CN110031524A - 测定多巴胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了测定多巴胺的方法，所述方法包括：提供传感器，所述传感器包括：碳纤维电极，所述碳纤维电极与栅极相连；叉指电极，所述叉指电极具有两端，其中一端与源极相连，另一端与漏极相连；参比电极，所述参比电极与所述源极相连；将所述碳纤维电极、参比电极和叉指电极插入待测液中，向所述栅极施加扫描电压，以便确定所述待测液中多巴胺含量，其中，所述扫描电压的扫描速度不低于50V/s。本发明通过提高扫描电压的扫描速度，可以有效放大检测信号，提高传感器的灵敏度，尤其适用于检测低浓度多巴胺。同时，可以缩短平衡时间，提高时空分辨率，有利于实时记录检测信号。由此，具有广泛的应用前景。

Description

测定多巴胺的方法
技术领域
本发明涉及材料领域。具体地，本发明涉及测定多巴胺的方法。
背景技术
多巴胺作为神经系统中重要的儿茶酚胺类神经递质，对人体许多方面的生理病理过程具有至关重要的作用。因此，多巴胺浓度变化的精准测量对研究神经系统中多巴胺相关的生理病理过程具有重要的意义。现有的高灵敏多巴胺检测方法一般是将样品分离技术与分析检测技术相结合，但这些方法由于时空分辨率低、仪器和操作条件比较复杂并不适合脑内多巴胺原位分析。而电化学方法具有高时空分辨率、高灵敏等特点，是在活体层次研究生理活性分子变化规律的重要方法。在现有的电化学方法中，由美国Wightman教授发展起来的快速扫描循环伏安法被广泛地用于多巴胺的活体实时分析，且具有相对较高的选择性。然而，该方法只能用于脑内多巴胺变化值的研究，且受限于其相对大的背景电流，因此对低浓度多巴胺的测定也具有非常大的挑战。
近年来，生物电子学作为一个高度跨学科的研究领域逐渐发展起来。其中，有机电化学晶体管直接将检测电化学活性分子的电化学方法与具有输出信号放大功能的场效应晶体管相结合，使构建的传感器具有较高的灵敏度，并且由于具有良好的生物相容性、低成本和易于制造等优势，现已被广泛应用到生物传感的各个领域。
目前使用有机电化学晶体管进行生物传感的方法主要是通过记录电流-时间曲线反映待测物浓度与电流对应变化信息，但该方法一般需要较长的响应时间，因此时间分辨率较低，无法实时监测多巴胺浓度变化。除此之外，在待测组分浓度低的情况下，使目前检测方法在检测灵敏度方面也面临严峻的考验。因此，急需发展一种新的极其灵敏且响应快速的检测方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
本发明提出了一种测定多巴胺的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：提供传感器，所述传感器包括：碳纤维电极，所述碳纤维电极与栅极相连；叉指电极，所述叉指电极具有两端，其中一端与源极相连，另一端与漏极相连；参比电极，所述参比电极与所述源极相连；将所述碳纤维电极、参比电极和叉指电极插入待测液中，向所述栅极施加扫描电压，以便确定所述待测液中多巴胺含量，其中，所述扫描电压的扫描速度不低于50V/s。
发明人发现，通过提高扫描电压的扫描速度，可以有效放大检测信号，提高传感器的灵敏度，尤其适用于检测低浓度多巴胺。同时，可以缩短平衡时间，提高时空分辨率，有利于实时记录检测信号。由此，具有广泛的应用前景。
根据本发明的实施例，所述测定多巴胺的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述扫描电压的扫描速度为50～150V/s，扫描电压范围为-0.2V～0.8V，源极接地，漏极施加-0.1V恒定电压。
根据本发明的实施例，所述碳纤维电极是通过下列方式获得的：将碳纤维用导电胶黏附于导电金属丝上，并穿入已拉制好的两端开口的玻璃毛细管中，玻璃管前端露出部分碳纤维，将玻璃管前后两端用绝缘胶封住，再浸入溶液中进行超声清洗，以便得到所述碳纤维电极。
根据本发明的实施例，所述导电金属丝选自铜丝或铁丝，所述超声清洗是依次在丙酮、乙醇和二次水中进行。
根据本发明的实施例，对所得到的所述碳纤维电极进行如下后处理：将所述碳纤维电极浸入0.2～0.8M的硫酸中，首先在2V电压下安培法处理30～50s，然后在-1V电压下安培法处理10～20s，最后以0.1～0.5V/s的扫描速度在0～1V电压范围内进行循环伏安处理10～20圈；其中，所述安培法处理和循环伏安处理均在三电极体系中进行，工作电极为所述碳纤维电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极。
根据本发明的实施例，所述叉指电极表面形成有半导体材料。
根据本发明的实施例，通过下列方式在所述叉指电极表面形成半导体材料：在叉指电极表面旋涂有机聚合物半导体材料溶液，高温热处理成膜，使用导电胶连接金属丝导线。
根据本发明的实施例，所述有机聚合物半导体材料溶液进一步含有交联剂、增加薄膜导电率的试剂和表面活性剂。
根据本发明的实施例，所述方法的多巴胺检出限为1.3～8nM。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的传感器电路图；
图2显示了根据本发明一个实施例的传感器性能测试图，其中(A)为转移曲线，(B)为输出曲线与跨导系数曲线；
图3显示了根据本发明一个实施例的获得的不同栅极电压扫描速度下工作的有机电化学晶体管的跨导系数对一定浓度下多巴胺响应图；
图4显示了根据本发明一个实施例的获得的耦合高栅极电压扫描速度的传感器对多巴胺响应的转移曲线、跨导系数曲线图；
图5显示了根据本发明一个实施例的获得的活体检测前跨导系数对不同浓度多巴胺响应图；
图6显示了根据本发明一个实施例的获得的活体检测前对多巴胺的浓度校正图；
图7显示了根据本发明一个实施例的获得的活体检测中对多巴胺浓度变化的记录图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
测定多巴胺的方法
本发明提出了一种测定多巴胺的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对传感器上的栅极施加高扫描速度的电压，以便有效放大检测信号，提高传感器的灵敏度，尤其适用于检测低浓度多巴胺。同时，可以缩短平衡时间，提高时空分辨率，有利于实时记录检测信号。由此，具有广泛的应用前景。
为了方便理解，下面先结合图1对传感器的结构进行详细描述。
根据本发明的实施例，参见图1，该传感器包括：碳纤维电极、叉指电极以及参比电极300。其中，碳纤维电极与栅极相连；叉指电极具有两端，其中一端与源极相连，另一端与漏极的一端相连；参比电极与源极相连。
根据本发明的实施例，该方法包括：提供上述传感器；将碳纤维电极、参比电极和叉指电极插入待测液中，向栅极施加扫描电压，以便确定待测液中多巴胺含量，其中，扫描电压的扫描速度不低于50V/s。
需要说明的是，本发明对于待测液的来源不作严格限定，只要是含有多巴胺的溶液即可，可以为体外的含有多巴胺的溶液，也可以为机体内的多巴胺，例如是对动物、植物或者微生物体内的多巴胺含量进行检测。另外，对于机体的存活状态也不作严格限定，既可以是已死亡的生物，也可以是活体生物，对于活体生物，测定多巴胺并非是以疾病的诊断为目的，可以用于科学研究，例如，研究多巴胺含量变化对FOXO3A基因、Nos1ap基因表达的影响。
根据本发明的实施例，扫描电压的扫描速度为50～150V/s，扫描电压范围为-0.2V～0.8V，源极接地，漏极施加-0.1V恒定电压。由此，可以有效放大检测信号，提高传感器的灵敏度，尤其适用于检测低浓度多巴胺。同时，可以缩短平衡时间，提高时空分辨率，有利于实时记录检测信号，具有广泛的应用前景。
根据本发明的实施例，碳纤维电极是通过下列方式获得的：将碳纤维用导电胶黏附于导电金属丝上，并穿入已拉制好的两端开口的玻璃毛细管中，玻璃管前端露出部分碳纤维，将玻璃管前后两端用绝缘胶封住，再浸入溶液中进行超声清洗，以便得到碳纤维电极。采用碳纤维电极，具有密度低、高强高模、耐高温、抗辐射、耐化学腐蚀、导电导热和热膨胀系数小、比表面积大等优异性能。
根据本发明的实施例，导电金属丝选自铜丝或铁丝；超声清洗是依次在丙酮、乙醇和二次水中进行。由此，以便提高传感器性能。
根据本发明的实施例，对所得到的碳纤维电极进行如下后处理：将碳纤维电极浸入0.2～0.8M的硫酸中，首先在2V电压下安培法处理30～50s，然后在-1V电压下安培法处理10～20s，最后以0.1～0.5V/s的扫描速度在0～1V电压范围内进行循环伏安处理10～20圈；其中，安培法处理和循环伏安处理均在三电极体系中进行，工作电极为碳纤维电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极。由此，以便实现碳纤维电极的活化，从而进一步提高传感器的性能。
根据本发明的实施例，叉指电极表面形成有半导体材料。由此，以便进一步提高传感器的性能。
根据本发明的实施例，通过下列方式在叉指电极表面形成半导体材料：在叉指电极表面旋涂有机聚合物半导体材料溶液，高温热处理成膜，使用导电胶连接金属丝导线。
根据本发明的实施例，有机聚合物半导体材料溶液进一步含有交联剂、增加薄膜导电率的试剂和表面活性剂。由此，以便提高有机电化学晶体管的性能。
根据本发明的实施例，该方法的多巴胺检出限为1.3～8nM。由此，利用根据本发明实施例的方法可以实时记录检测低浓度的多巴胺。
下面结合传感器的工作原理详细描述实现多巴胺检测的过程：
通过扫描栅极电压，使得多巴胺在栅极及碳纤维电极上被氧化，多巴胺氧化失去的电子通过外电路注入到半导体膜中，对半导体进行了电化学掺杂，改变了半导体材料的氧化还原程度。由于半导体材料的导电能力与其氧化还原程度相关，因此源极、漏极之间输出的通过半导体膜的漏极电流的大小与多巴胺浓度相关，从而实现对多巴胺的检测。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的多巴胺(DA)；有机聚合物半导体溶液，PEDOT：PSS溶液；交联剂，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)；增加薄膜导电率的溶剂，乙二醇(EG)；表面活性剂，十二烷基苯磺酸(DBSA)购于SIGMA-ALDRICH公司。
实施例1
碳纤维电极的制备：
碳纤维电极采用现有方法进行制备，具体如下：首先将玻璃毛细管(外径：1.5mm；内径：0.89mm；长度：10cm)在微电极拉制仪(WD-1型，成都仪器厂)上拉制成两个尖端很细的锥形毛细管，在光学显微镜下，使用手术刀将玻璃尖端切断，保留的端口内径约为30～50μm。随后通过导电银胶将约2cm长的碳纤维粘在一根约10cm的铜丝上，并将其穿入拉好的毛细管中，使碳纤维在毛细管的尖端外暴露出约3mm的长度。再使用环氧树脂(乙二胺)作为固化剂，封住尖端的空隙，防止测试溶液进入毛细管内。毛细管和碳纤维上多余的环氧树脂用丙酮除去，放置过夜，使环氧树脂固化。用绝缘胶将毛细管的另外一端封住，使铜丝和毛细管固定在一起。然后在光学显微镜下，用手术刀将碳纤维突出毛细管部分截为0.3mm左右，即制成碳纤维微电极(CFE)。对制备好的CFE进行电化学活化处理，在0.5M的硫酸中进行，具体步骤是首先在2V电压下安培法处理30s，然后-1V电压下安培法处理10s，最后0-1V电压下进行循环伏安处理10圈，扫描速度0.05V/s，即可制备好用于连接有机电化学晶体管栅极的碳纤维电极(CFE)。
有机电化学晶体管的构建
该方法包括：
S100：制备用于修饰叉指电极的有机半导体聚合物混合溶液
在该步骤中，用于实验的有机半导体聚合物(如PEDOT：PSS)溶液需要加入其他试剂才能用于电极的修饰，主要是由于加入其他试剂能够提高半导体薄膜的性能，且有利于半导体成膜，提升有机电化学晶体管的检测性能。常用的试剂为GOPTS、EG、DBSA，将试剂混合后超声混匀30min。
S200：进行叉指电极的旋涂修饰
在该步骤中，利用旋涂方法在叉指电极上修饰半导体薄膜。具体的，将混合溶液滴加到叉指电极表面，开启匀胶机，在叉指电极表面均匀成膜，修饰条件为600r，9s；2500r，30s，结束后即可得到均匀修饰PEDOT：PSS薄膜的叉指电极。
S300：对修饰半导体的叉指电极进行后处理
通过高温上步处理所得到的电极进行后处理：在氮气的保护下，采用管式炉程序升温至160℃，对PEDOT：PSS修饰的叉指电极维持高温处理1h，随后进行程序降温即可。
为了证实上述方法获得传感器构建的可行性，发明人对其进行了转移曲线和输出曲线的测试，结果参考图2。转移曲线扫描过程：将碳纤维电极、参比电极和已修饰有机聚合物半导体材料的叉指电极插入到磷酸盐缓冲溶液中，源极和漏极分别施加了0V和-0.1V的电压，在-0.4～0.6V扫描栅极电压。输出曲线扫描过程：将碳纤维电极、参比电极和已修饰有机聚合物半导体材料的叉指电极插入到磷酸盐缓冲溶液中，分别固定栅极电压为0、0.1、0.2、0.3、0.4V，在-0.6～0V扫描漏极电压，均可得到典型的有机电化学晶体管的转移曲线与输出曲线。通过计算转移曲线中漏极电流与栅极电压的偏微分，可以得到扫描过程中的跨导系数曲线，说明有机电化学晶体管构建的有效性。
为了证实上述方法能够增加多巴胺检测灵敏度的可行性，发明人在不同的扫描速度下对一定浓度的多巴胺进行检测(图3)。在0-0.8V范围内扫描栅极电压，固定漏极电压为-0.1V，向电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为NaCl(126mM),KCl(2.4mM),KH2PO4(0.5mM),MgCl2(0.85mM),NaHCO3(27.5mM),Na2SO4(0.5mM),CaCl2(1.1mM)，用于模拟脑脊液环境)中加入0.5mM的多巴胺溶液，得到对应的转移曲线。通过计算跨导系数得到不同扫描速度下对相同多巴胺浓度的响应，参考图4。证明高扫描速度提高了检测灵敏度。
为了证明上述方法对检测多巴胺(DA)浓度存在线性关系，在高栅极电压扫描速度下，首先检测了跨导系数随DA浓度变化的曲线。将碳纤维电极、叉指电极和参比电极浸入人工脑脊液中，在0-0.8V范围内扫描栅极电压，固定漏极电压为-0.1V，调节电解质溶液中DA的浓度为0–100nM，记录不同DA浓度下的转移曲线，计算其跨导系数曲线，参考图4。跨导系数能够随DA浓度上升呈梯度增长，参考图5。说明体系对DA存在良好的响应。根据浓度和对应的跨导系数响应绘制的校正曲线，参考图6，说明该方法对DA的浓度具有良好的线性响应关系，因此可以通过该方法准确得到脑内DA的浓度变化。
为了证实上述方法在活体检测多巴胺的可行性，发明人首先记录了鼠脑内多巴胺的基础值，之后记录了刺激过程中鼠脑内多巴胺的变化过程。首先将刺激电极植入到大鼠的刺激脑区，将碳纤维电极植入到大鼠的检测脑区，叉指电极放置在鼠脑的皮层中。高栅极电压扫描速度下扫描转移曲线，通过计算跨导系数，获得多巴胺基础值和刺激过程中的多巴胺变化情况，参考图7。说明该方法能够实现活体原位DA基础值浓度的检测。
从上述实施例可以看出，本发明采用的耦合高栅极电压扫描速度的传感器对多巴胺的测定具有良好的高灵敏度以及高时空分辨率。该方法避免了大型仪器操作复杂、时间分辨率低与快速扫描循环伏安法需要扣除背景、无法测量基础值等局限性，从而本发明有望发展成为一种简单便捷的基于有机电化学晶体管的多巴胺传感器，应用于多巴胺的定量分析。对于脑内多巴胺的基础值变化及其相关的生理、病理过程具有重要意义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种测定多巴胺的方法，其特征在于，包括：
提供传感器，所述传感器包括：
碳纤维电极，所述碳纤维电极与栅极相连；
叉指电极，所述叉指电极具有两端，其中一端与源极相连，另一端与漏极相连；
参比电极，所述参比电极与所述源极相连；
将所述碳纤维电极、参比电极和叉指电极插入待测液中，向所述栅极施加扫描电压，以便确定所述待测液中多巴胺含量，
其中，所述扫描电压的扫描速度不低于50V/s。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扫描电压的扫描速度为50～150V/s，扫描电压范围为-0.2V～0.8V，源极接地，漏极施加-0.1V恒定电压。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳纤维电极是通过下列方式获得的：
将碳纤维用导电胶黏附于导电金属丝上，并穿入已拉制好的两端开口的玻璃毛细管中，玻璃管前端露出部分碳纤维，将玻璃管前后两端用绝缘胶封住，再浸入溶液中进行超声清洗，以便得到所述碳纤维电极。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述导电金属丝选自铜丝或铁丝，所述超声清洗是依次在丙酮、乙醇和二次水中进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，对所得到的所述碳纤维电极进行如下后处理：
将所述碳纤维电极浸入0.2～0.8M的硫酸中，首先在2V电压下安培法处理30～50s，然后在-1V电压下安培法处理10～20s，最后以0.1～0.5V/s的扫描速度在0～1V电压范围内进行循环伏安处理10～20圈；
其中，所述安培法处理和循环伏安处理均在三电极体系中进行，工作电极为所述碳纤维电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叉指电极表面形成有半导体材料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过下列方式在所述叉指电极表面形成半导体材料：
在叉指电极表面旋涂有机聚合物半导体材料溶液，高温热处理成膜，使用导电胶连接金属丝导线。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机聚合物半导体材料溶液进一步含有交联剂、增加薄膜导电率的试剂和表面活性剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的多巴胺检出限为1.3～8nM。
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