CN114235775B - 一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，包括以下步骤：1)在微孔板中加入Ag@Au纳米粒子探针溶液、运行溶液和样品溶液，反应后，将试纸条的样品垫浸没在微孔板内，制作标准比色卡；2)扫描检测线处的拉曼光谱，以拉曼峰值作为纵坐标，人抗新冠病毒S蛋白抗体的浓度作为横坐标，绘制工作曲线；3)检测时，在微孔板中加入Ag@Au纳米粒子探针溶液、运行溶液和样品溶液，反应后通过试纸条与标准比色卡对比，可对人抗新冠病毒S蛋白抗体进行半定量检测；4)使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以拉曼峰值带入步骤2)的线性方程，即可求得人抗新冠病毒S蛋白抗体浓度。灵敏度高、性能稳定，可快速定性和定量分析。

Description

一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法

技术领域

本发明涉及新冠病毒抗体检测领域，尤其涉及一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法。

背景技术

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2，又称为(SARS-CoV-2或Covid-19)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈现圆形或椭圆形，直径为80至120纳米，属于网巢病毒目冠状病毒科。病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物，SARS-CoV-2病毒可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的ACE2为受体达到感染，主要感染的器官包括肺部、心脏、肾脏等多个器官。SARS-CoV-2病毒进入人体后，会引起先天免疫系统的免疫应答。其中，免疫系统会在病毒复制过程中介入并抑制病毒的传播，包括会产生特异性抗体等。对抗体的识别和使用可以帮助治疗COVID-19患者。基于COVID-19的血清样本横断面分析，感染SARS-CoV-2病毒的患者大约在20天后可完全检测到IgG和IgM抗体。两种血清的转换时间大约在发病两星期后出现。对抗体的检测有利于病毒感染的溯源，对于注射了疫苗的人群而言，检测抗体水平能够评估个人对病毒是否已经具有了抵抗能力。

传统的检测人体内抗体的方法包括沉淀反应、凝集试验补体结合试验；近年主流的方法有标记免疫测定，如酶联免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等。这些经典的检测方法具有较为出色的检出灵敏度，并且已经被实践证实其实用性。但是以上的方法，缺点也很明显，一方面，这些方法需要大型仪器和专业的操作人员，难以大范围推广实现快速实施检测；另一方面，上述方法检测时间往往很长，不利于现场的快速检出。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中即时现场检测抗体耗时长、费人力、成本高、无法定量等不足的上述问题，以由极薄的金壳包覆修饰有拉曼探针分子的银纳米粒子作为SERS基底和侧流免疫分析的标记物，提供一种具有高灵敏度和特异性等优点的适用于血样中新冠病毒抗体的检测方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，包括以下步骤：

1)在微孔板中加入Ag@Au纳米粒子探针溶液、运行溶液和已知浓度的样品溶液，常温下反应后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中，通过试纸条的颜色，制作标准比色卡；

2)使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm^-1处的拉曼峰值作为纵坐标，人抗新冠病毒S蛋白抗体的浓度作为横坐标，绘制工作曲线，得到线性方程；

3)检测时，在微孔板中加入Ag@Au纳米粒子探针溶液、运行溶液和已知浓度的样品溶液，常温下反应后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中，通过试纸条与标准比色卡对比颜色，可对人抗新冠病毒S蛋白抗体进行半定量检测；

4)使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm^-1处的拉曼峰值带入步骤2)的线性方程，即可求得人抗新冠病毒S蛋白抗体浓度。

所述运行溶液为含有1wt％牛血清白蛋白、1wt％Tween-20的pH＝7.4的缓冲溶液。

所述试纸条由PVC基板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组合粘贴合成，其中，在硝酸纤维素膜上使用划膜喷金仪喷涂新冠病毒Spike蛋白作为测试线(T线)和羊抗兔抗体作为质控线(C线)。

所述Ag@Au纳米粒子探针的制备方法包括如下步骤：

1)制备拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子；

2)制备Ag@Au纳米粒子；

3)在Ag@Au纳米粒子表面修饰巯基聚乙二醇羧基(HS-PEG-COOH)；

4)以(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活Ag@Au纳米粒子表面羧基，缀合抗体。

本发明中，步骤1)制备拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子包括以下步骤：

1.1)制备Ag种子；

1.2)通过步骤1.1)的Ag种子制备Ag球形纳米粒子；

1.3)将步骤1.2)的Ag球形纳米粒子和4-巯基苯甲酸的乙醇溶液搅拌，即得到拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子。

本发明中，步骤2)制备Ag@Au纳米粒子包括以下步骤：

2.1)将氯金酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液混合，无光静置即得到生长溶液；

2.2)将拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子、聚乙烯吡咯烷酮溶液、抗坏血酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液混合；

2.3)将步骤2.2)的混合溶液超声分散后加入生长溶液，然后加热，即得到Ag@Au纳米粒子。

本发明中，Ag@Au纳米粒子中，所述Ag纳米粒子的直径为27～30nm，Au壳的厚度为2nm。

本发明，步骤3)在Ag@Au纳米粒子表面修饰巯基聚乙二醇羧基包括以下步骤：称取巯基聚乙二醇羧基用适量水溶解，加入Ag@Au纳米粒子，在一定温度下搅拌，最后洗涤即可。

本发明，步骤4)缀合抗体包括以下步骤：

4.1)向修饰有巯基聚乙二醇羧基的Ag@Au中加入一定量的((1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活Ag@Au纳米粒子表面羧基溶液，振荡，离心洗涤；

4.2)向步骤4.1)活化后的溶液加入兔抗人抗体，振荡，洗涤并分散在重悬浮液中。

相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

本发明给出一种新的检测新冠病毒抗体的方法，即使用一种由Au包覆的修饰有拉曼探针的Ag纳米粒子来快速检测血样中的新冠病毒抗体浓度。首先利用强还原剂硼氢化钠和硝酸银制备银种子。然后利用逐步生长法，使银种子逐渐增大至30nm左右；再加入拉曼探针分子溶液，通过化学键合的方式结合到银纳米粒子表面；再通过还原法使金沉积在已有的银纳米粒子表面，形成具有强烈的表面增强拉曼散射(SERS)性能的Ag@Au纳米粒子。其中拉曼探针分子被夹在金壳与银核之间，SERS性能较单独的银纳米粒子和金纳米粒子更强。采用的拉曼探针分子为4-巯基苯甲酸的拉曼光谱在1075cm^-1处具有强烈的散射峰，其强度变化与Ag@Au颗粒的数量呈正相关，而在测试线处的纳米颗粒数量与样品中抗体数量呈正相关，从而实现对抗体浓度的定量检测。这种利用SERS信号的侧流免疫分析检测方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、耗时少并且无需专业的操作人员，利用人眼即可对抗体水平进行半定量分析，使用便携式拉曼光谱仪可实现灵敏的定量分析，可用于现场的血样中新冠病毒抗体的快速检测。

附图说明

图1为本发明基于Ag@Au纳米粒子的侧流免疫分析检测新冠病毒抗体的原理示意图。

图2为本发明中Ag纳米粒子和Ag@Au纳米粒子的透射电镜和粒径分布图。

图3给出本发明所述的Ag和Ag@Au纳米粒子的扫描透射电镜和元素成像图。

图4为本发明在检测实验的条件优化。

图5为本发明Ag@Au纳米粒子实施例检测在缓冲溶液和血清中不同浓度抗体的试纸条照片。

图6为本发明Ag@Au纳米粒子实施例检测不同浓度抗体的拉曼光谱图。

图7为本发明Ag@Au纳米粒子实施例检测在缓冲溶液和血清中不同浓度抗体的1075cm^-1处谱峰强度变化值与抗体浓度的线性关系曲线图。

图8位本发明Ag@Au纳米粒子实施例对人抗S蛋白抗体与其他类型抗体及蛋白的相应效果比较图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。

本发明中，一种使用Ag@Au纳米探针双模式检测人抗新冠病毒S蛋白抗体的侧流免疫分析方法如下：

取20μL探针溶液加入微孔板中，随后加入40μL运行溶液和40μL已知浓度的样品溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应15min后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中。等待20～25min后，拍摄试纸条的颜色，制作标准比色卡；同时使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱。以1075cm^-1处的拉曼峰值作为纵坐标，人抗新冠病毒S蛋白抗体的浓度作为横坐标，绘制工作曲线，得到线性方程；20μL探针溶液加入微孔板中，随后加入40μL运行溶液和40μL已知浓度的样品溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应15min后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中。等待20～25min后，拍摄试纸条的颜色，与标准比色卡对比，可以对人抗新冠病毒S蛋白抗体进行半定量检测；同时使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm^-1处的拉曼峰值带入上述线性方程，即可求得人抗新冠病毒S蛋白抗体浓度。

所述的人抗新冠病毒S蛋白抗体标准溶液浓度依次为1、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3mg/mL；运行溶液为含有1wt％牛血清白蛋白、1wt％Tween-20的pH＝7.4的缓冲溶液。

本实施例中，Ag@Au纳米粒子探针的合成步骤和试纸条的制作步骤包括以下过程：

1)Ag种子的制备：往三口烧瓶中依次加入柠檬酸钠溶液和超纯水，搅拌加热并保持一段时间，然后加入硝酸银溶液，并迅速加入新鲜配制的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌下保持一段时间。溶液将由无色转变为黑色，最后转变为棕黄色，即得到银种子溶液。

具体地，所述柠檬酸钠溶液浓度为1wt％，体积为20mL；超纯水的电阻为18MΩ，体积为75mL；加热温度为70℃，保持时间为15min；硝酸银溶液浓度为1％wt，体积为1.7mL；硼氢化钠溶液浓度为0.1％wt，体积为2mL；搅拌时间为2h，温度为70℃。

2)制备Ag球形纳米粒子：往三口烧瓶中加入柠檬酸钠溶液和超纯水，回流煮沸一段时间后，依次加入银种子与硝酸银溶液，继续回流煮沸，加入柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液，回流一段时间后再次加入柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液，回流一段时间后冷却至室温，放入紫外暗箱中进行熟化，即得到银纳米颗粒溶液。

具体地，所述柠檬酸钠溶液浓度为1wt％，体积为2mL；超纯水体积为75mL；煮沸时间15min；所述种子溶液体积为10mL，硝酸银浓度为1％wt，体积为1.7mL；第二次第三次加入的硝酸银溶液浓度为1％wt，体积为1.7mL，柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为2mL；回流煮沸时间为1h，磁力搅拌转速为600r/min。所述紫外暗箱波长为254nm；所述熟化时间可为20～60min，优选30min；所得Ag纳米粒子的粒径约为30nm。

3)制备拉曼探针分子修饰的银纳米颗粒：向烧瓶中加入步骤2)制备的银纳米颗粒溶液和4-巯基苯甲酸的乙醇溶液，磁力搅拌一段时间，即得到拉曼探针分子修饰的银纳米粒子。具体地，所述4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的浓度为1mM，与银溶胶的体积比为1:100。

4)Ag@Au的制备：往小瓶中加入超纯水和氯金酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液。无光静置即得到无色的生长溶液。另取小瓶，加入步骤3)制备的修饰探针分子的银溶胶、聚乙烯吡咯烷酮溶液、抗坏血酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液，将上述混合溶液超声振荡一段时间后加入生长溶液。在水浴下加热一段时间。即得到Ag@Au纳米粒子。

具体地，所述的生长溶液中超纯水为4.72mL，氯金酸溶液浓度为0.02943M，体积可采用20～160μL，优选40μL；氢氧化钠溶液浓度为0.2M，体积为240μL；亚硫酸钠溶液浓度为0.01M，体积为3mL；静置时间为12h。拉曼探针分子修饰的银溶胶体积为4.5mL；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液浓度为5wt％，MW＝10000，K13-18，体积为1mL；抗坏血酸溶液浓度为0.5M，体积为200μL；氢氧化钠溶液浓度为0.5M，体积为200μL；亚硫酸钠溶液浓度为0.1M，体积为200μL；加入生长溶液体积为1mL；水浴温度60℃，时间为2～6h，优选4h；所得Ag@Au纳米粒子的粒径约32nm。

5)Ag@Au表面修饰巯基聚乙二醇羧基(HS-PEG-COOH)：称取巯基聚乙二醇羧基用适量水溶解，加入步骤4)Ag@Au溶液。在一定温度下剧烈搅拌。并用PBS离心洗涤三次。

具体地，称取的巯基聚乙二醇羧基质量为15mg；加入Ag@Au的体积为10mL，最终体积为15mL；反应温度为37℃，时间为2h；所用PBS的pH值为6.8，浓度0.01M；所述离心速率为8500rpm；所述离心时间为10min；洗涤后体积为1mL。

6)缀合抗体：向步骤5)中制备的修饰了巯基聚乙二醇羧基的Ag@Au中加入一定量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，在室温下摇晃一段时间。使用PBS离心洗涤三次。向活化后的溶液加入适量的兔抗人抗体，在室温下摇晃一段时间，使用PBS离心洗涤并分散在重悬浮液中。

具体地，EDC溶液浓度为20mg/mL，体积为50μL，NHS溶液浓度为10mg/mL,体积为50μL；摇晃时间为0.5h，离心洗涤所用PBS的pH值为7.4，浓度为0.01M。兔抗人抗体浓度为1mg/mL，体积为10μL。摇晃时间为2h，离心洗涤所用PBS的pH值为7.4，浓度为0.01M。

7)试纸条组装及喷涂：试纸条由PVC基板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组合粘贴合成。在硝酸纤维素膜上使用划膜喷金仪喷涂新冠病毒Spike蛋白作为测试线(T线)和羊抗兔抗体作为质控线(C线)。

具体地，所使用的的羊抗兔IgG抗体和S蛋白的浓度均为1mg/mL，体积为30μL；试纸条长度为30cm，分切为100条，每条宽度3mm。

图1为本发明所述的以Ag@Au纳米粒子为侧流免疫分析标记物检测人抗新冠病毒S蛋白抗体的原理示意图。试纸条的检测区域喷涂有两种蛋白，分别是检测线上的新冠病毒S蛋白和质控线上的羊抗兔IgG抗体。当含有人抗S蛋白抗体的样品液滴加到样品垫后，液体会向吸水垫方向不断流动，经过结合垫时与标记物发生反应，人抗S蛋白抗体被兔抗体抗体捕获并和标记物连接在一起，随后经过检测线时，人抗S蛋白抗体会与其上的S蛋白结合，从而形成夹心结构使标记物停留在检测线处，呈现出一条色带，在经过质控线时，羊抗兔抗体会捕获兔抗人抗体，也会使标记物停留在质控线处，形成一条色带。检测线上的停留的标记物数量与样品中人抗S蛋白抗体呈正相关，而拉曼信号强度与标记物的数量呈现正相关，以此可以实现对人抗S蛋白抗体的定量检测。

图2为本发明所述的Ag和Ag@Au纳米粒子的透射电镜图像和粒径分布图，(a)为Ag纳米粒子的透射电镜图，(b)为Ag@Au纳米粒子的透射电镜图，(c)为Ag纳米粒子的粒径分布图，(d)为Ag@Au纳米粒子的粒径分布图。如图2所示，Ag内核的表面光滑致密，外观呈现均匀的球形整体尺寸约为30nm；Ag@Au纳米粒子的整体尺寸约为32nm；大部分纳米粒子呈现均匀的球形，Ag和Ag@Au纳米粒子的形状类似，尺寸大小略有差别。

图3为本发明所述的Ag和Ag@Au纳米粒子的扫描透射电镜和元素成像图。根据元素成像图像(c)～(e)可以发现，Ag元素处于中心位置位于结构的内部，Au处在外层的壳状结构，将内部的Ag完全包裹，致密且无泄漏。以上表征结果说明了本发明所提供的方法合成了具有核壳结构的Ag@Au纳米粒子。

图4为本发明在不同实验条件下阳性样本和阴性样本的信号强度及其比值的图像。其中，(a)为不同探针溶液用量下检测线上阴性样本和阳性样本的信号值以及比值；(b)为不同反应时间下检测线上阴性样本和阳性样本的信号值以及比值；(c)为不同封闭溶液用量下检测线上阴性样本和阳性样本的信号值以及比值；(d)为不同缀合抗体用量下检测线上阴性样本和阳性样本的信号值以及比值。本发明利用Au与Ag夹层中拉曼探针在特定激光下的拉曼散射信号来对目标物进行定量检测，信号值的大小取决于检测线上固定的探针数量，假阳性和假阴性会严重干扰检测的准确性。调整探针溶液和修饰抗体的用量、优化反应时间、使用封闭溶液可以有效地避免假阳性和假阴性的出现。如图4中(a)～(d)所示，当探针溶液的体积为20μL，反应时间为15min，牛血清白蛋白浓度(BSA)浓度为10％，缀合抗体用量为10μg时，阳性样本信号最大，且阳性和阴性样本的信号比值最大。

以下结合具体实施例对本方法的性能进行详细的考察。

实施例1：

以下给出本发明所制备的Ag@Au纳米粒子实施例对系列浓度抗体溶液的检测效果。配置一系列浓度的抗体溶液(0、10^-10～10^-3mg/mL)，滴加微孔板中，加入探针溶液反应一段时间后，常温下将试纸条样品垫一端插入微孔板中，15min后进行拍照和拉曼光谱扫描。图5表明，随着抗体浓度的增加，试纸条的检测线上逐渐出现一条色带，根据颜色变化可以实现对抗体浓度的半定量检测。图6表明，随着抗体浓度提高，检测线上的拉曼信号逐渐增大，1075cm^-1处峰值的变化值与抗体浓度在10^-6～10^-4mg/mL范围内呈现很好的线性关系(图7)，在缓冲溶液和血清中的线性相关系数达到0.997和0.995，最低检测浓度分别为3.75×10^-10mg/mL和4.41×10^-9mg/mL，说明本方法可用于抗体的定量检测。

实施例2：

以下给出本发明所述的Ag@Au纳米粒子实施例对人抗新冠病毒S蛋白抗体与其它类型的4种抗体的响应效果比较。图8表明，本发明所述Ag@Au纳米探针对人抗新冠病毒S蛋白抗体的响应信号是其它所有4种抗体的10倍以上，说明本方法对人抗新冠病毒S蛋白抗体具有很高的特异性。

实施例3：以下给出本发明所述的Ag@Au纳米探针实施例检测实际样品。

为了检验本方法在实际样品中人抗新冠病毒S蛋白抗体含量检测的可行性，将其应用于缓冲溶液和血清中来检测人抗新冠病毒S蛋白抗体。实验结果如表1和表2所示，在PBS和血清中，批次内变异系数分别为7.7％和9.1％，批次间变异系数分别为10.6％和13.2％。说明该方法具有良好的重现性，能满足血清中人抗新冠病毒S蛋白抗体的检测要求。

表1

表2

本发明以Ag@Au纳米粒子作为SERS基底，利用拉曼信号实现侧流免疫分析对人抗新冠病毒Spike蛋白抗体的定量检测的方法。该方法首先以硝酸银为原料，柠檬酸钠为还原剂，合成Ag纳米粒子，并加入拉曼探针分子4-巯基苯甲酸的乙醇溶液，将探针分子修饰在银纳米粒子表面。接着采用外延生长法，利用L-抗坏血酸还原由氯金酸配制的生长溶液，以将金还原沉积在已有的银纳米粒子的表面，形成形貌可控的Ag@Au纳米粒子。然后使用巯基聚乙二醇羧基修饰纳米粒子表面，并使用EDC和NHS溶液激活粒子表面的羧基，加入兔抗体IgG抗体使其结合在粒子表面。随后将修饰有抗体的纳米粒子用作侧流免疫分析的探针，样品中人抗新冠病毒Spike蛋白抗体与探针结合后，流经试纸条的T线时会留下一条显色带，从而实现对人抗新冠病毒Spike蛋白抗体的定性检测，使用拉曼光谱仪对T线进行扫描，利用拉曼信号实现对人抗新冠病毒Spike蛋白抗体的定量检测。该纳米探针对人抗新冠病毒Spike蛋白抗体响应的特异性强、灵敏度高、性能稳定，利用肉眼和仪器可实现对人抗新冠病毒Spike蛋白抗体的快速定性和定量分析。

本发明所提出的基于Ag@Au纳米粒子为标记物的侧流免疫分析方法主要有以下特点：

1)合成的Ag@Au纳米粒子具有形貌均一、尺寸可控、稳定性强等优点，水相温和合成，适用于水相检测。

2)基于Ag@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法灵敏度高、选择性好、通过肉眼即可实现对抗体浓度的实时、快速半定量检测。

3)基于Ag@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法抗干扰能力强、操作简单、实际应用价值高，对人体血样等复杂样品可以实现准确的定量检测。

Claims (6)

1.一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)在微孔板中加入Ag@Au纳米粒子探针溶液、运行溶液和己知人抗新冠病毒S蛋白抗体浓度的样品溶液，常温下反应后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中，通过试纸条的颜色，制作标准比色卡；

2)使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm^-1处的拉曼峰值作为纵坐标，人抗新冠病毒S蛋白抗体的浓度作为横坐标，绘制工作曲线，得到线性方程；

3)检测时，在微孔板中加入Ag@Au纳米粒子探针溶液、运行溶液和样品溶液，常温下反应后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中，通过试纸条与标准比色卡对比颜色，可对人抗新冠病毒S蛋白抗体进行半定量检测；

4)使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm^-1处的拉曼峰值带入步骤2)的线性方程，即可求得人抗新冠病毒S蛋白抗体浓度；

所述运行溶液为含有1wt％牛血清白蛋白、1wt％Tween-20的pH＝7.4的缓冲溶液；

所述试纸条由PVC基板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组合粘贴合成，其中，在硝酸纤维素膜上使用划膜喷金仪喷涂新冠病毒Spike蛋白作为测试线和羊抗兔抗体作为质控线；

所述Ag@Au纳米粒子探针的制备方法包括如下步骤：

1)制备4-巯基苯甲酸拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子；

2)制备Ag@Au纳米粒子；

3)在Ag@Au纳米粒子表面修饰巯基聚乙二醇羧基；

4)以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺激活Ag@Au纳米粒子表面羧基，缀合抗体。

2.如权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，其特征在于步骤1)制备拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子包括以下步骤：

1.1)制备Ag种子；

1.2)通过步骤1.1)的Ag种子制备Ag球形纳米粒子；

1.3)将步骤1.2)的Ag球形纳米粒子和4-巯基苯甲酸的乙醇溶液搅拌，即得到拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子。

3.如权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，其特征在于步骤2)制备Ag@Au纳米粒子包括以下步骤：

2.1)将氯金酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液混合，无光静置即得到生长溶液；

2.2)将拉曼探针分子修饰的Ag纳米粒子、聚乙烯吡咯烷酮溶液、抗坏血酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液混合；

2.3)将步骤2.2)的混合溶液超声分散后加入生长溶液，然后加热，即得到Ag@Au纳米粒子。

4.如权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，其特征在于：Ag@Au纳米粒子中，所述Ag纳米粒子的直径为27～30nm，Au壳的厚度为2nm。

5.如权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，其特征在于步骤3)在Ag@Au纳米粒子表面修饰巯基聚乙二醇羧基包括以下步骤：称取巯基聚乙二醇羧基用适量水溶解，加入Ag@Au纳米粒子，搅拌，最后洗涤即可。

6.如权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子的新冠病毒抗体检测方法，其特征在于步骤4)缀合抗体包括以下步骤：

4.1)向修饰有巯基聚乙二醇羧基的Ag@Au中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺激活Ag@Au纳米粒子表面羧基溶液，振荡，离心洗涤；

4.2)向步骤4.1)活化后的溶液加入兔抗人抗体，振荡，洗涤并分散在重悬浮液中。

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