CN103267783A

CN103267783A - 一种检测过氧化氢、尿酸或尿酸酶的方法

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Publication number: CN103267783A
Application number: CN2013101534035A
Authority: CN
Inventors: 徐国宝; 梁凤; 李云辉; 杨秀云
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103267783B

Abstract

本发明提供了一种检测尿酸、尿酸酶或过氧化氢的方法，本发明提供的方法在检测尿酸或尿酸酶时，利用尿酸酶氧化尿酸产生的过氧化氢与芳基硼化物反应，产生酚类化合物；在对过氧化氢进行检测时，芳基硼化物直接与过氧化氢进行反应，产生酚类化合物，酚类化合物具有较高的电化学活性，从而通过电化学的方法检测酚类化合物，间接得到尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法以芳基硼化物为前驱体，该前驱体可以迅速与过氧化氢反应得到酚类化合物，酚类化合物作为探针，根据酚类化合物的电化学响应信号间接得出待测溶液中尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法操作简单，无需对电极进行修饰，有着较高的选择性和灵敏度。

Description

一种检测过氧化氢、尿酸或尿酸酶的方法

技术领域

本发明涉及电分析化学技术领域，尤其涉及一种检测过氧化氢、尿酸或尿酸酶的方法。

背景技术

尿酸是人体中嘌呤类化合物分解代谢的主要产物，人体中尿酸含量的变化可以反映出与临床中许多心血管和代谢类等相关的疾病。尿酸含量的测定是诊断许多疾病如痛风、高血压，肾病等的一个重要依据。常规的检测尿酸的方法如酶光度法，化学发光法等，而这些方法灵敏度低、操作过于繁琐且成本比较高等，因此建立一种简单快速的方法来检测尿酸的浓度，对临床中相关疾病的预防、诊断以及监控有着重要的意义。

为了适应临床上检测尿酸简单、快速和准确的要求，现代医学上一般是采用尿酸酶法测定尿酸的含量。现有技术公开了许多报道利用间接氧化酶法就是酶促反应产生H₂O₂，通过检测H₂O₂的浓度间接的检测尿酸的浓度。现有技术公开的技术方案都是通过构建检测灵敏度高的修饰电极，利用该修饰电极作为工作电极实现对尿酸的灵敏检测。如层层自组装的方法在电极上组装上一层或几层分子膜，然后，使用共价连接的方式将尿酸酶与微过氧化物酶组装在电极表面，通过还原过氧化氢的方法检测尿酸（Biosens.Bioelectron.2007,23:556～561.)。再如现有技术公开了一种DNA/聚氨基苯磺酸双层膜修饰玻碳电极检测尿酸的技术方案，其通过电沉积的方法在玻碳电极表面构建了一种DNA/聚氨基苯磺酸复合层，聚氨基苯磺酸在电极表面形成了二维不规则纳米结构，DNA被沉积在聚氨基苯磺酸的表面，该修饰电极为多巴胺、尿酸和抗坏血酸的氧化提供一个超电活性的表面，实现了对多巴胺、尿酸和抗坏血酸的检测。

然而这种构建修饰电极的方法成本较高且制作电极的过程太复杂，对尿酸的检测结果准确度仍然较低。

发明内容

本发明提供了一种检测尿酸、尿酸酶或过氧化氢的方法，本发明提供的方法具有选择性好、灵敏度高和检测简便的优点。

本发明提供了一种检测尿酸的方法，包括以下步骤：

a）将待测溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液包含尿酸；

b）采用电化学方法检测含有酚类化合物的中间待测溶液，得到所述酚类化合物的电化学响应信号；

c）根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的尿酸标准曲线，得到待测溶液中尿酸的含量。

本发明提供了一种检测尿酸酶的方法，包括以下步骤：

a）将待测溶液与芳基硼化物和尿酸混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液包括尿酸酶；

c）根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的尿酸酶标准曲线，得到待测溶液中尿酸酶的含量。

本发明提供了一种检测过氧化氢的方法，包括以下步骤：

a）将待测溶液与芳基硼化物进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液包括过氧化氢；

c）根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的过氧化氢标准曲线，得到待测溶液中过氧化氢的含量。

优选的，所述芳基硼化物为对羟基苯硼酸和对氨基苯硼酸中的一种或两种。

优选的，所述步骤a）中反应的pH值为6.5～9.5。

优选的，所述步骤a）中反应的时间为30s～5min。

优选的，所述步骤a）中尿酸的物质的量、芳基硼化物的物质的量与尿酸酶的活力单位比为1mmol:（0.5～600）μmol:（1～150）U。

优选的，所述步骤a）中过氧化氢与芳基硼化物的摩尔比为（1～20）:1。

优选的，所述步骤b）中的电化学方法为循环伏安法；

所述循环伏安法的扫描速率为30mV/s～60mV/s。

优选的，所述步骤b）中电化学方法的三电极系统为：

高向热解石墨电极为工作电极；

铂丝为辅助电极；

Ag/AgCl（饱和KCl溶液）为参比电极。

本发明提供了一种检测尿酸、尿酸酶或过氧化氢的方法，本发明提供的方法在检测尿酸或尿酸酶时，利用尿酸酶氧化尿酸产生的过氧化氢与芳基硼化物反应，产生酚类化合物；在对过氧化氢进行检测时，芳基硼化物直接与过氧化氢进行反应，产生酚类化合物；再通过电化学的方法检测酚类化合物，得到其电化学响应值；然后根据检测得到的电化学响应值与预定的尿酸、尿酸酶或过氧化氢的工作曲线，得到尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法以芳基硼化物为前驱体，该前驱体可以迅速与过氧化氢反应得到酚类化合物，该酚类化合物作为探针，对其进行电化学检测，根据酚类化合物的电化学信号间接计算得出待测溶液中尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法操作简单，无需对电极进行修饰，有着较高的选择性和灵敏度。实验结果表明，本发明提供的方法检测过氧化氢的最低检测限为3.1×10^-7mol/L（S/N=3），检测尿酸的最低检测限为0.30μmol/L（S/N=3），且本发明提供的方法能够避免抗坏血酸对尿酸测定的干扰。

附图说明

图1为本发明实施例提供方法的反应原理示意图；

图2为本发明实施例1得到的CV曲线；

图3为本发明实施例2得到的CV曲线；

图4为本发明实施例2得到的氧化电流与pH值的线性关系曲线；

图5为本发明实施例2得到的氧化电位与pH值的线性关系曲线；

图6为本发明实施例3得到的系列浓度的过氧化氢在HOPG电极上的CV曲线；

图7为本发明实施例3得到的过氧化氢的工作曲线；

图8为本发明实施例4得到的系列浓度的UOx在HOPG上的CV曲线；

图9为本发明实施例4得到的UOx浓度与氧化电流的关系曲线；

图10为本发明实施例5得到的CV曲线；

图11为本发明实施例6得到的系列浓度的UA在POHG电极上的CV曲线；

图12为本发明实施例6得到的UA浓度与氧化电流之间的线性曲线；

图13为本发明实施例8得到CV曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种检测尿酸的方法，包括以下步骤：

a）将待测溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液中包含尿酸；

b）采用电化学方法检测含有酚类化合物的中间待测溶液，得到酚类化合物的电化学响应信号；

c）根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的尿酸的标准曲线，得到待测溶液中尿酸的含量。

本发明提供的方法以芳基硼化物为前驱体，尿酸酶氧化尿酸产生过氧化氢，芳基硼化物与过氧化氢反应得到酚类化合物，酚类化合物具有较强的电活性，该酚类化合物作为探针，对其进行电化学检测，通过检测酚类化合物的电化学信号间接得到待测样品中尿酸的含量。本发明提供的方法具有较高的灵敏度和选择性，且操作简单，无需对电极进行修饰。

参加图1，图1为本发明实施例提供方法的反应机理图，其中R为-OH或NH₂，R’为O或NH。由图1可以看出，过氧化氢具有很强的反应活性，不稳定O-O键使得过氧化氢作为一种双电子亲电氧化剂参加反应，而由于与氧原子相邻的非键轨道的α-效应使得过氧化氢也是一种很好的亲和试剂，因此，利用这种特殊的性质，本发明将对芳香硼类化合物作为一种前驱体，其与过氧化氢具有互补的反应活性。起初的反应是一种亲电子试剂与亲和试剂发生反应形成一种带负电的四面体硼酸复合物，随后，C-B键以一种亲和试剂参与反应。然而，此反应随着pH的增大，反应迅速，而在过氧化氢的作用下，酚类已经作为官能团可以从硼酸中释放出来。芳香硼类化合物能够与过氧化氢反应生成酚类化合物，酚类化合物又可以得到两个电子被氧化，具有较高的电化学活性。因此本发明提供的方法能够通过对酚类化合物的电化学检测，间接得到对尿酸、尿酸酶或过氧化氢的灵敏检测。

本发明将待测溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液中包含尿酸。本发明对所述待测溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合的方法没有特殊的限制，优选向待测溶液中加入芳基硼化物和尿酸酶，尿酸酶氧化待测溶液中的尿酸产生过氧化氢，所述芳基硼化物与生成的过氧化氢反应产生酚类化合物，酚类化合物具有较高的电化学活性。本发明为了能够使检测得到的待测溶液中尿酸的浓度在尿酸标准曲线的线性范围内，可以选择对待测溶液进行稀释或浓缩，本发明对此没有特殊的限制，本领域技术人员可以根据测定的需要进行稀释或浓缩，选择稀释或浓缩的倍数。在本发明中，所述芳基硼化物优选为对羟基苯硼酸和对氨基苯硼酸中的一种或两种，更优选为对羟基苯硼酸；所述反应的时间优选为30s～5min，更优选为1min～3min；所述反应的pH值优选为6.5～9.5，更优选为7.5～9，最优选为9。本发明对所述pH值的获得没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的调节溶液pH值的技术方案即可。本发明优选向待测溶液中加入缓冲溶液，调节待测溶液的pH值为6.5～9.5。本发明对所述缓冲溶液的种类没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的缓冲溶液即可，在本发明中，所述缓冲溶液优选为Tris-HCl缓冲溶液，所述缓冲溶液的摩尔浓度优选为30mmol/L～60mmol/L，更优选为40mmol/L～55mmol/L，最优选为50mmol/L，所述Tris-HCl缓冲溶液的配制方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的Tris-HCl缓冲溶液配制的技术方案即可，本发明优选采用由三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制得到Tris-HCl缓冲溶液即可；

在本发明中，所述待测溶液中尿酸的物质的量、芳基硼化物的物质的量与尿酸酶的活力单位比为1mmol:（0.5～600）μmol:（1～150）U，更优选为1mmol:（1～550）μmol:（5～130）U，最优选为1mmol:（1～500）μmol:（5～100）U。

得到含有酚类化合物的中间待测溶液后，本发明采用电化学方法检测所述含有酚类化合物的中间待测溶液，得到酚类化合物的电化学响应。本发明对所述电化学方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的电化学检测的方法即可。本发明优选采用传统的三电极体系对所述含有酚类化合物的中间待测溶液进行检测，所述三电极体系中工作电极优选为高向热解石墨电极（HOPG）、辅助电极优选为铂丝电极、参比电极优选为Ag/AgCl（饱和KCl溶液）；所述电化学检测的方法优选为循环伏安法，所述循环伏安法检测的扫描速率优选为30mV/s～60mV/s，更优选为40mV/s～55mV/s，最优选为45mV/s～50mV/s，最最优选为50mV/s；所述循环伏安法检测的扫描电位优选为-0.2V（vs.Ag/AgCl）～0.2V（vs.Ag/AgCl）。

得到所述酚类化合物的电化学响应信号后，本发明根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的尿酸的标准曲线，得到待测溶液中尿酸的含量。在本发明中，所述尿酸的标准曲线优选按照以下方法获得：

配制系列浓度的尿酸标准溶液；

将尿酸标准溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间标准溶液；

采用电化学方法检测所述含有酚类化合物的中间标准溶液，得到酚类化合物的电化学响应信号；

根据所述酚类化合物的电化学响应信号与相应的尿酸标准溶液的浓度，得到尿酸的标准曲线。

本发明配制系列浓度的尿酸标准溶液，本发明对所述尿酸标准溶液的配制方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的标准溶液配制的技术方案即可。本发明优选采用上述技术方案所述的缓冲溶液配制尿酸标准溶液，所述尿酸标准溶液的摩尔浓度优选为1μmol/L～500μmol/L；本发明对所述尿酸标准溶液的份数没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的获得标准曲线时标准溶液的份数即可，在本发明中，所述标准溶液的份数优选为5份～8份。

得到系列浓度的尿酸标准溶液后，本发明分别将每份尿酸标准溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合进行反应，得到含有酚类化合物的标准溶液。本发明优选采用上述技术方案所述的待测溶液与芳基硼化物和尿酸酶反应的技术方案，得到含有酚类化合物的标准溶液。

得到含有酚类化合物的标准溶液后，本发明优选采用上述技术方案所述的检测含有酚类化合物的中间待测溶液的技术方案，对所述含有酚类化合物的标准溶液进行电化学检测，得到酚类化合物的电化学响应信号。

得到所述酚类化合物的电化学响应信号后，本发明优选以电化学响应信号中的氧化电流值为纵坐标，以尿酸标准溶液的浓度为横坐标，得到尿酸的标准曲线。

得到尿酸的标准曲线后，本发明根据上述技术方案得到的含有酚类化合物的中间待测溶液的电化学响应信号与所述尿酸的标准曲线，计算得到待测溶液中尿酸的含量。

本发明基于芳基硼化物与过氧化氢反应的机理，以芳基硼化物为前驱体，提供了一种检测尿酸酶的方法，包括以下步骤：

a）将待测溶液与芳基硼化物和尿酸混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液中包括尿酸酶；

c）根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的尿酸酶的标准曲线，得到待测溶液中尿酸酶的含量。

本发明将待测溶液与芳基硼化物和尿酸混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液中包括尿酸酶。本发明优选向所述待测溶液中加入芳基硼化物和尿酸，待测溶液中的尿酸酶会氧化尿酸产生过氧化氢，芳基硼化物与生成的过氧化氢进行反应，产生酚类化合物，酚类化合物具有较高的电化学活性。本发明所述尿酸酶、尿酸和芳基硼化物反应的条件与上述检测尿酸的技术方案中所述的尿酸酶、尿酸和芳基硼化物反应的技术方案一致。

得到含有酚类化合物的中间待测溶液后，本发明优选按照上述技术方案所述检测酚类化合物的电化学方法，检测本技术方案得到的中间待测溶液中的酚类化合物，得到酚类化合物的电化学响应信号。

得到所述酚类化合物的电化学响应信号后，本发明根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的尿酸酶的标准曲线，得到待测溶液中尿酸酶的含量。在本发明中，所述尿酸酶的标准曲线优选按照以下方法获得：

配制系列浓度的尿酸酶的标准溶液；

将尿酸酶标准溶液与芳基硼化物和尿酸酶混合进行反应，得到含有酚类化合物的中间标准溶液；

根据所述酚类化合物的电化学响应信号与相应的尿酸酶标准溶液的浓度，得到尿酸酶的标准曲线。

本发明优选采用上述配制尿酸标准溶液的技术方案，配制得到系列浓度的尿酸酶的标准溶液，本发明对所述尿酸酶的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的尿酸酶的市售商品即可。在本发明中，所述尿酸酶标准溶液的浓度优选为0U/mL～5.0U/mL，更优选为0.01U/mL～4.0U/mL，最优选为0.01U/mL～0.1U/mL。

得到尿酸酶的标准溶液后，本发明优选采用上述技术方案所述的尿酸酶待测溶液与芳基硼化物和尿酸混合反应的技术方案，将尿酸酶标准溶液与芳基硼化物和尿酸混合反应，得到含有酚类化合物的中间标准溶液；

得到含有酚类化合物的中间标准溶液后，本发明优选采用上述技术方案所述的电化学检测方法，对所述中间标准溶液的酚类化合物进行检测，得到中间标准溶液中酚类化合物的电化学响应信号。

得到中间标准溶液中酚类化合物的电化学响应信号后，本发明优选以酚类化合物的电化学响应信号中的氧化电流值为纵坐标，以对应的尿酸酶标准溶液的浓度为横坐标，得到尿酸酶的标准曲线。

得到尿酸酶的标准曲线后，本发明根据上述技术方案得到的含有酚类化合物的中间待测溶液的电化学响应信号，计算得到待测溶液中尿酸酶的含量。

本发明还提供了一种检测过氧化氢的方法，包括以下步骤：

a）将待测溶液与芳基硼化物进行反应，得到含有酚类化合物的中间待测溶液，所述待测溶液中包括过氧化氢；

c）根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的过氧化氢的标准曲线，得到待测溶液中过氧化氢的含量。

本发明将含有过氧化氢的待测溶液与芳基硼化物混合，芳基硼化物与过氧化氢反应产生酚类化合物，酚类化合物具有较高的电化学活性，从而使得无需对工作电极进行修饰，对过氧化氢检测具有较高的灵敏度。在本发明中，所述待测溶液中过氧化氢与芳基硼化物的摩尔比优选为（1～20）:1，更优选为（1～15）:1，最优选为（5～10）:1；所述待测溶液与芳基硼化物反应的时间优选为30s～5min，更优选为1min～3min；所述反应的pH值优选为6.5～9.5，更优选为7.5～9，最优选为9。本发明对所述pH值的获得没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的调节溶液pH值的技术方案即可。本发明优选向待测溶液中加入缓冲溶液，调节待测溶液的pH值为6.5～9.5。本发明优选采用上述技术方案所述的Tris-HCl缓冲溶液调节待测溶液的pH值。

得到含有酚类化合物的中间待测溶液后，本发明优选按照上述技术方案所述的检测尿酸的中间待测溶液的技术方案，对本技术方案中得到的酚类化合物的电化学响应信号。

得到酚类化合物的电化学响应信号后，本发明根据所述酚类化合物的电化学响应信号与预定的过氧化氢的标准曲线，得到待测溶液中过氧化氢的含量。在本发明中，所述过氧化氢的标准曲线优选按照以下方法获得：

配制系列浓度的过氧化氢标准溶液；

将过氧化氢标准溶液与芳基硼化物混合，得到含有酚类化合物的中间标准溶液；

根据所述酚类化合物的电化学响应信号与相应的过氧化氢标准溶液的浓度，得到过氧化氢的标准曲线。

本发明优选采用上述配制尿酸标准溶液的技术方案，配制得到系列浓度的过氧化氢标准溶液。在本发明中，过氧化氢标准溶液的摩尔浓度优选为1μmol/L～1000μmol/L；所述过氧化氢标准溶液的份数优选为5份～8份，本领域技术人员可以根据标准溶液的浓度范围配制合适系列的过氧化氢标准溶液。

得到过氧化氢的标准溶液后，本发明优选采用上述技术方案所述的过氧化氢待测溶液与芳基硼化物和尿酸混合反应的技术方案，将过氧化氢标准溶液与芳基硼化物和尿酸混合反应，得到含有酚类化合物的中间标准溶液；

得到中间标准溶液中酚类化合物的电化学响应信号后，本发明优选以酚类化合物的电化学响应信号中的氧化电流值为纵坐标，以对应的过氧化氢标准溶液的浓度为横坐标，得到过氧化氢的标准曲线。

得到过氧化氢的标准曲线后，本发明根据上述技术方案得到的含有酚类化合物的中间待测溶液的电化学响应信号，计算得到待测溶液中过氧化氢的含量。

本发明提供了一种检测尿酸、尿酸酶或过氧化氢的方法，本发明提供的方法在检测尿酸或尿酸酶时，利用尿酸酶氧化尿酸产生的过氧化氢与芳基硼化物反应，产生酚类化合物；在对过氧化氢进行检测时，芳基硼化物直接与过氧化氢进行反应，产生酚类化合物；再通过电化学的方法检测酚类化合物，得到其电化学响应值；然后根据检测得到的电化学响应值与预定的尿酸、尿酸酶或过氧化氢的工作曲线，得到尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法以芳基硼化物为前驱体，该前驱体可以迅速与过氧化氢反应得到酚类化合物，该酚类化合物具有较高的电化学活性，可以作为电化学探针，对其进行电化学检测，根据检测得到的酚类化合物的电化学信号间接计算得出待测溶液中尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法操作简单，无需对电极进行修饰，有着较高的选择性和灵敏度。实验结果表明，本发明提供的方法检测过氧化氢的最低检测限为3.1×10^-7mol/L（S/N=3），检测尿酸的最低检测限为0.30μmol/L（S/N=3），且本发明提供的方法能够避免抗坏血酸对尿酸测定的干扰。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的检测尿酸、尿酸酶或过氧化氢的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例均在室温条件下完成，在实施例中采用的支持电解质为三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制得到的摩尔浓度为50mmol/L、pH值为10的Tris-HCl缓冲溶液，尿酸酶溶液和尿酸溶液均是有所述Tris-HCl缓冲溶液配制；采用传统的三电极系统进行电化学检测，工作电极为高向热解石墨电极（HOPG）、辅助电极为铂丝电极、参比电极为Ag/AgCl（饱和KCl）。

实施例1

将HOPG电极分别置于(a)摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液；(b)包括摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液和摩尔浓度为1.0mmol/L对羟基苯硼酸的混合溶液和(c)包括摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为1.0mmol/L对羟基苯硼酸和摩尔浓度为0.1mmol/L过氧化氢混合溶液中，进行循环伏安扫描分析，扫速50mV/s。

结果如图2所示，图2为本发明实施例1得到的CV曲线，其中曲线a为HOPG电极在摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液中的CV曲线，曲线b为HOPG电极在包括摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液和摩尔浓度为1.0mmol/L对羟基本硼酸的混合溶液中，得到的CV曲线，曲线c为HOPG电极在包括摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为1.0mmol/L对羟基本硼酸和摩尔浓度为0.1mmol/L过氧化氢的混合溶液中，得到的CV曲线，由图2可以看出，当将一定浓度的H₂O₂加入到对羟基苯硼酸溶液和Tris-HCl缓冲溶液中，明显地出现一对很好的可逆氧化还原峰(曲线c)，其氧化电位为0.045V，说明过氧化氢与对羟基苯硼酸反应产生对羟基苯酚的原因。

实施例2

本发明将HOPG电极置于包含摩尔浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为1.0mmol/L对羟基本硼酸和摩尔浓度为0.1mmol/L过氧化氢的混合溶液中，并改变缓冲溶液的pH值，按照实施例所述的测试条件，测试得到在pH值为6.8、7.0、7.2、7.6、8.0、8.4和9.0的条件下得到的CV曲线。

结果如图3～5所示，图3为本发明实施例2得到的CV曲线，其中从内到外依次是曲线a～g，曲线a～g依次为在pH值6.8、7.0、7.2、7.6、8.0、8.4和9.0的条件下得到的CV曲线；图4为本发明实施例2得到的氧化电流与pH值的线性关系曲线；图5为本发明实施例2得到的氧化电位与pH值的线性关系曲线。由图3可以看出，随pH值的增大氧化电流增大，说明反应速度逐渐增大，而且氧化电流与pH值之间存在良好的线性关系（参见图4所示）；而且随pH值增大氧化电位同时负移，氧化电位与pH值之间也存在良好的线性关系（参见图5所示），这说明该传感器电位较低具有一定的抗干扰性，因此，本发明为了更好的测定尿酸含量，在以下实施例中将pH值为9.0作为最佳测试条件。

实施例3

本发明检测系列浓度的过氧化氢，得到工作曲线。本发明将HOPG电极置于包括摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为1.0mmol/L对羟基本硼酸和系列过氧化氢的混合溶液中反应10min，其中过氧化氢的摩尔浓度依次为1μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L，按照实施例1的检测条件，得到系列浓度的过氧化氢在HOPG电极上的CV曲线。

结果如图6所示，图6为本发明实施例3得到的系列浓度的过氧化氢在HOPG电极上的CV曲线，其中由内到外依次是曲线a～f，曲线a～f为摩尔浓度为1μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L的过氧化氢在HOPG电极上的CV曲线。本发明将得到的CV曲线中的氧化电流与过氧化氢的摩尔浓度进行线性拟合，得到测定过氧化氢的线性曲线，结果如图7所示，图7为本发明实施例3得到的过氧化氢的工作曲线，由图7可以看出，过氧化氢的摩尔浓度与CV曲线中的氧化电流之间存在良好的线性关系，最低检测限为3.1×10^-7mol/L(S/N=3)，相关系数为0.999(n=6)，本发明提供的以羟基苯酚为前驱体的生物传感器比现有技术公开的采用HRP的生物传感器的灵敏度要高。

实施例4

本发明对尿酸酶的活性进行了检测，具体过程如下：

将POHG电极置于包括摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L的对羟基本硼酸、摩尔浓度为0.1mmol/L的尿酸（UA）和系列浓度的尿酸酶（UOx）的混合溶液中，采用实施例1的电化学测试条件进行循环伏安扫描测定。

结果如图8所示，图8为本发明实施例4得到的系列浓度的UOx在HOPG上的CV曲线，其中由内到外依次为曲线a～i，曲线a～i依次为浓度为0U/mL、0.005U/mL、0.01U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、2.0U/mL和4.0U/mL的UOx存在条件下，得到的CV曲线，由图8可以看出，随着尿酸酶浓度的增大，得到的CV曲线中氧化电流逐渐增大。

本发明将得到的CV曲线中的氧化电流与UOx的浓度进行线性拟合，结果如图9所示，图9为本发明实施例4得到的UOx浓度与氧化电流的关系曲线，图9中的插图为虚线范围内成线性关系的放大图，由图9可以看出，而当尿酸酶浓度大于2U/mL时，氧化电流趋于稳定，因此为了更好地检测尿酸含量，将2U/mL作为尿酸酶最佳浓度值；而且在小于等于0.10U/mL的范围内，UOx的浓度与氧化电流之间存在良好的线性关系，从而可以作为检测尿酸酶的工作曲线。

实施例5

本发明对尿酸进行了电化学检测，具体过程如下：

将POHG电极分别置于摩尔浓度为50mmol/L且pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液；摩尔浓度为50mmol/L且pH值为9.0额Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L的对羟基苯硼酸和浓度为2U/mL UOx的混合溶液；摩尔浓度为50mmol/L且pH值为9.0额Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L的对羟基苯硼酸、浓度为2U/mL UOx的混合溶液和摩尔浓度为0.1mmol/LUA的混合溶液中，按照实施例1所述的检测条件进行循环伏安扫描测试。

结果如图10所示，图10为本发明实施例5得到的CV曲线，其中曲线a为HOPG电极在摩尔浓度为50mmol/L且pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液中的CV曲线，曲线b为HOPG电极在摩尔浓度为50mmol/L且pH值为9.0额Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L的对羟基苯硼酸和浓度为2U/mLUOx的混合溶液中的CV曲线，曲线c为HOPG电极在摩尔浓度为50mmol/L且pH值为9.0额Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L的对羟基苯硼酸、浓度为2U/mL UOx的混合溶液和摩尔浓度为0.1mmol/L UA的混合溶液中的CV曲线，由图10可以看出，向对羟基苯硼酸、尿酸酶和缓冲溶液的混合溶液中加入一定浓度尿酸溶液后，明显地观察到一对好的可逆氧化还原峰(如2.7图曲线c所示)，其氧化电位为0.05V，这说明尿酸酶将尿酸氧化产生过氧化氢，而过氧化氢迅速与对羟基苯硼酸反应产生对羟基苯酚，而对羟基苯酚发生电化学氧化导致的。

实施例6

本发明按照实施例5所述的检测UA的技术方案检测得到了系列浓度的UA的CV曲线，UA的摩尔浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和500μmol/L。

结果如图11所示，图11为本发明实施例6得到的系列浓度的UA在POHG电极上的CV曲线，由图11可以看出，随着UA浓度的增加，得到的氧化电流值也在增大；

本发明根据图11，将氧化电流与UA的浓度进行线性拟合，结果如图12所示，图12为本发明实施例6得到的UA浓度与氧化电流之间的线性曲线，由图12可以看出，UA的浓度与氧化电流之间存在良好的线性关系，最低检测限为0.30μmol/L(S/N=3)，相关系数R为0.998(n=8)，本发明提供的方法与采用聚苯胺-尿酸酶为传感器得到的检测结果(10μmol/L)相比较，本发明提供的方法更简单易行而且具有很高的灵敏度。

实施例7

本发明采用实施例5检测UA的技术方案，连续十二次重复检测摩尔浓度为50μmol/L的尿酸，得到的相对标准偏差RSD为2.2%。这说明，本发明提供的方法具有良好的可重复性和稳定性。

实施例8

本发明采用实施例5检测UA的技术方案，将HOPG电极置于包含摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L对羟基苯硼酸、摩尔浓度为100μmol/L尿酸和浓度为2U/mL尿酸酶混合溶液；以及包含摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L对羟基苯硼酸、摩尔浓度为100μmol/L尿酸、浓度为2U/mL尿酸酶和摩尔浓度为5μmol/L的抗坏血酸混合溶液中，进行循环伏安扫描测试。

结果如图13所示，图13为本发明实施例8得到CV曲线，其中a为HOPG电极在包含摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L对羟基苯硼酸、摩尔浓度为100μmol/L尿酸和浓度为2U/mL尿酸酶混合溶液中得到的CV曲线，曲线b为HOPG电极在包含摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液、摩尔浓度为0.5mmol/L对羟基苯硼酸、摩尔浓度为100μmol/L尿酸、浓度为2U/mL尿酸酶和摩尔浓度为5μmol/L的抗坏血酸混合溶液中得到的CV曲线，由图13可以看出，在反应时间为1min时，加入对羟基苯硼酸与尿酸和尿酸氧化酶所产生的电流信号与对羟基苯硼酸与尿酸和尿酸酶和抗坏血酸产生的信号几乎相同，这说明本发明提供的方法具有一定的抗干扰性。

实施例9～11

采用本发明提供的方法检测新鲜的未处理过的血清样品中UA的含量，具体过程如下：

将包含摩尔浓度为50mmol/L、pH值为9.0的Ttis-HCl缓冲溶液、浓度为2U/mL UOx和摩尔浓度为0.5mmol/L对羟基苯硼酸混合溶液作为稀释液，将新鲜的未处理过的血清样品分别稀释100、50和25倍，反应1.0分钟之后，按照实施例5所述的检测UA的技术方案检测血清中尿酸的含量。

结果如表1所示，表1为本发明实施例8～11得到的血清中尿酸的检测结果。

由表1可以得出，血清中尿酸含量的平均值为0.43mmol/L，这个数值在正常人体血清中尿酸的含量范围之内（0.3mmol/L～0.5mmol/L）。由表1可以看出，实施例9～11三组样品中尿酸的回收率为别为102%、100.2%、100.4%，相对标准偏差RSDs分别为3.17%、2.74%、3.02%，这说明本发明提供的方法可有效地检测实际样品中尿酸的含量，且样品不经任何处理，即可获得实际应用的效果，这就为医学检测和实时监测等分析方面提供了一种高效、快速可靠的检测方法。

由以上实施例可知，本发明提供了一种检测尿酸、尿酸酶或过氧化氢的方法，本发明提供的方法在检测尿酸或尿酸酶时，利用尿酸酶氧化尿酸产生的过氧化氢与芳基硼化物反应，产生酚类化合物；在对过氧化氢进行检测时，芳基硼化物直接与过氧化氢进行反应，产生酚类化合物；再通过电化学的方法检测酚类化合物，得到其电化学响应值；然后根据检测得到的电化学响应值与预定的尿酸、尿酸酶或过氧化氢的工作曲线，得到尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法以芳基硼化物为前驱体，该前驱体可以迅速与过氧化氢反应得到酚类化合物，该酚类化合物具有较高的电化学活性，可以作为电化学探针，对所述酚类化合物进行电化学检测，根据酚类化合物的电化学信号间接计算得出待测溶液中尿酸、尿酸酶或过氧化氢的含量。本发明提供的方法操作简单，无需对电极进行修饰，有着较高的选择性和灵敏度。实验结果表明，本发明提供的方法检测过氧化氢的最低检测限为3.1×10^-7mol/L（S/N=3），检测尿酸的最低检测限为0.30μmol/L（S/N=3），且本发明提供的方法能够避免抗坏血酸对尿酸测定的干扰。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测尿酸的方法，包括以下步骤：

2.一种检测尿酸酶的方法，包括以下步骤：

3.一种检测过氧化氢的方法，包括以下步骤：

4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述芳基硼化物为对羟基苯硼酸和对氨基苯硼酸中的一种或两种。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中反应的pH值为6.5～9.5。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中反应的时间为30s～5min。

7.根据权利要求1～2任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中尿酸的物质的量、芳基硼化物的物质的量与尿酸酶的活力单位比为1mmol:（0.5～600）μmol:（1～150）U。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中过氧化氢与芳基硼化物的摩尔比为（1～20）:1。

9.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b）中的电化学方法为循环伏安法；

所述循环伏安法的扫描速率为30mV/s～60mV/s。

10.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b）中电化学方法的三电极系统为：

高向热解石墨电极为工作电极；

铂丝为辅助电极；

Ag/AgCl（饱和KCl溶液）为参比电极。