法，其中，该对象特性是该聚集体的亮度。
实施例79：如实施例1-78中任一项所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒提供光学信号。
实施例80：如实施例79所述的方法，其中该光学信号选自UV/Vis吸光度、荧光发射和磷光发射。
实施例81：如实施例79所述的方法，其中该光学信号在报告颗粒与分析物颗粒结合后基本上没有变化。
实施例82：如实施例79所述的方法，其中该光学信号是由表面等离激元共振(“SPR”)引起的。
实施例83：如实施例82所述的方法，其中该表面等离激元共振是局域表面等离激元共振。
实施例84：如实施例1-83中任一项所述的方法，进一步包括去除背景特征的步骤。
实施例85：如实施例84所述的方法，进一步包括去除大于给定大小最大值的背景特征的步骤。
实施例86：如实施例84和85所述的方法，进一步包括去除小于给定大小最小值的背景特征的步骤。
实施例87：如实施例1-86中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
腐蚀图像；
重建图像；以及
膨胀图像。
实施例88：如实施例1至87中任一项所述的方法，进一步包括在该检测器体积的一个或多个帧中形成边界的一个或多个步骤。
实施例89：如实施例1-88中任一项所述的方法的方法，其中该样品是生物流体。
实施例90：如实施例89所述的方法，其中该样品是经过稀释、浓缩和/或预处理的生物流体。
实施例91：如实施例89和90中任一项所述的方法，其中在某些实施例中，该样品衍生自血液。
实施例92：如实施例91所述的方法，其中该样品包含完整的血细胞。
实施例93：如实施例92所述的方法，其中该样品包含完整的红细胞。
实施例94：如实施例1-93中任一项所述的方法，其中该样品通过显微镜进行分析。
实施例95：如实施例94所述的方法，其中该样品通过能够进行暗场成像的显微镜进行分析。
实施例96：如实施例94和95中任一项所述的方法，其中该显微镜能够进行明场成像。
实施例97：如实施例94-96中任一项所述的方法，其中该显微镜能够自动对焦。
实施例98：如实施例94-97中任一项所述的方法，其中该显微镜包括荧光照明器。
实施例99：如实施例94-98中任一项所述的方法，其中该荧光照明器包括复眼透镜。
实施例100：如实施例1-99中任一项所述的方法，其中光学路径长度不超过0.1mm厚。
实施例101：如实施例100所述的方法，其中光学路径长度不超过0.05mm厚。
实施例102：如实施例101所述的方法，其中光学路径长度不超过0.02mm厚。
实施例103：如实施例102所述的方法，其中光学路径长度不超过0.01mm厚。
实施例104：如实施例1-103中任一项所述的方法，其中该样品用微流体装置进行处理。
还提供了实施例105：一种用于执行如实施例1-104中任一项所述的方法的装置或系统，包括：
·图像传感器；
·能够显示图像的屏幕；
·微处理器；
·存储器；
·图像分析软件，该图像分析软件存储在该存储器中并且可由能够分析由该图像传感器捕获的数据并对数据进行数字分类的处理器执行；以及
·可选地，通信接口。
还提供了以下实施例：
实施例106：如实施例105所述的装置，进一步包括通信接口。
实施例107：如实施例106所述的装置，其中该通信能力是无线的。
实施例108：如实施例106和107中任一项所述的装置，其中该装置或系统可以与智能电话或平板计算机进行通信。
实施例109：如实施例106和107中任一项所述的装置，其中该装置或系统可以与计算机、智能电话或平板计算机进行通信。
实施例110：如实施例105-109中任一项所述的装置，其中该图像传感器能够作为暗场显微镜的一部分操作。
实施例111：如实施例105-110中任一项所述的装置，其中该图像传感器能够作为明场显微镜的一部分操作。
实施例112：如实施例105-111中任一项所述的装置，其中该图像传感器包括相机。
实施例113：如实施例112所述的装置，其中该相机是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机。
实施例114：如实施例105-113中任一项所述的装置，进一步包括光源或其他电磁辐射源。
实施例115：如实施例114所述的装置，其中该光源或其他电磁辐射源包括发光二极管(LED)。
实施例116：如实施例114和115中任一项所述的装置，其中该光源或其他电磁辐射包括鱼眼透镜。
实施例117：如实施例105-116中任一项所述的装置，进一步包括可选地可移除的样品室。
实施例118：如实施例105-116中任一项所述的装置，进一步包括由玻璃或聚合物制成的报告表面，该报告表面的一侧已附连包含用捕获元件官能化的等离激元纳米颗粒的报告颗粒。
实施例119：如实施例118所述的装置，进一步包括适合于暗场显微镜检查的波导，该波导与该报告表面的相反侧接触。
实施例120：如实施例118和119中任一项所述的装置，其中该报告颗粒是光学报告颗粒。
实施例121：如实施例120所述的装置，其中每个附连的光学报告颗粒是空间上可分辨的。
实施例122：如实施例121所述的装置，其中这些附连的光学报告颗粒随机地排列。
实施例123：如实施例121所述的装置，其中这些附连的光学报告颗粒以网格或近似网格排列。
实施例124：如实施例121-123中任一项所述的装置，其中每个附连的光学报告颗粒可在记录设备的一个像素上分辨。
实施例125：如实施例118-124中任一项所述的装置，其中该捕获元件选自：
与该分析物结合的一种或多种纳米抗体；
与该分析物结合的一种或多种核苷酸序列；以及
与该分析物结合的抗体或其片段。
实施例126：如实施例105-125中任一项所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行本文所述的用于确定样品中分析物的存在或浓度的方法。
实施例127：如实施例126所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行本文所述的用于确定样品中分析物的存在的方法。
实施例128：如实施例126所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行本文所述的用于确定样品中分析物的浓度的方法。
实施例129：如实施例126-128中任一项所述的装置，其中该分析物是抗体。
实施例130：如实施例129所述的装置，其中该分析物是针对病毒的抗体。
实施例131：如实施例130所述的装置，其中该分析物是针对冠状病毒的抗体。
实施例132：如实施例131所述的装置，其中该分析物是针对SARS-CoV-2的抗体。
实施例133：如实施例126-128中任一项所述的装置，其中该分析物是抗原。
实施例134：如实施例126-128中任一项所述的装置，其中该分析物选自病毒、古菌和细菌。
实施例135：如实施例134所述的装置，其中该分析物是病毒。
实施例136：如实施例136所述的装置，其中该分析物是冠状病毒。
实施例137：如实施例135所述的装置，其中该分析物是SARS-CoV-2。
实施例138：如实施例126-128中任一项所述的装置，其中该分析物是核苷酸序列。
实施例139：如实施例105-138中任一项所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行以下一项或多项：
腐蚀图像；
重建图像；以及
膨胀图像。
实施例140：如实施例139所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行以下两项或更多项：
腐蚀图像；
重建图像；以及
膨胀图像。
实施例141：如实施例140所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行以下全部：
腐蚀图像；
重建图像；以及
膨胀图像。
实施例142：如实施例105-141中任一项所述的装置，其中该装置或系统可以用于执行在图像中形成边界的一个或多个步骤。
实施例143：如实施例105-142中任一项所述的装置，其中该装置或系统全部包括在单个设备中。
实施例144：如实施例143所述的装置，其中，该装置或系统全部包括在单个便携式设备中。
实施例145：如实施例143和144中任一项所述的装置，其中该装置或系统进一步包括用于将该智能电话、样品室和光源定位成彼此紧密且稳定地接近的壳体。
本文披露的实施例可以进一步相互组合，只要该组合不是相互排斥的。
术语和定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所用，以下术语具有所指示的含义。
当披露值范围以及使用符号“从n1……至n2”或“在n1……与n2之间”(其中n1和n2是数字)时，除非另外说明，否则此符号旨在包括这些数字本身以及它们之间的范围。此范围可以是整的或在这些端值之间连续的并且包括这些端值。举例来说，范围“2至6个碳”旨在包括两个、三个、四个、五个以及六个碳，因为碳以整数单位出现。举例来说，范围“1至3μM(微摩尔)”(其旨在包括1μM、3μM和介于两者之间的所有数)与有效数字的任何数字(例如，1.255μM、2.1μM、2.9999μM等)类似。
如本文所用，术语“约”旨在限定它所修饰的数值，表示此值在误差界限内可变。当未叙述具体误差界限(如图表或数据表中给出的平均值的标准差)时，术语“约”应理解为意指涵盖所叙述值的范围及还有通过四舍五入到该数字而被包括的范围，考虑到了有效数字。
如本文单独或组合使用的，术语“准确度”用于指报告值或估计值与真实值的接近度。不准确的测量值、观测值或估计值偏离真实值。准确的测量值、观测值或估计值不偏离真实值。
如本文单独或组合使用的，术语“聚集体”用于描述包含至少一种报告颗粒和至少一种分析物颗粒的集合体。在一些实施例中，术语“聚集体”保留用于包含总计五个或更多个颗粒(报告颗粒和分析物颗粒)的集合体。在一些实施例中，术语“聚集体”保留用于包含总计10个或更多个颗粒的集合体。在一些实施例中，术语“聚集体”保留用于包含总计20个或更多个颗粒的集合体。在一些实施例中，术语“聚集体”保留用于包含总计50个或更多个颗粒的集合体。
如本文单独或组合使用的，术语“分析物分子”用于描述这样的分子或颗粒，其在样品中的存在或不存在、或量最初是未知的，并且了解其在样品中的存在或不存在、或包含的量将是有用的。分析物分子的实例包括生物分子，如：肽、蛋白质、细胞因子、和朊病毒；抗体及其片段；核酸(DNA/RNA)和含有它们的颗粒，如组蛋白；小的有机分子和生物无机分子，如碳水化合物、脂类、激素、以及代谢的中间体和产物；大分子，如大环化合物、生物聚合物(例如低聚糖、多酚、和塑料)；以及病毒、病毒颗粒、病毒产物(例如病毒因子)。
如本文单独或组合使用的，术语“分析物颗粒”用于包括如上所述的“分析物分子”或更大的颗粒，其在样品中的存在或不存在、或量最初是未知的，并且了解其在样品中的存在或不存在、或包含的量将是有用的。分析物颗粒的实例包括病毒；原核生物，包括细菌和古菌；原生生物，包括变形虫、鞭毛虫、纤毛虫、硅藻、甲藻、贾第虫、疟原虫和卵菌。
分析物颗粒也可以被分类为生物标记物，即与生物体的生物状态(例如，如疾病或非疾病状态的病状)相关的组合物和/或分子、或组合物和/或分子的复合物，并且可以报告疾病、损伤或细胞或器官损害的存在。当此类标记物与抗体或其片段结合时，它们可被称为抗原。通过本文披露的聚集测定检测的针对分析物颗粒的有意义(例如，正常和异常)水平的值对于相关领域中的技术人员来说是已知的。
术语“分析物”可以指由分析物颗粒组成的某种物质，例如可待因、白三烯或PSA。术语“分析物”还可以指分析物颗粒的量或浓度。术语“分析物”也可以指多个分析物颗粒。在某些用法中，如从上下文中显而易见的，术语“分析物”可以指单个分析物颗粒。
如本文单独或组合使用的，术语“区域检测器”是指可以记录来自源的图像(即不仅记录输入光学信号的强度，而且记录光学信号的来源)的记录设备。区域检测器的常见实例是电视摄像机、数字SLR相机和手机相机。
如本文单独或组合使用的，术语“结合”是指报告颗粒与分析物颗粒之间的非共价相互作用。在一些实施例中，结合是由于氢键结合。在一些实施例中，结合是由于范德华相互作用。在一些实施例中，结合是由于静电和/或偶极相互作用。在一些实施例中，结合是由于上述一种或多种相互作用的组合。在一些实施例中，结合对应于1mM或更小的解离常数。在一些实施例中，结合对应于1μM或更小的解离常数。在一些实施例中，结合对应于1nM或更小的解离常数。
如本文单独或组合使用的，术语“结合等温线”是指报告颗粒/分析物颗粒系统的结合行为。对于报告颗粒和分析物都具有单一结合位点(因此不可能形成聚集体)的系统，术语“结合等温线”仅指已结合的报告颗粒/总报告颗粒的比率。应当理解，该比率将随着分析物颗粒浓度的增加而增加，并最终接近1，因为几乎所有报告颗粒都与分析物颗粒结合。当报告颗粒或分析物中任一者具有单一结合位点时，也将获得该行为，因为不可能发生聚集(这需要报告颗粒和分析物颗粒两者的多重结合)。当报告颗粒和分析物颗粒都具有多个结合位点时，结合等温线中还包括数量和颗粒大小。
如本文单独或组合使用的，术语“结合位点”是指报告颗粒或分析物颗粒的任一个中的特征，该特征可以与结合配偶体形成非共价键，从而将颗粒和结合配偶体保持接近。在一些实施例中，报告颗粒上的结合位点将专门与分析物颗粒上的结合位点结合。在一些实施例中，分析物颗粒上的结合位点将专门与报告颗粒上的结合位点结合。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含单个结合位点。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含两个结合位点。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含两个或更多个结合位点。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含两个相同的结合位点。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含两个不同的结合位点。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含两个或更多个相同的结合位点。某些报告颗粒和某些分析物颗粒包含两个或更多个不同的结合位点。在一些实施例中，报告颗粒或分析物中的任一个包含多个结合位点。在一些实施例中，多个结合位点中的每一个的结合行为与其余结合位点中的每一个不相关；换句话说，一个结合位点与配偶体形成非共价键的可能性不受同一颗粒上其他结合位点形成的非共价键存在与否的影响。
如本文单独或组合使用的，术语“分箱(binning)”是指将来自两个或更多个像素的信号组合成一个信号。当可以牺牲空间分辨率以便提高信噪比时，可以使用分箱。举例来说，“2×2分箱”是指将像素分组到2×2正方形中，并且对来自每个正方形中包含的像素的信号求和。
如本文单独或组合使用的，术语“生物分子”包括可能希望检测(定性或定量)的任何类型的有机分子或生物无机分子，包括但不限于肽、蛋白质、核酸、糖、单糖和多糖、脂质、脂蛋白、全细胞等。
如本文使用的，术语“相机”是指一种用于记录视觉图像(例如作为数字帧)的图像传感器。“百万像素相机”是可以每帧记录一百万个像素或数百万个像素的相机。许多智能电话相机包含1000万像素或更多像素的相机。
如本文使用的，术语“通信接口”是指用于将数据从如本文使用的设备或系统传输到另一个设备或系统的装置。无线通信接口的实例包括在无线设备(如移动电话)中使用的那些接口，例如蜂窝、wi-fi和蓝牙技术。
如本文单独或组合使用的，术语“临床用途”用于描述对包含未知浓度分析物颗粒的样品进行分析的方法。术语“临床用途”旨在区别于“非临床用途”。临床用途包括但不限于用于在医疗环境中确定患者体内的分析物颗粒浓度。如本文单独或组合使用的，术语“非临床用途”用于描述对包含已知浓度分析物颗粒的样品进行分析的方法。非临床用途包括但不限于测量样品以确定设备和方法在明确定义的分析物颗粒浓度下的行为。非临床用途包括临床前使用和临床后使用。
如本文单独或组合使用的，术语“浓度”是指每单位体积溶液的溶液中溶质的量。浓度可以以摩尔浓度的单位来指定，即每升溶液中溶质的摩尔数、或以数量浓度来指定，即每升溶液的溶质分子数或可替代地每升溶液的溶质的颗粒数。摩尔浓度和数量浓度可以容易地相互转换。如本文使用的，术语“浓度”扩展到包括在“溶液”的传统定义之外的体系，例如含有系接至固体支持物上的分子以及在“分子”的传统定义之外的颗粒(即，病毒和微生物)的体系。
如本文单独或组合使用的，术语“检测(detect)”或“检测(detection)”用于描述确定样品中分析物颗粒的出现、存在或事实的方法。
术语“发散性”指示由记录设备所能容纳的垂直度偏差。理想化的区域检测器型记录设备将仅接受垂直于检测器平面的光线。实际的区域检测器将允许以相对于垂直方向的一定角度到达的光线。尽管该特征可以增加信噪比(因为由检测器接受更多的光线)，但它也降低了空间分辨率，这取决于允许的发散角的大小、以及区域检测器像素的大小和区域检测器与样品平面之间的距离。
如本文单独或组合使用的，术语“帧”是指由记录设备捕获的图像的基本整体。某些相机一次捕获一帧。某些相机会在一段时间内捕获一系列帧。
如本文单独或组合使用的，术语“图像”是指由于特定对象被记录设备捕获而导致的相机信号中的特征。例如，月球的图像可以用安装在望远镜上的相机捕获，并且客户的图像可以用ATM相机捕获。在一些情况下，术语“图像”是指整个相机信号，而不考虑信号的来源。该术语的含义将从上下文中显而易见。
如本文单独或组合使用的，术语“孵育”用于描述将报告颗粒暴露于可能含有分析物颗粒的样品的过程。
如本文单独或组合使用的，术语“椭圆形”用于描述具有不等尺寸的体积。椭圆形体积的实例包括棱柱或圆柱体，其端面之间的距离明显大于或明显小于平行于端面的尺寸。椭圆形体积的另一个实例是椭圆体，其中一个轴明显大于或明显小于其他轴。
如本文单独或组合使用的，术语“光学路径”用于描述从报告颗粒到检测器的路径。
如本文单独或组合使用的，术语“光学报告颗粒”或等同地“光学报告物”用于描述能够通过光学信号报告分析物颗粒的存在或不存在、或量或浓度的报告颗粒。与光学报告颗粒接触的分析物颗粒(可选地，在某些测定形式中，伴有另一种光学报告颗粒)的存在或不存在诱导光学信号的变化。与分析物颗粒结合的光学报告颗粒(“已结合的光学报告颗粒”)将发出与未与分析物颗粒结合的光学报告颗粒(“未结合的光学报告颗粒”)不同的信号。
如本文单独或组合使用的，术语“光学信号”用于描述源自光学报告颗粒的信号。光学信号可以落在光谱的可见范围内、或者在光谱的可见光范围之外。信号可以是，例如：
·光的波长；
·信号的强度；
·亮度；
·信号或光谱的形状；
·光谱带的存在或不存在；
·吸收带的消光系数；
·吸收带的λmax；
·发射带的量子产率；或者
·发射带的荧光各向异性。
在一些实施例中，报告颗粒的光学信号随着分析物颗粒的结合而改变。在一些实施例中，报告颗粒的光学信号随着分析物颗粒的结合而保持不变。
如本文单独或组合使用的，术语“像素”是指区域检测器(例如图像传感器)上的区域，其信号可以独立于其他像素测量。区域检测器通常被划分为二维像素网格，其中每个像素的大小、以及两个方向上的像素计数由区域检测器制造商决定。
如本文单独或组合使用的，术语“精度”用于指与报告值或估计值相关联的误差估计量。低精度测量值、观测值或估计值与关于此数字与实际值的接近度的高不确定性相关联。高精度测量值、观测值或估计值与关于此数字与实际值的接近度的低不确定性相关联。通常可以通过在图表上使用误差条或数值范围来定量精度。例如，报告为10.5±0.1的估计值表明真实值很可能在10.4与10.6之间；真实值超出此范围的可能性很小但非零。
术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”和“寡肽”在本文中可互换使用并且包括包含通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何组合物。应了解，多肽可含有除通常称为20种天然存在的氨基酸的20种氨基酸之外的氨基酸。另外，多肽可包含通过本领域已知的任何手段(无论是天然的还是非天然的)修饰的一个或多个氨基酸，包括末端氨基酸。多肽修饰的实例包括例如通过糖基化、或其他翻译后修饰。可以存在于本披露的多肽中的修饰包括但不限于：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的至蛋白质的氨基酸添加如精氨酸化和泛素化。
如本文单独或组合使用的，术语“定性分析”用于描述用于确定样品中分析物颗粒的不存在或存在的方法。在一些实施例中，定性分析方法报告样品中单一分析物分子的存在或不存在。在一些实施例中，定性分析方法报告样品中单一分析物颗粒的存在或不存在。在一些实施例中，当样品中含有的分析物分子的水平低于某一阈值时，定性分析方法错误地报告该样品中分析物的不存在。在一些实施例中，当样品中含有的分析物颗粒的水平低于某一阈值时，定性分析方法错误地报告该样品中分析物的不存在。
如本文单独或组合使用的，术语“定量分析”用于描述用于确定样品中分析物颗粒的量的方法。
如本文单独或组合使用的，术语“记录设备”是指用于记录光学信号的设备。在某些实施例中，光学信号被转换为电信号。在某些实施例中，记录设备是电荷耦合(“CCD”)设备。在某些实施例中，记录设备是互补金属氧化物半导体(“CMOS”)设备。
如本文单独或组合使用的，术语“报告颗粒”用于描述将与感兴趣的分析物颗粒结合并且在与分析物结合时形成包含多个报告颗粒的聚集体的分子、超分子颗粒或纳米级颗粒。
术语“报告基因(reporter)”可以指由报告颗粒组成的一类物质。术语“报告基因”还可以指报告颗粒的量或浓度。在某些用法中，如从上下文中显而易见的，术语“报告基因”可以指单个报告颗粒。
如本文单独或组合使用的，术语“报告体积”用于描述报告颗粒位于其中的测量设备的体积。报告体积可以与样品隔室基本相同，或者报告体积可以更小。在某些实施例中，与报告颗粒的光学路径平行的报告体积的尺寸将是小的。在某些实施例中，报告体积将构成单层。
如本文单独或组合使用的，术语“样品”用于描述含有感兴趣分析物颗粒的组合物。样品通常是流动的，例如水性溶液。样品可以是化学的或生物的。来自待测试源的血液、血浆、水，来自植物、动物或人组织样品的提取物是生物样品的实例。化学样品可以是不含生物来源材料的样品，如含有石油化学产品或工业废料的水样品。从生物体抽取的生物样品可以包括但不限于以下物质：血液、血清、血浆、尿液、粘液、唾液、痰、粪便和其他生理分泌物，以及组织的提取物，和/或可能含有感兴趣的靶颗粒的身体的任何其他成分。其他类似的样品(如细胞或组织培养物或培养液)也是令人感兴趣的。
生物样品可以是新鲜的或储存的(例如储存在血库中的血液或血液级分)。生物样品可以是明确获得用于本发明的测定的体液或出于另一目的而获得的体液，可以对其进行二次取样以用于本发明的测定。在一个实施例中，生物样品是全血。可以使用标准临床过程从受试者获得全血。在另一个实施例中，生物样品是血浆。可以通过离心抗凝血从全血样品中获得血浆。这种过程提供白细胞成分的血沉棕黄层和血浆的上清液。在另一个实施例中，生物样品是血清。可以通过离心已经收集在不含抗凝血剂的管中的全血样品来获得血清。在离心之前允许血液凝结。通过离心获得的淡黄色-微红流体是血清。在另一个实施例中，样品是尿液。样品可以根据需要通过在适当的缓冲溶液中稀释、肝素化、浓缩(若需要)、或通过任意种方法分级来进行预处理，这些任意种方法包括但不限于超速离心、通过快速高效液相色谱(FPLC)分级、或用硫酸葡聚糖或其他方法沉淀含有蛋白质的载脂蛋白B。可以使用生理pH下的许多标准水性缓冲溶液中的任一种，如磷酸盐、Tris等。
如本文关于结合现象使用的，术语“饱和”是指几乎所有报告颗粒与分析物颗粒结合的状态。饱和条件的特性是分析物颗粒浓度的增加引起报告颗粒结合程度的小幅增加。
如本文使用的，术语“智能电话”是指具有移动操作系统和用于语音、SMS和互联网数据通信的集成移动宽带蜂窝网络连接(并且典型地是wi-fi)的手持式个人计算机。
如本文使用的，术语“平板计算机”或“平板电脑”是指薄的扁平便携式个人计算机，典型地具有移动操作系统、LCD触摸屏显示器、可再充电电池、和无线(可选地，蜂窝)通信接口。
聚集体形成
为了促进聚集体形成，报告颗粒包括多个结合位点，每个结合位点可以识别感兴趣分析物颗粒上的多个结合位点之一并与其结合。由于报告颗粒和分析物都包含多个结合位点，因此两者都可以同时与更多的结合配偶体结合，从而形成多核聚集体。该设计的要求是(a)单个分析物颗粒可以同时与两个或更多个报告颗粒结合，并且(b)单个报告颗粒可以同时与两个或更多个分析物颗粒结合。
该检测系统的原理在图1(a)-(d)中展示。感兴趣的分析物颗粒包含两个相同的结合位点，图1(a)中示意性地表示为附接到2个三角形的椭圆形。分析物颗粒暴露于绘制在反应箭头上方的2个报告颗粒，其中每个报告颗粒都包含一个三角形结合位点。分析物颗粒和2个报告颗粒组合形成超分子三元组1:2分析物颗粒：报告颗粒复合物。重要的是，这2个报告颗粒通过超分子聚集体的形成而接近。图1(b)示出了类似的系统，不同之处在于分析物颗粒具有两个不同的结合位点(三角形和矩形)，并且培养基包含两种类型的报告颗粒(包含三角形和矩形结合位点)。
图1(c)详细阐述图1(a)的系统，其中该系统包含具有两个相同(三角形)结合位点的报告颗粒，其中每个结合位点都可以与分析物颗粒中的一个结合位点结合。反应产物包含两个报告颗粒和两个分析物颗粒；然而，由于报告颗粒和分析物颗粒两者上都存在游离结合位点，附加的报告颗粒和分析物颗粒可以进一步结合到超分子结构上。
图1(d)建立在图1(b)的系统之上，其中该系统包含具有两个不同(三角形和矩形)结合位点的报告颗粒，其中每个结合位点都可以与分析物颗粒中的一个结合位点结合。与图1(c)中的系统一样，所披露的产物包含两个报告颗粒和两个分析物颗粒；附加的报告颗粒和分析物颗粒可以进一步结合到超分子结构上。
图2(a)-(b)中示出了报告颗粒的设计原理的详细说明，这些报告颗粒各自具有四个结合位点并且旨在结合具有两个结合位点的分析物颗粒。图2(a)示出了具有这种设计的报告颗粒，它同时与四个分析物颗粒结合，每个分析物颗粒具有两个相同的结合位点。每个分析物颗粒进而与附加的报告颗粒结合。很明显，这四个附加的报告颗粒中的每一个进而可以与三个附加的分析物颗粒结合，以形成具有总共5个报告颗粒和8个分析物颗粒的集合体。该过程(出于紧凑性而未示出)可以通过更多的分析物颗粒的结合来进一步扩展。
该原理可以通过引入具有不同结合位点的第二报告颗粒来扩展。图2(b)示出了具有不同的结合位点的一对不同的报告颗粒，其旨在结合具有两个不同结合位点的分析物颗粒。右侧所示的集合体通过形成第一报告颗粒与4个分析物颗粒的1:4聚集体而成核，每个分析物颗粒在两个结合位点之一上结合。每个分析物颗粒进而与第二类型报告颗粒之一结合。与之前一样，这四个附加的报告颗粒中的每一个都可以进而与三个附加的分析物颗粒结合，形成总共有5个报告颗粒(第一类型的一个和第二类型的四个)和8个分析物颗粒的集合体。该过程还可以通过更多分析物颗粒的结合来进一步扩展。
分析物颗粒的存在促进了包含若干报告颗粒的聚集体的组装。为简单起见，假设报告颗粒上的发色团彼此不会相互作用，单个聚集体中多个报告颗粒的响应将是相加的，即，一个集合体中的两个报告颗粒将提供两倍于单个报告颗粒的光谱信号。另外，出于本披露的目的，包含两个或更多个报告颗粒的集合体的大小将必然是单个报告颗粒的两倍或更多倍。
更简单系统的结合现象(其中报告颗粒和分析物颗粒各自具有单一的结合位点，并且只能形成1:1的复合物)已在化学和生物化学中进行了广泛的研究和建模。这两种颗粒之间的结合程度以及1:1复合物的形成由分子间相互作用的强度决定。给定总报告颗粒的固定浓度，随着分析物颗粒浓度的增加，未结合报告颗粒的浓度逐渐接近零。
如果报告颗粒或分析物颗粒包含多个结合位点，则可以形成化学计量比大于1:1的复合物。假设多个结合位点独立运行，对结合行为的数学建模仍然是可管理的。例如，具有3个等效结合位点的报告基因可以形成1:1、1:2和1:3的报告基因:分析物的复合物。此外，在所有报告结合位点中的90％被分析物颗粒占据(并且所有报告结合位点中的10％未被分析物颗粒占据)的条件下，99％的报告颗粒将结合到至少一个分析物。根据每个报告结合位点的分数占用，可以通过统计来估计每个种类(即，游离报告颗粒，以及1:1、1:2和1:3复合物)的比例。
如果报告颗粒和分析物颗粒都包含多个结合位点，则每个可能的复合物比例的数学预测将变得更加繁琐和不准确。结合行为可以通过某些简化和假设来预测；更现实地说，可以通过分析已知分析物颗粒浓度的溶液来构建校准曲线。可以为原型设备或实地的单个设备获得这些校准曲线。此外，在某些实施例中，校准曲线可以在重复使用该设备后或在延长的服务时间后重新确定，特别是当报告颗粒随时间退化时。
报告颗粒
测量设备和系统包括报告颗粒，并且本文披露的方法采用报告颗粒。报告颗粒的要求是：(a)用于与多个分析物颗粒结合的多个结合位点，(b)用于提供光学信号以允许成像的能力，(c)大到足以对单个报告颗粒进行成像。因此，术语“报告颗粒”包括原子集合体，这些原子集合体可能比“分子”的替代定义所包含的更大。报告颗粒在存在分析物颗粒和可选地不存在分析物颗粒的情况下提供光学信号。
报告颗粒包含多个结合位点，以便单个报告颗粒可以与多个分析物颗粒结合。在某些实施例中，报告颗粒包含多个相同的结合位点，每个结合位点可以与分析物颗粒上多个相同的结合位点之一结合。在某些实施例中，报告颗粒包含多个基本相同的结合位点，每个结合位点可以与分析物颗粒上多个相同或基本相同的结合位点之一结合。在某些实施例中，报告颗粒包含多个不同的结合位点，每个结合位点可以与分析物颗粒上多个相同的、基本相同的或不同的结合位点之一结合。
报告颗粒的结合位点可以由不同类型的分子功能提供。报告颗粒可以包含抗体(或其片段)、核酸、蛋白质和肽，其中任何一种都可以进行化学或生化修饰，并且其中任何一种可以提供与分析物颗粒的结合相互作用。现代免疫化学方法能够合成适用于本披露内容方法的报告颗粒。可以针对各种感兴趣的分析物颗粒产生抗体，特别是对于较大的分析物颗粒，可以识别出与分析物颗粒的不同区域结合并且可以同时与分析物颗粒结合的不同抗体。可替代地，报告颗粒可以包含可以与某些分析物颗粒结合的合成基序，比如用宿主/客体或超分子化学设计和/或用有机化学合成的基序。
报告颗粒在存在结合和可选地不存在结合的情况下提供光学信号。在一些实施例中，光学信号由紫外-可见光(“UV/vis”)吸收提供。在一些实施例中，光学信号由荧光或磷光发射提供。在某些实施例中，报告颗粒的光学信号在结合一个或多个分析物颗粒时基本不变。在某些实施例中，报告颗粒的光学信号在结合单个分析物颗粒时基本不变，而在结合多个分析物颗粒时改变。在某些实施例中，报告颗粒的光学信号在结合一个或多个分析物颗粒时发生变化。在一些实施例中，光学信号的变化是消光系数的变化。在一些实施例中，光学信号的变化是量子产率的变化。在一些实施例中，光学信号的变化是吸收波长的变化。在一些实施例中，光学信号的变化是发射波长的变化。在一些实施例中，光学信号的变化是荧光各向异性的变化。
报告颗粒可以包含发色团。在某些实施例中，发色团已共价附接至报告颗粒；可替代地，它可以经由官能化附接至报告颗粒上，例如，附接至量子点或等离激元纳米颗粒的表面上。在某些实施例中，发色团吸收电磁辐射。在某些实施例中，发色团吸收选自可见光和紫外光的光谱区中的电磁辐射。可替代地，发色团可以散射电磁辐射。在某些实施例中，发色团是发光的。在某些实施例中，发色团是荧光的。在某些实施例中，发色团是磷光的。
在一些实施例中，报告颗粒具有足够的大小而无需进一步修饰，使得可以对单个报告颗粒进行成像。在一些实施例中，报告颗粒可以是包含生化来源部分和合成部分的嵌合颗粒；实例包括抗体官能化的等离激元纳米颗粒或量子点和核苷酸官能化的等离激元纳米颗粒或量子点。合成部分可以提供光学信号和/或所需的大小，使得可以对单个报告颗粒进行成像。在一些实施例中，报告颗粒包含纳米颗粒或量子点。在一些实施例中，纳米颗粒或量子点经由共价键缀合到结合位点。在一些实施例中，纳米颗粒或量子点经由酯键或酰胺键缀合至结合位点。在一些实施例中，纳米颗粒或量子点经由硫醚键或硫酯键缀合至结合位点。
对象特性
本披露内容测量聚集体的特性，其可以提供关于聚集程度的信息，并且进而提供关于分析物的存在或浓度的信息。因此，术语“对象特性”是指与聚集体大小相关的聚集体属性。在一些实施例中，对象特性与聚集体的中值大小相关。在一些实施例中，对象特性与聚集体的平均大小相关。在一些实施例中，对象特性与聚集体的RMS大小相关。在一些实施例中，对象特性与聚集体的(中值/平均/RMS)大小成正比。在一些实施例中，对象特性与聚集体的(中值/平均/RMS)大小单调相关。在一些实施例中，对象特性与聚集体的(中值/平均/RMS)大小之间的关系可以通过校准曲线来估计。在一些实施例中，对象特性与聚集体的(中值/平均/RMS)大小之间的关系可以通过牛顿-拉夫森最小二乘拟合方法来估计。在一些实施例中，对象特性选自如直接观察或估计的聚集体的(中值/平均/RMS)大小、如直接观察或估计的聚集体的(中值/平均/RMS)周长、聚集体的形状、聚集体的颜色、聚集体的亮度、聚集体的反射率、聚集体的发光(荧光/磷光)。在一些实施例中，(中值/平均/RMS)颗粒大小的估计由两个或更多个这样的对象特性的组合来确定。
图像处理
在某些实施例中，检测器体积的帧被评估为“原始的”，而不进行任何进一步的图像处理。在某些实施例中，检测器体积的帧被滤波以将噪声、误差或背景特征与真正的颗粒聚集体分离。在某些实施例中，检测器体积的帧被滤波以将错误与真正的颗粒聚集体分离。在某些实施例中，检测器体积的帧被滤波以将噪声与真正的颗粒聚集体分离。
无活性报告颗粒
本文所述的方法适应一定分数的无活性报告颗粒，即来自这些无活性报告颗粒的光学信号不存在或基本上不同于大部分报告颗粒。这种行为可能是由于(a)报告颗粒未能与分析物颗粒结合，或(b)报告颗粒可以与分析物颗粒结合但不产生光学信号，或产生的光学信号与报告颗粒的其余部分大不相同。
与各种其他方法相比，这两种类型的无活性报告颗粒的存在对本披露的基于聚集的测定造成较少的复杂性。在第一种情况下，不与分析物颗粒结合的报告颗粒将不会参与聚集体形成过程，并且将仅作为单独的颗粒保留在测定中。在第二种情况下，基于聚集的测定不需要报告颗粒与分析物颗粒的结合扰动光学信号，因为光学信号的作用是对聚集体成像并估计它们的大小。为此，在与分析物颗粒结合时其光学信号保持不变的报告颗粒可能是优选的。相比之下，如果光学信号在报告颗粒之间的变化不均匀，则许多依赖报告基因/分析物结合的测定会表现不佳或根本不执行。
在本披露的某些实施例中，无活性报告颗粒包括聚集了的单独蛋白质(包括抗体)、未正确折叠的肽或蛋白质、包含不正确残基的肽或蛋白质、有缺陷的发色团。
在测量设备的操作寿命期间、特别是在无活性报告颗粒具有缺陷组成的情况下，无活性报告颗粒的数量可以保持基本恒定。由于报告颗粒的化学劣化、特别是由反复高强度暴露于光源引起的光化学劣化，或形成报告颗粒的一部分的蛋白质的聚集，无活性颗粒的数量也可能在测量设备的操作寿命期间增加。
无活性报告颗粒可以通过光学行为的变化来识别：他们未能在暴露于分析物颗粒时产生光学信号，或者它们在暴露于分析物颗粒时产生的光学信号与大部分报告颗粒明显不同。
信号处理
在某些实施例中，检测器体积阵列的一个或多个帧中的每一个由像素阵列组成。可以使用本领域已知的方法将一个或多个帧中的每一个处理成数字记录。
在某些实施例中，一个或多个图像的记录包含每个像素的强度信息。在一些实施例中，每个像素的强度信息由模数转换器(“ADC”)确定，其将在检测器的每个像素处观察到的强度信息转换为数字形式。强度信息的动态范围可以与ADC的性质相关：例如，使用12位ADC为每个像素提供了范围从0到(212-1)或从0到4095的强度值。在一些实施例中，获得颜色信号。在一些实施例中，颜色信号被转换为灰度信号。在一些实施例中，获得灰度信号。
计算机记录的处理可以包括去除杂散噪声的步骤。在某些实施例中，计算机记录中小于用户提供的阈值的特征被认为是噪声并且从处理中去除。在某些实施例中，计算机记录中大于用户提供的阈值的特征被认为是噪声并且从处理中去除。在某些实施例中，计算机记录中强度低于用户提供的阈值的特征被认为是噪声并且从处理中去除。
计算机记录的处理可以包括识别图像中与聚集体相对应的特征的步骤。计算机可以识别特征与背景之间的边界。可以通过在帧中定位具有与(亮)聚集体和(暗)背景之间的过渡相对应的较大明暗梯度的区域来识别帧中的这些边界。
计算机记录的处理可以包括计算帧上每个特征的面积的步骤。该处理可以进一步包括计算与帧上的每个特征相对应的每个聚集体的大小的步骤。
计算机记录的处理还可以包括分析关于每个聚集体大小的信息的步骤，并且根据该分析可以估计分析物的浓度。在一些实施例中，分析可以基于报告颗粒/分析物颗粒对的结合等温线属性。在一些实施例中，分析可以基于与具有预定量的报告颗粒和分析物颗粒的对照的比较。在一些实施例中，可以使用溶液中的平均聚集体大小进行比较。在一些实施例中，可以使用整个观察到的聚集体大小分布进行比较。在一些实施例中，比较是用最小二乘拟合进行的。在一些实施例中，最小二乘拟合由每个颗粒大小估计的估计误差进行加权。
图20中提供了执行分析的流程图。简而言之，在溶液中将样品与检测器颗粒一起孵育，之后记录溶液的时间帧。识别单个颗粒和聚集体的图像。取决于特定测定，可以使用选择标准来保留或丢弃单个图像。通过掩蔽所选图像并从整个帧中减去所产生的像素来完成背景减法。然后选择特别适合分析的单个图像，并使用已建立的算法生成硬边缘。然后根据二值图像来估计颗粒大小。然后将反馈分析应用于(多个)原始帧，以识别和去除任何伪影。根据从一组选定和量化的图像确定的属性(平均大小、周长、计数等)，可以确定分析物的存在和/或浓度。
应用
本文披露的聚集测定方法、系统和设备可用于多种领域和应用中。特别地，聚集测定在“实地”中(即，在便携式环境中)是有用的。例如，聚集测定将在医疗评估和诊断以及病原体检测中，特别是在偏远地区、服务不足或难以接近(例如由于暴力冲突)的地区、受流行病影响的地区中、以及在对传统测定设备和/或专业人员的接近受到限制的其他情况下是有用的。它们在医院或诊所内或在家庭访问环境中也是有用的，在那里它们可以在照护点或床边执行或使用。
聚集测定在兽医学环境中是与在医学中同样有用的，无论是在兽医办公室中、在牧场或农场上、还是在需要测试的动物所在的任何地方。它们还可以用于园艺或农业应用，以测试植物或土壤中的病原体或共生微生物、或检测其他感兴趣的基因型和表型。
聚集测定也可用于测试水的污染，例如通过细菌、藻类或真菌、或其毒性产物；通过石油或其产品和副产品、以及工业废物)。此类测定可用于食品安全测试和农业用途，如对病原体、毒素、掺杂物、污染物、和害虫的田间或加工设施测试。
测定
许多类型的生化测定可适于本文披露的聚集测定形式。实例包括：免疫测定，其中抗原被抗体或其片段捕获和结合；杂交测定，其中将一个或多个与感兴趣的分析物颗粒DNA/RNA互补的DNA或RNA区段用于捕获分析物颗粒；以及配体结合测定，其中将针对受体、酶或其他蛋白质的结合配偶体(或反之亦然)用作配偶体分析物颗粒(例如，蛋白质或其片段)的捕获剂。
在一些实施例中，使用异质测定方案，其利用多于一种类型的报告颗粒。多种报告颗粒的存在可以简化合成和聚集的问题。此外，由于该方法对包含多个报告颗粒的整个聚集体成像，因此仅单一类型的报告颗粒需要提供光学信号以提供聚集体的图像。
本文披露的方法可用于识别与临床诊断的疾病状态相关联的感兴趣的表型或基因型状态。此类疾病状态包括例如癌症、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、神经性疾病、感染性疾病和妊娠相关病症。可替代地，可以使用标记物检测健康状态。
癌症表型包括在本发明的一些方面中。本文中癌症的实例包括但不限于：乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈部癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、网状细胞肉瘤(veticulum cellsarcoma)、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺瘤、非小细胞肺癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马凡体征肿瘤(marfanoid habitus tumor)、威尔氏肿瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、利肌瘤肿瘤、宫颈发育不良和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病变、蕈样变、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、表皮癌以及其他癌和肉瘤。
心血管疾病可以包括在本发明的其他应用中。心血管疾病的实例包括但不限于充血性心力衰竭、高血压、心律失常、动脉粥样硬化、胆固醇、沃-帕-怀综合征、长QT综合征、心绞痛、心动过速、心动过缓、心房颤动、心室颤动、心肌缺血、心肌梗塞、心包填塞、心肌炎、心包炎、致心律失常性右心室发育不良、肥厚型心肌病、威廉姆斯综合征、心脏瓣膜病、心内膜炎、细菌性疾病、肺动脉闭锁、主动脉瓣狭窄、雷诺氏病、胆固醇栓塞、瓦伦贝格综合征、希佩尔-林道病和毛细血管扩张症。
炎性疾病和自身免疫性疾病可以包括在本发明的其他实施例中。炎性疾病和自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、非特异性关节炎、喉部炎性疾病、炎性肠病、银屑病、甲状腺功能减退症(例如，桥本甲状腺功能减退症)、结肠炎、1型糖尿病、盆腔炎炎性疾病、中枢神经系统炎性疾病、颞动脉炎、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、结节性多动脉炎、赖特综合征、硬皮病、系统性狼疮和红斑。
本文披露的组合物和方法将用于检测病毒。如别处所示，病毒包含负责病毒侵入细胞的表面大分子，通常是蛋白质。这些表面大分子包含识别元素，这些元素与被入侵细胞上的对应特征相互作用。这些表面大分子的著名实例是冠状病毒的刺突蛋白。这些表面分子可以用作适当官能化的报告颗粒的结合位点。
本发明的方法和组合物还可以提供有关传染病标记物的实验室信息，包括以下标记物：腺病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、霍乱毒素、霍乱毒素β、空肠弯曲杆菌、巨细胞病毒、白喉毒素、EB NA、EB EA、EB VCA、幽门螺杆菌、乙肝病毒(HBV)核心、乙肝病毒(HBV)包膜、乙肝病毒(HBV)表面(Ay)、丙肝病毒(HCV)核心、丙肝病毒(HCV)NS3、丙肝病毒(HCV)NS4、丙肝病毒(HCV)NS5、甲肝、丁肝、戊肝病毒(HEV)orf2 3KD、戊肝病毒(HEV)orf26KD、戊肝病毒(HEV)orf3 3KD、人类免疫缺陷病毒(HIV)-1p24、人类免疫缺陷病毒(HIV)-1gp41、人类免疫缺陷病毒(HIV)-1gp120、人类乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒HSV-1/2、单纯疱疹病毒HSV-1gD、单纯疱疹病毒HSV-2gG、人类T细胞白血病病毒(HTLV)-1/2、甲型流感、甲型H3N2流感、乙型流感、杜氏利什曼病、莱姆病、腮腺炎、肺炎支原体、结核杆菌、副流感1、副流感2、副流感3、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹、麻疹、O型链球菌素、破伤风毒素、苍白球菌15kd、苍白球菌p47、克鲁兹病毒、弓形虫和带状疱疹。
还应当理解，能够对病毒进行基于聚集的检测的相同识别特征可以应用于更大的生物体，比如古菌、细菌和其他微生物。例如，细菌通常在表面包含可以用作识别位点的糖蛋白。
本文披露的方法可用于检测遗传变异。本文的遗传变异可以包括但不限于核苷酸序列(例如，DNA和RNA)和蛋白质(例如，肽和蛋白质)中的一个或多个取代、翻转、插入、缺失、或突变，一个或多个微缺失，一个或多个稀有等位基因，多态性，单核苷酸多态性(SNP)，大规模遗传多态性，如翻转和易位，一个或多个核苷酸分子(例如，DNA)的丰度和/或拷贝数的差异(例如，拷贝数变异，CNV)，三体性，单体性和基因组重排。在一些实施例中，遗传变异可能与受试者中的疾病如癌症的转移、存在、不存在、和/或风险，药代动力学变异性，药物毒性，不良事件，复发和/或器官移植排斥的存在、不存在或风险相关。例如，HER2基因的拷贝数变化会影响乳腺癌患者是否对赫赛汀治疗有应答。类似地，检测来自孕妇的血液中21号染色体(或18、或13、或性染色体)拷贝数的增加可用作针对未出生的婴儿中的唐氏(Down's)综合征(或巴特氏(Patau's)综合征或爱德华氏(Edwards')综合症)的非侵入性诊断法。另一个实例是检测移植器官的受体基因组中不存在的等位基因——监测这些等位基因的频率、或拷贝数可以识别潜在器官排斥的征象。
测量设备和系统
本文所述的聚集测定方法采用测量设备或系统，其中任一者包括分析样品所需的部件。测量设备包括样品隔室，通过直接添加感兴趣样品、或通过插入比色皿或玻片(其本身包含感兴趣样品)将样品引入到该样品隔室中。样品隔室进一步提供包含报告颗粒的组件，这些报告颗粒的功能是与感兴趣分析物颗粒结合并形成聚集体。对于依赖于发射方法的设计，测量设备提供用于激发报告颗粒中包含的发色团的照明设备。测量设备包括记录设备(例如图像传感器，例如数字相机)，该记录设备检测并记录来自报告颗粒的光学信号。最后，测量设备可以包括附加组件，如用于操作的控件、用于显示或报告分析结果的设备、以及与外部计算机的接口。各种可选的组件的存在及其细节可在测量设备的各种设计之间不同。
整个系统或设备可以并入用于定向设备以方便添加或移除样品的底座。该系统可以耦合到移动计算设备。移动计算设备可以是智能电话、手持式计算机、平板计算机或类似的便携式计算设备。在一些实例中，移动计算设备包括所有必要的组件，如：显示器、处理器、存储器和存储在存储器中并且由处理器可执行的程序指令，以实现对如下列步骤的高度自动化执行：(i)引入样品，(ii)光学激发，(iii)可选地预筛选样品以评价样品质量和最佳暴露时间，通过记录设备记录帧，(iv)如果需要，减去检测器偏差，(v)对检测器信号数字化，(vi)将数字信号记录在非易失性存储器中，(vii)如果需要，再循环检测器，以及(viii)处理数字信号。功能可以进一步包括确定聚集测定的结果，并且将结果以视觉形式传达给最终用户。
使用智能电话或其他移动计算设备作为用于聚集测定的检测仪器允许价廉、便携且多功能的系统在实地(即，在实验室外)进行测定。应用可以包括用于测量病毒负载量、营养状况、疾病生物标记物、或环境污染物而无需将样品运送到中心实验室的定点照护诊断系统。此类测试可以在私人住宅、全球健康设施中、在执法站、和医疗诊所中进行。移动计算设备可以连接到互联网，这将能够将传感器数据与患者信息和地理位置组合。可以提供与外部计算设施的连接以便于数据解释、地理和人口统计绘图、数据库构建和维护、以及向远程医疗专家和当局递送通知。紧凑的可实地操作数字测量设备将使测定免除对实验室中培训过的技术人员的需求。而是，这些测定由于检测系统的大小和可承受性而可以由任何人进行。
样品隔室
测量设备提供适合于引入感兴趣样品的样品隔室。采用光学测量技术的测量设备将受益于具有一个短的尺寸的椭圆形样品隔室。光学信号的从报告颗粒到记录设备的光路将与短的尺寸对齐。此取向将使对于较长光学路径将引起问题的光学信号的吸收和色散最小化。此标准允许使用棱柱形或圆柱形样品隔室。
报告体积
样品隔室包含称为报告体积的组件，该组件含有报告颗粒。此组件消除了将报告颗粒添加到感兴趣样品中的需要，并将替代地实现报告颗粒再循环。在一些实施例中，报告体积由物理外壳限定，该物理外壳将报告颗粒保留在其自身内。物理外壳可以是多孔的，以允许分析物颗粒进入报告体积中以与报告颗粒接触。在一些实施例中，报告体积不是由物理外壳限定的；而是，可以提供其他手段以将报告颗粒保留在报告体积内。
光学路径重叠的程度可以根据限定受体体积的少量参数估计，这些参数包括报告颗粒的特定分布(随机、半随机、聚集、有序)、报告颗粒的浓度和有效大小、以及报告体积的厚度。在本披露的某些实施例中，报告颗粒与记录设备之间的基本上所有光学路径都不会遇到其他报告颗粒。在某些实施例中，报告颗粒与记录设备之间的基本上所有光学路径遇到至多一个其他报告颗粒。
在一些实施例中，报告体积足够薄，以实现单层报告颗粒。在此设计中，由于所有报告颗粒基本上在垂直于光学路径的平面中，并且平行于记录设备，因此光学路径的重叠是不可能的。
记录设备和显微镜
提供记录设备以记录来自报告颗粒的光学信号。在某些实施例中，来自报告颗粒的光学信号通过样品隔室的透明窗口。在某些实施例中，记录设备将是图像传感器，如相机。例如，CMOS(互补金属氧化物半导体)相机是可用的，因为它可以单独读取每个像素；另外，CMOS相机消耗非常小的功率，这允许它们在作为实地设备的一部分使用时持续更长时间。几乎所有智能电话相机都具有CMOS相机，许多具有超过1000万像素的分辨率，使得它们可用于本文披露的方法、系统和设备中。
在本披露的某些实施例中，记录设备允许观测来自样品隔室的一个或多个信号。在某些实施例中，多个信号中的每一个源自样品隔室的不同区。在某些实施例中，多个信号中的每个信号源自跨越样品隔室的规则几何网格中的像素。
在某些实施例中，记录设备的像素布置成长方形或正方形阵列。在某些实施例中，记录设备的像素布置成512×512正方形阵列、1024×1024正方形阵列、2048×2048正方形阵列、或4096×4096正方形阵列。在某些实施例中，来自每个像素的信号与所有其他像素分开记录。在某些实施例中，来自2×2组像素的信号被分箱在一起。
测量设备可以允许观测来自多个报告颗粒的不同区的多个信号。在某些另外的实施例中，多个报告颗粒的不同区设置在规则网格中。可替代地，可以观测到来自基本上所有报告颗粒的单独光学信号而不受任何其他报告颗粒的干扰。
与放大透镜结合使用，记录设备可以检测甚至更小的信号。此类透镜在本领域中是熟知的。在某些实施例中，记录设备可以捕获单独像素和/或单独报告颗粒。使用等离激元纳米颗粒/量子点作为捕获元件官能化到其上的基底有利于此检测。
记录设备可以使用本领域中已知的任何技术来检测和定量报告颗粒/分析物颗粒复合物。记录设备可以使用与报告颗粒设计配对的光学吸收和发射方法。
可替代地，光输出可以包括通过光源激发、来自报告颗粒上或与报告颗粒耦合的荧光团的荧光发射。然后将通过荧光发射的强度报告分析物颗粒的存在和数量。荧光团可以在一表面(如光子晶体)近侧，由此使得增强荧光发射。可以采用多个荧光团来将荧光信号调谐到期望的结果。因此，可以通过两个或更多个荧光团之间的激发转移来调节光学信号。
在本披露中设想了荧光和磷光量子产率、λmax偏移和各向异性。对于各向异性测量，可以将偏振器引入到激发光学路径或发射光学路径、或两者中。光源可以与发射方法耦合。光源可以是常规的宽带光源、发光二极管、或激光，并且可以直接或经由波长选择设备(如光栅)递送到样品，以便优化激发。可以将光引导通过并入波导并形成报告体积的基部的基部的全内反射组件，从而提供暗场激发。
对无活性报告颗粒的识别
本文提供了用于识别无活性报告颗粒的方法，称为“识别方法”。对于某些系统，将使两种溶液(第一种不含分析物颗粒，并且第二种具有高浓度分析物颗粒)与报告体积顺序提交。应了解，这两种溶液将分别导致不存在报告颗粒与分析物颗粒的结合以及报告颗粒与分析物颗粒接近饱和的结合。使用记录设备记录帧，并且在无分析物颗粒条件的帧与分析物颗粒饱和条件的帧之间进行比较。将不符合选择标准的报告颗粒标记为无活性。
在由于纳米颗粒聚集而失活的情况下，对无活性报告颗粒的识别将是直截了当的。聚集体的形成在目视检查来自记录设备的帧时将是明显的，并且不需要上面概述的“无分析物颗粒”和“分析物颗粒饱和”过程。
识别方法保持对报告颗粒在测量设备中的位置的记录。报告颗粒的位置可以通过x/y坐标来引用，例如相对于测量设备中的适当几何网格、或相对于记录器设备上的像素坐标。无活性报告颗粒的记录可以保持在非易失性计算机存储器上。
识别方法将提供用于将报告颗粒标记为无活性的标准。对标准进行设定以在消除使用中表现不佳的报告颗粒与保持足够高的报告颗粒计数以满足测量设备的特定准确度和灵敏度要求之间取得平衡。为了消除偏差、并实现自动化标记，可以基于观测到的光学信号的类型选择数值阈值。仅举例来说，某种报告颗粒在结合分析物颗粒时可能经历发射λmax的偏移，并且对于本实例中的大部分化合物，λmax偏移20纳米(nm)。可能选择5nm偏移的阈值用于该特定实例。
为了满足准确度和灵敏度的要求，可以选择数值阈值以排除一定分数的报告颗粒。参考先前的实例，对于95％的报告颗粒，可以观测到12nm的λmax偏移。然后可以选择12nm的阈值λmax以保留95％的作为活性的报告颗粒，并且丢弃5％的作为无活性的报告颗粒。
可以应用多种标准来指派无活性状态。重要的是，可以选择任何标准以将报告颗粒指派为无活性。由于任何一个报告颗粒的结合独立于所有其他报告颗粒，因此从活性报告颗粒库中消除报告颗粒不会影响剩余颗粒的行为。
如果需要，可以在测量设备的操作寿命期间周期性地重复上述识别方法。此做法对于性能易于随时间劣化的报告设备是特别有益的。理想地，识别方法需要最少量的操作员干预，其中测量设备自动化执行所有必需的步骤。对于基于纳米颗粒的报告颗粒的情况，可以周期性地记录帧，并且可以通过模式匹配软件识别可能随时间发生的任何聚集。
识别方法还可以包括使测量设备经受含有中等浓度的分析物颗粒的一种或多种溶液的步骤。这对于分析物颗粒的定量测量尤其重要，其中设想了一系列报告颗粒饱和度。通过使用跨越一系列分析物颗粒浓度的若干种溶液，可以构建校准曲线以更好地匹配光学报告数据与分析物颗粒浓度。
使用来自报告颗粒场的空间上可分辨信号的关键益处是记录设备的特别成问题的区可以同样标记，并在随后的分析中丢弃。这不仅包括无活性报告颗粒，即被不当折叠的抗体的情况，而且还包括任何存在困难的区的情况。这可能包括来自两个或更多个紧密间隔的报告颗粒的重叠斑点，或者无论出于何种原因其游离状态和已结合状态难以区分的报告颗粒。每个单独报告颗粒的结合独立于所有其他报告颗粒，并且丢弃一小组光学信号可以提高准确度或精度，而仅略微影响灵敏度。
准确度/精度/灵敏度
预期所披露的数字测量方法的准确度将至少与常规模拟方法的一样好。数字测量方法将最小化或消除若干个误差来源，根据定义，这些误差来源是低准确度的来源。举例来说，一个可能的误差产生自无活性的报告颗粒：它们不与分析物颗粒结合，或与分析物颗粒结合但不能提供预期的光学信号。如别处所讨论的，不与分析物颗粒结合的报告颗粒的存在仅表示不形成聚集体的报告颗粒的一小部分，并且可以通过对已知分析物浓度的样品进行校准来考虑在内。此外，由于聚集测定设计不需要在分析物结合时扰动光学信号，因此可以使用其发色团对客体结合相对不敏感的报告颗粒。由于这两个原因，与许多其他基于宿主/客体的分析系统相比，无活性颗粒对准确度和精度的挑战要小得多。
预期所披露的数字测量方法的精度将至少与常规模拟测量的一样好。观测来自全部报告颗粒的整体信号的常规方法可以在大多数但不是所有情况下使用各种统计和数值方法来提供精确估计值。
相比之下，使用聚集测定，特别是对于导致相对较小的聚集体形成的系统和条件，该测定可以被认为是“数字的”，因为每个聚集体只有少量整数的报告颗粒。可以将观察到的颗粒大小(如以样品体积中的像素跨度或物理大小指定的)指派为包含报告颗粒的整数计数的“数字”聚集体大小。在一些实施例中，可能优选有意地形成小聚集体，这是由于较弱的报告颗粒/分析物结合，或由于样品的预稀释。
结合等温线
分析物颗粒浓度与数量和颗粒大小之间的关系(本文称为“结合等温线”)是复杂且间接的。简而言之，给定固定的报告颗粒浓度，随着总分析物颗粒浓度的增加，报告颗粒上的已结合位点/总结合位点的比率逐渐增加到1。在任何给定的分析物颗粒浓度下，较高亲和力的报告颗粒将与较高比例的分析物颗粒结合。重要的是，报告颗粒总浓度仅是指活性报告颗粒。
在为所披露的方法设想的许多用途中，已经建立了对应于临界值的阈值或截止值。这些阈值或截止值可以对应于环境法规定的监管水平、或对应于某些健康状况的关键生物标记物水平。测量方法可以调整所推荐的扫描参数和稀释水平，以便提供足以满足预期用途的测量条件。
在某些实施例中，测量设备可以提供用于自动稀释样品的机构。此举可以通过喷射一定分数的现有样品，然后引入溶质进行稀释来完成。此举也可以通过引入已经用溶质预稀释的新样品来完成。
在某些实施例中，所推荐的稀释水平可以通过计算设备计算，该计算设备并入到测量设备中或连接到测量设备。计算设备可以经由界面(如显示器、打印输出、或合成语音报告)向操作员提供所推荐的稀释水平。计算设备还可以直接控制测量设备以执行自动化分析稀释样品所需的任何步骤，而无需用户干预。
在某些实施例中，阈值或截止值可以在计算设备中预先设定，该预先设定呈固件的形式(该固件在阈值或截止值变化的情况下可任选地更新)，或者呈软件的形式。此外，操作软件可以提示用户对正在测量的样品的进一步输入。例如，在测量生物标记物的情况下，用户可以输入受试者的历史参数，如年龄、体重、性别等，这些历史参数可能改变阈值或截止值并且因此可以影响给定测量所要求的精度。
如将在实例中证明的，聚集体测定的重要特征是平均颗粒大小可以在一定范围的分析物浓度内平稳增加。这种行为是由于在统计上不太可能形成需要多个同时的结合相互作用的更大聚集体。这种行为与传统的1:1结合行为形成对比，后者通常在狭窄的分析物浓度范围内显示出S形通断(sigmoidal off-on)行为。换句话说，1:1结合等温线导致报告颗粒在绝大多数分析物浓度范围内基本上结合或基本上未结合的情况。因此，传统的1:1结合在确定分析物浓度时价值有限(与分析物的存在/不存在相反)。相比之下，分析物浓度与颗粒大小之间的平滑关系本身很适合于分析物浓度的精确确定。
缩写
本披露内容中使用以下缩写。也可以使用本领域技术人员认可的其他缩写。
PEG：聚(乙二醇)；EDC：1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；DDI水：双去离子水；PBS：磷酸盐缓冲盐水；RBD：SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域
实例
本发明进一步通过以下实例说明。
实例1：羧基官能化纳米颗粒
向在1mL EtOH中的100nM Au纳米颗粒(“GNP”s，NanoComposix，圣地亚哥，加利福尼亚州)的悬浮液中，加入1mL 3-巯基丙酸的EtOH溶液(10mM)。将所得混合物在离心管中在室温下孵育数小时，伴随间歇振荡和超声处理。对混合物进行最终超声处理，然后在约5000RCF下离心5分钟，或直到颗粒充分沉淀。去除上清液，小心操作以免扰动固体沉淀物。如下进行EtOH冲洗：加入EtOH(1mL)，并对混合物进行超声处理以使颗粒重新悬浮。在约5000RCF下将混合物离心5分钟，或直到颗粒充分沉淀。EtOH冲洗再重复2次，总共进行3次EtOH冲洗。在EtOH冲洗过程之后进行水冲洗，用水代替EtOH，总共进行3次水冲洗。
实例2：C2抗CRP抗体缀合纳米颗粒
在羧基官能化纳米颗粒的水性悬浮液(1mL)中加入20μL含有10mg/mL EDC的水性溶液，然后加入40μL含有10mL/mg磺基NHS的水性溶液。将混合物伴随旋转孵育30min，然后在5000RCF下离心5分钟。去除上清液，小心操作以免扰动固体沉淀物。向沉淀物中加入1mL的0.1x PBS，并通过涡旋和/或超声处理(<30sec)使颗粒重新悬浮。在悬浮液中加入20μGC2抗CRP(C反应蛋白)抗体(Abcam，剑桥，英国)，并将混合物在室温下孵育2小时，然后离心。去除上清液，小心操作以免扰动固体沉淀物。如下进行PBS冲洗：向沉淀物中加入1mL的0.1xPBS，并通过涡旋和/或超声处理(<30sec)使颗粒重新悬浮。PBS再重复两次，总共冲洗3次。在第三次(最后一次)冲洗时，使用1mL的0.1x PBS+0.5％(v/v)Tween 20。将所得材料在4℃下存储。
实例3：C6抗CRP抗体缀合纳米颗粒
按照实例2的过程，使用C6抗CRP抗体(Abcam，剑桥，英国)代替C2抗CRP抗体。
实例4：缀合物的光吸收研究
图5示出了与C2抗体(插图(a))和C6抗体(插图(b))缀合的GNP(金纳米颗粒)悬浮液的UV-Vis吸收光谱。对于每个缀合物，从裸GNP(i)到GNP-抗体缀合物(ii)都观察到轻微的红移，这可能是由于GNP介电属性的扰动，导致局域表面等离激元共振(LSRP)发生变化。对于每种缀合物，添加CRP会导致吸光度(iii)发生进一步变化，从而证实了抗体仍然具有捕获溶液中CRP的活性。与C2抗体(插图(a)，迹线(iii))相比，C6抗体(插图(b)，迹线(iii))观察到更大的吸光度变化。
实例5：聚集研究
与C2抗体和C6抗体缀合的GNP以1:1的比例组合，并悬浮在PBS+0.05％
Figure BDA0003986688660000441
20中。添加洗涤剂以使颗粒悬浮液稳定。然后将CRP溶液(10μL)与GNP-抗体缀合物溶液(20μL)混合，并在37℃下孵育一段时间。孵育后，将15μL的CRP/GNP-抗体缀合混合物夹在两个显微镜玻璃之间，形成一层薄薄的液膜。在DF模式下使用直立光学显微镜观察聚集行为，通常使用40倍物镜。全尺寸DF帧通常在250mm×200mm区域内包含2,000-10,000个颗粒。使用更高的浓度预计会增加聚集体帧的重叠程度，从而使信号处理复杂化。
图6和图7示出了对照和阳性实验的DF显微照片。在没有CRP的情况下，对单个GNP进行成像(图6(a))。CRP的添加导致GNP簇的形成，在显微照片中清晰可见(图6(b))。在图7(a)至图7(c)中对单个簇进行成像。
典型的实验由10个帧组成，需要分析20,000-100,000个颗粒。分析大量颗粒的需要推动了如实例6-9中所述的图像处理方法的发展，以使过程自动化并避免劳动密集型的手动评估。信号处理考虑的因素包括：由于焦平面外的灰尘/碎屑、来自单个GNP的较暗光学信号以及聚集体的不均匀形状，帧中出现明亮的圆形缺陷。
图8中展示了信号处理方法的概况。对转换为灰度的原始帧(插图(a))进行处理以去除伪影(插图(b))。在该步骤之后，帧被分割成多个区，每个区对应一个颗粒或颗粒聚集体(插图(c))。然后量化每个区段的大小(插图(d))。
实例6：减去信号背景
以下MATLAB代码从帧中去除背景。该代码适用于由j索引的帧I，并且需要用户提供bglvl参数。
se＝strel(′disk′，bglvl)；％创建结构化元素
Ie＝imerode(I{j，1}，se)；％使用结构化元素
％识别大背景特征
％接下来，优化背景帧的一系列函数
Iobr＝imreconstruct(Ie，I{j，1})；
Iobrd＝imdilate(Iobr，se)；
Iobrcbr＝imreconstruct(imcomplement(Iobrd)，imcomplement(Iobr))；
Iobrcbr＝imcomplement(Iobrcbr)；％最终背景帧
％减去背景帧
i＝I{j，1}-Iobrcbr；
该过程的效果可以在图9中看出。处理插图(a)中的原始帧以产生背景帧(插图(b))，从原始帧中减去背景帧以提供减去背景后的插图(c)。
实例7：边界形成
以下MATLAB代码从包含B/W特征的清除后的灰度帧构建与单个聚集体相对应的帧。该过程在高梯度(即，从黑色快速变为白色)的位置处创建边界。梯度幅度阈值由用户提供的参数FudgeFactor来修改。对于大多数分析，采用FudgeFactor＝1.05的值。为了容纳未被该步骤产生的边界完全包围的特征，使边界大小膨胀。然后，填充完全由边界包围的区域，并反转膨胀。
Figure BDA0003986688660000461
图10示出了边界形成过程的实例。对从背景减法步骤中清除后的帧(如插图(a)所示)进行边界形成过程。插图(b)示出成功识别该帧上四个特征的边界。然后填充边界，以提供与这四个特征相对应的B/W帧(插图(c))。
实例8：特征识别
以下MATLAB代码识别与单个聚集体相对应的特征。使用MATLAB bwconncomp函数从B/W帧创建特征向量。像素少于用户提供的参数T的特征被视为噪声并恢复为背景。
Figure BDA0003986688660000471
图11示出了特征识别过程的实例。插图(a)是在处理之前的清除后的灰度帧。插图(b)示出了边界形成过程中的B/W帧。插图(c)是去噪后的B/W帧。可以注意到，在所有三个插图中圈出的伪影已成功去除。
实例9：帧填充
以下MATLAB代码标识了将帧填充到其原始大小，以便于比较。标签矩阵由对应于每个特征的元素构造而成。计算并存储每个特征的面积。
Figure BDA0003986688660000472
实例10：CRP滴定
图12展示了使用披露的聚集方法的CRP测定，并与传统的等离激元感测方法进行了比较。颗粒簇的多分散性导致对整体平均值分析的嘈杂响应。相比之下，颗粒间分析提供了有关颗粒聚集的详细信息，从而提高了灵敏度和动态范围。插图(a)示出了校准曲线，该曲线衍生自对多个CRP浓度的簇大小分布的分析。平均簇大小与CRP浓度之间的线性关系是值得注意的，并且与插图(b)(相比之下，其示出了许多测定中典型的饱和等温线)中所示的传统等离激元感测方法形成对比。重要的是，插图(a)的线性关系清楚地显示了对于CRP浓度为2-3mg/mL(对应于心脏病的风险阈值)和CRP浓度为10mg/mL(对应于正常水平)的显著不同的平均簇大小。传统的等离激元感测方法无法区分这两个水平。
实例11：检测全血中的C反应蛋白(CRP)。
图13中示出了全血中的颗粒检测。插图(a)中示出了(i)0.1mm和(ii)0.05mm深度的毛细血管。插图(b)、(c)和(d)中分别示出了使用0.1mm、0.05mm和0.01mm厚的毛细血管示出全血中颗粒的暗场图像。
图14中示出了不同深度的全血中单个纳米颗粒的成像。在插图(a)、(b)和(c)中，分别描绘了在深度为0.1mm、0.05mm和0.01mm的培养基中的纳米颗粒。插图(a)、(b)和(c)中分别示出了这些图像的16位强度(亮度)图像。
图15的图像中示出了全血中CRP测定的性能，横轴＝CRP浓度(mg/dL)，并且纵轴＝平均簇大小(像素)。如图12所示，该测定利用了分析物浓度与聚集体大小之间的线性关系。
实例12：抗人抗体纳米颗粒的合成
使用实例2中描述的方法制备用抗人抗体官能化的Au纳米颗粒。
实例13：RBD连接的纳米颗粒的合成
以下协议用于制备RBD连接的Au纳米颗粒，用于检测完整的SARS-CoV-2病毒。
金纳米颗粒1mL PEG化的80nm金纳米颗粒溶液(20OD＝1.3E11颗粒/mL)。(Nanocomposix.Bio ready,Carboxyl,20OD,SKU:AUXR80-5M)根据需要进行缩放。
RBD Thermo Fisher Scientific，SARS-CoV-2刺突蛋白(S-RBD)(aa319-541)，His标签重组蛋白。
其他化学品EDC、NHS、DDI水、PBS缓冲液、KH2PO4、20KDa PEG(推荐)、甘氨酸(或Tris缓冲液)、Tween 20。
通过将1-10mg的EDC溶解在水中来制备含有10mg/mL的EDC的溶液。类似地，通过将1-10mg磺基NHS溶解在水中来制备含有10mg/mL磺基NHS的溶液。对于这两种溶液，使用每mg溶质100μL H2O，并且溶液在使用前立即制备。
在1mL以-COOH为末端的颗粒(悬浮在DDI水中)中加入7μL的EDC溶液，然后加入14μL的磺基NHS溶液。将溶液充分混合，然后在室温下在试管旋转器上孵育30分钟。溶液在5000RCF下离心5分钟。小心去除上清液，加入1mL反应缓冲液(5mM KH2PO4+0.5％(v/v)20KDaPEG，pH 7.4)。将混合物涡旋和超声处理(<30秒)以使颗粒重新悬浮。向混合物中加入20μL1mg/mL RBD蛋白质，对混合物进行涡旋以混合，并在室温下孵育2小时。然后向混合物中加入5μL饱和甘氨酸(在DDI水中)，将内容物混合并孵育10分钟。
如下用反应缓冲液洗涤颗粒：将混合物在5000RCF离心5分钟，去除上清液，并使用30sec或更短的超声处理将沉淀物重新悬浮于1mL反应缓冲液中。反应缓冲液冲洗再重复两次，总共冲洗3次。在第三次(即，最后一次)冲洗时，将沉淀物重新悬浮在1mL的0.1x PBS+0.5％(v/v)Tween 20中。将所得材料在4℃下存储。
以下顺序用于用PEG重新填充颗粒表面，以避免非特异性聚集。制备2mg SH-PEG-COOH(MW 6000)在50mL 0.1X PBS中的溶液。将等体积的该溶液与缀合颗粒溶液和PEG溶液混合，并在25℃下振荡孵育6小时，或可替代地在4℃下孵育过夜。
如下用反应缓冲液洗涤颗粒：将混合物在5000RCF离心5分钟，去除上清液，并使用1mL 0.1X PBS+0.5％(v/v)Tween 20将沉淀物重新悬浮。反应缓冲液冲洗再重复两次，总共冲洗3次。将所得材料在4℃下存储。
实例14：全血中SARS-CoV-2抗体的检测。
开发了以下测定来检测和量化针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体。设计原理如图16所示。实例12的纳米颗粒示出为具有经由PEG(i)连接至纳米颗粒的抗人抗体(ii)。实例13的纳米颗粒示出为具有经由PEG(v)连接至纳米颗粒的RBD结构域(iv)。分析物(iii)(即，针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体)可以同时与两种类型的官能化纳米颗粒结合。
化学品抗体：SARS-CoV-2刺突蛋白S1嵌合重组人单克隆抗体(H6)
全血ZenBio，Inc.，目录：SER-WB10ML
制备具有期望抗体浓度的全血样品。制备了含有10μL RBD缀合颗粒(20OD＝1.3E11颗粒/mL)和10μL 0.1X PBS+0.5％(v/v)Tween20溶液的溶液。将20μL稀释后的颗粒溶液(10OD＝6.5E10颗粒/mL)与5μL全血样品混合，并轻轻涡旋混合物，然后在25℃下孵育1小时。
将5μL溶液应用于大载玻片(CORNING盖玻片，厚度1.24×50mm，目录号2975-245)，盖上小盖玻片(CORNING盖玻片，厚度1.18×18mm，目录号2845-18)。使用20倍物镜记录暗场图像。使用自制图像分析程序来处理图像。
图17中展示了测定结果。插图(a)示出了聚集体的显微镜检查。插图(b)提供了校准曲线：横轴＝SARS-CoV-2抗体(mg/dL)，纵轴＝聚集大小(像素)。对于高于5mg/dL的抗体浓度，观察到良好的线性度。值得注意的是，患者血清中的COVID-19IgG浓度在0.14至420mg/dL之间，对应于1.4至4200μg/ml之间。此外，10mg/dL(或100μg/mL)是使供体有资格进行恢复期血清治疗的截止浓度。
实例15：检测完整的SARS-CoV-2病毒
用于完整SARS-CoV-2的检测测定的成分如图18所示。插图(a)示出了冠状病毒的细节，突出显示了(i)装饰病毒表面并负责细胞入侵的刺突蛋白的多样性。纳米抗体已由其他人设计用于与刺突蛋白结合。插图(b)和(c)示出了描述三部分纳米抗体(ii)与刺突蛋白(i)之间相互作用的俯视图和侧视图。
使用实例2中描述的方法制备了用SARS-CoV-2刺突蛋白的纳米抗体官能化的纳米颗粒。SARS-CoV-2的检测细节如图19所示，其示出SARS-CoV-2病毒的检测。插图(a)示出了纳米抗体官能化的纳米颗粒：(i)SARS-CoV-2刺突纳米抗体，(ii)PEG接头，(iii)Au纳米颗粒。插图(b)和(c)示出了不同病毒浓度水平下聚集体的显微镜检查。
在本申请中引用的所有参考文献、专利或申请(无论是美国的还是国外的)都特此通过引用并入，就像完整地写在本文中一样。在出现任何不一致之处，以本文字面意义上披露的材料为准。
通过以上的说明，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明作出不同变化和修改，以使它适应不同用途和条件。

Claims (102)

1.一种用于确定样品中分析物颗粒的存在或浓度的方法，该方法包括以下步骤：
将该样品与一定数量的一种或多种类型的报告颗粒组合在检测器体积中；
记录该检测器体积的一个或多个帧；
在该一个或多个帧中，识别与报告颗粒的聚集体相对应、以及可选地与单个未聚集的报告颗粒相对应的颗粒的图像；
确定一个或多个对象特性；以及
根据该对象特性，确定该分析物颗粒的存在和/或浓度；
其中：
该分析物颗粒的存在诱导聚集体的形成，每个聚集体包含至少两个报告颗粒和至少一个分析物颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其中这些颗粒图像对应于报告颗粒的聚集体和单个未聚集的报告颗粒。
3.如权利要求1所述的方法，其中这些颗粒图像对应于报告颗粒的聚集体。
4.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中该一个或多个帧中的每一个都由像素阵列组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中聚集体的形成是由该报告颗粒上的结合位点与该分析物颗粒上的结合位点之间的结合引起的。
6.如权利要求5所述的方法，其中该报告颗粒包含两个或更多个结合位点。
7.如权利要求6所述的方法，其中该报告颗粒包含两个或更多个相同的结合位点。
8.如权利要求6所述的方法，其中该报告颗粒包含两个或更多个不同的结合位点。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒包含两个或更多个结合位点。
10.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒包含两个或更多个相同的结合位点。
11.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中该分析物颗粒包含两个或更多个不同的结合位点。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该对象特性随平均聚集体大小而单调增加。
13.如权利要求12所述的方法，其中该对象特性与平均聚集体大小成比例地增加。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该平均聚集体大小可以通过校准曲线根据该对象特性来确定。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包括获得校准曲线的步骤。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该报告颗粒提供光学信号。
17.如权利要求16所述的方法，其中该光学信号选自UV/Vis吸光度、荧光发射和磷光发射。
18.如权利要求16和17中任一项所述的方法，其中该光学信号在报告颗粒与分析物颗粒结合后基本上没有变化。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，进一步包括去除背景特征的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，进一步包括去除大于给定大小最大值的背景特征的步骤。
21.如权利要求19和20中任一项所述的方法，进一步包括去除小于给定大小最小值的背景特征的步骤。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
腐蚀图像；
重建图像；以及
膨胀图像。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，进一步包括在该检测器体积的一个或多个帧中形成边界的一个或多个步骤。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该报告颗粒包括纳米颗粒或量子点。
25.如权利要求24所述的方法，其中该报告颗粒包括纳米颗粒。
26.如权利要求25所述的方法，其中该纳米颗粒是用一个或多个结合位点官能化的金纳米颗粒(“GNP”)。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中该光学信号是由表面等离激元共振(“SPR”)引起的。
28.如权利要求27所述的方法，其中该表面等离激元共振是局域表面等离激元共振。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该一定数量的报告颗粒中存在的一种或多种类型的报告颗粒中的每一种都包含一种或多种相同类型的结合位点。
30.如权利要求29所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒是单一类型的报告颗粒。
31.如权利要求30所述的方法，其中：
该单一类型的报告颗粒可以同时与两个或更多个分析物颗粒结合；并且
该分析物颗粒可以同时与两个或更多个报告颗粒结合。
32.如权利要求29所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒是两种类型的报告颗粒。
33.如权利要求32所述的方法，其中该两种类型的报告颗粒中的每一种包含与另一种类型的报告颗粒不同类型的结合位点。
34.如权利要求33所述的方法，其中该两种类型的报告颗粒上的这两种类型的不同结合位点中的每一种与该分析物颗粒上的不同结合位点结合。
35.如权利要求34所述的方法，其中：
该两种类型的报告颗粒中的每一种可以同时与两个或更多个分析物颗粒结合；并且
该分析物颗粒可以同时与该两种类型的报告颗粒中的每一种的一个或多个结合。
36.如权利要求35所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的每一种都位于该两种类型的报告颗粒中的每一种所包含的抗体或纳米抗体上。
37.如权利要求35所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的每一种都位于该两种类型的报告颗粒中的每一种所包含的抗体上。
38.如权利要求37所述的方法，其中该两种类型的结合颗粒中的每一种上的抗体与另一种类型的结合颗粒上的抗体不同。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中该分析物是抗体。
40.如权利要求39所述的方法，其中该抗体是人类抗体。
41.如权利要求40所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的一种包括抗人抗体。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中该分析物是针对病毒的病毒包膜中生物分子的抗体。
43.如权利要求42所述的方法，其中该病毒是冠状病毒。
44.如权利要求43所述的方法，其中该冠状病毒是SARS-CoV-2。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中该生物分子是该病毒包膜中的蛋白质。
46.如权利要求45所述的方法，其中该病毒包膜中的蛋白质选自膜蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白。
47.如权利要求46所述的方法，其中该病毒包膜中的蛋白质是刺突蛋白。
48.如权利要求47所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的至少一种包括刺突蛋白受体结合结构域(刺突RBD)。
49.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中该分析物是血液学蛋白。
50.如权利要求36所述的方法，其中该血液学蛋白是C反应蛋白(“CRP”)。
51.如权利要求50所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点包括抗C反应蛋白抗体。
52.如权利要求51所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的一种包括C2抗C反应蛋白抗体。
53.如权利要求51和52中任一项所述的方法，其中该两种类型的不同结合位点中的一种包括C6抗C反应蛋白抗体。
54.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中该分析物是病毒。
55.如权利要求54所述的方法，其中该病毒是冠状病毒。
56.如权利要求55所述的方法，其中该冠状病毒是SARS-CoV-2。
57.如权利要求56所述的方法，其中该结合位点与该病毒包膜中的蛋白质结合。
58.如权利要求57所述的方法，其中该病毒包膜中的蛋白质选自膜蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白。
59.如权利要求58所述的方法，其中该病毒包膜中的蛋白质是刺突蛋白。
60.如权利要求59所述的方法，其中该结合位点是刺突纳米抗体。
61.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中该分析物是细菌。
62.如权利要求61所述的方法，其中该结合位点与该细菌上的表面糖蛋白结合。
63.如权利要求1-62中任一项所述的方法，其中该样品是生物流体。
64.如权利要求1-62中任一项所述的方法，其中该样品是血液。
65.如权利要求1-62中任一项所述的方法，其中该样品衍生自生物流体。
66.如权利要求1-62中任一项所述的方法，其中该样品衍生自血液。
67.如权利要求63所述的方法，其中该样品是经过浓缩、稀释和/或预处理中任一项的生物流体。
68.如权利要求64和66中任一项所述的方法，其中该样品包含完整的血细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中该样品包含完整的红细胞。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其中该样品用能够进行暗场成像的显微镜进行分析。
71.如权利要求70所述的方法，其中该显微镜还能够进行明场成像。
72.如权利要求70和71中任一项所述的方法，其中该显微镜还能够自动对焦。
73.如权利要求70-72中任一项所述的方法，其中该显微镜包括荧光照明器。
74.如权利要求73所述的方法，其中该荧光照明器包括复眼透镜。
75.如权利要求70-74中任一项所述的方法，其中该样品用微流体装置进行处理。
76.如权利要求75所述的方法，其中该光学路径长度不超过0.1mm厚。
77.如权利要求76所述的方法，其中该光学路径长度不超过0.05mm厚。
78.如权利要求77所述的方法，其中该光学路径长度不超过0.02mm厚。
79.如权利要求78所述的方法，其中该光学路径长度不超过0.1mm厚。
80.如权利要求1-79中任一项所述的方法，其中该一种或多种类型的报告颗粒是一种或多种类型的光学报告颗粒。
81.一种用于执行如权利要求1-80中任一项所述的方法的装置或系统，该装置或系统包括：
·图像传感器；
·能够显示图像的屏幕；
·微处理器；
·存储器；
·图像分析软件，该图像分析软件存储在该存储器中并且可由能够分析由该图像传感器捕获的数据并对数据进行数字分类的处理器执行；以及
·可选地，通信接口。
82.如权利要求81所述的装置或系统，其中该图像传感器能够作为暗场显微镜的一部分操作。
83.如权利要求82所述的装置或系统，其中该图像传感器选自相机和/或显微镜。
84.如权利要求83所述的装置或系统，其中该图像传感器是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机。
85.如权利要求81-84中任一项所述的装置或系统，另外包括光源或其他电磁辐射源。
86.如权利要求85所述的装置或系统，其中该光源或其他电磁辐射源包括发光二极管(LED)。
87.如权利要求81-86中任一项所述的装置或系统，另外包括可选地可移除的样品室。
88.如权利要求87所述的装置或系统，另外包括
·由玻璃或聚合物制成的报告表面，该报告表面的一侧已附连包含用捕获元件官能化的等离激元纳米颗粒的光学报告颗粒；以及
·适合于暗场显微镜检查的波导，该波导与该报告表面的相反侧接触。
89.如权利要求88所述的装置或系统，其中每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
90.如权利要求89所述的装置或系统，其中这些附连的光学报告颗粒随机地排列。
91.如权利要求90所述的装置或系统，其中这些附连的光学报告颗粒以网格或近似网格排列。
92.如权利要求89所述的装置或系统，其中每个附连的光学报告颗粒可在记录设备的一个像素上分辨。
93.如权利要求81-92中任一项所述的装置或系统，其中该捕获元件选自：
与该分析物结合的一种或多种纳米抗体；
与该分析物结合的一种或多种核苷酸序列；以及
与该分析物结合的抗体或其片段。
94.如权利要求93所述的装置或系统，其中该分析物是抗原。
95.如权利要求94所述的装置或系统，其中每个光学报告颗粒包括作为该捕获元件的抗体或其片段。
96.如权利要求93所述的装置或系统，其中该分析物是核苷酸序列。
97.如权利要求96所述的装置或系统，其中每个光学报告颗粒包括作为该捕获元件的与该分析物核苷酸序列互补的一种或多种核苷酸序列。
98.如权利要求93所述的装置或系统，其中该微处理器、存储器、图像传感器、软件、能够显示图像的屏幕、以及通信接口全部包括在单一便携式设备中。
99.如权利要求98所述的装置或系统，其中该通信能力是无线的。
100.如权利要求99所述的装置或系统，其中该单一便携式设备选自智能电话和平板计算机。
101.如权利要求100所述的装置或系统，其中该单一便携式设备是智能电话。
102.如权利要求81-101中任一项所述的装置或系统，另外包括用于将该智能电话、样品室和光源定位成彼此紧密且稳定地接近的壳体。
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