CN104237341B

CN104237341B - 一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其应用

Info

Publication number: CN104237341B
Application number: CN201310239818.4A
Authority: CN
Inventors: 王雪; 卢宪波; 陈吉平
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2033-06-13
Also published as: CN104237341A

Abstract

本发明公开了一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其应用，首先将酪氨酸酶固定在有序介孔碳的孔道中，再与四氧化三钴和壳聚糖混合生成GMC‑Co₃O₄‑Tyr‑Chi复合材料固定在玻碳电极表面制得酪氨酸酶电化学生物传感器。本发明的优点是：1.对酚类化合物灵敏度高；2.选择性好；3.具有长期稳定性；4.本发明的生物传感器制备价格低廉，样品前处理简单，检测快速，设备便携适合现场检测。

Description

一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其应用

技术领域

本发明属于生物传感器，涉及一种基于有序介孔碳(GMC)-四氧化三钴(Co₃O₄)-壳聚糖(Chi)复合材料的酪氨酸酶(Tyr)电化学生物传感器用于检测水体环境中酚类化合物的方法。

背景技术

酚类化合物作为化工合成的基础原料在工业生产中被广泛应用，主要来自农药、杀虫剂、塑料和药物等化学品的生产。这些酚类化合物被排入到水体中会产生严重的水体环境污染，并具有致癌、致畸、致突变等潜在毒性，对生态环境和人类健康造成巨大威胁。酚类化合物因其高毒性引起世界各国的高度重视，上个世纪70年代，美国就将11种酚类化合物列入129种环境优先控制污染物之中。中国也在上个世纪80年代将6中酚类化合物纳入优控污染物的行列。

为了预防酚类污染物的危害，能够及时准确的测定环境(特别是水体)中酚类化合物的浓度水平显得尤为重要。目前常用的酚类化合物分析检测方法有：分光光度法、色谱法和色谱-质谱联用法等。这些方法存在着所使用的仪器价格昂贵，仪器操作繁琐，需要专业的科研人员进行测定，样品的前处理过程繁琐等缺点。因此急需发展一种简便、快速、灵敏、价格低廉的酚类化合物检测方法，来满足水体环境中快速现场检测的需求。电化学生物传感器这一新兴的分析手段能够弥补上述缺点，满足快速现场检测的需求。

生物传感器是一种精密的分析器件，它结合一种生物或生物衍生敏感元件与一只理化换能器，能够产生间断或连续的数字电信号，信号强度与被分析物成正比。从1956年Clark首次提出酶电极概念以来，经过数十年的发展，生物传感器技术已广泛应用在环境监测、食品分析、医疗保健、医药和军事医学等方面。酶电化学生物传感器利用酶分子作为响应元件，依靠电化学信号的变化来指示检测结果，具有以下几个方面的优势：1.酶对催化反应底物酚类化合物具有专一性，酶传感器选择性较好；2.电化学检测响应时间短，分析快速；3.传感器可以长期储存，多次使用；4.传感器易于小型化，适合现场检测。

酶的固定对生物传感器的性能起着至关重要的作用。近年来，纳米材料作为酶固定材料越来越受到关注。纳米材料有着比表面积大，导电性好，生物相容性强等优点，这些优点能够有效的提升酶生物传感器的性能。有序介孔碳是一类新兴的碳基纳米材料，它具有有序的孔结构，孔容量大，比表面积大，孔直径可调等优点。当介孔碳的孔尺寸正好和酶分子的大小相当，介孔碳就可以为酶分子提供一个具有保护能力的微环境来阻止酶失活，解决酶生物传感器酶分子泄露和酶分子失活的难题。此外，纳米结构的金属氧化物可以增强酶与金属氧化物之间的直接电子传递，缩短传感器的响应时间、增强传感器的响应强度。为了进一步提高生物传感器的灵敏性和稳定性，将介孔碳和四氧化三钴通过简单物理混合得到介孔碳-四氧化三钴纳米复合材料，再利用成膜剂壳聚糖将由纳米复合材料固定的酪氨酸酶修饰在玻碳电极表面，期望构建性能更加优异的酶生物传感器。

迄今为止，国内外上还没有基于介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖复合材料制备的酪氨酸酶电化学生物传感器用于检测酚类化合物。所以发明一种灵敏度高、检测限低、稳定性好、价格低廉、方法简单的用于检测酚类化合物的生物传感器是一个亟待解决的技术难题，本发明有望成为用于现场检测环境水样中酚类污染物的一个有力工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖修饰玻碳电极的酪氨酸酶电化学生物传感器，这种传感器具有高灵敏度、低检测限、高选择性、可靠便携、价格低廉、易于小型化和具有长期的存储稳定性等优点，并且能够用于现场检测环境污染物尤其是水体中酚类化合物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

构建基于介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖修饰玻碳电极的酪氨酸酶电化学生物传感器，并利用该传感器通过电化学检测信号前后的变化对水体中的酚类化合物进行测定。

酪氨酸酶电化学传感器的制备与样品的检测过程具体步骤如下：

(1)将介孔碳材料与酪氨酸酶磷酸缓冲盐溶液混合，在室温下震荡1小时。

(2)将四氧化三钴加入到上述介孔碳酪氨酸酶混合溶液中，在室温下震荡0.5小时。

(3)将成膜能力和粘着力极强的壳聚糖加入到介孔碳、酶分子和四氧化三钴形成的复合材料溶液中混匀，取4μL上述含有介孔碳-酪氨酸酶-四氧化三钴-壳聚糖复合物溶液滴加到已经进行过抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干。

(4)将一定浓度的待检测酚类化合物水溶液滴加到缓冲溶液中，利用电化学工作站进行电化学扫描并记录响应信号。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明中的介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖纳米复合材料具有很大的比表面积，能够为酶分子的固定提供更多的孔道和保护酶分子活性的微环境，极大提高了酶分子的长期稳定性和生物催化活性；(2)纳米复合材料优异的导电性显著增强酶分子与电极表面之间的电子传递，从而提高了传感器的灵敏度和检测限；(3)本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器对水体样品中酚类化合物的检测不需要复杂的样品预处理，操作简便快速；(4)测试设备简单，易于微型化，便于携带，适合野外现场监测。

本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器对环境样品中尤其是水体中的酚类化合物具有超高的选择性，能够快速、灵敏、准确、高效地评价环境水样中酚类化合物的浓度水平。

附图说明

图1(A)为本发明合成的10nm孔径的介孔碳透射电镜(TEM)图；(B)为四氧化三钴TEM图。(C)介孔碳-四氧化三钴纳米复合材料的TEM图。

图2(A)为酪氨酸酶修饰电极在磷酸缓冲溶液(PBS)中不同扫速下扫描曲线，自下到上为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mV/s；(B)为扫描速度与电信号线性相关曲线。

图3为本发明方法实施例2的儿茶酚、苯酚、对甲基苯酚、间甲基苯酚和对氯苯酚电信号与浓度关系曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其它未具体注明的实验条件，按照常规或仪器制造厂建议的条件。

电化学检测所用仪器为上海辰华电化学工作站CHI440，三电极体系，修饰玻碳电极作为工作电极，银/氯化银电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极。酪氨酸酶(菌菇)购于Sigma-aldrich(China)。

实施例1.酪氨酸酶电化学生物传感器制备

玻碳电极组装步骤：

(1)用粒径分别为1、0.3、0.05μm的三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，之后用高纯氮气将电极表面吹干待用。放入1mmolL^-1的铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液(摩尔比1:1)中在-0.1～+0.6V之间扫描循环伏安曲线。该曲线氧化还原峰电位差小于75mV，说明玻碳电极表面的氧化还原反应属于完全可逆反应，电极抛光情况良好，可以进行下一步实验。

(2)介孔碳-四氧化三钴-酪氨酸酶复合材料的构建。将介孔碳材料加入到酪氨酸酶磷酸缓冲溶液(50mmol/L K₂HPO₄/KH₂PO₄溶液,pH=7.0)中，震荡1小时，酪氨酸酶被成功诱导到介孔碳的孔道中，得到介孔碳-酪氨酸酶复合材料分散液。再将已经超声分散均匀的四氧化三钴水分散液与介孔碳-酪氨酸酶复合材料分散液混匀，震荡0.5小时，得到介孔碳-酪氨酸酶-四氧化三钴复合材料分散液。

(3)将生物相容性的成膜剂壳聚糖（其成膜能力和粘着力极强）加入到上述复合材料分散液中，加入壳聚糖后形成的最终分散液的组成为介孔碳浓度为0.2mg mL^-1；酪氨酸酶浓度为2.5mg mL^-1；四氧化三钴浓度为0.5mgmL^-1；壳聚糖浓度为1.5mg mL^-1，取4μL最终分散液滴到玻碳电极表面，在室温下静置缓慢晾干得到均一性薄膜。

(4)将修饰后的玻碳电极放入50mmol L^-1PBS溶液(pH=7.0)中搅拌0.5小时，去除没有固定在电极表面的酶和材料，利用电化学循环伏安法，电势范围在+0.3V～-0.5V之间，将三电极浸润到50mmol L^-1PBS溶液中，以10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mV s^-1十个不同的扫速扫描，得出信号峰电流强度与扫速成线性相关，此反应属于电极表面控制反应。

实施例2.酪氨酸酶电化学生物传感器检测酚类化合物的标准溶液

分别将儿茶酚、苯酚、对甲基苯酚、间甲基苯酚和对氯苯酚溶于水中，配成浓度为1mmol/L的标准溶液。

将一定体积(8μL)的儿茶酚标准溶液连续滴加(每40s一次)到由酪氨酸酶修饰的玻碳电极组成的三电极体系的检测溶液8ml PBS中，在工作电势为-0.1V的情况下进行恒电势扫描，得到的电流-时间(I-t)关系曲线，由于I-t曲线中固定时间点时检测溶液中的儿茶酚浓度可知，可以得到电流强度与儿茶酚浓度之间的相关曲线。儿茶酚作为酪氨酸酶的天然底物，在氧气存在情况下，酪氨酸酶催化儿茶酚生成邻苯醌，邻苯醌又在较低的电势下被还原成儿茶酚。酪氨酸酶电化学生物传感器可以检测这一还原信号，并且信号变化强度与儿茶酚的浓度在一定范围内线性相关。苯酚、对甲基苯酚、间甲基苯酚和对氯苯酚均采用与儿茶酚相同的检测过程进行检测。结果显示酪氨酸酶电化学生物传感器对这五种酚类化合物都产生了较强的电化学响应信号。并且随着浓度的升高，电化学响应信号逐步增强，在一定浓度范围呈良好的线性关系。

在工作电压下将分析水体样品加入到检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流；通过电流-时间曲线中的电流强度I和酚类目标物浓度C组成的校正曲线来计算分析样品中酚类化合物的浓度含量。

实施例3.酪氨酸酶电化学生物传感器干扰物的检测

取尿酸、葡萄糖和过氧化氢等检测时常见的干扰物溶于水中，配置成一定浓度的水溶液，在儿茶酚浓度为2μM的情况下，向检测溶液滴加尿酸、葡萄糖和过氧化氢水溶液，扫描I-t曲线，得到上述三种干扰物的电信号响应。结果证明尿酸浓度为40μM、葡萄糖浓度为2mM和过氧化氢浓度为0.1mM时均不影响酪氨酸酶电化学生物传感器对儿茶酚的检测。使用相同检测过程分别对无机盐离子(浓度为2mM的K⁺、Na⁺、NO₃ ^-、H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-、Cl^-、Ac^-离子)和有机溶剂(丙酮、乙腈、乙醇)进行了干扰测试，结果显示上述干扰物均对本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器无干扰作用。

本发明对酚类化合物具有优秀的选择性，对其他物质有极强的抗干扰能力，能够胜任对复杂环境水样的检测分析。本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器与常规的光谱和色谱方法相比，具有前处理简单、检测迅速、易于微型化和检测仪器价格低廉等优势，在环境水样酚类污染物监测中极具应用潜力。

本发明的优点是：1.对酚类化合物灵敏度高，介孔碳和四氧化三钴均具有良好的导电性，大大增强了响应电流，与常规的4-氨基安替比林分光光度法相比具有检测限低和样品前处理简便等优势；2.选择性好，由于酚类化合物是酪氨酸酶的天然底物，所以此酪氨酸酶电化学传感器对酚类化合物有很强的选择性，同时纳米复合材料的加入大大降低了工作电压，减少了其他化合物对检测的干扰；3.具有长期稳定性，孔径尺寸均一的有序介孔碳可以为固载其上的酶分子提供一个具有保护作用的微环境，防止酶失活；四氧化三钴还具有良好的生物相容性，提高了传感器的长期稳定性。4.本发明的生物传感器制备价格低廉，样品前处理简单，检测快速，设备便携适合现场检测。因此有序介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖的复合材料有望成为一种新型的酪氨酸酶固定材料，为酪氨酸酶电化学生物传感器的应用提供新思路。

Claims

1.一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于：

其采用如下过程制备获得，

(a)将介孔碳材料与酪氨酸酶磷酸缓冲盐溶液混合，在室温下震荡1小时或1小时以上；

(b)将四氧化三钴加入到上述介孔碳酪氨酸酶混合溶液中，在室温下震荡0.5小时或0.5小时以上；

(c)将壳聚糖加入到介孔碳、酪氨酸酶和四氧化三钴形成的复合材料溶液中混匀；

含有介孔碳-酪氨酸酶-四氧化三钴-壳聚糖复合物溶液中：介孔碳浓度为0.1～0.3mgmL^-1；酪氨酸酶浓度为1.0～4.0mg mL^-1；四氧化三钴浓度为0.2～0.8mg mL^-1；壳聚糖浓度为1.0～2.0mg mL^-1；

取4～10μL上述含有介孔碳-酪氨酸酶-四氧化三钴-壳聚糖复合物溶液滴加到已经进行过抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干，得到酪氨酸酶电化学生物传感器。

2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述的介孔碳孔径大小为2～50nm。

3.如权利要求2所述的传感器，其特征在于：所述的介孔碳孔径大小优选为10nm。

4.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述的四氧化三钴纳米材料具有颗粒状结构、棒状结构、带状结构或片状结构中的一种或二种以上。

5.如权利要求4所述的传感器，其特征在于：优选为具有棒状结构的四氧化三钴纳米材料。

6.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述磷酸缓冲盐溶液的组成为K₂HPO₄和KH₂PO₄等摩尔浓度混合水溶液，并将pH调至7.0。

7.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述的壳聚糖是从蟹壳、或虾壳中所获得的直链高分子聚合物；其壳聚糖脱乙酰度为75％～85％。

8.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：玻碳电极表面的抛光处理过程为：依次用粒径分别为1、0.3、0.05μm的三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后依次分别在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，之后用氮气将电极表面吹干待用。

9.一种权利要求1-8任一所述传感器的应用，其用于检测水体中酚类化合物，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)将所述的酪氨酸酶电化学生物传感器放入空白检测溶液中，在工作电压下将已知浓度的酚类化合物中的一种或二种以上作为目标分析物连续加入到上述检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流-时间曲线；

进一步，由于电流-时间曲线中固定时间点时检测溶液中的儿茶酚浓度可知，通过电流-时间曲线中的电流强度I和酚类目标物浓度C组成校正曲线；

(2)在工作电压下将分析水体样品加入到检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流；通过电流-时间曲线中的电流强度I和酚类目标物浓度C组成的校正曲线来计算分析样品中酚类化合物的浓度含量。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的目标分析物包括儿茶酚、苯酚、对甲基苯酚、间甲基苯酚以及对氯苯酚中的一种或二种以上；

所述电化学扫描的工作电压范围为-0.05～-0.15V，其为恒电势扫描；通过酪氨酸酶电化学传感器检测的电流强度与酚类目标物浓度关系而得到的标准曲线，来确定样品中是否含有酚类化合物并同时确定酚类化合物的浓度。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于：

检测溶液为磷酸缓冲盐溶液，其组成为pH＝7.0的K₂HPO₄和KH₂PO₄等摩尔浓度混合水溶液，体积为8mL。

12.如权利要求9所述的应用，其特征在于：

目标分析物连续加入到上述检测溶液中的加入速度为每隔40～50s一次，加入体积为2～8μL；此时检测溶液的体积为8mL。