JP4798454B2 - 細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステム - Google Patents

Description

本発明は、細胞内及び細胞間の微小空間の計測又は操作に適した細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムに関する。

近年、バイオ分野において、細胞の生体機能の解明又は制御を行うことが注目されている。
このような細胞の生体機能の解明又は制御を行うためには、細胞内及び細胞間の微小空間の電位差の計測や細胞内に遺伝子等を導入したり取り出す等の操作が必要不可欠となっている。

そこで、従来より、細胞内に遺伝子等の被導入物質を導入する方法又は装置に関する提案が数多くなされており、例えば、特許文献１及び特許文献２によって開示されたものがある。

特許文献１は、細胞操作装置及びこれを用いた細胞操作方法に関する提案である。そして、この特許文献１には、遺伝子の導入から発現に至るまでの間、細胞に表れる経時的な動態変化をリアルタイムで詳細に観察でき、また、細胞分化の解明又は制御に対しても適用でき、さらに、遺伝子等の導入時における細胞のダメージを極力低減し得る細胞操作手段として、原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope；ＡＦＭ）の探針に、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質を固定化して細胞内に挿入するための針状物を設けた構成に関する技術が開示されている。

しかしながら、この特許文献１に記載の従来技術では、遺伝子又は遺伝子発現に関与する物質は針状物に固定化されたままであり、針を抜去しても遺伝子等は細胞内に恒常的に保持されないため、遺伝子組換体を作製できないと問題点があった。

そこで、このような問題点に鑑みてなされた提案が前記特許文献２である。すなわち、特許文献２は、細胞に対して物質を導入する方法に関する提案である。
そして、この特許文献２には、被導入物質を中間的な結合力で針状材料に結合し、この針状材料を細胞内に穿刺した際に被導入物質が残留することにより、被導入物質を細胞内に導入するといった方法に関する技術が開示されており、また、細胞内への針状材料の穿刺検知方法並びに被導入物質を細胞内に導入する導入装置として、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用する構成に関する技術が開示されている。

具体的には、特許文献２に記載の方法では、図２１に示すように、ＡＦＭカンチレバー１００に設けられた探針１０１を集束イオンビームでエッチングすることで、針状材料として構成し、そして、この針状材料である探針１０１を用いて、細胞１０３及び細胞１０３内の核１０４内に穿刺操作を行うようにしている。

また、特許文献２には、被導入物質を中間的な結合力で針状材料に結合する方法の一つとして静電気結合に関する技術が開示されている。このような静電気結合は、弱い結合であるため、細胞内で容易に被導入物質を分離することが可能である。また、この場合の静電気結合には、一般的にカチオン性ポリマーが用いられるようになっている。

具体的には、特許文献２に記載の方法では、図２２の模式図に示すように、シリコン製
ＡＦＭ探針をエッチングにより先鋭化した針状材料１０４にチオール基を導入してスクシ
ンイミド活性エステルを表面に修飾し、ポリリジンを固定化した後に被導入物質であるプ
ラスミドｐｈｒＧＦＰを静電気結合させて、細胞内へ導入するようにしている。
特開２００３−３２５１６１号公報 特開２００６−１６６８８４号公報

しかしながら、前記特許文献２に記載の従来技術では、静電気結合は弱いため結合が外れ、細胞内に導入する以前に被導入物質が取れてしまう可能性があるため、所望の物質を細胞内に導入できない恐れがあるといった問題点があった。

また、前記特許文献２に記載の従来技術には、細胞内から物質を取り出すこと、及び細胞内の電位分布計測に関してなんら示唆も開示もされてはおらず、このため、細胞内での安定した測定又は操作を容易に行える具体的な装置が望まれている。

そこで、本発明は前記問題点に鑑みてなされたもので、細胞内での安定した測定又は操作を容易に行うことが可能であり、耐久性及び信頼性のある、細胞に低侵襲な細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムを提供することを目的とする。

また、本発明は、ナノ細胞マッピング、つまり細胞内及び細胞間の微小空間での測定と物質の導入及び取り出しを容易且つばらつきを抑えて再現性良く安定に行うことを可能にする細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムを提供することを他の目的とする。

本発明の一態様の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムは、支持部と、前記支持部から突出するように前記支持部に設けられたレバー部と、前記レバー部の自由端近傍に設けられた導電性探針と前記導電性探針の周囲を被覆した絶縁膜とで構成された探針部と、前記レバー部の前記支持部側の基端部に設けられた電極パッドと、前記導電性探針と前記電極パッドとを前記レバー部内部を介して電気的に接続する配線部と、を有するカンチレバーと、細胞を配置する配置面を有する導電性の部材で構成された導電性ステージと、前記探針部が細胞及び細胞間に挿入される前記カンチレバーの電極パッドと、前記導電性ステージと、の間に印加する電圧の極性を反転可能な電源部と、を含むことを特徴とする。
本発明の他の態様の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムは、支持部と、前記支持部から突出するように前記支持部に設けられたレバー部と、前記レバー部の自由端近傍に設けられた導電性探針と前記導電性探針の周囲を被覆した絶縁膜とで構成された探針部と、前記レバー部の前記支持部側の基端部に設けられた電極パッドと、前記導電性探針と前記電極パッドとを前記レバー部内部を介して電気的に接続する配線部と、を有するカンチレバーと、細胞を配置する配置面を有する導電性の部材で構成された導電性ステージと、前記探針部と前記導電性ステージとの間の抵抗を計測する抵抗計と、前記探針部が細胞及び細胞間に挿入される前記カンチレバーの電極パッドと、前記導電性ステージと、の間にパルス波電位を印加可能なパルス発生部と、を含むことを特徴とする。

本発明によれば、細胞内での安定した測定又は操作を容易に行うことが可能であり、耐久性及び信頼性のある、細胞に低侵襲な細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムを提供することができる。
また、本発明によれば、ナノ細胞マッピング、つまり細胞内及び細胞間の微小空間での測定と物質の導入及び取り出しを容易且つばらつきを抑えて再現性良く安定に行うことを可能にする細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステムを提供することが可能となる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

（第１の実施の形態）
図１から図７は本発明の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーの第１の実施の形態に係り、図１は第１の実施の形態の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーの外観構成を示す斜視図、図２は図１の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーにおけるＡ−Ａ’線に沿ったレバー部の一部破断した断面図、図３は図１の探針部の突出方向に対して鉛直方向における断面図、図４は図１の探針部の突出方向における先端部分の断面図、図５は探針部の第１の変形例を示す先端部分の断面図、図６は探針部の第２の変形例を示す先端部分の断面図、図７は探針部の第３の変形例を示す探針部及びレバー部の一部破断した断面図である。

図１に示すように、第１の実施の形態の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバー（以下、カンチレバー１と称す）１は、細胞内及び細胞間の微小空間の計測又は操作に用いられるものである。

具体的には、カンチレバー１は、支持部２と、前記支持部２から突出するように前記支持部２に設けられたレバー部３と、前記レバー部３の自由端近傍に設けられた探針部４と、前記レバー部３の前記支持部２側の基端部に設けられた電極パッド６と、前記探針部４の後述する導電性探針７と前記電極パッド６とを前記レバー部３内部を介して電気的に接続するための配線部５とを有して構成されている。

支持部２は、細胞内及び細胞間の微小空間計測又は操作を行う場合には、図示しない細胞操作装置内のカンチレバーホルダ等に保持される。また、この支持部２の例えば底面部には、レバー部３の基端側部分が支持された状態で固定されている。尚、レバー部３の支持部２への取付方法は、特に限定されることはなく、いずれの方法で取り付けても良い。

レバー部３は、例えば、酸化シリコン又は窒化シリコン等の材料を用いて構成されている。具体的な構成については後述する。

探針部４は、前記レバー部３の自由端近傍に形成されている。また、探針部４は、レバー部３の長手方向に対して鉛直方向に突出するように設けられている。
尚、第１の実施の形態では、探針部４は、レバー部３に対して鉛直方向に設けた構成について説明したが、これに限定されるものではなく、レバー部３に対していずれの方向に傾けるように形成しても良い。

次に、カンチレバー１の主要部分であるレバー部３及び探針部４の具体的な構成について、図２から図７を参照しながら説明する。
本発明では、図２に示すように、探針部４は、炭素系材料からなる導電性部材である導電性探針７と、この導電性探針７の周囲を被覆するように設けられた絶縁膜８とを有して構成されている。

また、図３には、探針部４の突出方向に対して鉛直方向における探針部４の断面の構成が示されている。すなわち、図３に示すように、第１の実施の形態では、探針部４の形状は、例えば円柱状に形成されている。そして、探針部４を構成する導電性探針７の形状は、例えば円柱状に形成されている。

尚、探針部４及び導電性探針７の形状は、円柱状に限らず、それ以外の形状に形成しても良く、例えば、楕円柱又は多角柱などの柱状体形状、又は円錐や多角錘などの錐体形状に形成しても良い。但し、細胞へのダメージを低減するために、前記したように円柱状に形成することが望ましい。

絶縁膜８は、このような形状の導電性探針７の周囲を被覆するように設けられている。従って、絶縁膜８の形状を変えることによって導電性探針７の形状はそのままで探針部４自体の形状を変えるように構成しても良い。尚、この絶縁膜８は、導電性探針７の周囲を完全に被覆して絶縁性が確保できれば、その形状や厚さ等は特に限定することはなく、柱状体形状でも錐体形状に構成しても良い。

また、探針部４の先端面４ａは、図２及び図４に示すように、例えば平面形状に形成されている。この先端面４ａには、導電性探針７の先端面７ａが設けられている。この先端面７ａは、探針部４の先端面と同一面となるように設けられている。また、導電性探針７の先端面７ａとは逆側の基端部には、基端面７ｂが形成されている。
絶縁膜８の下部には、前記レバー部３に係合して固定するための係合部８ａが設けられている。

ここで、探針部４を構成する導電性探針７及び絶縁膜８の材料について説明する。
具体的には、導電性探針７を構成する炭素系材料は、例えば、単結晶ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド、ナノダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、及びアモルファスカーボンの少なくとも１つである。そして、このような炭素系材料にボロン又はリン等をドープすることにより、導電性探針７として構成されるようになっている。

したがって、このような炭素系材料を用いて導電性探針７を構成することにより、炭素系材料の導電性探針７は高剛性を有しているため、耐久性が向上すると共に、また、酸化されにくい特性を有しているため、信頼性が得られる。よって、このような耐久性及び信頼性のある導電性探針７を用いて探針部４を構成しているので、細胞内での安定した測定又は操作を容易に且つ安定して行うことが可能となる。

また、絶縁膜８は、酸化膜、窒化膜又は有機膜のいずれか１層、又は酸化膜、窒化膜又は有機膜の少なくとも１つを含む積層膜で構成されている。このような積層膜は、一般的な方法で形成可能である。このため、絶縁膜８は、容易に導電性探針７を覆うように形成することが可能である。

また、絶縁膜８は、前記積層膜に替えて、多結晶ダイヤモンド、ナノダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、及びアモルファスカーボンの少なくとも１つを含む炭素系材料を用いて形成しても良い。尚、第１の実施の形態では、絶縁膜８を形成する材料としては、生体への適合性及び、被導入物質の付着性向上のための表面処理（後述する表面修飾部を形成するための表面処理）性を考慮すると、炭素系材料を用いることが望ましい。

したがって、導電性探針７の周囲を絶縁膜８で覆うことにより、後述するが、細胞内及び細胞間の微小空間での電位計測を正確に行うのに好適な構成となる。また、被導入物質を細胞内及び細胞間の微小空間の所望の位置に導入し易くなると共に、所望の位置から物質を取り出すことを可能にするのに好適な構成となる。

尚、探針部４は、先端部の径が１μｍ以下、好ましくは４００ｎｍ以下となるように形成することが望ましい。また、探針部４の長さは、２μｍ以上、好ましくは５μｍ以上、さらに好ましくは１０μｍ以上となるように形成することが望ましい。

このような構成の探針部４の導電性探針７は、図２に示すように、基端面７ｂがレバー部３内の配線部５と接触することにより、この配線部５と電気的に接続されるようになっている。

ここで、レバー部３の構成を説明すると、レバー部３は、図２に示すように、前記探針部４の絶縁膜８の係合部８ａと係合することにより探針部４自体を固定するとともに、内部の配線部５を保護するための保護膜９と、この保護膜９の次に配設される前記配線部５と、この配線部５を前記保護膜９とで挟持するレバー本体部３Ａと、このレバー本体部３Ａの外表面にコーティング処理された光学反射膜１０とを有して構成されている。

保護膜９は、絶縁性部材で構成されたもので、レバー部３の片側全面に亘って覆うように設けられている。また、この保護膜９は、図示はしないが支持部２の同じ側の全面に亘って設けられている。

保護膜９の探針部４近傍には、絶縁膜８の係合部８ａが露出するように開口９ａが形成されている。尚、第１の実施の形態では、保護膜９の探針部４近傍に開口９ａを設けた構成について説明したが、これに限定されることはなく、開口９ａを設けずに、探針部４の絶縁膜８の周囲全体を覆うように形成しても良い。このことにより、探針部４を強固にレバー部３に固定することが可能となる。

また、図示はしないが、保護膜９は、支持部２上の電極パッド６の対応する部分においては、内部の配線部５と電極パッド６との電気的な接続を行うために開口している。

尚、第１の実施の形態では、保護膜９を設けた構成について説明したが、これに限定されることはなく、必要に応じて保護膜９を設けずに構成しても良い。

配線部５は、導電性探針７の基端面７ｂと接触することにより、この導電性探針７と電気的に接続されている。そして、この配線部５の支持部２側の基端部は、例えば電位計等の外部装置と電気的に接続するための電極パッド６に電気的に接続されている。

尚、配線部５の材料としては、白金又はイリジウムが望ましい。これは、炭素系材料の導電性探針７を堆積成長させ易いためである。また、配線部の５の材料としては、導電性探針７との密着性が確保できれば、その他の金属を用いて構成しても良い。また、その他に、ポリシリコン等の半導体材料を用いて配線部５を構成しても良い。

また、配線部５とレバー本体部３Ａとの間に、チタン又はクロム等の導電性材料を形成して、配線部５とレバー本体部３Ａとの密着性を向上させるように構成しても良い。また、同様に配線部５と保護膜９との間に、チタン又はクロム等の導電性材料を形成して、配線部５と保護膜９との密着性を向上させるように構成しても良い。

また、電極パッド６は、配線部５自体で形成しても良いが、その上に金、銅又はアルミニウム等の電極層を形成して、半田接続又はワイヤボンディング等による外部端子との電気的接続を取り易いように構成しても良い。この場合、電極パッド６と電極層との密着性を向上させるために、電極パッド６と電極層との間にチタン又はクロム等の導電性材料を形成しても良い。

レバー本体部３Ａの外表面に設けられた光学反射膜１０は、アルミニウム又は金によってコーティング処理することによって形成されている。尚、このようなコーティング処理に限定されることはなく、他の方法を用いて光学反射膜１０を構成しても良い。また、多層膜を設けて光学反射膜１０を構成しても良い。

この光学反射膜１０は、例えば、このカンチレバー１と、外部光学系機器及びパーソナルコンピュータ等の外部装置とでシステムを構成した場合には、外部光学系機器から照射される光の反射角又は反射量を検出するためのものである。そして、このようなシステムでは、パーソナルコンピュータによって、光学反射膜１０による検出結果を分析することにより、探針部４が細胞膜に接触したか否かを力学的に検知することが可能となるので、細胞内及び細胞間の微小空間での測定又は操作を行うのに有効である。

従って、以上説明したように構成することによって、細胞に対して低侵襲なカンチレバー１を構成することができ、細胞内及び細胞間の微小空間でのばらつきを抑えて再現性良く安定した様々な測定又は操作が容易に行うことが可能となる。

また、レバー部３及び電極パッド６を除く支持部２上を保護膜９にて覆うため、細胞が培養液又は生理食塩水等の水系溶液に浸っている場合等、さまざまな環境下においても、細胞内及び細胞間の微小空間での安定した測定や操作が容易に行うことができる。

さらに、耐久性及び信頼性のある導電性探針７を用いて探針部４を構成しているので、高耐久性及び高信頼性のあるカンチレバー１を構成することが可能となる。

尚、第１の実施の形態では、前記探針部４は、導電性探針７の先端面７ａと絶縁膜８と同一平面ではなく、図５の第１の変形例に示す探針部４Ａのように、導電性探針７の先端部７ａ１が絶縁膜８よりも突出する形状に先端部４ａ１を構成しても良い。

この場合、探針部４Ａの先端部４ａ１及び導電性探針７の先端部７ａ１は、例えば円錐又は多角錘等の錐体形状に構成される。

また、前記探針部４は、図６の第２の変形例に示す探針部４Ｂのように、導電性探針７の先端部７ａ２が絶縁膜８よりも突出する形状に先端部４ａ２を構成した場合に、この導電性探針７の先端部７ａ２を半球状、楕円球状等の円弧形状に形成するとともに、この先端部７ａ２周囲の絶縁膜８の先端部についても半球状、楕円球状等の円弧形状に形成しても良い。すなわち、探針部４Ｂの先端部４ａ２を円弧形状に形成することにより、細胞へのダメージを低減できるといった効果がある。

さらに、前記探針部４は、図７の第３の変形例に示す探針部４Ｃのように、導電性探針７の先端面７ａ３が絶縁膜８よりも突出する形状に先端部４ａ３を構成した場合に、導電性探針７の突出する突出部７ｃを設けるとともに、この突出部７ｃの先端面７ａ３と絶縁膜８の先端面とが同一平面ではなく、それぞれ異なる位置に設けられるように構成しても良い。すなわち、導電性探針７の突出部７ｃを設けたことにより、導電性探針７の露出する表面面積が大きくなるので、被導入物質及び細胞内物質の付着性能を向上させるのに有効である。

次に、このような構成のカンチレバー１を用いて、実際に細胞内及び細胞間の微小空間電位差測定を行うためのシステムとして構成した場合の構成例及び動作について、図８及び図９を参照しながら説明する。
図８は第１の実施の形態のカンチレバー１を備えたシステム全体の概略構成を示す模式図、図９は細胞内電位差測定を行う場合のカンチレバー１の探針部４及び細胞内の拡大図である。

図８に示すように、システムは、図１に示すカンチレバー１と、このカンチレバー１の電極パッド６に電気的に接続される接続線１１と、この接続線１１に電気的に接続され、カンチレバー１の探針部４の先端部と後述する導電ステージとの電位差を計測可能な電位計１２と、この電位計１２からの接続線１１に電気的に接続され、細胞５０を配置する配置面１３ａを有する導電性の部材で構成された導電性ステージ１３とを有して構成されている。

このような構成により、カンチレバー１と導電性ステージ１３とが、接続線１１及び電位計１２を介して電気的に接続される。尚、説明簡略化のため、カンチレバー１の支持部２を保持するカンチレバーホルダ及びその他のパーソナルコンピュータ等の外部装置については説明を省略し、主要部のみの構成及び動作について説明する。

いま、オペレータは、図８に示すように構成されたシステムを用いて、細胞内電位差測定を行うものとする。この場合、オペレータは、導電性ステージ１３の配置面１３ａ上に細胞５０を配置させる。

そして、オペレータは、システムの電源を投入した上で、図９に示すように、カンチレバー１の探針部４を細胞５０に向けて移動させる。尚、細胞５０は、周知のように細胞内の核５１と、細胞膜５２とを有している。

すると、カンチレバー１の探針部４の先端面４ａが細胞５０の細胞膜５２に接触する。この場合、第１の実施の形態では、カンチレバー１の探針部４が細胞膜５２に接触したことを、電位計１２によって電気的に検知し又は前記したように光学反射膜１０からの反射光等によって力学的に検知しても良く、いずれの検知方法で検知しても良い。

その後、オペレータは、図９に示すように、カンチレバー１の探針部４を細胞膜５２を突き破るようにして細胞５０内に挿入させる。

そして、オペレータは、電位計１２を用いて、細胞５０内の探針部４の先端面４ａと導電性ステージ１３との電位差を測定する。このときの測定結果は、図示しないパーソナルコンピュータ等によって記録されることになる。

ここで、第１の実施の形態では、オペレータは、前記したような方法で細胞５０内に探針部４を刺し直し、刺し直し毎に電位差を測定する。このことにより、細胞５０内での所望位置における電位分布の測定結果が得られる。

例えば、刺し直し回数は、数十回〜１００回程度が望ましいが、特に限定されるものではなく、必要に応じた回数で行えば良い。この場合、探針部４を数十回刺し直しても、細胞５０は死んでしまうことはない。また、細胞５０内に刺し直す位置については、必要に応じた所望の位置を設定すれば良い。

このように探針部４を細胞５０内に複数回刺し直しながら、それぞれの電位差を測定することで、前記したようなシステムを用いることにより、細胞５０での所望位置における微細電位分布の測定が可能になり、電位分布でのナノ細胞マッピングを行うことが可能となる。

尚、ナノ細胞マッピングは、組織・気官に存在する細胞内及び細胞間の物質や電位等の物理的パラメータや、特定の生物機能の強弱の微細分布をマッピングするもので、電位分布に限るものではない。

また、探針部４及びレバー部３がそれぞれ絶縁膜８及び保護膜９に覆われているため、細胞５０が培養液又は生理食塩水等の水系溶液に浸っていても電位差及び電位分布の測定が可能である。

従って、第１の実施の形態によれば、細胞内と細胞膜との電位差が容易に且つ安定して測定することができ、さらに、細胞内又は細胞間での電位分布もリアルタイムで容易に且つ安定して測定することが可能となる。よって、細胞内での安定した測定又は操作を容易に行うことが可能であり、耐久性及び信頼性のある、細胞に低侵襲な細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバー（カンチレバー１）の実現が可能である。

また、カンチレバー１を有するシステムを用いることにより、細胞内での電位分布測定を行うことで、細胞内及び細胞間における電位のナノ細胞マッピングを行うことが可能となる。

（第２の実施の形態）
図１０から図１７は本発明の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーの第２の実施の形態に係り、図１０から図１３はカンチレバーを有するシステムを用いて細胞内に被導入物質を導入する方法を説明するための説明図であり、図１４から図１７はカンチレバーを有するシステムを用いて細胞内から細胞内物質を取り出す方法を説明するための説明図である。
尚、図１０から図１７は前記第１の実施の形態のカンチレバー１及びシステムと同様な構成要素については同一の符号を付して説明を省略し、異なる部分のみを説明する。

第２の実施の形態のカンチレバー１は、前記第１の実施の形態のカンチレバー１と略同様に構成されているが、導電性探針７の少なくとも先端部分が、細胞内の物質又は細胞内に導入する被導入物質を付着し易くするための表面処理を施した表面修飾部４０を有して構成されている。

前記表面修飾部４０は、水素、酸素、フッ素、アミノ酸、シラン、有機分子又は生体分子のいずれか１つを用いて表面処理を施すことにより形成されるようになっている。

尚、この表面修飾部４０は、例えば、導電性探針７の先端面７ａ又は露出部と、先端面４ａを形成する絶縁膜８の先端面又は露出部との少なくとも一方に形成されても良い。

また、表面修飾部４０は、探針部４の先端部には限定されることはなく、探針部４の先端部から周囲にかけて前記材料を用いて表面処理を施して形成しても良い。

さらに、表面修飾部４０を形成させるための方法としては、前記表面処理に限定されることはなく、物理的な結合を含む如何なる方法を用いて表面修飾部を形成しても良い。

また、表面修飾部４０は必ずしも必要ではないが、後述するように、細胞内及び細胞間の微小空間への被導入物質の導入又は細胞内からの細胞内物質の取り出しにあたっては、表面修飾部４０を形成した方が有効である。

したがって、このようなカンチレバー１では、探針部４の先端部近傍に表面処理を施して表面修飾部４０を形成したことにより、後述する被導入物質５３を探針部４の先端部に付着させ易くなるとともに、細胞内及び細胞間の微小空間から細胞内物質５４を取り出す際に、細胞内及び細胞間の微小空間からの細胞内物質５４を探針部４の先端部に付着させ易くなる。

そして、このようなカンチレバー１を用いて、細胞内に被導入物質を導入又は細胞内からの細胞内物質の取り出しを行うためのシステムを構成すると、図１０に示すような構成となる。

すなわち、このシステムは、図１０に示すように、表面修飾部４０を有するカンチレバー１を有し、第１の実施の形態の電位計１２に替えて、第１電源Ｖ１及び第２電源Ｖ２を有する電源部１４を設けると共に、これらの第１電源Ｖ１と第２電源Ｖ２とを切り替えるスイッチＳＷを設けている。また、このシステムでは、導電性ステージ１３が接地電位となるように接続されている。

電源部１４の第１電源Ｖ１の正極側には、スイッチＳＷの一方の端子が接続され、負極側には、導電性ステージ１３からの接続線１１が接続されている。

また、電源部１４の第２電源Ｖ２の負極側には、スイッチＳＷの他方の端子が接続され、正極側には、導電性ステージ１３からの接続線１１が接続されている。

そして、スイッチＳＷは、カンチレバー１の電極パッド６からの接続線１１が接続されており、電源部１４の第１電源Ｖ１側の一方の端子に切り替えた場合にはカンチレバー１側に正極の電位が印加され、一方、電源部１４の第２電源Ｖ２側の他方の端子に切り替えた場合にはカンチレバー１側に極性が反転した負極の電位が印加されるようになっている。

尚、このスイッチＳＷは、オフすることにより、カンチレバー１には第１電源Ｖ１又は第２電源Ｖ２からの電位を与えないフローティング状態に切り替えることも可能である。

次に、このような構成のカンチレバー１を有するシステムを用いて細胞内に被導入物質を導入する方法、及び細胞内から細胞内物質を取り出す方法について説明する。
まず、細胞内に被導入物質を導入する方法について、図１０から図１４を参照しながら説明する。

尚、図１０はカンチレバー１の探針部４に負の電位を印加して被導入物質５３を吸着させた状態を示し、図１１は探針部４を電気的にフローティング状態にして探針部４を細胞５０内に挿入する状態を示し、図１２はカンチレバー１の探針部４に正の電位を印加して細胞５０内に被導入物質５３を分離する状態を示し、図１３は探針部４を電気的にフローティング状態にして探針部４のみを細胞５０内から抜いた状態を示している。
いま、オペレータは、図１０に示すように構成されたシステムを用いて、細胞５０内に被導入物質５３を導入するものとする。この場合、オペレータは、予め、導電性ステージ１３の配置面１３ａ上に細胞５０を配置させる。

そして、オペレータは、システムの電源を投入した上で、図１０に示すように、スイッチＳＷを第２電源Ｖ２側の他方の端子に切り替えるように操作する。

すると、カンチレバー１の探針部４には、第２電源Ｖ２から負電位が印加される。このことにより、正に帯電した遺伝子やタンパク質等の被導入物質５３の探針部４の先端部近傍への吸着を電気的に促進させることが可能となる。

その後、オペレータは、図１１に示すように、スイッチＳＷを操作して電源部１４をオフすることにより、カンチレバー１の探針部４を電気的にフローティング状態とする。そして、オペレータは、この状態を保持したままの状態で、カンチレバー１を細胞５０に向けて移動させてこの細胞５０内に挿入させる。

次に、カンチレバー１の探針部４が細胞内の所望の位置に到達したことを確認後、オペレータは、図１２に示すように、スイッチＳＷを第１電源Ｖ１側の一方の端子に切り替えるように操作する。

すると、カンチレバー１の探針部４には、第１電源Ｖ２から正電位が印加される。すなわち、探針部４に印加する電位の極性を切り替えて正電位が印加されると、細胞５０内及び細胞５０間の微小空間で探針部４の先端部に付着された被導入物質５３の分離を促進させることが可能となる。

その後、オペレータは、図１３に示すように、スイッチＳＷを操作して電源部１４をオフすることにより、カンチレバー１の探針部４を電気的にフローティング状態とする。そして、オペレータは、この状態を保持したままの状態で、カンチレバー１を細胞５０内から抜くことにより、遺伝子やタンパク質等の被導入物質５３を細胞５０内及び細胞５０間の微小空間に留まらせることになる。

次に、細胞内から細胞内物質を取り出す方法について、図１４から図１７を参照しながら説明する。
尚、図１４はカンチレバー１の探針部４を電気的にフローティング状態にして細胞５０の挿入前の状態を示し、図１５は探針部４を電気的にフローティング状態のままで細胞５０内に挿入した状態を示し、図１６はカンチレバー１の探針部４に負の電位を印加して細胞５０内の細胞内物質５４を吸着した状態を示し、図１７は探針部４に負の電位を印加した状態のままで吸着した細胞内物質５４とともに探針部４を細胞内から抜いた状態を示している。

いま、オペレータは、図１４に示すように構成されたシステムを用いて、細胞５０内から細胞内物質５４を取り出すものとする。尚、予め導電性ステージ１３の配置面１３ａ上に、細胞内物質５４を内部に有する細胞５０を配置させておく。

そして、オペレータは、システムの電源を投入した上で、図１４に示すように、スイッチＳＷを操作して電源部１４をオフすることにより、カンチレバー１の探針部４を電気的にフローティング状態にする。

そして、オペレータは、図１５に示すように、このフローティング状態を保持したままの状態で、カンチレバー１を細胞５０に向けて移動させてこの細胞５０内に挿入させる。

次に、カンチレバー１の探針部４が細胞５０内の所望の位置、具体的には細胞内物質５４を取り出すのに好適に位置に到達したことを確認後、オペレータは、図１６に示すように、スイッチＳＷを第２電源Ｖ２側の他方の端子に切り替えるように操作する。

すると、カンチレバー１の探針部４には、第２電源Ｖ２から負電位が印加される。このことにより、正に帯電した遺伝子やタンパク質等の被導入物質５３の探針部４の先端部近傍への吸着を電気的に促進させることが可能となる。

その後、オペレータは、図１７に示すように、探針部４に細胞内物質５４が吸着しているのを確認後、カンチレバー１の探針部４に負電位を印加している状態を保持したままの状態で、カンチレバー１を細胞５０内から抜くように操作する。このことより、細胞５０内から遺伝子やタンパク質等の細胞内物質５４を容易に取り出すことが可能となる。

尚、探針部４から取り出した細胞内物質５４を分離させる場合には、オペレータは、スイッチＳＷを操作して電源部１４をオフすることにより、カンチレバー１の探針部４を電気的にフローティング状態として、探針部４から細胞内物質５４を分離させれば良い。

以上、説明した方法により、遺伝子又はタンパク質等を容易に安定して細胞及び細胞間の微小空間内に導入、又は細胞内及び細胞間の微小空間から取り出しを容易に行うことが可能となる。

尚、第２の実施の形態では、カンチレバー１の探針部４に印加する電位は、前記した第２の実施の形態とは逆の極性の電位を印加しても良い。

また、細胞内及び細胞間の微小空間にカンチレバー１の探針部４を挿入、又は抜くときに探針部４を電気的にフローティング状態としたことについて説明したが、電位を印加した状態で行っても良い。

従って、第２の実施の形態によれば、前記第１の実施の形態と同様の効果が得られる他に、細胞５０が配置された導電性ステージ１３とカンチレバー１の電気的極性と電位を制御することにより、細胞５０内及び細胞５０間の微小空間に被導入物質５３を容易に導入できると共に、細胞５０内及び細胞５０間の微小空間から細胞内物質５４を容易に取り出すことが可能となる。

また、この場合、カンチレバー１の探針部４の先端部近傍に表面修飾部４０を形成することにより、目的の被導入物質５３を確実に細胞５０内及び細胞５０間の微小空間に導入することが可能となり、また、細胞５０内及び細胞５０間の微小空間の目的の細胞内物質５４を選択的且つ確実に取り出すことも可能となる。

（第３の実施の形態）
図１８から図２０は本発明の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーの第３の実施の形態に係り、カンチレバーを有するシステムを用いて探針部を細胞内に挿入し易くする方法を説明するための説明図で、図１８は抵抗計をオンして導電性ステージと探針部との間に抵抗を計測し探針部と細胞膜との接触を検知する状態を示し、図１９は探針部と細胞膜との接触を検知した場合にパルス発生部をオンしてパルス波電位を印加した状態を示し、図２０は探針部が細胞内に挿入された後にパルス発生部をオフしてパルス波電位の印加を停止した状態を示している。
尚、図１８から図２０は前記第１及び第２の実施の形態のカンチレバー１及びシステムと同様な構成要素については同一の符号を付して説明を省略し、異なる部分のみを説明する。

第３の実施の形態のカンチレバー１及びシステムは、前記第２の実施の形態のカンチレバー１及びシステムと略同様に構成されているが、電源部１４に替えて抵抗計１５及びパルス発生部１６を設けるとともに、これら抵抗計１５とパルス発生部１６とを切り替えるためのスイッチＳＷ１を有して構成されている。

すなわち、このような構成とすることで、探針部４と細胞膜との接触を抵抗計１５による測定結果によって検知し、また、検知した場合に、パルス発生部１６によってパルス波電位を印加することにより、細胞５０内への探針部４の挿入をより容易に行うようにしている。

尚、スイッチＳＷ１は、カンチレバー１の電極パッド６からの接続線１１が接続されており、抵抗計１５側の一方の端子に切り替えた場合には導電性ステージ１３と探針部４との間の抵抗の測定を可能にし、一方、パルス発生部１６側の他方の端子に切り替えた場合には導電性ステージ１３と探針部４との間にパルス波電位が印加されるようになっている。

尚、このスイッチＳＷ１は、オフすることにより、前記パルス発生部１６からのパルス波電位の印加を停止させることも可能である。

具体的な、探針部４の細胞内への挿入方法について、図１８から図２０を参照しながら説明する。
いま、オペレータは、図１８に示すように構成されたシステムを用いて、カンチレバー１の探針部４を細胞５０内に挿入するものとする。尚、予め導電性ステージ１３の配置面１３ａ上に細胞５０を配置させておく。

そして、オペレータは、システムの電源を投入した上で、図１８に示すように、スイッチＳＷ１を抵抗計１５側の一方の端子に切り替えるように操作する。このことにより、導電性ステージ１３と探針部４との間は抵抗計１５を介して電気的に接続されるので、導電性ステージ１３と探針部４との間の抵抗の測定して、探針部４と細胞５０（細胞膜５２）との接触を検知する。

ここで、オペレータの操作によって、図１９に示すように、探針部４を細胞５０に接触させたとする。この場合、抵抗計１５には導電性ステージ１３と探針部４との所定の抵抗値が測定される。このことにより、探針部４が細胞５０に接触したことが検知される。

その後、オペレータは、抵抗計１５によって探針部４が細胞５０に接触したと検知した場合には、図１９に示すように、スイッチＳＷ１をパルス発生部１６側の他方の端子に切り替えるように操作する。

すると、パルス発生部１６はオンすることになり、導電性ステージ１３と探針部４との間にはパルス波電位が印加されることになる。

そして、オペレータは、パルス波電位を印加しながら、カンチレバー１の探針部４を細胞５０に向けて移動させてこの細胞５０内に挿入させる。このとき、探針部４の導電性探針７にはパルス波電位が印加されているので、細胞５０の細胞膜５２（図示せず）を容易に開口させて細胞５０内に挿入させることが可能となる。

その後、オペレータは、カンチレバー１の探針部４が細胞５０内の所望の位置に到達したことを確認後、図２０に示すように、スイッチＳＷ１をオフすることにより、パルス発生部１６からのパルス波電位の印加を停止させる。

尚、第３の実施の形態では、探針部４と細胞５０との接触の検知方法は、導電性ステージ１３とカンチレバー１の探針部４との抵抗測定の代わりに、カンチレバー１の光学反射膜１０を用いて行う力学的検知方法を用いても良い。

また、導電性ステージ１３とカンチレバー１の探針部４との間に印加する電位は、交流（高周波）でも直流でも良い。

さらに、カンチレバー１の探針部４を細胞５０に接触させる以前からパルス発生部１６をオンしてパルス波電位を印加させても良い。

従って、第３の実施の形態によれば、前記第２の実施の形態と同様の効果が得られる他に、カンチレバー１の探針部４を細胞５０内に挿入する際、カンチレバー１の力学的な操作に加えて細胞膜５２に電気的な刺激を与えることにより、カンチレバー１の探針部４の細胞５０内及び細胞５０間の微小空間への挿入を容易に行うことが可能となる。このことにより、カンチレバー１の探針部４の先端部の径が比較的大きくても、容易に探針部４を細胞５０内に挿入することが可能となる。

本発明は、以上述べた実施の形態のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施可能である。

本発明の第１の実施の形態に係る細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーの外観構成を示す斜視図。 図１の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーにおけるＡ−Ａ’線に沿ったレバー部の一部破断した断面図。 図１の探針部の突出方向に対して鉛直方向における断面図。 図１の探針部の突出方向における先端部分の断面図。 探針部の第１の変形例を示す先端部分の断面図。 探針部の第２の変形例を示す先端部分の断面図。 探針部の第３の変形例を示す探針部及びレバー部の一部破断した断面図。 第１の実施の形態のカンチレバーを備えたシステム全体の概略構成を示す模式図。 細胞内電位差測定を行う場合のカンチレバーの探針部及び細胞内の拡大図。 本発明の第２の実施の形態に係る細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーの探針部に負の電位を印加して被導入物質を吸着させた状態を示す説明図。 探針部を電気的にフローティング状態にして探針部を細胞内に挿入する状態を示す説明図。 カンチレバーの探針部に正の電位を印加して細胞内に被導入物質を分離する状態を示す説明図。 探針部を電気的にフローティング状態にして探針部のみを細胞内から抜いた状態を示す説明図。 カンチレバーの探針部を電気的にフローティング状態にして細胞の挿入前の状態を示す説明図。 探針部を電気的にフローティング状態のままで細胞内に挿入した状態を示す説明図。 カンチレバーの探針部に負の電位を印加して細胞内の細胞内物質を吸着した状態を示す説明図。 探針部に負の電位を印加した状態のままで吸着した細胞内物質とともに探針部を細胞内から抜いた状態を示す説明図。 本発明の第３の実施の形態に係り、抵抗計をオンして導電性ステージと探針部との間に抵抗を計測し探針部と細胞膜との接触を検知する状態を示す説明図。 探針部と細胞膜との接触を検知した場合にパルス発生部をオンしてパルス波電位を印加した状態を示す説明図。 探針部が細胞内に挿入された後にパルス発生部をオフしてパルス波電位の印加を停止した状態を示す説明図。 従来技術における針状材料を用いた細胞穿刺操作を示す説明図。 従来技術におけるポリリジン修飾した針に静電吸着させた状態を示す模式図。

符号の説明

１…カンチレバー、
２…支持部、
３…レバー部、
３Ａ…レバー本体部、
４、４Ａ〜４Ｃ…探針部、
４ａ…先端面、
４ａ１〜４ａ３…先端部、
５…配線部、
６…電極パッド、
７…導電性探針、
７ａ…先端面、
７ｂ…基端面、
７ａ１〜７ａ３…先端部、
７ｃ…突出部、
８…絶縁膜、
８ａ…係合部、
９…保護膜、
９ａ…開口、
１０…光学反射膜、
１１…接続線、
１２…電位計、
１３…導電性ステージ、
１３ａ…配置面、
１４…電源部、
１５…抵抗計、
１６…パルス発生部、
４０…表面修飾部、
５０…細胞、
５１…核、
５２…細胞膜、
５３…被導入物質、
５４…細胞内物質、
ＳＷ、ＳＷ１…スイッチ、
Ｖ１…第１電源、
Ｖ２…第２電源。

Claims (4)

1. 支持部と、前記支持部から突出するように前記支持部に設けられたレバー部と、前記レバー部の自由端近傍に設けられた導電性探針と前記導電性探針の周囲を被覆した絶縁膜とで構成された探針部と、前記レバー部の前記支持部側の基端部に設けられた電極パッドと、前記導電性探針と前記電極パッドとを前記レバー部内部を介して電気的に接続する配線部と、を有するカンチレバーと、
   細胞を配置する配置面を有する導電性の部材で構成された導電性ステージと、
   前記探針部が細胞及び細胞間に挿入される前記カンチレバーの電極パッドと、前記導電性ステージと、の間に印加する電圧の極性を反転可能な電源部と、
   を含むことを特徴とする細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステム。
2. 前記電源部は、極性の異なる二つの電源を備え、スイッチにより切り替えることを特徴とする請求項１に記載の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステム。
3. 支持部と、前記支持部から突出するように前記支持部に設けられたレバー部と、前記レバー部の自由端近傍に設けられた導電性探針と前記導電性探針の周囲を被覆した絶縁膜とで構成された探針部と、前記レバー部の前記支持部側の基端部に設けられた電極パッドと、前記導電性探針と前記電極パッドとを前記レバー部内部を介して電気的に接続する配線部と、を有するカンチレバーと、
   細胞を配置する配置面を有する導電性の部材で構成された導電性ステージと、
   前記探針部と前記導電性ステージとの間の抵抗を計測する抵抗計と、
   前記探針部が細胞及び細胞間に挿入される前記カンチレバーの電極パッドと、前記導電性ステージと、の間にパルス波電位を印加可能なパルス発生部と、
   を含むことを特徴とする細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステム。
4. 前記抵抗計と前記パルス発生部とは、スイッチにより切り替えることを特徴とする請求項３に記載の細胞内及び細胞間の微小空間計測用カンチレバーシステム。

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