CN113866323B - 一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,属于半导体生物传感器件技术领域;该方法是先采用CoFe2O4纳米流体与色谱纸进行复合掺杂得到磁性试纸;将AuNPs表面硫醇化得到CYS‑AuNPs;将CYS‑AuNPs均匀掺杂于上述磁性试纸得到表面硫醇化的磁性试纸;采用EDC/NHS活化骨关节炎抗体溶液,通过共价键合的方式将抗体分子修饰于磁性试纸表面;采用牛血清白蛋白对磁性试纸非特异性位点封闭处理,得到骨关节炎标志物检测试纸;本发明将具有优异电磁特性的CoFe2O4纳米粒子和优异力学性能的纸张相结合,用于检测骨关节炎标志物,具有微型便携、快速、低成本、高灵敏等优点。
Description
技术领域
本发明属于半导体生物传感器件技术领域,具体涉及一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)属于风湿性疾病,是一种退化性并且不可逆的疾病,是世界上最常见的关节疾病。目前OA的诊断方法主要是:X射线成像、声发射分析、磁共振成像等,但是上述手段大都需要昂贵的大型精密仪器,并且无法在OA早期进行有效诊断,约数年后逐渐出现关节间隙狭窄,表明关节软骨已开始变薄,已经进入了中后期。所以现在需要一种在OA早期就能进行诊断的方法。
近年来,一些学者提出利用生物标志物来预测骨关节炎的发生、发展,如基质金属蛋白酶3(MMP-3),OA患者关节液中MMP-3含量高于正常人。MMP-3的检测基本停留在实验阶段,还没有大规模应用于临床,检测手段一般采用酶联免疫吸附试验(ELISA 法)对血清、关节液及尿液中不同MMP-3含量进行测定,而ELISA 法检测时间较长且操作过程复杂。因此,亟需一种低成本、高灵敏、便携快速的检测方法。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足,提出一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,是一种基于磁弹性试纸的骨关节炎标志物检测手段,对于骨关节炎标志物的检测具有良好的便携性和特异性。
为了达到上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的:
一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,包括以下步骤:
a)将Whatman色谱纸浸泡在CoFe2O4纳米流体中至完全饱和,将浸泡后的色谱纸脱水干燥,得到磁性试纸。
b)按1:9体积比混合巯基乙胺溶液与金纳米粒子AuNPs溶液,并室温孵育,得到硫醇化的AuNPs,即CYS-AuNPs。
c)将磁性试纸浸入CYS-AuNPs溶液1h,干燥得到表面硫醇化的磁性试纸CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs。
d)将骨关节炎抗体溶液与含有4mg/ml EDC- 4mg/ml NHS的溶液在室温下混合,将羧基活化得到NHS酯,得到活化的抗体溶液。
e)将CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs薄膜浸入活化的抗体溶液1h,之后取出冲洗,干燥,得到抗体修饰的磁性试纸CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs/antibody。
f)采用牛血清白蛋白BSA对抗体修饰磁性试纸的非特异性位点进封闭处理,之后冲洗,干燥,得到骨关节炎标志物检测试纸。
优选的,CoFe2O4纳米流体的制备方法为:将CoFe2O4纳米粒子和去离子水混合,利用超声粉碎,充分分散20-30min。
更优的,超声粉碎的周期为4-5s,脉冲宽度为2-3s,幅度为40-50%。
优选的,CoFe2O4纳米流体的浓度为35 wt%。
优选的,步骤a脱水干燥的方法是将浸泡后的色谱纸在 70 ℃电热板上干燥 10min,得到的磁性试纸储存于恒温恒湿的环境中备用。
优选的,步骤b中室温孵育的时间为11-13h。
优选的,步骤b中金纳米粒子AuNPs溶液的制备方法是:向 100 mL去离子水中加入250 nL,0.1 M 氯金酸溶液,加热至沸腾;然后迅速将 600 nL,0.25 M 柠檬酸钠溶液加入到沸腾溶液中,继续加热 30 min,所得溶液以12000 rpm的转速离心 15 min,洗涤 3 次,得到AuNPs;最后将 AuNPs重新分散在去离子水中,并在4℃下保存。
优选的,步骤d中,所述室温下混合的时间为30min。
优选的,步骤f中,封闭处理的时间为30min。
优选的,步骤f中,封闭处理后使用PBS冲洗。
本发明相对于现有技术所产生的有益效果为:
本发明基于纸张良好的力学性能、三维纤维结构、生物相容性和生物降解性、造价低廉以及易于加工等诸多优势,采用磁致伸缩性能良好的半导体材料CoFe2O4纳米粒子进行复合掺杂,制备新型纸基磁弹性生物传感器,用于检测骨关节炎标志物,它具有微型便携、快速、低成本、灵敏度高等优点。
与传统检测方法相比,本发明的制备方法简单易行、可控性好、稳定性强、可重复性良好,采用4mm×4mm的微型尺寸,具有便携和家庭使用的小型化功能,为实现微型化、低成本、批量化生产提供了可能,为骨关节炎标志物检测提供新方法,可实现对骨关节炎的早期诊断。
附图说明
图1为实施例所述的骨关节炎标志物检测试纸的制备方法流程图。
图2为实施例所述的不同等级OA的相对阻抗变化的拟合曲线。
图3为实施例所述的骨关节炎标志物检测试纸对不同待测物检测的相对阻抗△Z柱形图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,结合实施例和附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案,但保护范围不被此限制。
一种新型骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,选择基本材料:基质金属蛋白酶3(MMP-3)抗体、0-Ⅳ级关节炎患者关节液、四氧二铁酸钴(CoFe2O4)纳米粒子(粒径20~30nm)、Whatman色谱纸、巯基乙胺溶液、AuNPs溶液。
包括下述步骤:
1)把Whatman色谱纸剪成4mm*4mm大小;
2)用电子秤称取3g CoFe2O4纳米粒子、用10mL量筒量取量取9mL去离子水,将CoFe2O4纳米粒子和去离子水放入试剂瓶中,利用超声粉碎机进行粉碎,设置其周期为4s,脉冲宽度为2s,幅度为40%,充分分散20min,得到均匀的浓度为35 wt%的CoFe2O4纳米流体。
3)将裁剪好的4mm*4mm色谱纸浸泡在均匀的CoFe2O4纳米流体中1个小时直至完全饱和,将浸泡后的色谱纸在70°C的电热板上脱水10 min,以达到干燥效果,得到磁性试纸(CoFe2O4/paper),并将其储存于恒温恒湿的环境中。
4)制备金纳米粒子 (AuNPs):向 100 mL去离子水中加入 250 nL,0.1 M 氯金酸溶液,加热至沸腾。然后迅速将 600 nL,0.25 M 柠檬酸钠溶液加入到沸腾溶液中, 溶液在短时间内由淡黄色变为深红色,继续加热 30 min,保证完全还原。所得溶液以12000 rpm的转速离心 15 min,洗涤 3 次,得到AuNPs。最后将 AuNPs重新分散在去离子水中,并在4℃下保存。
5)取1mL巯基乙胺溶液与9mL AuNPs溶液按1:9体积比混合,并室温孵育12h,得到硫醇化的AuNPs (CYS-AuNPs)。
6)将磁性试纸(CoFe2O4/paper)水平浸入CYS-AuNPs溶液1 h,干燥,得到表面硫醇化的磁性试纸(CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs)。
7)将MMP-3抗体溶液与含有4mg/ml EDC- 4mg/ml NHS的溶液在室温下混合30min,将羧基活化得到NHS酯,得到活化的MMP-3抗体溶液。
8)将CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs薄膜浸入活化的MMP-3抗体溶液1h,之后取出用PBS冲洗,干燥,得到抗体修饰的磁性试纸(CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs/antibody)。
9)采用0.1%牛血清白蛋白(BSA)对非特异性位点进行30分钟封闭处理,之后用PBS冲洗,干燥,即可得到检测试纸。
1、工作原理:利用抗体和抗原在化学结构和空间构型上呈现的互补关系,可使抗原表位与抗体超变区中的抗原结合位点进行结合,即检测试纸表面抗体与抗原的特异性结合,从而导致表面应力的改变。基于铁磁材料的磁弹性效应,铁磁材料在应力影响下形成磁弹性能,使磁化强度矢量重新取向,从而改变应力方向的磁导率。磁导率的变化引起的铁磁材料磁阻的变化,进而引起阻抗的变化,这样就可以将应力的变化转变为阻抗的变化,实现对应力变化的检测。
2、表面功能化原理:金纳米颗粒(AuNPs)具有良好的生物相容性,采用巯基乙胺处理AuNPs颗粒,一端的巯基与AuNPs形成金-硫键,末端的氨基共价键合MMP-3抗体分子的羧基,从而完成表面功能化。
MMP-3检测实验:
阻抗测试结果:利用检测试纸分别对 0-Ⅳ级OA患者关节液进行检测,记录检测关节液前后试纸阻抗的变化量△Z,拟合结果如图2所示,拟合曲线的方程可以表示为y=23.8+6.7*x,可以看到,检测MMP-3之后试纸的△Z都大于0,说明了0-Ⅳ级OA患者关节液里都存在MMP-3,并且随着OA等级的增加,MMP-3浓度增大,△Z也随之增大,证明了利用该试纸检测骨关节炎标志物MMP-3的可行性。
特异性测试结果:如图3所示为特异性测试结果,利用试纸检测不同待测物得到阻抗变化量△Z,可以看出试纸对Ⅳ级OA患者关节液的响应最显著,对0级OA患者关节液的响应次之,对其他几种待测物几乎没有响应,证明了该检测试纸的特异性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施方式仅限于此,对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的前提下,还可以做出若干简单的推演或替换,都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。
Claims (10)
1.一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)将Whatman色谱纸浸泡在CoFe2O4纳米流体中至完全饱和,将浸泡后的色谱纸脱水干燥,得到磁性试纸;
b)按1:9体积比混合巯基乙胺溶液与金纳米粒子AuNPs溶液,并室温孵育,得到硫醇化的AuNPs,即CYS-AuNPs;
c)将磁性试纸浸入CYS-AuNPs溶液1h,干燥得到表面硫醇化的磁性试纸CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs;
d)将骨关节炎MMP-3抗体溶液与含有4mg/ml EDC和4mg/ml NHS的溶液在室温下混合,将羧基活化得到NHS酯,得到活化的MMP-3抗体溶液;
e)将CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs薄膜浸入活化的MMP-3抗体溶液1h,之后取出冲洗,干燥,得到抗体修饰的磁性试纸CoFe2O4/paper/CYS-AuNPs/antibody;
f)采用牛血清白蛋白BSA对抗体修饰磁性试纸的非特异性位点进封闭处理,之后冲洗,干燥,得到骨关节炎标志物检测试纸。
2.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,CoFe2O4纳米流体的制备方法为:将CoFe2O4纳米粒子和去离子水混合,利用超声粉碎,充分分散20-30min。
3.根据权利要求2所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,超声粉碎的周期为4-5s,脉冲宽度为2-3s,幅度为40-50%。
4.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,CoFe2O4纳米流体的浓度为35 wt%。
5.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,步骤a脱水干燥的方法是将浸泡后的色谱纸在 70 ℃电热板上干燥 10 min,得到的磁性试纸储存于恒温恒湿的环境中备用。
6.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,步骤b中室温孵育的时间为11-13h。
7.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,步骤b中金纳米粒子AuNPs溶液的制备方法是:向 100 mL去离子水中加入 250 nL,0.1 M 氯金酸溶液,加热至沸腾;然后迅速将 600 nL,0.25 M 柠檬酸钠溶液加入到沸腾溶液中,继续加热 30 min,所得溶液以12000 rpm的转速离心 15 min,洗涤 3 次,得到AuNPs;最后将AuNPs重新分散在去离子水中,并在4℃下保存。
8.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,步骤d中,所述室温下混合的时间为30min。
9.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,步骤f中,封闭处理的时间为30min。
10.根据权利要求1所述的一种骨关节炎标志物检测试纸的制备方法,其特征在于,步骤f中,封闭处理后使用PBS冲洗。
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