CN102411022A

CN102411022A - 一种基于原电池的电化学传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN102411022A
Application number: CN2011102205962A
Authority: CN
Inventors: 毛兰群; 赵灵芝; 杨丽芬; 于萍
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2011-08-03
Filing date: 2011-08-03
Publication date: 2012-04-11

Abstract

本发明公开了一种基于酶型原电池的电化学传感器及其制备方法。该电化学传感器由电池阴极、电池阳极、万用表和外加电阻串联组成；所述电池阴极和阳极包括依次排列的基底电极、碳纳米材料层、催化剂层(介体层)及酶层；其中，阴极上的碳纳米材料层由阳离子功能化的碳纳米材料组成，催化剂层由普鲁士蓝组成，酶层包括氧化酶或氧化酶、惰性蛋白和交联剂交联形成的固定化酶；阳极上的碳纳米材料层由非功能化的碳纳米材料组成，介体层由亚甲基蓝、亚甲基绿、聚合亚甲基绿或聚合亚甲基蓝组成，酶层包括脱氢酶或脱氢酶、惰性蛋白和交联剂交联形成的固定化酶。本发明中基于原电池的传感器无需外来供能装置，燃料分子同时也即被检测物质，有望发展成为一种新型便携式电化学传感器。

Description

一种基于原电池的电化学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于原电池的电化学传感器及其制备方法。

背景技术

近几十年来，生物传感器以其原理简单、工作条件温和、仪器设备低廉且选择性高等优势备受关注。其中电化学生物传感器以生物物质作为分子识别单元，以电化学工作站作为换能器，得到了广泛的应用。利用生物电化学传感器技术，针对生理物质或环境污染物的高效、快速检测可通过设计不同的电极，在电化学工作站上即可完成。虽然生物电化学传感器具有潜在的应用前景，但是由于电化学工作站的使用，导致这种方法仍然很难满足样品的现场检测。

发明内容

本发明的目的是基于原电池技术，提供一种可以直接、快速、准确地检测溶液中待测物浓度的电化学生物传感器。

本发明所提供的基于酶型原电池的电化学传感器由：电池阴极、电池阳极、万用表和外加电阻串联组成；

所述电池阴极由基底电极、涂覆于所述基底电极上的碳纳米材料层、涂覆于所述碳纳米材料层上的催化剂层及涂覆于所述催化剂层上的酶层组成；其中，所述碳纳米材料层由阳离子功能化的碳纳米材料组成；所述催化剂层由普鲁士蓝(Prussian Blue，PB)组成；所述酶层由下述a)或b)或c)或d)或e)组成：a)氧化酶(glucose oxidase，GOx)，b)氧化酶、惰性蛋白和交联剂交联形成的固定化酶，c)氧化酶、生物高聚物和交联剂交联形成的固定化酶；d)氧化酶和惰性蛋白；e)氧化酶和生物高聚物；

所述电池阳极由基底电极、涂覆于所述基底电极上的碳纳米材料层、涂覆于所述碳纳米材料层上的介体层及涂覆于所述介体层上的酶层组成，或由基底电极、涂覆于所述基底电极上的碳纳米材料与介体复合层、涂覆于所述复合层上的酶层组成；其中，所述碳纳米材料层或碳纳米材料与介体复合层中的碳纳米材料由碳纳米材料(即非功能化的碳纳米材料)组成；所述介体层或碳纳米材料与介体复合层中的介体选自下述任意一种：亚甲基蓝(methylene blue，MB)，亚甲基绿(methylene green，MG)，聚合亚甲基绿(polymethylene green，PMG)和聚合亚甲基蓝(polymethylene blue，PMB)；所述酶层由下述a)或b)或c)或d)或e)组成：a)脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)，b)脱氢酶、惰性蛋白和交联剂交联形成的固定化酶，c)脱氢酶、生物高聚物和交联剂交联形成的固定化酶；d)脱氢酶和惰性蛋白；e)脱氢酶和生物高聚物。

所述电池阴极和电池阳极的碳纳米材料层中，每平方厘米基底电极上碳纳米材料的含量为5～180μg。所述碳纳米材料为单壁碳纳米管(Single-walled Nanotubes，SWNTs)和多壁碳纳米管(Multi-walled Nanotubes，MWNTs)的一种或其任意组合；所述功能化阳离子为聚吡咯阳离子、聚苯胺阳离子、咪唑阳离子和吲哚阳离子中的一种或其任意组合。

本发明对碳纳米材料的尺寸无特别要求，一般来说，所述碳纳米管的直径为1～500nm，优选为1～10nm；平均长度为0.5～50μm，优选为5～15μm。

所述电池阴极的催化剂层和电池阳极的介体层中，每平方厘米基底电极上催化剂(或介体)的含量为1～20μg。

所述电池阴极和电池阳极的酶层中，每平方厘米基底电极上GOx为1.4～217.2U，GDH的含量为3.9～31.1U。所述惰性蛋白可为牛血清蛋白、人血清蛋白和白明胶中的一种或其任意组合。所述生物高聚物为纤维素、淀粉、壳聚糖和琼脂糖中的一种或其任意组合。根据待测物(即底物)的不同，可以选择相应的针对待测物的氧化酶及脱氢酶。以测定葡萄糖的葡萄糖传感器为例，所用氧化酶为葡萄糖氧化酶，脱氢酶为葡萄糖脱氢酶；以检测乳酸的乳酸传感器为例，所用氧化酶为乳酸氧化酶，脱氢酶为乳酸脱氢酶；以检测谷氨酸的谷氨酸传感器为例，所用氧化酶为谷氨酸氧化酶，脱氢酶为谷氨酸脱氢酶；

本发明电化学传感器中所串联的电阻的阻值可为5～3000Ω。

本发明中所述基底电极具体可为玻碳电极(Glassy Carbon，GC)。

制备上述电化学传感器的方法，包括以下步骤：

1)制备电池阴极：

a)将阳离子功能化碳纳米材料进行超声处理，然后涂覆于基底电极上，室温干燥；

b)在经过a)修饰的电极上通过化学吸附或电化学沉积的方法制备PB层；具体可采用化学吸附或电化学沉积两种途径来制备：(i)将所述的碳纳米材料修饰的GC电极浸入在含有KCl的K₃Fe(CN)₆溶液中5～60分钟，用二次水反复冲洗以除去吸附不稳定的K₃Fe(CN)₆；干燥后，浸泡在FeCl₂溶液中5～60分钟，用二次水反复冲洗以除去吸附不稳定的FeCl₂，即得PB修饰的电极。(ii)将所述的碳纳米材料修饰的GC电极置于含有0.01mol/L FeC1₃+0.01mol/L K₃Fe(CN)₆+1.0mol/L KC1+0.1mol/LHC1的溶液中，在电位-0.2～1.1V之间，以100mV/s的扫速循环扫描50～250圈后取出，用二次蒸馏水将电极表面冲洗干净，待电极干燥后，即得到PB修饰的电极。

c)将含有氧化酶的溶液涂覆于PB层上，室温干燥形成酶层，即得到所述电池阴极。

2)制备电池阳极：

a)将碳纳米材料进行超声处理，然后涂覆于基底电极上，室温干燥，再将处理后的电极浸泡于介体溶液中，5～30分钟后取出，室温干燥，形成介体层；或将碳纳米材料与介体溶液混合超声均匀后涂覆于基底电极上，室温干燥，形成碳纳米材料与介体复合层；

b)将含脱氢酶的溶液涂覆于介体层上或碳纳米材料与介体复合层上，室温干燥，形成酶层，即得到所述电池阳极。

为了使酶层能够更好地在电极表面固定，酶溶液中还可含有惰性蛋白和交联剂。所述交联剂可为常见的功能化试剂，如戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，优选为戊二醛。传感器的电池阴极制备过程中，每平方厘米基底电极上各种物质用量如下：碳纳米材料层中含有2mg/mL的阳离子功能化的碳纳米材料分散液10～85μL；酶溶液中含有100～1900U/mL的氧化酶溶液14～114.2μL、质量分数为0.5～10％的惰性蛋白溶液或者生物高聚物溶液0～57μL、质量分数为0.5～6％的交联剂溶液0～57μL。

传感器的电池阳极制备过程中，每平方厘米基底电极上各种物质具体用量如下：碳纳米材料层中含有2mg/mL的碳纳米材料分散液10～85μL；酶溶液中含有272U/mL的GDH溶液14～114.2μL、质量分数为0.5～10％的惰性蛋白溶液或者生物高聚物溶液0～57μL、质量分数为0.5～6％的交联剂溶液0～57μL。

3)基于原电池构筑的电化学传感装置

将所制备的电池阳极和阴极与万用表、外加电阻串联，即得到所述电化学传感器。

电池两极的电线一端接于万用表下面A插孔，一端接于其下面COM插孔，在待测物质存在的条件下，即可得到稳定的电流读数。通常将阳极接A孔，阴极接COM孔，万用表电流显示为正值；反接时，万用表电流显示为负值。

本发明所提供的电化学传感器的生物阳极和阴极均以待测物为燃料分子，可作为自身可发电的便携式传感器应用。

本发明创新之处在于：1)传感器仅由两支电极、外加电阻和一个万用表组成，不需要外加的电化学工作站。万用表上的电流读数可以直接、方便、准确地反映溶液中待测物质的浓度，有望发展成为一种便携式电化学传感器；2)该传感器的生物阳极和阴极均以同一种物质为燃料，电池两极之间不存在交叉干扰，因此无须任何隔膜将两极分开，属于无隔膜式原电池；3)与传统酶型原电池阴极(大多采用漆酶和胆红素氧化酶作为生物识别元件，电化学催化氧气还原来发电)相比，本发明中原电池阴极通过PB(普鲁士蓝)在一个较低的电位下催化还原过氧化氢，可避免一些电化学生理活性物质如尿酸等对电池阴极的干扰。电池两极可以同时在同一个溶液中工作；4)该基于酶型原电池的电化学传感器的原理可推广到其它物质(如乳酸、谷氨酸等)的电化学传感器的构筑。

附图说明

图1为实施例1室温20℃时，万用表检测葡萄糖的电流I-浓度C关系图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的葡萄糖氧化酶(GOx)购于SIGMA-ALDRICH公司，商品目录号为：G7141；所用的葡萄糖脱氢酶(GDH)购于SIGMA-ALDRICH，商品目录号为19359。

实施例1、制备葡萄糖电化学传感器

1)电池阴极的制备方法：2mg咪唑阳离子功能化的碳纳米管(中国科学院化学研究所合成，直径范围20～30nm，平均长度为0.5～50μm，Anal.Chem.2008，80，6587-6593.)具体的制备过程如下：首先，将MWNTs(多壁碳纳米管)在体积比为3∶1的硫酸和硝酸混合液中超声以引入羧基，得到的产物与亚硫酰(二)氯反应以引入酰氯基团；之后，在三氯化铁的催化下，酰氯基团启动环氧氯丙烷对MWNTs进行原位阳离子开环聚合，得到聚醚接枝的碳纳米管；最后，与甲基咪唑反应，得到咪唑阳离子功能化的碳纳米管。将其分散至1mL蒸馏水中，室温下连续超声(超声功率为50W，频率为50Hz)2小时后，吸取5μL该悬浊液涂覆于0.07平方厘米的GC电极(玻碳电极)上，室温干燥。将干燥后的电极浸泡于K₃Fe(CN)₆(10mg/mL)中，20分钟后取出，用二次水反复冲洗以除去吸附不稳定的K₃Fe(CN)₆。干燥后再浸泡在FeCl₂的磷酸缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS，pH＝6)溶液中10分钟，在电位0～0.6V中扫描20圈后，取出，然后在0.1M的PBS中扫20圈直至得到稳定的循环伏安曲线。取出，待电极干燥后，形成电化学催化层(PB层)，其含量可以通过比较吸附前后碳纳米管质量的变化而计算。将含有GOx1.9U(1900U/mL，1μL)、牛血清蛋白20μg(1％水溶液，2μL)和交联剂(戊二醛)10μg(1％水溶液，1μL)的4μL混合液涂覆在电化学催化层上，室温干燥形成酶层，即得到GOx/催化层/MWNTs/GC电极，该电极作为原电池的阴极。

2)电池阳极的制备方法：将5μL(1mg/mL SWNTs)(单壁碳纳米管)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)分散液滴涂在0.07平方厘米的GC电极上，干燥后，将所制备的SWNT/GC电极在MG(亚甲基绿)溶液(500μM/L)中浸泡5分钟，取出后用二次水反复冲洗以除去未吸附的MG，得到MG/SWNT/GC电极。将1％的牛血清蛋白溶液、1％的戊二醛溶液和1mg/mL的GDH溶液(272U/mL)以1∶1∶2的体积比混合，取4μL混合液滴涂到上述MG/SWNT/GC电极上，室温干燥后即得到GDH/MG/SWNT/GC电极。该电极用于催化葡萄糖氧化及构筑“葡萄糖/H₂O₂”原电池的阳极。

3)利用万用表检测葡萄糖的装置连接

将电池阳极和电池阴极连接拼成原电池，室温20℃时，含有40mmol葡萄糖，10mmol NAD⁺的PBS(pH＝6)溶液中，当外加电压为0.15V时，最大功率可达7.8μW/cm²。

将所制备的电池阳极和阴极与一万用表串联，为得到稳定的电流读数，此电路上再串联一个100Ω的外加电阻，电池阳极的电线接于万用表下面A插孔，电池阴极的电线接于其下面COM插孔，构成一个回路。电池两极浸没在含有10mmol NAD⁺的PBS(pH＝6)溶液中。当未加入葡萄糖时，万用表上的电流读数显示为0。随着加入的葡萄糖浓度的增加，万用表上的电流读数与溶液中葡萄糖的浓度呈一定的线性关系，如图1所示，其检测限达10μM，线性范围10～400μM，响应范围为0.01～10mM。该范围区域包含了正常人体(3.5～6.1mM)的血糖浓度范围值，所以本发明有望发展为一种可自身发电的便携式新型葡萄糖传感器。

实施例2

1)电池阴极的修饰方法

将2mg实施例1中制备的咪唑阳离子功能化的碳纳米管分散在1mL蒸馏水中，室温下连续超声(超声功率为50W，频率为50Hz)30分钟，吸取4μL经超声处理的碳纳米管悬浊液涂覆于0.07平方厘米的玻碳基底电极上，干燥后，将电极浸泡于浓度为10mg/mL的K₃Fe(CN)₆溶液中，20分钟后取出，用二次水反复冲洗以除去吸附不稳定的K₃Fe(CN)₆。干燥后再浸泡在FeCl₂的磷酸缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS，pH＝6)溶液中10分钟，在电位0～0.6V中扫描20圈后，取出，然后在0.1M的PBS中扫20圈直至得到稳定的循环伏安曲线。取出，待电极干燥后，形成电化学催化层(PB层)，催化剂的含量可通过比较吸附前后碳纳米管质量的变化而计算。将含有5.7U的GOx(1900U/mL，4μL)和牛血清蛋白20μg(1％水溶液，2μL)的6μL混合液滴涂在电化学催化层上，干燥后，即得到葡萄糖氧化酶电极，该电极可作为原电池的阴极。

2)电池阳极的制备方法：将SWNTs(1mg)与0.5mL浓度为200μM的MG溶液混合超声30min，离心收集沉淀物，用H₂O清洗2遍，再将其分散在H₂O中，取10μL滴涂在已处理干净的GC电极上，干燥后，即得到MG/SWNT/GC电极。将牛血清蛋白20μg(1％水溶液，1μL)、交联剂(戊二醛)10μg(1％水溶液，1μL)和1mg/mL的GDH溶液(272U/mL)以1∶1∶2的体积比例混合，取4μL混合液滴涂到上述MG/SWNT/GC电极上，室温干燥后得到GDH/MG/SWNT/GC电极。该电极可用于催化葡萄糖氧化及构筑“葡萄糖/H₂O₂”原电池的阳极。

3)利用万用表检测葡萄糖的装置连接

将电池阳极和电池阴极连接拼成原电池，室温20℃时，在含有20mmol葡萄糖，10mmol NAD⁺的PBS(pH＝6)溶液中，当外加电压为0.18V时，其最大输出功率约1.2μW/cm²。

将所制备的电池阳极和阴极与一万用表串联，为得到稳定的电流读数，此电路上再串联一个100Ω的外加电阻，电池阳极的电线接于万用表下面A插孔，电池阴极的电线接于其下面COM插孔，构成一个回路。电池两极浸没在含有10mmol NAD⁺的PBS(pH＝6)溶液中。当未加入葡萄糖时，万用表上的电流读数显示为0；随着葡萄糖的加入，万用表上的电流读数与溶液中葡萄糖的浓度呈一定的线性关系。其检测限达10μM，线性范围0.01～2mM，响应范围为0.01～20mM。该范围区域基本包含了正常人体(3.5～6.1mM)和糖尿病人(超过20mM)的血糖浓度范围值，所以本发明有望发展成一种新的自身可发电的便携式葡萄糖生物传感器。

从实施例1与实施例2可以得到，提高原电池的功率必须优化电池阴、阳两极电化学催化/介体层的修饰，本发明中原电池阴极的催化层PB通过化学吸附可以合成，而在吸附的同时，通过施加一定的电位(在实施例1中)，可以更有效地促使更多PB的形成，增大了阴极的催化还原电流，提高了电池的功率。同样，电池阳极通过先修饰SWNTs，再通过改变浸泡时间吸附MG，从而形成了阳极的介体层(在实施例1中)。该方法比起将SWNTs与MG先混合超声得到加合物再滴涂在电极表面修饰法简单，修饰量不仅可以通过改变浸泡时间来控制，而且增大了阳极的催化氧化电流，提高了电池的功率。电池阴、阳两极催化层修饰方法的优化对提高电池的功率具有重要的作用，电池的功率越高，输出电流越大，即对相同浓度的葡萄糖响应也越大，检测限低。这里所构筑的原电池对葡萄糖在较宽的范围内均有响应，有望作为一种新型可自身发电的便携式葡萄糖传感器直接用于现场检测。

Claims

1.一种基于酶型原电池的电化学传感器，由电池阴极、电池阳极、万用表和外加电阻串联组成；

所述电池阴极由基底电极、涂覆于所述基底电极上的碳纳米材料层、涂覆于所述碳纳米材料层上的催化剂层及涂覆于所述催化剂层上的酶层组成；其中，所述碳纳米材料层由阳离子功能化的碳纳米材料组成；所述催化剂层由普鲁士蓝组成；所述酶层由下述a)或b)或c)或d)或e)组成：a)氧化酶，b)氧化酶、惰性蛋白和交联剂交联形成的固定化酶，c)氧化酶、生物高聚物和交联剂交联形成的固定化酶；d)氧化酶和惰性蛋白；e)氧化酶和生物高聚物；

所述电池阳极由基底电极、涂覆于所述基底电极上的碳纳米材料层、涂覆于所述碳纳米材料层上的介体层及涂覆于所述介体层上的酶层组成，或由基底电极、涂覆于所述基底电极上的碳纳米材料与介体复合层、涂覆于所述复合层上的酶层组成；其中，所述碳纳米材料层或碳纳米材料与介体复合层中的碳纳米材料由碳纳米材料组成；所述酶层由下述a)或b)或c)或d)或e)组成：a)脱氢酶，b)脱氢酶、惰性蛋白和交联剂交联形成的固定化酶，c)脱氢酶、生物高聚物和交联剂交联形成的固定化酶；d)脱氢酶和惰性蛋白；e)脱氢酶和生物高聚物。

2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于：所述碳纳米材料为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管的一种或其任意组合；所述阳离子功能化的碳纳米材料中的阳离子为聚吡咯阳离子、聚苯胺阳离子、咪唑阳离子和吲哚阳离子中的一种或其任意组合；

所述电池阳极中的所述介体层或所述碳纳米材料与介体复合层中的介体选自下述任意一种：亚甲基蓝、亚甲基绿、聚合亚甲基绿和聚合亚甲基蓝。

3.根据权利要求2所述的电化学传感器，其特征在于：所述单壁碳纳米管和多壁碳纳米管的直径均为1～500nm，优选为1～10nm，平均长度均为0.5～50μm，优选为5～15μm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的电化学传感器，其特征在于：所述电池阴极的碳纳米材料层中，每平方厘米基底电极上阳离子功能化的碳纳米材料的含量为5～180μg；所述电池阴极的催化剂层中，每平方厘米基底电极上催化剂的含量为1～20μg；所述电池阴极的酶层中，每平方厘米基底电极上氧化酶的含量为1.4～217.2U；

所述电池阳极的碳纳米材料层中，每平方厘米基底电极上非功能化的碳纳米材料的含量为5～180μg；所述电池阳极的介体层中，每平方厘米基底电极上介体的含量为1～20μg；所述电池阳极的酶层中，每平方厘米基底电极上脱氢酶的含量为3.9～31.1U。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的电化学传感器，其特征在于：所述惰性蛋白为牛血清蛋白、人血清蛋白和白明胶中的一种或其任意组合；所述生物高聚物为纤维素、淀粉、壳聚糖和琼脂糖中的一种或其任意组合；形成所述固定化酶所用的交联剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐或双偶氮苯，优选为戊二醛。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的电化学传感器，其特征在于：所述氧化酶为葡萄糖氧化酶且所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶；所述氧化酶为乳酸氧化酶且所述脱氢酶为乳酸脱氢酶；所述氧化酶为谷氨酸氧化酶且所述脱氢酶为谷氨酸脱氢酶。

7.制备权利要求1-6中任一项所述的电化学传感器的方法，包括下述步骤：

1)制备电池阴极：

b)在经过a)修饰的电极上通过化学吸附或电化学沉积的方法制备普鲁士蓝层；

c)将含有下述a)或b)或c)或d)或e)物质的溶液涂覆于普鲁士蓝层上，室温干燥形成酶层，即得到所述电池阴极；所述a)氧化酶，b)氧化酶、惰性蛋白和交联剂，c)氧化酶、生物高聚物和交联剂；d)氧化酶和惰性蛋白；e)氧化酶和生物高聚物；

2)制备电池阳极：

b)将含有下述a)或b)或c)或d)或e)物质的溶液涂覆于介体层上或碳纳米材料与介体混合层上，室温干燥，形成酶层，即得到所述电池阳极；a)脱氢酶，b)脱氢酶、惰性蛋白和交联剂，c)脱氢酶、生物高聚物和交联剂；d)脱氢酶和惰性蛋白；e)脱氢酶和生物高聚物；

3)将所述电池阳极和阴极与万用表、外加电阻串联，即得到所述电化学传感器。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：制备所述电池阴极制备过程中，每平方厘米基底电极上各种物质的用量如下：2mg/mL的碳纳米材料分散液10～85μL；100～1900U/mL的氧化酶溶液14～114.2μL；质量分数为0.5～10％的惰性蛋白溶液0～57μL；质量分数为0.5～6％的交联剂溶液0～57μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：制备所述电池阳极制备过程中，每平方厘米基底电极上各种物质的用量如下：2mg/mL的碳纳米材料分散液10～85μL；酶溶液中含有272U/mL的脱氢酶溶液14～114.2μL、质量分数为0.5～10％的惰性蛋白溶液或者生物高聚物溶液0～57μL；质量分数为0.5～6％的交联剂溶液0～57μL。

10.权利要求1-6中任一项所述的电化学传感器作为自身可发电的便携式传感器的应用。