CN111549103B - 一种基于一步触发的分支dna纳米结构的微小rna检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于目标微小RNA诱导的分支DNA纳米结构，开发了一种简单且超灵敏的微小RNA检测方法。双链体两侧的短DNA单链尾巴可以用发夹DNA4和发夹DNA5启动第二级HCR扩增，以在形成的长双螺旋DNA的两侧产生许多长双链体由此形成的支链DNA纳米结构可以携带大量的甲基蓝，可以有效增强电化学信号并实现低检测限。重要的是，该策略提供了简单的操作，良好的可靠性和超高灵敏度。它已成功应用于人体血清样品，显示出令人满意的结果和有希望的未来。重要的是，一站式方法可以极大地减少操作步骤并避免由于多个操作步骤而导致的系统错误。

Description

一种基于一步触发的分支DNA纳米结构的微小RNA检测方法
技术领域
本发明涉及微小RNA的检测领域，特别是基于一步触发的分支DNA纳米结构的微小RNA检测方法领域。
背景技术
微小RNA是一类小的非编码RNA，长度约为19-23nt。它已成为转录后调节剂，在每个基本生物学过程(例如增殖，分化和凋亡)中都发挥着重要作用。据报道，许多人类微小RNA在疾病病因中的整个基因组中表达，例如包括癌症，心血管疾病和阿尔茨海默氏病。研究微小RNA的表达对于早期癌症的诊断和预后过程具有重要价值。因此，非常需要开发一种用于微小RNA检测的方法，尤其是对于复杂的临床样本和单细胞。一些现有技术显示出用于微小RNA临床诊断的潜力，包括RNA印记技术(Northern blot)和微阵列。但是，它们在临床应用中灵敏度低。
PCR被认为是用于核酸检测的有效扩增策略。然而，微小RNA的短长度要求对典型的PCR技术进行短的引物设计，从而降低PCR的效率并增加非特异性扩增的机会。与PCR相比，杂交链反应(HCR)是一种强大的核酸定量方法，无需精确的温度控制循环和昂贵的酶。重要的是，由HCR形成的DNA双链体是高度有序的。可以在这些螺旋上精确控制信号分子的密度，从而提供较高的扩增效率。因此，它已通过与电化学，比色法，荧光，电化学发光，增强拉曼散射或表面偶联，用于检测DNA，金属离子，生物小分子和蛋白质。目前，还未有将杂交链反应(HCR)用于微小RNA的检测的先例。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于一步触发的分支DNA纳米结构的微小RNA检测方法。
本发明包括如下步骤：
一种基于一步触发的分支DNA纳米结构的微小RNA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备发夹DNA1-5结构；
(2)准备金电极；
(3)将发夹DNA1固定到金电极表面上；
(4)在含有目标微小RNA的溶液中加入适量步骤(1)制备的发夹DNA2-5结构形成待测溶液；
(5)将步骤(3)制备的金电极浸入步骤(4)所得待测溶液中进行孵育；
(6)将步骤(5)所得电极浸入甲基蓝溶液中；
其中，用方波伏安法扫描步骤(2)、(3)、(5)、(6)所得电极和测定其电化学阻抗谱信号，其中，用方波伏安法扫描步骤(6)所得电极，并将所得电流信号用于微小RNA浓度的计算；所述计算的方法为：利用方波伏安扫描法所得电流信号随着微小RNA浓度的增加而增加的标准曲线计算待测溶液中微小RNA浓度，
其中，微小RNA序列，发夹DNA1-5序列如下表：
Figure BDA0002454841110000021
优选的，步骤(1)中，发夹DNA1-5结构是通过将序列在90℃退火5分钟并冷却至室温而形成的。
优选的，步骤(2)中，金电极用0.05μm氧化铝粉末抛光，并在水中超声处理。
优选的，步骤(3)中，将含1M NaCl的10mM PBS中的10μM发夹DNA1滴到金电极表面上，过夜，然后，添加1mM MCH并孵育2h以防止非特异性吸附。
优选的，步骤(4)待测溶液为：500nM的发夹DNA2-5和目标微小RNA溶于含有0.5MNaCl的pH 7.2的50mM PBS。
优选的，步骤(5)中，孵育时间为4小时。
优选的，步骤(6)中，将步骤(5)所得电极浸入20μMMB中并搅拌10分钟，之后，用PBS洗涤电极以去除非特异性结合的MB。
优选的，方波伏安法(SWV)在10mM PBS溶液(pH 7.2)中以25mV的振幅从-0.40到0.00V扫描电极。
本发明基于目标微小RNA诱导的分支DNA纳米结构，开发了一种简单且超灵敏的微小RNA检测方法。目标微小RNA可以与金电极表面的发夹DNA1(H1)杂交并诱导发夹的打开。随后，暴露于发夹末端以启动两个交替发夹DNA(发夹2(H2)，发夹3(H3))之间的第一级HCR(HCR-1)扩增，并产生一个长双螺旋DNA，其中含有大量伸出长双螺旋DNA的短DNA单链尾巴。双链体两侧的短DNA单链尾巴可以用发夹DNA4(H4)和发夹DNA5(H5)启动第二级HCR(HCR-2)扩增，以在形成的长双螺旋DNA的两侧产生许多长双链体由此形成的支链DNA纳米结构可以携带大量的甲基蓝(MB)，可以有效增强电化学信号并实现低检测限。重要的是，该策略提供了简单的操作，良好的可靠性和超高灵敏度。它已成功应用于人体血清样品，显示出令人满意的结果和有希望的未来。重要的是，一站式方法可以极大地减少操作步骤并避免由于多个操作步骤而导致的系统错误。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2A和2B为最佳检测过程的整个过程通过循环伏安图(CV)和电化学阻抗谱(EIS)；图2C为不同样品或检测过程的电流强度对比图。
图3A为电流强度-孵育时间图,图3B为电流强度-H2和H3的浓度图，图3C为电流强度-H4和H5的浓度图，图3D为电流强度-电极浸入甲基蓝溶液时间图。
图4A为不同浓度的微小RNA的电化学信号图，图4B为电化学信号--微小RNA的不同浓度线性图，图4C为空白，随机DNA，随机RNA，单碱基错配微小RNA(smRNA)和微小RNA的电化学信号对比图。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明作进一步详细的说明。
如图1所示，本发明的原理为：H1通过5个引发基上的巯基固定在金电极表面。然后使用MCH封闭表面并减少非特异性吸附，从而提高杂交效率和表面结合发夹DNA的可及性。目标微小RNA可以与H1杂交，从而暴露H1的末端。H1的末端与H2的脚趾和茎部区域互补，从而导致H2开口并暴露H2的末端。H2的末端可以展开H3并释放H3的末端。H3的释放端与H1的有效部分顺序相同。因此，可以触发H2和H3之间的HCR-1形成一个长刻痕的dsDNA，侧面带有一些捕获探针。然后，双链体两侧的捕获探针可以在两个交替的发夹DNA(H4和H5)之间启动HCR-2。因此，形成了分支的DNA纳米结构，并且许多MB可以插入形成的分支的DNA纳米结构的碱基对中，从而导致电化学信号强度的显著放大。
下列实验验证了本发明检测方法的可行性：将最佳检测过程的检测结果和改变最佳检测过程的部分条件后的检测结果进行对比(如图2C所示)，证明本方法的可行性。所述最佳检测过程为：发夹DNA1-5结构是通过将序列在90℃退火5分钟并冷却至室温而形成的。金电极用0.05μm氧化铝粉末抛光，并在水中超声处理。将含1M NaCl的10mM PBS中的10μM发夹DNA1滴到金电极表面上，过夜。然后，添加1mM MCH并孵育2h以防止非特异性吸附。将制备的电极与待测溶液(500nM的H2和H3、2μM的H4和H5和目标微小RNA在含有0.5M NaCl的pH7.2的50mM PBS中)孵育4小时。MB用作电子转移介体，插入形成的分支双链DNA的碱基对中。因此，将电极浸入20μMMB中并搅拌10分钟。之后，用PBS洗涤电极以去除非特异性结合的MB。用方波伏安法(从-0.40到0.00V，振幅25mV)。扫描每个步骤所得电极和测定其电化学阻抗谱信号。最后步骤用方波伏安法扫描所得电极得到的电流强度信号为图2C中样品5的信号。最佳检测过程的整个过程通过循环伏安图(CV)和电化学阻抗谱(EIS)进行表征。如图2A和B所示，裸露的金电极显示一对[Fe(CN)6]-3/-4可逆的氧化还原峰和小的半圆形畴(曲线a)，表明其良好的电荷转移性质。H1固定在金表面上后，氧化还原峰电流明显降低，EIS的半圆增大(曲线b)，这是由于H1的带负电的磷酸盐骨架与[Fe(CN)6]-3/-4。用MCH处理后，电极的氧化还原峰和电子转移电阻继续变差(曲线c)。与目标微小RNA反应后，CV和EIS的变化很小，这是由电极上更多带负电荷的DNA引起的(曲线d)。HCR-1在H2和H3之间时，电流显著下降，EIS明显增加，这归因于长dsDNA引起的高静电排斥力和电极界面的电阻(曲线e)。最后，在HCR-2在H4和H5之间(曲线f)之后，氧化还原峰值电流进一步减小，并且电子转移电阻增加(曲线f)，这意味着形成了分支的DNA纳米结构。
样品1为空白溶液，即，待测液中不含有微小RNA，其余过程同最佳检测过程，没有微小RNA的空白样品显示的电化学信号可忽略不计(图2C中样品1的信号)，表明如果没有微小RNA，则无法启动HCR扩增。
样品2为待测溶液是500nM的H2和H3和目标微小RNA在含有0.5M NaCl的pH 7.2的50mM PBS中，即，待测溶液中不含H4和H5，其余过程同最佳检测过程，信号显示出弱的电流强度(图2C中样品2的信号)，表明在存在H2和H3的情况下只有HCR-1才被激活。
样品3为待测溶液是2μM的H4和H5和目标微小RNA在含有0.5M NaCl的pH 7.2的50mM PBS中，即，待测溶液中不含H2和H3，其余过程同最佳检测过程，所测得的电流强度与空白样品相似(图2C中样品3的信号)，这表示仅使用H4和H5不能触发两个HCR的扩增。
样品4为电极与待测溶液孵育2小时，该孵育时间为最佳检测过程相应孵育时间的一半，其余过程同最佳检测过程，信号显示出相对弱的电化学信号(图2C中样品4的信号),因为仅半数HCR孵育时间的HCR扩增不完全。
实验条件的优化
优化了一些关键参数以提高灵敏度，包括HCR孵育时间，发夹DNA浓度和MB嵌入时间。如图3A所示，电化学信号随孵育时间逐渐增加。该信号在4小时左右变得稳定，表明反应在4小时内完成。H2和H3的浓度影响HCR-1扩增反应。结果表明，当H2和H3的浓度约为500nM时，信号电平趋于平稳(图3B)。此外，H4和H5的浓度极大地影响了HCR-2扩增反应(图3C)。结果表明，当H4和H5的浓度为2μM时，信号变得稳定。MB的插入时间影响插入分支的DNA纳米结构碱基对的MB数量。信号随时间急剧上升，并在10分钟后到达平台(图3D)。根据这些结果，最佳孵育时间为4h，H2和H3的最佳浓度为500nM，H4和H5的最佳浓度为2μM，MB的最佳嵌入时间为10分钟。
为了评估该方法的分析性能，将其用于检测不同浓度的微小RNA。如图4(A)所示，方波伏安扫描法所得电流信号随着微小RNA浓度的增加而逐渐增加。图4(B)显示，微小RNA浓度从10fM到50pM与方波伏安扫描法所得电流信号之间表现出良好的线性关系。线性回归方程为I(μA)＝0.376logC微小RNA+6.003，线性相关系数为0.991。此外，检测极限(LOD)估计为2fM，乘以3σ(空白值的三倍标准偏差，n＝6)。
该方法的选择性由不同的样品评估，包括空白，随机DNA，随机RNA，单碱基错配微小RNA(smRNA)和微小RNA(图4C)。结果表明，随机DNA和随机RNA的强度与空白样品相似。对于smRNA表现出较弱的电流响应，对于目标微小RNA表现出较强的电流响应，这表明只有目标微小RNA才能有效地引起两种水平的HCR扩增策略并形成分支DNA纳米结构。这些结果表明该方法对微小RNA检测具有令人满意的选择性。
通过使用标准添加方法检测人血清样品中的微小RNA来评估该电化学生物传感器的性能。通过将不同浓度的微小RNA加入10倍稀释的健康人血清中来制备分析样品。如表1所示，回收率从92.0％更改为104.4％，六个重复项的RSD从5.68％更改为8.78％。这些结果表明，该方法在实际人血清中检测微小RNA具有广阔的前景。
Figure BDA0002454841110000061
表1不同浓度的微小RNA加入10倍稀释的健康人血清中产生的电化学信号
总之，本发明通过一步操作通过两次HCR扩增形成分支的DNA纳米结构实现超灵敏的微小RNA检测。该策略显示出对目标微小RNA的高度敏感性和可靠性。它也已成功地用于检测人血清样品中的微小RNA，显示出巨大的应用前景。该策略仅需一步操作即可完成分支DNA纳米结构的形成，大大简化了实验程序，减少了系统误差的影响。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种非诊断目的的基于一步触发的分支DNA纳米结构的微小RNA检测方法，包括如下步骤：
（1）制备发夹DNA1、发夹DNA2、发夹DNA3、发夹DNA4和发夹DNA5结构；
（2）准备金电极；
（3）将发夹DNA1固定到金电极表面上；
（4）在含有目标微小RNA的溶液中加入步骤（1）制备的发夹DNA2、发夹DNA3、发夹DNA4和发夹DNA5结构形成待测溶液；
（5）将步骤（3）制备的金电极浸入步骤（4）所得待测溶液中进行孵育；
（6）将步骤（5）所得电极浸入甲基蓝溶液中；
其中，用方波伏安法扫描步骤（6）所得电极，并将所得电流信号用于微小RNA浓度的计算；所述计算的方法为：利用方波伏安扫描法所得电流信号随着微小RNA浓度的增加而增加的标准曲线计算待测溶液中微小RNA浓度，
其中，微小RNA序列：AGCUGGUAAAAUGGAACCAAAU，发夹DNA1序列：GGTTTGGAACCAAATGCCTTAGCGATTTGGTTCCATTTTACCAGCTGCGGTGAAGCAGCGTG，发夹DNA2序列：TTAACCGGCATTTGGTTCCAAACCCAAAGTGGTTTGGAACCAAATGCCTCCTCTAATACACTCACTAT，发夹DNA3 序列：GGTTTGGAACCAAATGCCTTAGCGGGCATTTGGTTCCAAACCACTTTGTCCTCTAATACACTCACTAT，发夹DNA4 序列：AATACACTCACTATGAATGAATAGTGAGTGTATTAGAGGA，发夹DNA5 序列：TCATTCATAGTGAGTGTATTTCCTCTAATACACTCACTAT。
2.如权利要求1所述方法，其中，步骤（1）中，发夹DNA1、发夹DNA2、发夹DNA3、发夹DNA4和发夹DNA5结构是通过将序列在90℃退火5分钟并冷却至室温而形成的。
3.如权利要求1或2所述方法，其中，步骤（2）中，金电极用0.05μm氧化铝粉末抛光，并在水中超声处理。
4.如权利要求1或2所述方法，其中，步骤（3）中，将含1 M NaCl的10 mM PBS中的10μM发夹DNA1滴到金电极表面上，过夜，然后，添加1 mM MCH并孵育2 h以防止非特异性吸附。
5.如权利要求1或2所述方法，其中，步骤（4）形成的待测溶液为：500 nM的发夹DNA1、发夹DNA2、发夹DNA3、发夹DNA4、发夹DNA5和目标微小RNA溶于含有0.5 M NaCl的pH 7.2的50mM PBS。
6.如权利要求1或2所述方法，其中，步骤（5）中，孵育时间为4小时。
7.如权利要求1或2所述方法，其中，步骤（6）中，将步骤（5）所得电极浸入20μM的MB中并搅拌10分钟，之后，用PBS洗涤电极以去除非特异性结合的MB。
8.如权利要求1或2所述方法，其中，方波伏安法（SWV）在pH 7.2的10 mM PBS溶液中以25 mV的振幅从-0.40到0.00 V扫描电极。
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