CN103353529B - 检测h7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极是利用甲壳胺修饰石墨烯负载金纳米粒子并得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物，将纳米复合物用于修饰金电极，而后固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体而得。实验显示，本发明对目标病毒H7的检测敏感度为102.3EID50/mL，对非目标禽病原体，检测时其特征吸收峰没有发生改变，表明该传感器具有很高的敏感性和特异性，在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。

Description

检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感器，尤其涉及一种检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法。
背景技术
H7亚型禽流感(AIV H7)不仅严重地影响养禽业的发展，而且危害人类的健康。因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测H7亚型禽流感病毒的方法对于防控H7亚型禽流感传播具有重要的意义。目前，用于检测AIV的方法有病毒分离鉴定、酶联免疫吸附(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核酸序列扩增(NASBA)以及环介导等温扩增(LAMP)。其中，病毒分离鉴定最为准确，但操作繁杂、耗时较长。ELISA、RT-PCR、NASBA、LAMP等方法能够检测出各种样品中的H7亚型禽流感病毒，但在实际应用中均存在一定的缺陷，因此研究工作者们致力于开发更为出色的新型检测方法和试剂。
近年来，生物传感器由于具有操作简便、灵敏、快速、所需样品少等优点，在病原微生物快速检测中的应用日益受到各国学者的重视。电化学免疫传感器将电化学分析和免疫分析方法相结合，既具备电化学分析特有的检测快速、操作简单、灵敏度高、仪器可微型化等优点，也具有免疫反应中特有的抗原-抗体特异性结合的特点。如今，电化学免疫传感器已经成功应用于环境分析、食品工业和临床医学。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好、敏感度高的检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极是利用甲壳胺修饰石墨烯负载金纳米粒子并得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物，将纳米复合物用于修饰金电极，而后固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体而得。
上述检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极。
上述检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器的制备方法，采用饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，工作电极是利用甲壳胺修饰石墨烯负载金纳米粒子并得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物，将纳米复合物用于修饰金电极，而后固定H7 亚型禽流感病毒单克隆抗体而得。
工作电极按以下步骤制备：
<1>石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物的制备
将0.5g的甲壳胺加入到100mL体积浓度1.0%醋酸溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.5wt%甲壳胺溶液；将1mg石墨烯加入到1mL0.5wt%甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的石墨烯-甲壳胺悬浊液；
取1mL质量浓度1.0%HAuCl4溶液加入到制备好的石墨烯-甲壳胺悬浊液中，室温下搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物；
<2>工作电极的制备
用移液枪移取8μL步骤<1>的石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到金电极(GE, =3mm)表面，4℃下自然晾干，然后滴涂15μL 0.1mg/mL H7亚型禽流感病毒单克隆抗体置于4℃下反应8小时，再滴涂15μL1wt%BSA溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，即可。
步骤<1>的石墨烯按以下步骤制备：冰水浴条件下，在200mL的烧杯中加入1g石墨粉、2.5g硝酸钾、100mL浓H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g KMnO4，随后将烧杯置于35℃水浴反应2h，逐步加入100mL去离子水，温度升至95℃继续反应1h，混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL水稀释，并加入质量分数为30%的H2O2中和未反应的高锰酸钾，先用0.5mol/L的盐酸洗涤，再用水反复离心洗涤，真空干燥，即得氧化石墨；称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100mL去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯；再以硼氢化钠作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯。
步骤<2>的金电极先以0.05μm的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min，用N2吹干；然后在0.5mol·L-1H2SO4溶液中用循环伏安进行扫描，扫描前通入N2除氧15min，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N2吹干待用。
针对目前H7亚型禽流感病毒检测存在的不足，发明人构建了检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，该传感器的工作电极用甲壳胺包裹石墨烯，还原HAuCl4得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物用于修饰金电极固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。本发明的电化学免疫传感器利用抗体和不同浓度的抗原反应，改变电极界面的电子传导能力 引起响应电流值的变化，从而可实现对抗原定量分析检测的目的。实验显示，本发明对目标病毒H7的检测敏感度为102.3EID50/mL，对非目标禽病原体，如H5和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、喉气管炎病毒（LTV）和传染性支气管炎病毒（IBV）等检测时其特征吸收峰没有发生改变，表明该传感器具有很高的敏感性和特异性，在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器制备过程中不同电极修饰材料的循环伏安曲线图，图中：a裸金电极，b Au-Chi-G修饰，c MAb/H7固定，d BSA封闭。
图2是本发明H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器的敏感实验循环伏安曲线图，图中：1 0（阴性），2 101.3EID50/mL，3 102.3EID50/mL，4 103.3EID50/mL，5 104.3EID50/mL，6 105.3EID50/mL，7 106.3EID50/mL，8 107.3EID50/mL。
具体实施方式
检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器实验研究
1材料与方法 
1.1毒株
灭活H5N1亚型禽流感病毒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；H7、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、喉气管炎病毒（LTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）由广西壮族自治区兽医研究所保存。
1.2试剂和仪器 
CHI660D电化学工作站(北京华科普天科技责任有限公司)，KQ-250DB型数控超声清洗器(昆山市超生仪器有限公司)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，旋涡混合器(北京金北德工贸有限公司)，离心机(BECKMAN COULTER)，真空干燥箱（郑州长城科工贸有限公司）。
氯金酸及牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购自Sigma公司；K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、甲壳胺、无水乙醇、柠檬酸三钠和硫酸等均为国产分析纯，实验用水为二次去离子水；H7亚型禽流感病毒单克隆抗体购自abcam公司，产品代码ab82458。
1.3石墨烯（G）的制备
根据Hummer方法改进后制备氧化石墨烯，具体步骤如下：冰水浴条件下，在200mL的烧杯中加入1g石墨粉、2.5g硝酸钾、100mL浓H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g KMnO4，随后将烧杯置于35℃水浴反应2h，逐步加入100mL去离子水，温度升至95℃继续反应1h， 混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL水稀释，并加入质量分数为30%的H2O2中和未反应的高锰酸钾，先用0.5mol/L的盐酸洗涤，再用水反复离心洗涤，真空干燥，即得氧化石墨；称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100mL去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯(GO)；再以硼氢化钠(NaBH4)作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯（G）。1.4石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子（G-Chi-Au）纳米复合物的制备
将0.5g的甲壳胺(Chi)加入到100mL1.0%(V/V)醋酸溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.5wt%甲壳胺溶液；将1mg石墨烯加入到1mL0.5wt%甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的石墨烯-甲壳胺（G-Chi）悬浊液；
取1mL质量浓度1.0%HAuCl4溶液加入到制备好的石墨烯-甲壳胺悬浊液中，室温下搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子（G-Chi-Au）纳米复合物。
1.5工作电极和传感器的制备及检测
采用饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，工作电极按以下步骤制备：
金电极(GE,=3mm)先以0.05μm的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min，用N2吹干；然后在0.5mol·L-1H2SO4溶液中用循环伏安进行扫描，扫描前通入N2除氧15min，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N2吹干待用。
用移液枪移取8μL上述石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到金电极表面，4℃下自然晾干，然后滴涂15μL 0.1mg/mL H7亚型禽流感病毒单克隆抗体(MAb/H7)置于4℃下反应8小时，再滴涂15μL1wt%BSA溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，即可。
检测时，在工作电极上滴涂15μL待测样品37℃下反应40min，用二次去离子水反复离心洗涤3次，置于5mM K4Fe(CN)6、5mM K3Fe(CN)6和0.1M KCl的0.01mol/L PBS(pH=7.0)缓冲溶液中进行循环伏安测试(CV)，电化学工作站的CV测定参数：电位扫描范围-0.2～0.6V，扫描速率为0.05V/s。
2结果
2.1电极修饰过程的电化学表征
如图1所示，金电极在含有5mM Fe(CN)6 3-/4-+0.1M KCl的0.01mol/L PBS(pH7.0)缓冲溶液中出现氧化还原特征峰。当金电极上覆盖了一层Au-Chi-G之后，其氧化还原峰 电流值增加，这是因为金纳米粒子和石墨烯的修饰有效地提高了电极表面的电子传导能力。随后，滴涂了MAb/H7、BSA后，其循环伏安扫描的响应电流值明显下降，这是因为MAb/H7、BSA是蛋白分子物质，阻碍了电极表面的电子转移通道。
2.2特异性实验结果
用上述制备的H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器对其它鸡的病原体（包括：H5和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、喉气管炎病毒（LTV）和传染性支气管炎病毒（IBV））进行特异性试验，结果显示，该传感器只有在H7存在时CV的氧化还原峰电流值降低，而其他病原体其CV的氧化还原峰电流值几乎不发生改变，表明该传感器特异性好。
2.3敏感性实验结果
对病毒含量为107.3EID50/mL的H7亚型禽流感病毒液进行10倍倍比稀释，各取15μL用本发明的传感器检测，结果在10-5稀释时其响应电流值仍然明显下降，可见传感器最低检出量为102.3EID50/mL（见图2）。

Claims (6)

1.一种检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，其特征在于：所述工作电极是利用甲壳胺修饰石墨烯负载金纳米粒子并得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物，将纳米复合物用于修饰金电极，而后固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体而得；所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极；
所述工作电极按以下步骤制备：
<1>石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物的制备
将0.5g的甲壳胺加入到100mL体积浓度1.0％醋酸溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.5wt％甲壳胺溶液；将1mg石墨烯加入到1mL 0.5wt％甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的石墨烯-甲壳胺悬浊液；
取1mL质量浓度1.0％HAuCl4溶液加入到制备好的石墨烯-甲壳胺悬浊液中，室温下搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物；
<2>工作电极的制备
用移液枪移取8μL步骤<1>的石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到直径为3毫米的金电极表面，4℃下自然晾干，然后滴涂15μL 0.1mg/mL H7亚型禽流感病毒单克隆抗体置于4℃下反应8小时，再滴涂15μL 1wt％BSA溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，即可。
2.根据权利要求1所述的检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，其特征在于：所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极。
3.根据权利要求1所述检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于采用饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，工作电极是利用甲壳胺修饰石墨烯负载金纳米粒子并得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物，将纳米复合物用于修饰金电极，而后固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体而得。
4.根据权利要求3所述检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于工作电极按以下步骤制备：
<1>石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物的制备
将0.5g的甲壳胺加入到100mL体积浓度1.0％醋酸溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.5wt％甲壳胺溶液；将1mg石墨烯加入到1mL 0.5wt％甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的石墨烯-甲壳胺悬浊液；
取1mL质量浓度1.0％HAuCl4溶液加入到制备好的石墨烯-甲壳胺悬浊液中，室温下搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物；
<2>工作电极的制备
用移液枪移取8μL步骤<1>的石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到直径为3毫米的金电极表面，4℃下自然晾干，然后滴涂15μL 0.1mg/mL H7亚型禽流感病毒单克隆抗体置于4℃下反应8小时，再滴涂15μL 1wt％BSA溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，即可。
5.根据权利要求4所述检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于步骤<1>的石墨烯按以下步骤制备：冰水浴条件下，在200mL的烧杯中加入1g石墨粉、2.5g硝酸钾、100mL浓H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g KMnO4，随后将烧杯置于35℃水浴反应2h，逐步加入100mL去离子水，温度升至95℃继续反应1h，混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL水稀释，并加入质量分数为30％的H2O2中和未反应的高锰酸钾，先用0.5mol/L的盐酸洗涤，再用水反复离心洗涤，真空干燥，即得氧化石墨；称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100mL去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯；再以硼氢化钠作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯。
6.根据权利要求4所述检测H7亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤<2>的金电极先以0.05μm的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min，用N2吹干；然后在0.5mol·L-1H2SO4溶液中用循环伏安进行扫描，扫描前通入N2除氧15min，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N2吹干待用。
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