CN112326763A

CN112326763A - 一种可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器

Info

Publication number: CN112326763A
Application number: CN202011018217.7A
Authority: CN
Inventors: 许雄伟; 陈锦元; 杨良永; 翁秀华; 林新华; 刘周杰
Original assignee: First Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN112326763B

Abstract

本发明公开一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器，特点是通过巯基修饰DNA在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssDNA和dsDNA的界面型DNA纳米筛，其空腔大小可以通过改变巯基修饰DNA的浓度来调节，通过以[Ru(NH₃)₆]³⁺为氧化还原的电化学计时库仑法对界面上巯基DNA的间距进行表征，当巯基修饰DNA的间距小于dsDNA的长度时，dsDNA由于其刚性结构不能透过DNA纳米筛，而无规则卷曲结构的ssDNA由于其高度的柔韧性可以进入纳米筛，通过引入再生探针，构建了重现性性较好的DNA电化学模型。最后，我们以连接循环反应(LCR)为单链DNA扩增策略，构建了基于可再生纳米筛的DNA电化学传感器，实现了单个传感器的多个临床样本的连续检测。

Description

一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器

技术领域

本发明涉及可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器的制备方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

单核苷酸多态性（SNPs），也称点突变，是癌症诊断和预后有价值的遗传标志，也是预测药物疗效及耐药性的重要指标之一。目前，大多数应用于SNPs的检测方法是基于PCR扩增技术和直接测序法，但这些方法成本高、需要精密的仪器设备且对人工操作高要求，以及在检测低丰度点突变方面能力有待提高，因此，不适合作为临床常规性的诊断工具。DNA电化学传感器由于具有灵敏度高、成本低、信号读出方式简便以及易于微型化等优点，在SNP检测以及开发成床边检测工具方面具有其独特的优势。

随着工具酶、纳米材料及分子器件的引入，DNA电化学传感器的灵敏度和特异性不断提升，然而它的稳定性和重现性一直困扰着广大科研工作者。传感器在组装过程中不可避免会产生批间差异，即传感器间的差异（chip-to-chip variance），主要包括基底差异以及界面功能化修饰差异，是导致传感器重现性差的主要原因之一^[1]。而通过构建可再生传感器，实现单一传感器对多个样品的连续检测，可有效地消除传感器间的差异，不仅进一步降低成本，且提高了传感器的重现性、可靠性以及准确性^[2]。

为实现DNA电化学传感器的再生，已报道方法的切入点主要是考虑如何破坏DNA双链间的氢键，如通常采用改变pH值、提高温度和添加化学试剂（胍盐、尿素或甘氨酸等）^[3-7]等方法。然而，这些方法不仅会改变界面离子的种类和排布，还会不可逆地破坏界面上DNA捕获探针的二级结构，使DNA自组装单分子层的电荷和构象发生改变，难以获得持续且可靠的再生效果^[2]。因此，迫切需要从另一个角度来开发具有高稳定性和可靠性的可再生DNA电化学传感器。

通常，用于DNA检测的DNA电化学传感器的制备包括在电极表面上形成DNA 自组装单分子层（SAM），通过靶标诱导的三明治结构与标记探针进行非共价杂交，以及使用电化学技术监控电子转移过程。在“信号开”的检测模式下，通常需要采用“倒立型杂交三明治”使如亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）等电活性物质靠近电极表面。值得注意的是，这种倒立型杂交过程与通常在酶催化的DNA电化学传感器^[8]中使用的“正立型杂交模式”完全不同。对于后者，仅需要参与杂交的单链DNA（ssDNA）部分进入SAM即可完成杂交，但是，前者需要整个双链DNA（dsDNA）部分渗透进入SAM，使得突出的ssDNA与捕获探针充分碰撞才能形成三明治结构。据我们所知，ssDNA像羊毛球一样盘绕，而dsDNA具有像棍棒一样的刚性结构特征，因此，这种明显的柔韧性差异应使它们对SAM具有不同的渗透性。

基于以上讨论，本发明公开一种新型的可再生DNA电化学传感器，通过调节巯基修饰DNA浓度来对SAM的探针间距进行纳米调控，形成能够区分ssDNA和dsDNA的DNA纳米筛。我们假设，棒状dsDNA由于其长度大于纳米筛的腔长，会被阻挡在纳米筛之外，不能以倒置的形式与巯基修饰DNA杂交。相反，缠绕的ssDNA由于具有很高的柔韧性，可以很容易地渗透到纳米筛中，完成杂交。以往已有报道，短链寡核苷酸（8~12 bp）的杂交存在一个结合和解离的动态平衡过程，全内反射荧光显微镜证实了这一点^[9]。因此，当基于DNA纳米筛的电化学传感器检测ssDNA时，可以加入互补的DNA，我们称之为再生探针（RP），以打破ssDNA的平衡过程，形成的dsDNA会在纳米筛口被阻挡，导致ssDNA从SAM中被去除，电信号消失。通过这种方式，基于DNA纳米筛的电化学传感器可以容易地再生用于下一轮测试，而不会破坏DNA-SAM。本发明将ssDNA和dsDNA的柔韧性差异与短DNA双链的动态结合特性相结合，构建了一种基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感界面，同时以连接循环反应（LCR）为ssDNA扩增策略对CYP2C19等位基因进行差别化扩增，最终制备了一种可用于临床样品CYP2C19等位基因分型的可再生DNA电化学传感器，具有成本低、重现性好、准确度高以及单根电极可连续进行7次不同样品检测等优点，在临床应用方面具有非常重要的应用价值及实际意义。

参考文献：

[1] Gu, Q.; Nanney, W.; Cao, H.H.; Wang, H.; Ye, T. Single MoleculeProfiling of Molecular Recognition at a Model Electrochemical Biosensor. J.Am. Chem. Soc. 2018, 140(43), 14134-14143.

[2] Goode, J. A.; Rushworth, J. V.; Millner, P. A. Biosensorregeneration: a review of common techniques and outcomes. Langmuir 2015, 31(23), 6267-6276.

[3] Radi, A.-E.; Acero Sánchez, J. L.; Baldrich, E.; O'Sullivan, C. K.Reagentless, Reusable, Ultrasensitive electrochemical molecular beaconaptasensor. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128 (1), 117-124.

[4] Chen, J. Y.; Liu, Z. J.; Zheng, Y. J.; Lin, Z.; Sun; Z. L.; Liu, A.L.; Chen, W.; Lin, X. H. B/C genotyping of hepatitis B virus based on dual-probe electrochemical biosensor. J. Electroanal. Chem. 2017, 785, 75-79.

[5] Wang, T.; Viennois, E.; Merlin, D.; Wang, G. Microelectrode miRNAsensors enabled by enzymeless electrochemical signal amplification. Anal.Chem. 2015, 87 (16), 8173-8180.

[6] Wang, L. L.; Wen, Y. L.; Yang, X.; Xu, L.; Liang, W.; Zhu, Y.; Wang,L. H.; Li, Y.; Li, Y.; Ding, M.; Ren, S. Z.; Yang, Z. Z.; Lv, M.; Zhang, J.C.; Ma, K.; Liu, G. Ultrasensitive electrochemical DNA biosensor based on alabel-free assembling strategy using a triblock polyA DNA probe. Anal. Chem.2019, 91 (24), 16002-16009.

[7] Zeng, G. M.; Zhang, C.; Huang, D. L.; Lai, C.; Tang, L.; Zhou, Y. Y;Xu, P.; Wang, H.; Qin, L.; Cheng, M. Practical and regenerableelectrochemical aptasensor based on nanoporous gold and thymine-Hg2+-thyminebase pairs for Hg2+ detection. Biosens. Bioelectron. 2017, 90, 542-548.

[8] Wen, Y.; Li, L.; Li, J. DNA Framework-Mediated ElectrochemicalBiosensing Platform for Amplification-Free MicroRNA Analysis. Anal. Chem.2020, 92(6):4498-4503.

[9] Johnson-Buck, A.; Su, X.; Giraldez, M. D.; Zhao, M.; Tewari, M.;Walter, N. G. Kinetic fingerprinting to identify and count single nucleicacids. Nat. Biotechnol. 2015, 33 (7), 730-732。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器及其对CYP2C19等位基因分型的电化学传感方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面用于对CYP2C19等位基因分型的电化学传感方法，其特征是通过巯基修饰DNA（Capture Probe）在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssDNA和dsDNA的界面型DNA纳米筛，其空腔大小能通过改变巯基修饰DNA的浓度来调节，通过以[Ru(NH₃)₆]³⁺为氧化还原的电化学计时库仑法对界面上巯基修饰DNA的间距进行表征，当巯基修饰DNA的间距小于dsDNA的长度时，dsDNA由于其刚性结构不能透过DNA纳米筛，而无规则卷曲结构的ssDNA由于其高度的柔韧性能进入纳米筛，接着以连接酶循环反应为ssDNA扩增策略对样品中的等位基因进行扩增，用所构建的DNA纳米筛传感界面对ssDNA进行检测，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析；在检测完成后，加入再生探针破坏ssDNA的动态杂交过程，形成的dsDNA由于其刚性结构且长度大于巯基修饰DNA的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极能再生并用于下一次检测，单个传感器能对7个不同样品进行连续检测。

所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的制备方法，包括如下步骤：

（1）金电极用0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗；将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

（2）将巯基修饰DNA分别稀释至以下浓度： 2 μM、1 μM、800 nM、600 nM、500 nM、400nM、200 nM；取3 μl上述各浓度的巯基修饰DNA溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜后，以PBS洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mM MCH溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用；

（3）将步骤（2）获得的电极浸入PH=7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl中进行第一次计时电量法测量，电压0 V至-0.5 V，500 ms，记录截距值Q1；测量完成后将电极浸入50 μM氯化六胺合钌溶液中，室温孵育10 min，之后将电极用双蒸水彻底冲洗后再次浸入PH=7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl中进行第二次计时电量法测量，电压0 V至-0.5 V，500 ms，记录截距值Q2，并计算两次测量得到的截距值的差值：ΔQ=Q2-Q1；

（4）将步骤（3）得到的ΔQ代入以下公式：

,其中Γ₀表示限定在电极表面附近的氯化六胺合钌的量，n是每个氧化还原过程转移的电子数，n=1，F是法拉第常数：F=96485.33289±0.00059 C/mol，A是电极面积；将计算得到的Γ0代入公式：

，其中Γ_DNA表示界面巯基修饰DNA的密度，z是氧化还原分子所带的电荷量：z=3，m是巯基修饰DNA的碱基个数：m=63，N_A是阿伏伽德罗常数：N_A≈6.02×10²³；

（5）计算探针间距：每个巯基修饰DNA周围有一个圆圈面积，通过Γ_DNA值的倒数来估算这个面积，从而由这个圆圈面积的直径计算出DNA与DNA之间的平均距离；得到DNA间距小于17.34 nm的可再生DNA纳米筛电化学传感界面。

所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的再生方法，其特征是利用短寡核苷酸杂交的动态性，通过加入一条与被检测ssDNA部分互补的再生探针，在ssDNA处于杂交解离态时与其杂交形成dsDNA，所形成的dsDNA由于其刚性结构且几何长度大于纳米筛界面的空腔而被阻隔，从而使ssDNA从界面脱落，使传感界面实现再生并可用于下一次ssDNA的检测。

所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面构建及其对CYP2C19等位基因分型所涉及到的所有脱氧核苷酸序列，包括巯基修饰DNA，LCR引物AP与SP以及再生探针RP:

具体地说，本发明采用以下技术方案：

（一）基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的构建

根据文献报道，随着巯基修饰DNA（Capture Probe）的浓度的增加，在金电极界面所构建的DNA自组装层的密度就越大，即巯基修饰DNA间的距离减少。根据这一原理，首先将一系列浓度梯度的巯基修饰DNA（序列见表1）固定于金电极表面，接着用巯基己醇（MCH）对界面上剩余活性位点进行封闭，从而获得一定密度的DNA自组装层。接着利用氯化六胺合钌能与DNA磷酸骨架静电结合的特点，通过计时电量法对界面上捕获探针的密度以及间距进行定量分析。本发明所设计的CYP2C19等位基因目标序列长度为51 nt，可计算得出其与互补序列杂交后形成的DNA双链的几何长度为17.34 nm，因此我们以捕获探针间距小于17.34 nm时的巯基修饰DNA浓度为最优浓度用于后续实验。

（二）PCR扩增技术结合连接循环反应（LCR）对样品中的CYP2C19等位基因进行扩增

首先，从NCBI基因数据库Genbank中，查找CYP2C19*2全基因序列，选取含突变位点的基因片段共1170 nt，设计上下游引物对全血样品的核酸总提物进行扩增，接着利用耐热连接酶（Ampligase）具有特异性区分单碱基错配的能力，构建连接循环反应（LCR）信号放大体系，其原理见示意图1：存在完全互补的目标链时，AP（5’端的12个碱基可与捕获探针杂交）和SP（3’端修饰亚甲基蓝MB）与目标链杂交后形成含有缺口的双链DNA，Ampligase催化缺口处的3’-OH与5’-PO₄形成磷酸二酯键，94 ℃高温解链后得到加长的ssDNA（AP-SP），通过“94℃解链-53 ℃连接”的温度循环，得到大量的ssDNA扩增产物；若为点突变目标链，则AP、SP与其杂交后在缺口处存在碱基错配，此时Ampligase无法发挥其催化功能。

（三）基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感界面用于CYP2C19等位基因分型

将LCR扩增产物（AP-SP）与可再生DNA纳米筛电化学传感界面的捕获探针进行杂交，使SP末端的电活性物质亚甲基蓝（MB）靠近电极表面产生电子传递，通过方波伏安法对电信号进行采集并纪录峰电流值。接着加入再生探针RP，由于AP-SP与巯基修饰DNA的杂交区域只有12 bp，因此该杂交存在动态过程，RP会在AP-SP处于杂交解离态时与其杂交形成刚性DNA双链，由于其几何长度17 nm大于巯基修饰DNA间距而无法进入DNA自组装层进行杂交，从而使AP-SP从电极表面脱落，实现传感器再生并可接着进行下一个样品的检测。单个传感器可连续检测7个样品，最终根据每个样品所采集的峰电流大小可实现临床样品中CYP2C19等位基因准确分型。利用3个本发明所构建的可再生传感器对21例临床样品的检测结果如图2，方波伏安法峰电流值主要分布在3个区域：107 nA~144 nA（高）, 62 nA~74 nA（中）, 18 nA~30 nA（低）。对此，我们根据实验原理将信号落在高、中、低三个区域的样品分别判定为CYP2C19*2, CYP2C19*1 和 CYP2C19*1*2。同时，为了验证所构建的传感器检测的准确性，我们将这21例样品进行了测序（SNP检测的金标准），测序结果如图3所示，我们将电化学检测结果与测序结果进行比对，发现这两者结果完全吻合，证明了所构建的基于可再生纳米筛的DNA电化学传感器在临床样品核酸检测中具有高准确性。

由上述技术方案可知，本发明所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感器可用于临床样品中CYP2C19等位基因的准确分型，并且利用所设计的新型再生策略可实现单个传感器对7个不同样品的高通量检测，一方面消除传感器间的差异，提高了分析的准确度，另一方面进一步降低了检测成本。

附图说明

图1为基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感器的原理图。

图2为三个独立可再生传感器检测21例人的全血样品核酸总提物的PCR产物的检测图，图中：（A）为方波伏安法响应值，（B）为方波伏安法图。

图3为所检测的21例人的全血样品的基因测序图，其中第243个碱基为G的是CYP2C19*1纯野生基因型，为A的是CYP2C19*2纯突变基因型，为G/A的是CYP2C19*1*2杂合基因型。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感器，包括电极、巯基修饰DNA(Capture Probe)、LCR引物、耐热连接酶、巯基己醇和再生探针RP，电极优选金电极，LCR引物包括AP（5’端的12个碱基可与巯基修饰DNA杂交）和SP（3’端修饰亚甲基蓝MB），AP和SP与目标链杂交后形成含有缺口的双链DNA，耐热连接酶Ampligase催化缺口处的3’ OH与5’ PO₄形成磷酸二酯键，94 ℃高温解链后得到加长的ssDNA（AP-SP），通过“94 ℃解链-53 ℃连接”的温度循环，得到大量的ssDNA扩增产物；若为点突变目标链，AP、SP与其杂交后在缺口处存在碱基错配，此时Ampligase的催化效率将大大降低，因此得到的ssDNA较少。将扩增得到的ssDNA与通过金巯键固定于金电极表面的巯基修饰DNA杂交，使SP末端的短程电活性物质亚甲基蓝MB靠近电极表面产生电子传递，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析。在检测完成后，加入可再生探针破坏ssDNA的动态杂交过程，形成的dsDNA由于其刚性结构且长度大于捕获探针DNA的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极再生并可用于下一次检测，单个传感器可对7个不同样品进行连续检测，一方面消除传感器间的差异，提高了分析的准确度，另一方面进一步降低了检测成本。本发明中涉及的核酸序列表以及实施例所用的核酸序列表见表1，为已知产品，由Takara公司提供合成服务。

表1.本发明中涉及的核酸序列表

实施例1：

基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感界面用于临床样品中CYP2C19等位基因分型的步骤如下：

（1）在可再生DNA纳米筛电化学传感界面上滴加3 μl的LCR反应液，室温杂交1 h，用10mM 的PBS洗液（pH 7.4）冲洗电极表面，除去未杂交的DNA链，再用双蒸水冲洗后待测；

（2）将步骤（2）制得的电极浸入电解液（10 mM PBS, 1 M NaCl, PH=7.4）中，初始电位为-0.05 V, 终电位为-0.45 V，频率为100 hz，振幅为25 mV ,记录方波伏安法电流曲线后用PBS小心冲洗，氮气吹干备用。

（3）将3 μl再生探针RP（1 μM）滴加到步骤（5）得到的电极表面，室温孵育5 min，用双蒸水冲洗后氮气吹干后重复步骤（1）、步骤（2）进行下一个样品检测。单个传感器可进行7次检测。

实施例2：

上述实施例1中的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛电化学传感界面的制备步骤如下：

（1）金电极用0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

（2）将巯基修饰DNA分别稀释至以下浓度： 2 μM、1 μM、800 nM、600 nM、500 nM、400nM、200 nM。取3 μl各浓度的巯基修饰DNA溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜（16 h）后，以PBS洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mM 巯基己醇溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用。

（3）将步骤（2）获得的电极浸入10 mM Tris-HCl（PH=7.4）进行第一次计时电量法测量（电压0 V至-0.5 V，500 ms），记录截距值Q1。测量完成后将电极浸入50 μM氯化六胺合钌溶液中，室温孵育10 min，之后将电极用双蒸水彻底冲洗后再次浸入10 mM Tris-HCl（PH=7.4）进行第二次计时电量法测量（电压0 V至-0.5 V，500 ms），记录截距值Q2，并计算两次测量得到的截距值的差值：ΔQ=Q2-Q1。

（4）将步骤（3）得到的ΔQ代入以下公式：

,其中Γ₀表示限定在电极表面附近的氯化六胺合钌的量，n是每个氧化还原过程转移的电子数（n=1），F是法拉第常数（F=96485.33289±0.00059 C/mol），A是电极面积。将计算得到的Γ0代入公式：

，其中Γ_DNA表示界面巯基修饰DNA的密度，z是氧化还原分子所带的电荷量（z=3），m是巯基修饰DNA的碱基个数（m=63），N_A是阿伏伽德罗常数（N_A≈6.02×10²³）。

（5）计算探针间距：假设每个巯基修饰DNA周围有一个圆圈面积，通过Γ_DNA值的倒数来估算这个面积，从而由这个圆圈面积的直径计算出DNA与DNA之间的平均距离。得到DNA间距小于17.34 nm的可再生DNA纳米筛电化学传感界面。

实施例3：

上述实施例1所用到的LCR反应液的制备：将4 μl AP（1 μM）、4 μl SP（1 μM）、0.2 μlAmpligase（5 U/μl, 购自美国Lucigen公司）、5.0 μl Reaction Buffer（10×，购自美国Lucigen公司）与1 μl CYP2C19等位基因PCR扩增产物的混合溶液充分混匀，放入PCR仪进行扩增，反应条件：53 ℃ 2 min - 94 ℃ 1 min，30个循环。反应完成后，加入2.63 μl的0.2M 磷酸盐缓冲液（PH=7.4）。

实施例4：

上述实施例2所用的CYP2C19等位基因PCR扩增产物的制备方法：将1 μl的正向引物（5’-AAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGA-3’）、1 μl反向引物（5’-ACTCCTTGACCTGTTAAACATCCGT-3’）、1 μl模板、1 μl dNTP (10 mM, 购自上海生工公司)、5 μl Taq Buffer（购自上海生工公司）、5 μl MgCl₂（25 mM，购自上海生工公司）、0.5 μl Taq酶（5 U/μL，购自上海生工公司）与15.5 μl 水的混合溶液充分混匀，放入PCR仪进行反应，反应条件：95 ℃预变性3 min后，“94 ℃ 30s -55 ℃ 35s - 72 ℃ 45s”30个循环，最后72 ℃修复延伸7 min。

实施例5：

Claims

1.一种基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面用于对CYP2C19等位基因分型的电化学传感方法，其特征是通过巯基修饰DNA（Capture Probe）在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssDNA和dsDNA的界面型DNA纳米筛，其空腔大小能通过改变巯基修饰DNA的浓度来调节，通过以[Ru(NH₃)₆]³⁺为氧化还原的电化学计时库仑法对界面上巯基修饰DNA的间距进行表征，当巯基修饰DNA的间距小于dsDNA的长度时，dsDNA由于其刚性结构不能透过DNA纳米筛，而无规则卷曲结构的ssDNA由于其高度的柔韧性能进入纳米筛，接着以连接酶循环反应为ssDNA扩增策略对样品中的等位基因进行扩增，用所构建的DNA纳米筛传感界面对ssDNA进行检测，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析；在检测完成后，加入再生探针破坏ssDNA的动态杂交过程，形成的dsDNA由于其刚性结构且长度大于巯基修饰DNA的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极能再生并用于下一次检测，单个传感器能对7个不同样品进行连续检测。

2.权利要求1所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的制备方法，包括如下步骤：

金电极用0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗；将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

将巯基修饰DNA分别稀释至以下浓度： 2 μM、1 μM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、200 nM；取3 μl上述各浓度的巯基修饰DNA溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜后，以PBS洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mM MCH溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用；

（4）将步骤（3）得到的ΔQ代入以下公式：

3.权利要求1所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的再生方法，其特征是利用短寡核苷酸杂交的动态性，通过加入一条与被检测ssDNA部分互补的再生探针，在ssDNA处于杂交解离态时与其杂交形成dsDNA，所形成的dsDNA由于其刚性结构且几何长度大于纳米筛界面的空腔而被阻隔，从而使ssDNA从界面脱落，使传感界面实现再生并可用于下一次ssDNA的检测。

4.权利要求1所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面构建及其对CYP2C19等位基因分型所涉及到的所有脱氧核苷酸序列，包括巯基修饰DNA，LCR引物AP与SP以及再生探针RP:

。