JP4213577B2 - グラフト重合鎖固定基材、グラフト重合鎖固定基材の製造方法及び測定方法 - Google Patents
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Description
そこで現在では、フォトリソグラフィ技術により Si3N4、SiO2、Si などを加工した薄板カンチレバーが製作され、その先端部に探針が設けられている(非特許文献4,5,6)。AFMカンチレバーは、微視的な力である原子間力(10?9 N 程度)を検知するために、力に対する変位を大きくし感度を上げるためバネ定数が小さいことが求められる。また、床振動など低周波ノイズを抑制し、走査速度を向上させるために、共振周波数が高いことが望ましい。
微小変位検出法と測定モードには、小型で安定な半導体レーザーが用いられ、レーザー光の反射を利用する変位検出方式が実用化されている。とりわけ、光てこ方式が一般的であり、この方式では集光したレーザー光をカンチレバーの先端部に当て、カンチレバーのたわみによるレーザー光束の反射角度変化を、4分割フォトダイオード検出器や半導体位置センサーに入射する光の相対強度の変化として検出する方式(DC検出方式)である(非特許文献7、8)。
また、以下の点にも特徴を有する。
(1)イニファターが光イニファターまたは熱イニファターであること。
(2)イニファターが一般式[I]:
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]:
で表されるチウラムジスルフィドであること。
(3)所定の官能基に生体高分子を固定していること。
(4)生体高分子がタンパク質であること。
(5)基材がプローブ顕微鏡用プローブまたはガラス基板であること。
また、以下の点にも特徴を有する。
(6)イニファターが光イニファターまたは熱イニファターであること。
(7)イニファターが、一般式[I]:
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]:
で表されるチウラムジスルフィドであること。
(8)グラフト重合鎖がシランカップリング結合を介して基材に固定すること。
(9)請求項7ないし10項のいずれか1項に記載のグラフト重合鎖固定基材の製造方法において得られたグラフト重合鎖固定基材に対して、更に生体高分子を固定化すること。
(10)生体高分子がタンパク質であること。
さらに以下の点にも特徴を有する。
(11)生体高分子がタンパク質であること。
(12)生体高分子の力学特性および分子間の相互作用力特性を原子間力顕微鏡で測定すること。
(13)請求項13または14に記載の測定方法において、前記生体高分子の力学特性および分子間の相互作用力特性を原子間力顕微鏡で測定すること。
さらに、以下の点にも特徴を有する。
(14)生体高分子がタンパク質であること。
(15)基材がナノ・マイクロスケールプローブまたは被検体としての基板であること。
(16)生体高分子力学特性および分子間の相互作用力特性を測定すること。
(17)請求項13ないし19のいずれか1項に記載の測定方法において前記生体高分子の活性および運動自由度が保持されていること。
この発明に係る生体高分子固定可能なグラフト重合体は、生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターが表面グラフト重合鎖の自由末端に配置されていることを特徴とする。このグラフト重合体においては、グラフト重合鎖の固定端はシランカップリング結合等を介して基材に固定化されている。
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]:
で表されるチウラムジスルフィドが挙げられる。
上記の構成からなるこの発明の生体高分子固定可能なグラフト重合体は、まず、シランカップリング剤等で処理して基材にイニファターを固定可能な化学官能基を導入した後、上記イニファターをそのシランカップリング剤分子との結合を介して基材に固定化する。なお、基材への固定化方法やシランカップリング法はいずれも当業者に公知の文献記載の方法に従って行なうことができる。
続いて、この基材に固定化したイニファターに対して、ビニルモノマーの存在下に光照射もしくは加熱することにより重合反応を起こして、該基材上のシランカップリング剤とイニファター分子との間にグラフト重合鎖を挿入・伸長させることができる。なお、この重合反応は非特許文献11、12、13に記載の方法に従って行なうことができる。
(AFMプローブおよびガラス基材の修飾方法)
ガラス基材とAFMプローブ表面にグラフト重合層の状態の確認は次のようにして行なうことができる。グラフト重合層の状態としては、例えば、グラフト重合層の厚さ、鎖長、末端特性、鎖間または層間相互作用などを特定する必要がある。
UV強度を上げるまたは照射時間を長くすることによって、グラフト重合層の鎖長が伸長し、厚さは増加する。グラフト重合層の末端特性と鎖間または層間相互作用は、上述したように反応開始剤とモノマー基質の種類によって決めることができる。
本発明におけるAFMプローブ表面のグラフト化については、AFMプローブ表面が非常に小さいので、水接触角度測定による解析は不可能であるが、AFMフォースカーブ測定方法によってプローブ表面にグラフト重合層ができているかどうかは確認できることが判明した。
ガラス基材をアセトン、脱イオン蒸留水(DDW)、続いてエタノールで各20分づつ超音波洗浄した。次に、ガラス基材は、ピラニア液(c-H2SO4 : 30%H2O2 = 7 : 3)で80℃のオイルバスで1時間処理し、基材の表面をシラノール化するとともに、汚れを除去した。続いて、基材をDDWで3回洗浄し、ピラニア液を完全に洗い流した後、脱水アセトンで5回洗浄し、水を完全に洗い流した。更に、脱水アセトン・トルエン(1:1)で洗浄した後、脱水トルエンで5回洗浄して、アセトンを完全に洗い流した。
更に、ガラス基材を、クロロメチルフェニルトリクロロシラン(蒸留トルエン中にシラン5%)中で、ArまたはN2ガス置換状態で18時間震盪し、シランカップリングした。その後、ガラス基材をトルエン、次にアセトンでそれぞれ20分間超音波洗浄し、上記と同様にして、クロロメチルフェニルトリクロロシランによりシランカップリングを行い、更にトルエン、次にアセトンでそれぞれ20分間超音波をかけながら再度洗浄した。再洗浄後、ガラス基材を115℃で10分間乾燥処理し、トルエンとアセトンの吸着残留物を揮発除去させた。
次に、蒸留DMAAmの1Mエタノール液300μLを直径35 mmガラスディッシュの真中においてある直径15 mm カバーガラス基材上に載せ、直径30 mm ガラスでカバーし、N2ガスを当てながらUV照射をして光イニファター重合反応を行った。AFMプローブは、テフロン(登録商標)製の小さいチャンバーの中に上向きで入れ、同じ方法で重合反応を行った。
UV強度800 mW/cm2、UV照射時間3分間の条件でガラス基材表面上に作成された−COOH自由端グラフト重合層にEDC処理を施し、アミノシラン化されたAFMプローブを使って自由末端から引っ張った。EDCは、−COOH 基および−NH2 基の架橋剤で、[1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimide Hydrochloride]である。図7に、測定された鎖長延伸フォースカーブを示す。
図中、左のカーブは観察された幾つかの典型的な Deflection-Displacement プロットを示し、右はそのExtension (Force-Distance) プロットである。その結果、ガラス基材表面上に作成された−COOH自由端グラフト重合層のポリマー鎖長は50〜300 nmの範囲内であり、ポリマー鎖を切り離すRupture forceは1〜2 nNであることが判った。
以上の特徴から見ても、この発明に係るグラフト重合層を仲介したタンパク質のソフトハンドリング方法は全く新しい発想であり、AFMによる1分子の観察、操作または力測定分野での応用性が期待される。
そこで、この発明に係るグラフト重合層化AFMプローブをタンパク質のソフトハンドリングによる相互作用力の測定に応用した例について説明する。
HSA抗体・抗原に対し、シラン化表面、PEG3400修飾表面およびPDMAAmグラフト重合層表面上での相互作用力測定を行い、それぞれの固定条件で観察されるフォースカーブの形態、力と延伸距離の測定値分布、特異的なフォースカーブの出現確率、非特異的なフォースカーブの割合などについて比較と評価を行う。それによって、この発明によるグラフト重合層化AFMプローブを用いたタンパク質のソフトハンドリングによる微弱相互作用力の測定方法の特徴と実用性を検証する。
抗体・抗原の相互作用力は、一般的に他のリガンドーレセプタ対に比べて強いとされているので、今回の実験試料にはアルブミン抗体・抗原を使用した。新しい固定条件で観察されるフォースカーブの形態、力と延伸距離の測定値分布、特異的なフォースカーブの出現確率、非特異的なフォースカーブの割合など諸状況については、他の方法を使った場合の結果を比べながら評価を行い、この発明方法の応用性を試験した。なお、三種類の固定方法の問題点については既に説明したので、ここでは実験方法と結果を中心に説明する。
HSA抗体・抗原の3種類のタンパク質固定方法および相互作用力測定の基本原理をそれぞれ図9、図10および図11に示す。
図9に示すシラン化表面の場合には、一晩SH−シラン化剤でカップリングされた基材とプローブ表面上に抗体・抗原を固定する。図10に示すPEG3400修飾表面の場合には、一晩SH−シラン化剤でカップリングされた基材とプローブ表面を20 mMのNHS-PEG3400-MALで1時間修飾した後、タンパク質固定を行う。
これに対して、図11に示すグラフト重合層表面上での場合には、UV強度が840 mW/cm2で、 重合時間が3 minの条件で作成されたPDMMAm-DTCSグラフト重合層を0.1MのEDC(pH4.8)で一晩修飾した後、タンパク質固定を行う。
また、3種類のタンパク質固定条件と同様にして、非固定のタンパク質を1M Tris bufferで洗い流してから、PBS(-) buffer中で力測定を行った。
なお、これらのタンパク質固定は、HSA抗原として 2 mg/ml のものを、抗体として 1 mg/mlのものを使い、タンパク質固定時間を約3時間にして行った。AFMによる力測定は、スキャン速度を500 nm/sec (スキャン距離は 500 nm で、 頻度は 0.5 Hz) に設定した状態で行った。マイクロカンチレバーはオリンパス製の OMCL TR400PSA の長いカンチレバー(バネ定数20 pN/nm)を使用した。
HSA抗体・抗原に対し、シラン化表面、PEG3400修飾表面およびグラフト重合層表面上での相互作用力測定を行って、フォースカーブの形態特性を調べた後、それぞれの場合に観察された典型的なフォースカーブを非吸着型、付着型、シングルピーク型、ダブルピーク型、マルチピーク型に分けて、それらの形態特性を図12にまとめた。
まず、シラン化表面上では、8割のフォースカーブに付着現象が見られたのに対して、PEG3400修飾表面では付着力の出現は1割程度に留まり、グラフト重合層表面上ではほとんど付着力は確認されなかった。
また、シラン化表面上では、ほとんどの場合にマルチフォースピーク現象が観察され、特異的なフォースピークと非特異的なフォースピークの区別が難しい場合がほとんどだった。他方、マルチフォースピークの場合には、最後に現れるピークを力測定値データとして使っているが、それが必ずしも特異的なものであるとは言えないため、この方法で測定されたタンパク質間相互作用力の測定値には誤差が予想される。
したがって、本実験においても、PEG3400修飾表面上では、グラフト重合層のようにポリマー鎖がブラシ状にはなっておらず、ポリマー鎖の固定密度が比較的に低く、強い力でプローブを基材に押し付けた場合には、固体表面間に直接的な接触が起こりやすくなっていることが予測される。グラフト重合層上では、その現象は解消される。
Claims (20)
- シランカップリング結合を介して基材に固定されている、生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターと、該シランカップリング結合と該イニファターとの間に介在するグラフト重合鎖とからなる生体高分子固定可能グラフト重合鎖固定基材であって、該生体高分子固定可能化学官能基が−COOH基、−NH2基、−SH基または−OH基であり、また該グラフト重合鎖がビニルモノマーの重合反応により該シランカップリング結合と該イニファターとの間に挿入されていることを特徴とする生体高分子固定可能グラフト重合鎖固定基材。
- 請求項1に記載のグラフト重合鎖固定基材において、前記イニファターが光イニファターまたは熱イニファターであることを特徴とするグラフト重合鎖固定基材。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の生体高分子固定可能グラフト重合鎖固定基材の該生体高分子固定可能化学官能基に生体高分子が固定されていることを特徴とする生体高分子固定グラフト重合鎖固定基材。
- 請求項4に記載のグラフト重合鎖固定基材において、前記生体高分子がタンパク質であることを特徴とするグラフト重合鎖固定基材。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のグラフト重合鎖固定基材において、前記基材がプローブ顕微鏡用プローブまたはガラス基板であることを特徴とするグラフト重合鎖固定基材。
- −COOH基、−NH2基、−SH基または−OH基である生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターを、シランカップリング剤によりシランカップリング結合させて基材に固定させ、ビニルモノマーを重合させて該イニファターと該シランカップリング結合との間に挿入させて生体高分子固定グラフト重合鎖固定基材を得ることを特徴とする生体高分子固定可能グラフト重合鎖固定基材の製造方法。
- 請求項7に記載のグラフト重合鎖固定基材の製造方法において、前記イニファターが光イニファターまたは熱イニファターであることを特徴とするグラフト重合鎖固定基材の製造方法。
- 請求項7または8に記載のグラフト重合鎖固定基材の製造方法において、前記イニファターが、一般式[I]:
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]:
で表されるチウラムジスルフィドであることを特徴とするグラフト重合鎖固定基材の製造方法。 - 請求項7〜9のいずれか1項に記載のグラフト重合鎖固定基材の製造方法において、前記グラフト重合鎖がシランカップリング結合を介して基材に固定することを特徴とするグラフト重合鎖固定基材の製造方法。
- 請求項7〜10のいずれか1項に記載のグラフト重合鎖固定基材の製造方法において得られたグラフト重合鎖固定基材に対して、更に生体高分子を固定化することを特徴とするグラフト重合鎖固定基材の製造方法。
- 請求項11に記載のグラフト重合鎖固定基材の製造方法おいて、前記生体高分子がタンパク質であることを特徴とするグラフト重合鎖固定基材の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のグラフト重合鎖固定基材を使用して生体高分子を操作することを特徴とする測定方法。
- 請求項13に記載の測定方法において、前記生体高分子がタンパク質であることを特徴とする測定方法。
- 請求項13または14に記載の測定方法において、前記生体高分子の力学特性および分子間の相互作用力特性を原子間力顕微鏡で測定することを特徴とする測定方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のグラフト重合鎖固定基材を使用して生体高分子の力学特性および分子間の相互作用力特性を測定することを特徴とする測定方法。
- 請求項16に記載の測定方法において、前記生体高分子がタンパク質であることを特徴とする測定方法。
- 請求項16または17に記載の測定方法において、前記基材がナノ・マイクロスケールプローブまたは被検体としての基板であることを特徴とする測定方法。
- 請求項16〜18のいずれか1項に記載の測定方法において前記生体高分子力学特性および分子間の相互作用力特性を測定することを特徴とする測定方法。
- 請求項13〜19のいずれか1項に記載の測定方法において前記生体高分子の活性および運動自由度が保持されていることを特徴とする測定方法。
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