WO2010057351A1 - 利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法 - Google Patents

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WO2010057351A1
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hard
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deionized water
nitrogen
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胡孔新
张丽萍
平芮巾
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中国检验检疫科学研究院
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y35/00—Methods or apparatus for measurement or analysis of nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/32—AC mode
    • G01Q60/34—Tapping mode

Definitions

  • BSA bovine serum albumin
  • the hard particulate material is a nano gold particulate material having a hard property.
  • the process in the step 2) is specifically: ultrasonic washing in the washing liquid for 30 minutes, washing with deionized water for 2 minutes, ultrasonic washing with deionized water for 15 minutes, taking out nitrogen blowing, and then polymerizing. Lysine was treated for 5 minutes and dried under nitrogen.
  • Figure 3B is a result of AFM scanning of the antibody-labeled nanogold-binding recombinant melitostervirus nucleoprotein E. coli sample in Example 2;
  • the invention adopts atomic force microscopy scanning, uses nano gold as a hard particle material marker, carries out specific antibody coating labeling, and takes the morphology scanning antigen recognition process of microbial surface specific antigen antibody binding as an example, aiming at creating a novel utilization.
  • the atomic force microscope realizes a method for interpreting the signal of the hard marker material and the signal of the biological background material, but the method of the invention is not limited to the nano-gold particle material as a hard marker, and thus the hard marker such as nano metal, nano composite or the like can be utilized.
  • Materials for biological markers such as specific antigens, antibodies, nucleic acids, etc.
  • the antibody was diluted to 0.2 mg/ml with 2 mmo l / L of borate buffer (pH 9. 0).
  • the diluted antibody and other related reagents are operated item by item according to Table 1.
  • the 0D value is plotted on the ordinate, and the amount of protein is plotted on the abscissa.
  • the amount of protein close to the horizontal axis is the minimum protein stability. Adding 20% on this basis is to stabilize the actual amount of nanogold protein.
  • the experiment marks lml
  • the actual amount of protein used in the nanogold solution is 9.6 ⁇ ⁇ .
  • the prepared gold standard microbial sample is pasted on a special 15 inch round patch with double-sided tape.
  • the sample was scanned using the AFM tapping mode.
  • the AFM image is collected in Tapping mode at room temperature and atmospheric conditions by VECCO Mul t imode and NanoScope ll la controller. Use an E-scanner.
  • the probe used was an RSESP probe made of silicon.
  • the length of the cantilever was 115-135 ⁇ ⁇ , the elastic constant k was 20_80 N/m, the resonance frequency was 200-400 kHz, the radius of curvature of the tip was 5-10 nm, and the probe tapping frequency was 1 ⁇ .
  • the measurement mode is constant force mode.
  • the image output signals are height (Aight) and amplitude (Ampl i tude), and phase (Phase) data.
  • the results were analyzed with three graphs. The color change of the phase map with different differences was used as the main basis for interpretation.
  • the height map and amplitude map were used as the auxiliary judgment basis, and the existence of hard nano gold particles was determined according to the pathogen morphology.
  • the antibody-coated nanogold particle pattern is shown in Fig. 2C.
  • the difference from Fig. 2A and Fig. 2B is that the particle shape profile observed under the phase diagram of Fig. 2C is significantly inconsistent with the height map and the shape of the gold particle observed under the amplitude map. The occurrence of disappearance or defect of the nanoparticles is relatively common. Comparing Fig. 2A with Fig. 2B, it can be seen that the gold particle shape of the phase diagram defect of Fig. 2C appears in a high brightness form, while the other positions are mixed with the biological background.
  • the high-brightness region of the defect shows the presence of nano-gold particles, and indirectly indicates the coverage area of the protein through the defect position, that is, It is the main position of the coated protein, and the auxiliary amplitude map, which can further clarify the partially gold nanotopographic features of the surface of the antibody coated gold particles. Therefore, the use of the phase map bright region of the defect can clearly indicate the distinguishing characteristics of the hard nano gold particles from the biological substances such as the background or the coating, thereby further clarifying that the labeled particles can be used as a biomarker for the signal used for immune AFM detection. Set and interpretation characteristics.
  • the signals were collected in three modes: height, amplitude and phase.
  • the obtained image is shown in Figure 3A.
  • the surface of the recombinant E. coli BL-21, which normally expresses measles nucleoprotein, has a regular morphology, the cells are partially concave, and the surface is smooth and flawless. Protrusion, regular particles visible on the surface, no obvious contrast between light and dark on the phase map, generally appearing as a darker soft material image, and highly consistent with the height and amplitude maps, scanning range: 300nm x 300nm;
  • 3B is a picture of recombinant engineered bacteria combined with measles virus nucleoprotein antibody gold. The surface is slightly deformed compared with the surface of normal bacteria.
  • Example 3 The influenza virus A1 strain was prepared by concentrating the chicken embryo culture by ultrafiltration and purifying by sucrose density gradient centrifugation. 50 ⁇ l of virus solution was evenly applied to a polylysine-treated 15 mm circular slide, incubated at 37 °C for 30 min, and the virus solution on the surface of the slide was removed by filter paper, and one of the samples was washed 5 times with lx PBS.
  • lmin / time deionized water washing 3 times, 3min / time, nitrogen drying, as a control.
  • the same sample was added with 50 ⁇ l of nanogold labeled with the corresponding antibody, incubated at 37 °C for 30 min, 1 ⁇ PBS for 5 times, lmin/time, deionized water for 3 times, 3 min/time, and dried with nitrogen.
  • the slide was attached to a 15 mm diameter circular iron piece dedicated to AFM, and the sample was scanned using the AFM tapping mode.
  • the obtained image is shown in Fig. 4A as a picture of influenza virus.
  • the distribution is hooked, spherical, regular in shape, and the diameter is about 80 ⁇ 120nm.
  • the invention provides a series of research methods and results of biomaterials, nano-gold particle materials and combinations and mixtures thereof by atomic force microscopy, and clarifies the difference in hardness and hardness of materials, which can be collected by atomic force microscope height, amplitude and phase.
  • the method for determining the set of signals can distinguish between the background of hard materials and biological materials, especially the image discrimination of background biomass with hard particles coated with biological materials, and thus the hard particulate matter can be used as a biomarker.
  • biomarker detection to analytical tools including scanning probes as signal collection methods including atomic force microscopy greatly expands the biological application range of such instruments, making the application of immunoatomic microscopy technology into the application stage.
  • the hard marker used does not need to be limited to nano gold, but can also be extended to plastic materials with hard properties such as plastic balls, glass spheres, other nano metal particles or composites, and can be extended to applications such as nucleic acid labeling. Therefore, it has a huge science Value and market value.
  • the difference between the hardness of the marking material and the softness of the biological material is utilized, and the combination of the height, the amplitude and the phase of the signal is collected by an atomic force microscope and observed and observed.
  • the present invention is to effectively utilize the special signal reading mode of the atomic force microscope probe, and the series studies the image discrimination between the hard particle marker and the biological background material;
  • Material The method of specifically distinguishing between hard marker materials and biological background materials can be used in practical work for hard marker materials for biological markers such as specific antigens, antibodies, nucleic acids, etc., and then directly observed and detected by atomic force microscopy, thereby
  • the field of study realizes the effective combination of microscopic high-resolution imaging performance and specific detection performance of atomic force microscopy. It can be directly used for marker immunodiagnosis and localization analysis of biological materials such as microorganisms, and bioassays such as hybridization technology markers in other fields. field.

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Description

利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法 技术领域
本发明涉及扫描探针显微镜及相关扫描探针模式传感器生物学应用 的标记检测领域， 尤其是利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法。 背景技术
生物标记技术是目前广泛应用于生物领域的一门技术， 其基本原理 是利用标记物的信号作用结合生物材料特异结合的属性， 进而通过对信 号的阅读间接反映生物结合作用的存在。 由于通常的抗原抗体结合反应， 在反应量不足或抗原为半抗原、 抗体为单价抗体时， 肉眼不易察出。 而 有一些物质即使在含量极微时仍能用某种特殊的理化测试仪器将其检测 出来，典型的如酶标记的免疫检测技术（EIA ) ,免疫荧光标记技术（ IFA )、 反射免疫标记技术（RIA )等， 利用抗原抗体的结合具有高度特异性， 通 过洗涤、 免疫层析等步骤实现游离标记物与结合标记物的分离， 再通过 酶促反应实现底物显色或通过观察荧光信号等反映出抗原抗体结合反应 的存在或结合位置。 标记物质可以结合在抗体或抗原分子上， 它就能追 踪抗原或抗体并与之结合， 通过化学或物理的手段使肉眼不可见的反应 放大、 转化为可见的、 可测知的、 可描记的光、 色、 电、 脉冲等信号。 根据这种类似抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的试验技 术， 称为生物标记技术。 这些技术可用于检测抗原或抗体， 其特异性和 敏感性远远高于常规的血清学技术。 生物领域内已普遍应用的还可以是 核酸、 受体、 配体等生物物质的标记示踪技术。
生物标记技术同样可以结合微观成像技术实现纳米级微观图像与标 记物的定位分析， 免疫电镜技术就是利用纳米金颗粒的电子致密性特点 实现了与背景生物材料的区分， 在透射电子显微镜上实现了纳米级病毒 颗粒等生物物质的免疫分析。 但是， 免疫电镜技术仍然是目前仅有的将 病原高分辨率微观形态学与免疫识别技术同时结合在一起的病原检测方 法。 尽管这是一种需要染色和固定的形态学破坏性检测技术， 且并不适 合于多元化和自动化检测， 但对于不可培养的病毒检测而言， 它仍然保 持着基准的检测方法地位， 核心原因便在于它能够将免疫学的特异性精 确到对单个微生物病原的定位与结合。
由于微观高分辨率形态学检测技术的发展必须依赖于新型高分辨率 仪器的出现， 因而使新的替代技术发展受到一定限制。 随着新型高分辨 率观测工具——原子力显 镜（a tomic force micros copy, AFM)的出现， 由于它具备接近生理条件 （液相）观察样品的优势， 使之成为生物样品 观察的理想工具， 其制样的简便性以及高分辨率三维成像模式， 使之不 需要固定、 染色或其它合成制样模式便可直接以粒径、 粗糙度等量化指 标描述纳米级的病毒颗粒， 成为表面微观研究的重要工具。 作为以探针 扫描釆集信号的一种成像方式， AFM是近十几年来表面成像技术中最重要 的进展之一。 AFM可以在自然状态下检测样品， 因而使样品更接近生理状 态， 既可以观察生物样品局部微区形貌， 还可以检测生物分子间相互作 用力。 对其结构和功能关系的研究和在微生物领域中的研究都具有重要 的意义。
基于 AFM 高分辨率成像能力及其生物学应用优势， 如果结合生物标 记等示踪检测技术， 将成为类似于免疫电镜检测的另一新型替代技术， 实现微观成像与特异性定位分析的结合， 并充分发挥 AFM生物学应用领 域的优势。 发明内容
本发明的目的在于提供一种利用原子力显微镜进行生物标记检测的 方法， 本方法在生物学领域实现了原子力显微镜的微观高分辨率成像性 能与特异性检测性能的有效结合， 可直接用于微生物等生物材料的标记 免疫诊断和定位分析。
本发明利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 具体为： 1 ) 以公知手段制备用于标记的硬质颗粒材料，并对硬质颗粒材料进 行抗体生物材料标记， 获得硬质标记材料颗粒；
2 )将样品载体玻片用洗涤液浸泡清洗， 然后以超声波洗涤后， 去离 子水洗净， 再经多聚赖氨酸进行表面处理；
3 )将生物样品材料直接滴加在样品载体玻片表面并均勾涂开，湿盒 中孵育后， 用去离子水洗涤， 然后用氮气吹干；
4 ) 滴加 BSA (牛血清白蛋白）溶液覆盖样品载体玻片表面， 湿盒中 孵育后， 用去离子水洗涤， 然后用氮气吹干；
5 ) 滴加硬质标记材料颗粒溶液至覆盖样品载体玻片表面，湿盒中孵 育后， 用去离子水洗涤， 然后用氮气吹干；
6 )将样品载体玻片固定到原子力显微镜上设置的样品贴片上；
7 )在室温、大气环境条件下利用 AFM的探针的轻敲模式对样品进行 扫描；并同时釆集硬质标记材料颗粒的高度、振幅和相位的数据；
8 ) 综合比较高度图、振幅图和相位图的形貌一致性， 以有差异的相 位图颜色变化为主要判读依据，以高度图和振幅图作为辅助判定 依据， 结合生物检测对象的形貌确定硬质标记材料颗粒的存在；
9 )通过确定硬质标记材料颗粒后进一步确定被标记物存在。
进一步， 所述硬质颗粒材料为具有硬质属性的纳米金颗粒材料。 进一步， 所述步骤 2 ) 中的处理过程具体为： 在洗涤液中超声洗涤 30分钟， 再用去离子水流水冲洗 2分钟， 去离子水超声洗涤 15分钟， 取 出氮气吹干， 再用多聚赖氨酸处理 5分钟， 氮气吹干。
进一步， 步骤 2 )中所述洗涤液包括石克酸 3. 5%、 AES 12%、 LD-650 12% , 氯化钠 1. 2-1. 5% , NaOH调节至 PH7- 8。
进一步， 所述步骤 3 )中的处理过程具体为： 将涂有生物样品材料的 样品载体玻片在湿盒中、 37 °C下孵育 1 小时后， 用去离子水洗涤 3次， 每次 5分钟， 最后用氮气吹干。
进一步， 所述步骤 4 ) 中的处理过程具体为： 滴加 1 0%的 BSA溶液覆 盖样品载体玻片表面， 然后在湿盒中、 37 °C下孵育 1 小时， 去离子水洗 涤 3次， 每次 5分钟， 最后用氮气吹干。
进一步， 所述步骤 5 )中的处理过程具体为： 滴加硬质标记材料颗粒 溶液至覆盖样品载体玻片的表面， 然后在湿盒中、 37 °C下孵育 1 小时， 去离子水洗涤 3次， 每次 5分钟， 最后用氮气吹干。
进一步， 所述步骤 8 ) 中， 利用相位图亮度形貌数据特征结合高度、 振幅形貌数据进行组合判定。
进一步， 在步骤 7 )所述 AFM轻敲模式中所用的探针为由硅制成的 RTESP探针， 其悬臂的长度为 1 15-1 35 μ ηι, 弹性常数 k为 20_80N/m , 共 振频率为 200-400kHz , 针尖曲率半径为 5-1 0nm, 探针敲击频率为 1 Ηζ。
本发明方法中对生物样品载体应用洗涤液洗涤和多聚赖氨酸处理， 所得载体吸附性好， 表面平整， 适用于大多数 AFM生物样品样片的制备， 且使用的试剂常见、 价格便宜， 处理简单， 不需用浓硫酸、 强碱等有强 腐蚀性的试剂分段定时处理， 使整体时间大大缩短。 本发明使用 AFM轻 敲模式扫描软硬度不同的生物材料和硬质标记物， 通过三种信号同时釆 集的分析方式， 主要以相位图反映标记颗粒与生物材料软硬度的不同， 并结合高度图和振幅图形貌特征来反映生物抗原抗体等生物结合作用的 存在， 进而进行定位检测分析。 附图说明
图 1为最适蛋白质测定曲线；
图 2A为本发明实施例 1多聚赖氨酸处理样品玻片的 AFM扫描结果； 图 2B为利用多聚赖氨酸处理的样品玻片制备纳米金样片的 AFM扫描 结果；
图 2C为多聚赖氨酸处理的样品玻片制备的被抗体包被后的纳米金样 片的 AFM扫描结果；
图 3A为本发明实施例 1中制备的重组表达麻疹病毒核蛋白的大肠杆 菌空白对照样片的 AFM扫描结果；
图 3B为实施例 2中抗体标记纳米金结合重组表达麻疹病毒核蛋白大 肠杆菌样片的 AFM扫描结果；
图 4A为本发明实施例 3中制备的流感病毒空白对照样片的 AFM扫描 结果；
图 4B为实施例 3中抗体标记纳米金结合流感病毒样片的 AFM扫描结 果。 具体实施方式
本发明应用原子力显微镜扫描， 以纳米金作为硬质颗粒材料标记物， 进行特异抗体包被标记， 并以微生物表面特异抗原抗体结合的形貌扫描 识别过程为例， 目的在于创建一种新型的利用原子力显微镜实现对硬质 标记材料信号和生物背景材料信号特异区分的解读方法， 但本发明方法 并不限于纳米金颗粒材料作为硬质标记物， 进而可以利用纳米金属、 纳 米合成物等硬质标记材料进行特异性抗原、 抗体、 核酸等生物学标记， 再利用原子力显微镜进行直接观察检测， 从而实现原子力显微镜的微观 高分辨率成像性能与特异性检测性能在生物学领域的有效结合， 扩展原 子力显微镜的生物学应用范围， 直接用于微生物等生物材料的标记免疫 诊断或定位分析， 以及其它领域内相关的杂交技术标记等生物检测领域。 本发明的方法步骤如下：
一、 纳米金的制备
1.煮金
三角烧杯用前用硫酸泡 24h, 取出水洗 10遍， 蒸馏水洗 8遍， 然后 双蒸水洗 6遍， 煮金用的三角烧杯及转子为纳米金专用。 洗好的三角烧 杯取 100ml 双蒸水， 先用微波炉煮沸， 然后放在加热磁力搅拌机上， 调 整转子， 不要有液体溅出，旋转平稳，加 1ml氯金酸， 1. 5ml柠檬酸二钠， 其中先加氯金酸，然后加柠檬酸二钠， 1. 5ml要一起加入。观察颜色变化， 无色一黑一酒红，到颜色稳定为酒红色，冷却，装在棕色瓶子里 4 °C保存。
2.调节 PH值
用小三角烧瓶（纳米金专用）取 15ml制备好的纳米金溶液，用 lmo l /L 1 2( 03调节 PH值， 将纳米金溶液 PH值调节到 8. 5 ~ 9. 0之间。
3.最适蛋白量的测定
将抗体用 2mmo l /L的硼酸盐緩冲液 ( PH9. 0 )稀释至 0. 2mg/ml。 稀释 后的抗体与其他有关试剂按表 1逐项操作。
表 1 分光光度计测定纳米金最小蛋白量计量
试管号
试剂 ·
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对 /'J眧 金子 Cml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 缓冲液 (μΐ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 抗体 (μΐ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
摇匀、 放置 2min
10%NaCl(^) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
摇匀， 放置 lOmin观察
以 0D值为纵坐标， 蛋白质用量为横坐标做一曲线， 如图 1所示， 取 曲线与横轴接近点的蛋白用量即为最小蛋白质稳定量。 在此基础上再加 20%即为稳定纳米金蛋白质实际用量。 根据图 1所得， 本次实验标记 lml 纳米金溶液所用蛋白质实际用量为 9.6 μ§。
4.标金
lml纳米金加测得的最适蛋白量， 混合， 静置 5min。
5.洗金
加 10% BSA (牛血清白蛋白） 混合摇匀， 放置 lOmin, 在 4°C下以 12000r/min 离心 30min; 弃上清， 加重悬液 lml, 把沉淀的纳米金弹开 使混匀， 再在 4°C下以 12000rpm/min离心 30min; 弃上清， 加重悬液 500 μ 1, 把沉淀的纳米金弹开使混匀， 在 4°C下以 1000r/min 离心 10min。 用 0.2 μηι滤器过滤除去聚集物。 即可得到标记好的纳米金。
二、 载体玻片制备
将直径 15mm圓形样品载体玻片放入自制的洗涤液中超声洗涤 30min, 该洗涤液包括石克酸 3.5%、 AES 12%、 LD - 65012%, 氯化钠 1.2-1.5%, NaOH 调节至 PH7-8。 该洗涤液也可为生活中所使用的常规洗涤液， 如洗涤剂、 洗衣粉等； 再用去离子水流水冲洗 2min, 50ml去离子水超声洗涤 15min, 取出氮气吹干， 再用多聚赖氨酸处理 5min, 氮气吹干。 在取出干燥时保 证玻片无粘贴现象； 多聚赖氨酸处理玻片时使玻片与溶液完全接触， 以 保证玻片表面处理均匀。
三、 样品载体玻片制备
纳米金颗粒样品、 蛋白包被的纳米金颗粒样品或微生物样品， 分别 用 1 X PBS稀释， 取 50 μ 1样品液均匀涂于经多聚赖氨酸处理的样品载体 玻片上， 37°C恒温孵育 1小时， 去离子水洗涤 3次， 每次 5分钟， 用氮 气吹干； 滴加 10%的 BSA (牛血清白蛋白）溶液覆盖样品表面， 然后在湿 盒中、 37°C下孵育 1 小时， 去离子水洗涤 3次， 每次 5分钟； 力。 50μ 1 制备的标记好相应抗体的纳米金颗粒覆盖样品载体玻片的表面， 37°C恒 温孵育 1小时， l x PBS洗 5次， lmin/次， 去离子水洗 3次， 5min/次， 氮气吹干。 加纳米金时动作轻柔， 液体尽量完全覆盖微生物样品表面， 但加液的枪头不能碰到微生物样品； 微生物样片制备和原子力显微镜扫 描过程中， 严格保证环境无尘， 移动样片时镊子不能接触有样品的玻片 表面， 样片扫描完装入培养亚， 封口膜封好， 4°C保存。
四、 原子力显微镜扫描
将制好的金标微生物样片用双面胶粘贴到特制的 15匪圓形贴片上， 用 AFM的轻敲模式对样品进行扫描。 AFM图像通过 VECCO Mul t imode和 NanoScope l l la控制器， 在室温、 大气条件下以 Tapping模式釆集。 选用 E 型扫描器。 所用探针为由硅制成的 RTESP探针， 悬臂的长度为 115-135 μ ηι, 弹性常数 k为 20_80N/m, 共振频率为 200_400kHz , 针尖曲率半径 为 5_10nm, 探针敲击频率为 1Ηζ。 测量模式为恒力模式。 图像输出信号 为高度（He ight)与振幅（Ampl i tude ), 相位（Phase)数据。 结果分析釆用 三图对照， 以有差异的相位图颜色变化为主要判读依据， 以高度图和振 幅图作为辅助判定依据， 结合病原形态确定硬质纳米金颗粒的存在。 实施例 1
将直径为 15匪的圓形样品载体玻片放入自制的洗涤液（包括硫酸 3%、 AES3%、 氢氧化钠 0. 4%、 氯化钠 1. 2-1. 5% ), 超声洗涤 l Omin, 取出氮气 吹干，多聚赖氨酸处理 5min, 自然干燥。将玻片贴于 AFM专用的直径 15mm 的圓形贴片上， 用 AFM的轻敲模式对样品进行扫描。 所得图像见图 U: 样片背景均匀， 起伏小于 lnm, 表面有孔状结构， 易于样品以物理吸附的 方式固定， 各区软硬度适中。
取煮好的纳米金溶液 50 μ 1 , 均匀涂于多聚赖氨酸处理的玻片表面， 37 °C恒温孵育 30min, 1 PBS洗 5次、 lmin/次， 去离子水洗 3次、 3min/ 次， 氮气吹干。 将玻片贴于 AFM专用的直径 15mm的圓形贴片上， 用 AFM 的轻敲模式对样品进行扫描， 获得扫描图见图 2B。 未标记金颗粒形状较 规则， 多圓形， 直径 25讓左右， 高度图、 振幅图、 相位图综合观察， 可 见三种信号釆集图金颗粒形貌轮廓及大小表现出高度一致， 相位图金颗 粒与背景亮暗对比明显。 相位图亮暗对比反应样品表面的软硬度、 粘滞 度等特性， 对于金颗粒来说其硬度为其主要特性， 因此相位图中亮代表 硬， 暗代表软， 亮暗对比明显表示金颗粒的硬度与周围背景有较大差别。
抗体包被的纳米金颗粒图见图 2C, 与图 2A和图 2B明显不同的是， 图 2C相位图下观察到的颗粒形貌轮廓与高度图、 振幅图下观察到金颗粒 形状出现明显不一致， 纳米颗粒出现消失或缺损的情况比较多见， 对比 图 2A和图 2B, 可以发现， 图 2C相位图缺损的金颗粒形状以高亮度形式 出现， 而其它位置混同于生物背景物中。 因此缺损的高亮度区域显示出 纳米金颗粒的存在， 并通过缺损位置间接指示出蛋白的覆盖区域， 也即 是包被蛋白的主要位置， 辅助振幅图， 可以进一步明确抗体包被金颗粒 表面所形成的部分凹陷的纳米金形貌学特征。 因此， 利用缺损的相位图 亮区可以明确指示硬质纳米金颗粒与背景或包被物等生物物质的区分特 征， 进而明确了该标记颗粒可以作为生物标记物用于免疫 AFM检测使用 的信号釆集及判读特点。 实施例 2
克隆并可诱导表达有麻疹病毒核蛋白的工程菌种 BL-21 ( BL-21-30a-MVn菌株， 来自中国检验检疫科学研究院外来病传染室）， 用枪头挑取 LB固体培养基上的单个菌落， 移入 LB液体培养基中， 在恒 温摇床中（37 °C 265 rad/min)振荡过夜；取 lm l 菌液至 1. 5ml EP 管中， 3000rpm离心 l Omin , 弃上清， 再用 lml 1 PBS悬起菌沉淀后， 离心， 3000rpm, l Omin , 按以上步骤洗三次， 最后将洗涤的菌体细胞悬浮于 500 μ 1 1 X PBS中。 各取 50 μ 1菌液均匀涂于两张经多聚赖氨酸处理的 15mm 圓形玻片上， 37 °C恒温孵育 30min , 用滤纸吸走玻片表面的菌液， 其中一 张样片 l x PBS洗 5次， lmin/次， 去离子水洗 3次， 3mi n/次， 氮气吹干， 作为对照。 另一样片加 50 μ ΐ 制备的标记好麻疹病毒核蛋白抗体的纳米 金颗粒， 37 °C恒温孵育 30min , 1 PBS洗 5次， lmin/次， 去离子水洗 3 次， 3min/次， 氮气吹干。 将玻片贴于 AFM专用的直径 1 5mm的圓形铁片 上， 用 AFM的轻敲模式对样品进行扫描。
以高度、 振幅和相位三种模式釆集信号， 所得图像见图 3A为正常表 达麻疹核蛋白的重组大肠杆菌 BL-21 表面微区图片， 形态规则， 菌体部 分凹陷， 表面平滑， 无嚢状突起， 表面可见规则颗粒， 相位图上无明显 的亮暗对比， 普遍表现为较暗的软材质图像， 并与高度图和振幅图表现 出形貌轮廓高度一致， 扫描范围： 300nm x 300nm; 图 3B为麻疹病毒核蛋 白抗体标金结合的的重组工程菌的图片， 表面较正常菌体表面轻微变形， 有不规则起伏， 可见分层或凹陷， 相位图上可观察到形状不规则， 大小 不一的亮点， 且亮点有明显的聚集区， 结合振幅图和高度图， 则显示明 显异物颗粒沉积的形貌特征， 从而可以判定标记物颗粒的存在。 实施例 3 流感病毒 A1株为鸡胚培养物经超滤浓缩后经蔗糖密度梯度离心纯化 制备。 取 50 μ 1病毒液均匀涂于经多聚赖氨酸处理的 15mm圓形玻片上， 37 °C恒温孵育 30min, 用滤纸吸走玻片表面的病毒液， 其中一张样片 l x PBS洗 5次， lmin/次， 去离子水洗 3次， 3min/次， 氮气吹干，作为对照。 另一样片加 50 μ 1制备的标记好相应抗体的纳米金， 37 °C恒温孵育 30min, 1 χ PBS洗 5次， lmin/次， 去离子水洗 3次， 3min/次， 氮气吹干。 将玻 片贴于 AFM专用的直径 15mm的圓形铁片上， 用 AFM的轻敲模式对样品进 行扫描。 所得图像见图 4A为流感病毒图片， 分布均勾， 呈球状， 形状规 则， 直径约 80 ~ 120nm, 相位图上无明显的亮暗对比， 并与高度图和振幅 图表现出形貌轮廓高度一致， 扫描范围： 600nm x 600nm; 图 4B为标金 流感病毒抗体结合的流感病毒扫描图片， 与未结合标金抗体的对照图 4A 相比较， 病毒颗粒形态同样清晰可见； 结合高度图和振幅图， 部分病毒 表面发生了局部内陷， 在相位图上可见该内陷部位出现明显的亮度反差， 显示为标记的纳米金颗粒结合位置， 扫描范围： 600nm x 600nm, 从而反 映出抗体包被纳米金颗粒在病毒表面的结合位置。
本发明通过提供原子力显微镜对生物材料、 纳米金颗粒材料以及二 者结合物、 混合物等系列研究方法及结果， 阐明了利用材料的软硬度差 异属性， 可以通过原子力显微镜高度、 振幅以及相位釆集信号的集合判 定方法， 得以区分硬质材料与生物材料背景， 尤其是包被有生物物质的 硬质颗粒对于背景生物物质的图像区分及方法， 进而使该类硬质颗粒物 质可以作为生物标记物， 并应用于包括原子力显微镜在内的以扫描探针 为信号釆集方式的分析工具的生物标记物检测， 极大的扩展了该类仪器 的生物学应用范围， 使得免疫原子力显微镜技术进入应用阶段， 所用硬 质标记物并不需要局限于纳米金， 还可推广至塑料球、 玻璃球、 其他纳 米金属颗粒或合成物等具有硬质属性的颗粒材料， 并可推广至核酸标记 等应用领域， 因而具有巨大的科学应用价值和市场应用价值。
本发明的信号釆集模式则是利用了标记材料的硬质性与生物材料的 软质性的差异， 通过原子力显微镜进行高度、 振幅和相位等信号组合釆 集并成像观测， 进行区分。 区别于传统的生物标记信号釆集模式， 本发 明在于有效利用了原子力显微镜探针的特殊信号读取方式， 系列研究了 硬质颗粒标记物与生物背景材料的图像区分； 基于应用扫描探针对于材 而对硬质标记材料和生物背景材料进行特异区分的方法， 实际工作中可 用于硬质标记材料进行特异性抗原、 抗体、 核酸等生物学标记， 再利用 原子力显微镜进行直接观察检测， 从而在生物学领域实现了原子力显微 镜的微观高分辨率成像性能与特异性检测性能的有效结合， 可直接用于 微生物等生物材料的标记免疫诊断和定位分析， 以及其它领域内相关的 杂交技术标记等生物检测领域。

Claims

权 利 要求 、 利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 具体为：
1 ) 以公知手段制备用于标记的硬质颗粒材料， 并对硬质颗粒材料 进行抗体生物材料标记， 获得硬质标记材料颗粒；
2 )将样品载体玻片用洗涤液浸泡清洗， 然后以超声波洗涤后， 去离 子水洗净， 再经多聚赖氨酸进行表面处理；
3 )将生物样品材料直接滴加在样品载体玻片表面并均勾涂开， 湿盒 中孵育后， 用去离子水洗涤， 然后用氮气吹干；
4 ) 滴加 BSA (牛血清白蛋白）溶液覆盖样品载体玻片表面， 湿盒中孵 育后， 用去离子水洗涤， 然后用氮气吹干；
5 ) 滴加硬质标记材料颗粒溶液至覆盖样品载体玻片表面， 湿盒中孵 育后， 用去离子水洗涤， 然后用氮气吹干；
6 )将样品载体玻片固定到原子力显微镜上设置的样品贴片上；
7 )在室温、 大气环境条件下利用 AFM的探针的轻敲模式对样品进行 扫描； 并同时釆集硬质标记材料颗粒的高度、 振幅和相位的数据；
8 ) 综合比较高度图、 振幅图和相位图的形貌一致性， 以有差异的相 位图颜色变化为主要判读依据， 以高度图和振幅图作为辅助判定 依据， 结合生物检测对象的形貌确定硬质标记材料颗粒的存在；
9 )通过确定硬质标记材料颗粒后进一步确定被标记物存在。
2、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 所述硬质颗粒材料为具有硬质属性的纳米金颗粒材料。
3、 如权力要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 所述步骤 2 )中的处理过程具体为： 在洗涤液中超声洗 涤 30分钟， 再用去离子水流水冲洗 1分钟， 去离子水超声洗涤 15 分钟， 取出氮气吹干， 再用多聚赖氨酸处理 5分钟， 氮气吹干。
4、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 步骤 2 )中所述洗涤液包括^ 酸 3. 5%、 AES12%、 LD-650 12% , 氯化钠 1. 2-1. 5% , NaOH调节至 PH7- 8。
5、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 所述步骤 3 )中的处理过程具体为： 将涂有生物样品材 料的样品载体玻片在湿盒中、 37 °C下孵育 1 小时后， 用去离子水洗 涤 3次， 每次 5分钟， 最后用氮气吹干。
、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 所述步骤 4 ) 中的处理过程具体为： 滴加 10%的 BSA溶 液覆盖样品载体玻片表面， 然后在湿盒中、 37 °C下孵育 1 小时， 去 离子水洗涤 3次， 每次 5分钟， 最后用氮气吹干。
、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 所述步骤 5 )中的处理过程具体为： 滴加硬质标记材料 颗粒溶液至覆盖样品载体玻片的表面， 然后在湿盒中、 37 °C下孵育 1 小时， 去离子水洗涤 3次， 每次 5分钟， 最后用氮气吹干。
、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 所述步骤 8 )中， 利用相位图亮度形貌数据特征结合高 度、 振幅形貌数据进行组合判定。
、 如权利要求 1 所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法， 其特征在于， 在步骤 7 )所述 AFM轻敲模式中所用的探针为由硅制成 的 RTESP探针，其悬臂的长度为 115-1 35 μ ηι,弹性常数 k为 20_80N/m, 共振频率为 200-400kHz , 针尖曲率半径为 5-10nm, 探针敲击频率为 1Ηζ。
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