CN111398220B - 一种利用石墨烯多重信号放大spr传感测定双酚a的方法 - Google Patents
一种利用石墨烯多重信号放大spr传感测定双酚a的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111398220B CN111398220B CN202010246411.4A CN202010246411A CN111398220B CN 111398220 B CN111398220 B CN 111398220B CN 202010246411 A CN202010246411 A CN 202010246411A CN 111398220 B CN111398220 B CN 111398220B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bpa
- spr
- solution
- sample
- chip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
- G01N21/03—Cuvette constructions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
- G01N21/03—Cuvette constructions
- G01N2021/0325—Cells for testing reactions, e.g. containing reagents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P10/00—Technologies related to metal processing
- Y02P10/20—Recycling
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法,其包括步骤:S1:试样准备:使用磁性石墨烯为吸附剂,对待测样品中的双酚A进行吸附富集,然后洗脱液洗脱,将洗脱下来的双酚A定容,得到待测试样;S2:将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净并连接羧基化氧化石墨烯;S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定BPA‑BSA;S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中双酚A的浓度:将含BPA的待测试样和BPA的单克隆抗体溶液混合进样,共同竞争被固定在SPR芯片表面的BPA‑BSA,SPR产生的信号与待测试样中BPA的浓度呈反比。按照本发明的测定方法,使LOD值低至5.169×10‑5ng/mL,IC50为5.137×10‑3ng/mL,检测范围2.288×10‑4ng/mL~9.211×10‑2ng/mL,可实现对双酚A超痕量的准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种内分泌干扰的检测技术领域,尤其是一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高,人们对环境激素也越来越重视,关注食源性激素与人类健康的研究也越来越多。食源性物质中雌激素的含量,对人们身体的健康有很大的影响。尤其是牛奶,牛奶的主要摄入人群是儿童。牛奶中有相当量的雌性激素,有些学者认为,目前消费的牛奶比100年前明显增加。双酚A,也称为BPA,是一种化学物质,普遍用于环氧树脂和聚碳酸酯塑料制品中,在生活中最常见的塑料制品就是婴儿的塑料奶瓶。由于人体普遍暴露于双酚A的环境中,体内循环的双酚A浓度为0.2ng/mL~20ng/mL。不少研究已经证明,暴露于双酚A环境中可以引起多种健康问题,如焦虑、短期失忆、肥胖、糖尿病和心血管疾病等。2003年,研究人员Hunt就已经提出双酚A是一种人造的,具有雌激素特征的化学物质,可以诱导增加中板集合障碍和减数分裂非整倍性的概率。到目前为止,双酚A是唯一已知的可以引起非整倍体(aneugen)的化学物质,该物质能通过破坏减数分裂过程从而使机体产生含有错误染色体数量的胚胎。
为了保证下一代的健康,需要对牛奶及其他饮食中双酚A的含量进行控制。Spr(Surface Plasmon Resonance)即表面等离子体共振,是一种用于表征表面折射系数改变的光学专业技术。SPR传感检测芯片包括金膜和金膜(或银膜等其他贵金属片)表面的微流通道,在微流通道内且在金膜表面固定着可与目标分子特异性结合的识别分子,金膜下方有棱镜。分析时,当试样从微流通道流过,试样中目标分子与识别分子相互结合,会引起金膜表面折射率变化,最终导致SPR角变化,通过检测SPR角度变化,获得被分析物的浓度、亲和力等信息。SPR传感测定内分泌干扰具有检测程序简单、无需标记、可实时快速动态检测的优点,且已成为最有希望用于生物痕量检测的技术之一。由于双酚A具有巨大的危害性且能在人体内积累,人们希望对双酚A实现超痕量的检测,而如何进一步降低检测限也是相关研究者的共同目标。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题,本发明提供一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法,通过优化检测程序结合修饰SPR检测芯片,结合采用间接竞争法进一步降低试样中双酚A的检出限、提高检测的灵敏度,实现对试样中双酚A超痕量的检测。
(二)技术方案
为了达到上述目的,本发明采用的主要技术方案包括:
一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法,包括如下步骤:
S1:试样准备
使用磁性石墨烯为吸附剂,对待测样品中的双酚A进行吸附富集、并用洗脱液洗脱,将洗脱下来的双酚A定容,得到待测试样;
S2:对SPR芯片进行修饰:将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净,并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯;
S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定BPA-BSA;
S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中双酚A的浓度:将含BPA的待测试样和BPA的单克隆抗体溶液混合进样,共同竞争被固定在SPR芯片表面的BPA-BSA,SPR产生的信号与待测试样中BPA的浓度呈反比。
本发明实现检测信号的多重放大:其一为利用磁性石墨烯对待测样品中的双酚A进行富集、经洗脱、定容制得待测试样,待测试样中具有较高浓度的BPA;其二为利用石墨烯对SPR芯片的贵金属片表面进行修饰从而可增强SPR信号;其三为,利用石墨烯具有大比表面积及其表面含有丰富羧基的特点,固定更高浓度的BPA-BSA,再次有效放大SPR信号。通过以上三重信号放大,可显著提高从待测样品中检出BPA的灵敏度,降低其检出限,实现对BPA的超痕量检测,LOD值低至5.169x10-5ng/mL。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中,磁性石墨烯按照如下方法制备得到:
(1)以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料,其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2;
(2)向所述原料中加入浓盐酸后,超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中,机械搅拌12-24h,加入浓氨水调节pH>10,在加热条件下继续搅拌,得到沉淀物,分离该沉淀物;
(3)加入超纯水和无水醇清洗,并采用磁分离器去除无磁性杂质,将所得物分散到无水醇中,低温烘干,即得到磁性石墨烯。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中,所述二价铁盐为硫酸亚铁或氯化亚铁,所述三价铁盐为氯化铁;加入浓氨水调节pH>10后,在70-85℃下搅拌,得到沉淀物,经超纯水和无水醇清洗后,于40-65℃烘干,制得磁性石墨烯材料。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中:采用磁性石墨烯为吸附剂,在pH为酸性条件下对待测样品中的双酚A进行吸附富集,吸附时间为4-10min,采用乙腈为洗脱液,将被磁性石墨烯吸附的双酚A洗脱下来,氮气吹干定容至100-250μL。
根据本发明较佳实施例,步骤S2中,对SPR芯片进行修饰的方法包括如下步骤:
步骤1:清洗SPR芯片的贵金属片,去除其表面的有机物;
步骤2:在SPR芯片的贵金属片表面引入带负电荷的基团;
步骤3:借助所述带负电荷的基团的静电作用,在所述在SPR芯片的贵金属片表面引入带正电荷的基团;
步骤4:借助所述带正电荷的基团的静电作用,在所述在SPR芯片的贵金属片表面连接带负电荷的羧基化氧化石墨烯。
根据本发明较佳实施例,步骤S2中,所述SPR芯片的贵金属片为金片,具体步骤为:
步骤1:采用体积比为H202:H2S04=1:3配制成piranha溶液,在室温下浸泡SPR芯片的金片,去除金片表面的有机物,用去离子水清洗、无水乙醇清洗,最后氮气吹干;其中H202为质量百分含量30%的双氧水;
步骤2:将所述SPR芯片的金片浸泡到MPA(巯基丙酸)的醇溶液中,放置过夜,取出并用乙醇冲洗金片以去除多余的MPA,用去离子水冲洗以去除多余的醇,取出后氮气吹干金片;通过浸泡,MPA与金片形成金硫键并引入带负电荷的羧基;
步骤3:将所述SPR芯片的金片浸泡到PAH(聚(烯丙胺·盐酸))溶液中,取出后用去离子水冲洗,氮气吹干金片;通过浸泡和静电作用,使金片表面连接带正电荷的PAH;
步骤4:将带有正电荷的金片浸泡在羧基化氧化石墨烯的分散液中,通过浸泡和PAH的静电作用,使羧基化氧化石墨烯连接到金片表面。
根据本发明较佳实施例,步骤S3中固定BPA-BSA的方法为:
将SPR芯片及金片装入传感器中,以EDC(1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶液对芯片表面的羧基进行活化5-10min;以pH=4-5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液,用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的BPA-BSA反应15-30min,以乙醇胺为封闭液反应5-20min,以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生1-3min,依次重复循环1-3次,使BPA-BSA与SPR芯片的金片表面带羧基的氧化石墨烯连接,实现BPA-BSA的固定化。上述方法,可先配制待用的溶液,再借助相关软件进行固定化程序,完成BPA-BSA(BPA-牛血清白蛋白包被原)的固定。
根据本发明较佳实施例,步骤S3中,活化时,EDC浓度为0.4mol/L,NHS的浓度为0.1mol/L,活化时间为7min;耦合缓冲溶液pH为4.5;其中用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的BPA-BSA反应20min,以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min,以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生2min。
根据本发明较佳实施例,步骤S3中,在固定BPA-BSA时,BPA-BSA浓度为100μg/mL,此时BPA-BSA在SPR芯片上的固定量接近饱和,SPR的响应值为605.46m°。相对地,通常情况下,当SPR芯片的金片表面未经氧化石墨烯修饰时,BPA-BSA浓度为25μg/mL时,BPA-BSA在SPR芯片上的固定量就已达到饱和。由此说明,石墨烯的修饰可显著增加BPA-BSA在SPR芯片表面的固定浓度。
此外,SPR芯片的金片表面经修饰氧化石墨烯后,所固定的BPA-BSA具有很好的稳定性、重复性。即使经30次再生处理后,同一浓度抗体产生的信号值仍能达到初始信号的90%以上,表明固定在SPR芯片表面的BPA-BSA在多次再生后依然可以保持很好的活性,重复性良好。
根据本发明较佳实施例,步骤S4中,将含BPA的待测试样和BPA-mAb(BPA的单克隆抗体)溶液以体积比1:1进行混合后,室温孵育加入样品池中进样检测,进样中游离的BPA和固定在传感基芯片上的BPA-BSA共同竞争BPA-mAb,测定SPR响应值。
根据本发明较佳实施例,步骤S4的具体步骤为:将12.50μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合后,室温孵育并加入样品池中进样检测,监测SPR响应信号,得到BPA-响应信号(SPR角度变化mo)的校准曲线;依据该校准曲线,将12.50μg/mL的BPA-mAb与含BPA的待测试样等体积混合,室温孵育进样,测定出待测试样中BPA的浓度;进样中BPA-mAb浓度为6.25μg/mL。
按照本发明的测定方法,使LOD值低至5.169×10-5ng/mL,IC50为5.137×10-3ng/mL,检测范围2.288×10-4ng/mL~9.211×10-2ng/mL,加标回收率93.36%~105.30%之间,RSD在5.32%~7.38%之间,可实现对双酚A超痕量的准确检测。在实际应用中如果待检测的样品BPA质量浓度较低时,可以采取磁性石墨烯富集浓缩的步骤来检测BPA残留。
根据本发明较佳实施例,还包括步骤S5,SPR的再生:采用0.05mol/L NaOH溶液120min/次,再生2次以上,使抗体去除率达到99.75%以上。
该再生方法可在保证固定在SPR芯片表面的全抗原(BPA-BSA)的活性的前提下,尽可能地去除与全抗原特异性结合的抗体以及非特异吸附的物质。再生后可对SPR芯片进行重复利用测定BPA。
(三)有益效果
本发明的有益效果是:
(1)本发明提出了一种基于石墨烯材料的多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法,具有良好的特异性,可用于对牛奶中微量甚至超痕量双酚A(BPA)的测定,具有比常规ELISA方法更低的检出限和更高的灵敏度。
(2)本发明使用石墨烯修饰SPR芯片的金片(银片或铂片)使SPR信号进行放大;同时由于SPR芯片的金片表面具有羧基化氧化石墨烯,利用石墨烯具有大比表面积和丰富羧基的特点,可以在芯片表面固定浓度更高的BPA-BSA(固定浓度达到100μg/mL,此时SPR响应值为605.46m°),进一步有效放大SPR信号,使双酚A的LOD值为0.020ng/mL,IC50为2.126ng/mL,检测范围0.102-32.960ng/mL,比未负载氧化石墨烯放大的SPR方法和常规ELISA方法具有更低的检出限和更高的灵敏度。
(3)本发明还利用磁性石墨烯对待测样品中双酚A进行高倍富集,并洗脱定容处理后得到待测试样,使LOD值低至5.169×10-5ng/mL,IC50为5.137×10-3ng/mL,检测范围2.288×10-4ng/mL~9.211×10-2ng/mL,加标回收率93.36%~105.30%之间,RSD在5.32%~7.38%之间,检测限相较于仅负载石墨烯SPR芯片进一步降低,灵敏度至少提高了500多倍,具有更广阔的检出范围,特别适合低浓度样品的检测。由此可见,可本发明可实现对低浓度、痕量和超痕量样品的检测。
(4)本发明优化了BPA-BSA的固定浓度、BPA-mAb的进样浓度(6.25μg/mL)和再生条件,使本发明相较于常规SPR方法和ELISA方法具有更低的检出限和更高的灵敏度,有利于对食源性人造雌激素含量的严格控制。
附图说明
图1为制备磁性石墨烯的实验例中石墨烯与磁性石墨烯的红外光谱图。
图2为制备磁性石墨烯的实验例中石墨烯与磁性石墨烯的扫描电镜图。
图3为对SPR芯片的金片表面进行修饰过程中,不同阶段的金片表面的原子力显微镜。
图4为对SPR芯片的金片表面进行修饰过程中,不同阶段的金片表面的SPR角度变化曲线图。
图5为在SPR芯片表面(含石墨烯修饰)固定不同浓度的BPA-BSA的SPR角偏移曲线图。
图6为在SPR芯片表面(不含石墨烯修饰)固定不同浓度的BPA-BSA的SPR角偏移曲线图。
图7为对SPR芯片(含石墨烯修饰)进行再生处理时再生次数对BPA-BSA稳定性的影响曲线图。
图8为采用SPR间接竞争免疫测定方法全程(含再生)的SPR响应曲线图。
图9为本发明实施例1中进样含不同浓度的BPA-mAb时,与SPR芯片(有石墨烯修饰)上的BPA-BSA结合产生的SPR角偏移曲线图。
图10为本发明实施例1将12.50μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合进样时的SPR角偏移曲线图。
图11为本发明实施例1将12.50μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合进样时,间接竞争抑制曲线(a)和BPA检测的校准曲线(b)。
图12为对比例1进样中含不同浓度的BPA-mAb时,与SPR芯片(无石墨烯修饰)上的BPA-BSA结合产生的SPR角偏移曲线图。
图13为对比例1将15μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合进样时的间接竞争的SPR角偏移曲线。
图14为对比例1将16.25μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合进样时,间接竞争抑制曲线(a)和BPA检测的校准曲线(b)。
图15为本发明实施例2(引入磁性石墨烯富集的前处理)将12.50μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合进样时的SPR角偏移曲线图。
图16为本发明实施例2(引入磁性石墨烯富集的前处理)将12.50μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合进样时,间接竞争抑制曲线(a)和BPA检测的校准曲线(b)。
图17为对比例2中ELISA的间接竞争结果:间接竞争抑制曲线(a)和BPA检测的校准曲线(b)。
图18为本发明实施例2(引入磁性石墨烯富集的前处理)特异性测定的实验结果柱状图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。
以下各实验及实施例要用到的试剂、材料及仪器的说明如下:
实验中用到的水为实验室自制的超纯水。
0.01M pH 7.4的PBS溶液,被用做反应的缓冲液,用于BPA-mAb以及待测溶液的稀释,并与10%的甲醇混合后用于BPA标准溶液的配制,Phosphate Buffered Saline(1X)0.0067M(PO4)。
仪器
ESPRIT表面等离子共振生物传感器(Auto Lab,荷兰),本仪器的入射波长为670nm,角度预设范围为62°-78°,动态检测范围为4000m°,角度分辨率小于0.02m°,平均基线波动为0.1m°。整个反应温度控制在25±0.5°。数据采集软件为Autolab ESPRIT DataAcquisition 4.3,数据分析软件为Kinetic Evaluation5.0。
酶标仪Microplate Spectrophotometer,美国BIO-RAD,Xmark
0.25μm过滤器,BIOFIC。
下述第1-6条为本发明方法的基本概述,包括:磁性石墨烯的制备、利用磁性石墨烯对待测样品的处理、石墨烯修饰SPR芯片、BPA-BSA在SPR芯片表面固定、SPR间接竞争免疫测定、SPR芯片再生方法的基本概述。下述第7-8条,为本发明方法的特异性评价、牛奶样品中双酚A的检测方法的基本概述。
1、制备磁性石墨烯
采用化学共沉淀法,将纳米石墨烯粉、硫酸亚铁、氯化铁摩尔比为4:3:4混合,加入0.8mL 37%的浓盐酸后超声脱氧并充分分散于200mL超纯水与无水乙醇的溶液中,机械搅拌1500rpm,1000min,加入浓氨水调节pH>10,80℃搅拌40min,利用磁分离器用超纯水和无水乙醇各清洗5次,去除无磁性杂质,分散到无水乙醇中,于60℃烘干,即可得到磁性石墨烯材料。
磁性石墨烯材料的表征:
石墨烯与磁性石墨烯的红外光谱图如图1,在1600cm-1和3430cm-1处,两材料均有吸收峰,3430cm-1处的中等强度的吸收峰是由O-H键伸缩振动引起的,1600cm-1处的较弱的吸收峰是由C=C键伸缩振动引起的。而磁性石墨烯在617cm-1处有一强烈的吸收峰,是属于Fe-O键的伸缩振动,石墨烯的光谱图无此吸收峰,表明Fe3O4纳米颗粒被固定在石墨烯薄层上。
观察石墨烯与磁性石墨烯的扫描电镜图如图2所示,石墨烯呈现清晰的片层状,表面光滑,而在磁性石墨烯石墨烯片层表面包覆上数量不等的颗粒,表明石墨烯表面的位点被Fe3O4纳米颗粒占据。
从两种材料的红外光谱图和扫面电镜图可以看出Fe3O4磁性内核被包覆在石墨烯上,材料制备成功。
2、磁性石墨烯对待测样品的富集方法
采用高效液相色谱优化富集条件,用30mg磁性石墨烯在pH为酸性条件下对待测样品中的双酚A吸附5min,2mL乙腈洗脱5min,氮气吹干定容至200μL,作为待测试样。
3、用石墨烯对SPR芯片的金片表面进行修饰
(1)将金片用新配置的piranha溶液(30%H202:H2S04=1:3)室温下浸泡1-2h,去除金片表面的有机物,然后用大量的去离子水清洗,无水乙醇清洗,最后氮气吹干。
(2)将0.01mol/L的MPA乙醇溶液过滤后置于培养皿中,然后将金片浸入溶液,避免金面上有气泡,放置过夜;用乙醇冲洗金片三次,去除多余的MPA;去离子水冲洗三次,去除多余的醇;氮气吹干金片。
(3)将MPA修饰好的金片(带羧基)浸泡在1%的PAH溶液中1h,水洗氮气吹干,此时金膜表面带正电荷的PAH。
(4)然后将带正电荷的金膜浸泡在0.1mg/mL的氧化石墨烯溶液中1h,通过PAH和带羧基的氧化石墨烯之间的静电作用,使带羧基的氧化石墨烯被固定在金片表面。
芯片表面的功能化修饰的表征:
由图3a可见,裸金片表面平滑;引入-COOH以后,粗糙度提升(图3b);由图3c对比图3b可知,平滑度有所提升,说明引入-COOH,PAH正电化处理后,氧化石墨烯成功修饰在芯片表面。
SPR信号值的变化基于芯片表面介质折射率的变化以及芯片表面固定物的量。因此,考查SPR信号值的变化可以考查芯片表面是否被修饰成功。图4可知,MPA自组装过程SPR角度变化约为39.21m°;PAH正电化后SPR角度变化为276.54m°,GO修饰后SPR角变化值为45.59m°,固定化后SPR角变化值接近605.46m°,特异性抗体反应后SPR角度变化值为132.98m°。由此进一步验证,氧化石墨烯成功吸附于芯片表面。
4、将BPA-BSA在SPR芯片的金片表面固定
将SPR芯片装入传感器中,以pH4.5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液,以0.4mol/L的EDC和0.1mol/L的NHS对芯片表面的羧基进行活化7min,用耦合缓冲液配制一定质量浓度的BPA-BSA反应20min,以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min,0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生时间为2min。根据BPA-BSA固定情况和SPR响应值,可依照前述程序重复1-3次,调用软件进行固定化程序。
随着全抗原质量浓度的增加,SPR角度变化值变大,说明全抗原在芯片表面的固定量逐渐增大。如图5所示,在100μg/mL时,固定量接近饱和,SPR的响应值为605.46m°。所以选择100μg/mL作为全抗原的最佳固定质量浓度。当全抗原的固定浓度大于100μg/mL时,SPR的响应值几乎不再变化。因此说明全抗原BPA-BSA浓度为100μg/mL时,固定量接近饱和。
传统的未经氧化石墨烯修饰的芯片25μg/mL时,固定量就已接近饱和,正如图6所示,SPR的响应值仅为238.31°。由此说明,引入羧基化氧化石墨烯以后,全抗原BPA-BSA在芯片表面的固定量(固定浓度)明显增加。
5、SPR间接竞争免疫测定
将一定质量浓度的抗体(6.25μg/ml),与不同浓度的BPA溶液等体积混合后,室温孵育加入样品池中,使游离的BPA和固定在传感基芯片上的BPA-BSA共同竞争BPA-mAb,分别测定SPR响应值。通过再生液将与BPA-BSA结合的BPA-mAb洗掉,从而实现对芯片的再生,反应过程如图8所示。为保证检测结果的重复性,每次实验均测量3次。
如图8所示,羧基化氧化石墨烯修饰的表面等离子共振生物传感器间接竞争法检测BPA,SPR角度值的变化过程包括结合阶段、解离阶段和再生阶段,再生2次后可重复使用。
6、再生
再生需要在保证固定在芯片表面的全抗原的活性的前提下,尽可能的除去与全抗原特异性结合的抗体以及非特异吸附的物质。研究时,选取了如表2所列的各试剂:0.1mol/L盐酸溶液,0.1mol/L盐酸+0.1%SDS溶液,0.1mol/L盐酸+0.1%Triton X-100溶液,0.05mol/LpH2.0甘氨酸-盐酸可溶液,0.05mol/L NaOH溶液再生一次;0.05mol/L NaOH溶液再生2次的抗体去除情况。分别可以去除94.45%、95.33%、87.96%、48.23%、98.01%的、99.75%的结合抗体(表2)。
表2
因此,最优的再生条件为0.05mol/L NaOH溶液120min/次再生2次。
由图7所示,为再生次数对氧化石墨烯修饰的芯片表面BPA-BSA活性的影响。由图示证明,经过30次再生,同一浓度抗体产生的信号值仍能达到初始信号的90%以上,表明固定在SPR芯片表面的BPA-BSA在多次再生后依然可以保持很好的活性,重复性良好。
再生后,为研究SPR芯片表面的非特异性吸附的影响,用12.5μg/mL的BSA溶液代替抗体,其他反应条件和反应过程不变,监测SPR的响应值。重复7次,均未观察到SPR角度变化,说明:经再生的芯片表面的非特异性吸附可以忽略不计。
7、特异性
选择BPA的结构和功能类似物双酚酸、己烯雌酚、雌二醇、雌酮,分别配制成不同的浓度梯度,用间接竞争法进行实验,通过计算反应的抑制率来进行特异性评价。
为了评价构建的磁性石墨烯富集氧化石墨烯放大测定方法的特异性,对双酚A和四种结构和功能类似物双酚酸、己烯雌酚、雌二醇、雌酮分别进行测定。特异性实验结果如图18所示,所有类似物的抑制率均低于9%,表明它们几乎不与抗体结合。并且五种混合物的特异性与只有双酚A的特异性基本一致。所以,其它类似物对检测双酚A几乎无影响,该方法特异性良好。
8、牛奶样品的检测
牛奶样品购自本地超市,通过高效液相色谱分析验证不含BPA,进行加标回收实验。采用磁性石墨烯富集,SPR间接竞争法进行检测,在检测范围内设高中低不同浓度(1×10-4ng/mL;1×10-3ng/mL;1×10-2ng/mL),每个浓度平行测定六次,计算加标收回率。
加标回收结果如表3所示,加标回收率在93.36%~105.30%之间,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在5.32%~7.38%之间,说明该方法准确可靠,在实际应用中如果待检测的样品BPA质量浓度较低时,可以采取磁性石墨烯富集浓缩的步骤来检测BPA残留。
表3
现结合本发明具体实施例和具体对比例,对本发明的特点和技术效果进一步说明如下。
实施例1
本实施例不包含采用磁性石墨烯对待测样品中的双酚A进行富集的前处理步骤。本实施例包含如下步骤:
步骤一:用石墨烯对SPR芯片的金片表面进行修饰
(1)将金片用新配置的piranha溶液(30%H202:H2S04=1:3)室温下浸泡1-2h,去除金片表面的有机物,然后用大量的去离子水清洗,无水乙醇清洗,最后氮气吹干。
(2)将0.01mol/L的MPA乙醇溶液过滤后置于培养皿中,然后将金片浸入溶液,避免金面上有气泡,放置过夜;用乙醇冲洗金片三次,去除多余的MPA;去离子水冲洗三次,去除多余的醇;氮气吹干金片。
(3)将MPA修饰好的金片(带羧基)浸泡在1%的PAH溶液中1h,水洗氮气吹干,此时金膜表面带正电荷的PAH。
(4)然后将带正电荷的金膜浸泡在0.1mg/mL的氧化石墨烯溶液中1h,通过PAH和带羧基的氧化石墨烯之间的静电作用,使带羧基的氧化石墨烯被固定在金片表面。
步骤二:将BPA-BSA在SPR芯片的金片表面固定
将SPR芯片装入传感器中,以pH4.5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液,以0.4mol/L的EDC和0.1mol/L的NHS对芯片表面的羧基进行活化7min,用耦合缓冲液配制100μg/mL的BPA-BSA结合反应20min,以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min,0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生时间为2min。依照前述程序重复1次。BPA-BSA固定饱和后SPR角变化值为605.46m°。
步骤三:SPR间接竞争免疫测定
在测定样品中BPA含量之前需确定BPA-mAb抗体的浓度。如图9所示,采用不同浓度的BPA-mAb进样,监测与SPR芯片(有石墨烯修饰)上的BPA-BSA结合产生的SPR角偏移曲线,发现BPA-mAb抗体浓度低于6.25μg/mL时,抗体在芯片表面的结合未达到饱和。因此,最佳抗体浓度6.25μg/mL。
用0.05M的NaOH溶液再生2次,再进行BPA的测定。
在测定时,将12.50μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合,监测响应信号,响应信号值如图10所示。如图11所示,LOD(检测限)值为0.020ng/mL,IC50为2.126ng/mL,检测范围0.102-32.960ng/mL。
对比例1
对比例1是在实施例1的基础上,去掉步骤一,即不采用石墨烯对SPR芯片的金片表面进行修饰。本对比例包含步骤:
步骤1:将BPA-BSA在SPR芯片的金片表面固定
(1)将金片用新配置的piranha溶液(30%H202:H2S04=1:3)室温下浸泡1-2h,去除金片表面的有机物,然后用大量的去离子水清洗,无水乙醇清洗,最后氮气吹干。
(2)将0.01mol/L的MPA乙醇溶液过滤后置于培养皿中,然后将金片浸入溶液,避免金面上有气泡,放置过夜;用乙醇冲洗金片三次,去除多余的MPA;去离子水冲洗三次,去除多余的醇;氮气吹干金片。
(3)将SPR芯片装入传感器中,以pH4.5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液,以0.4mol/L的EDC和0.1mol/L的NHS对芯片表面的羧基进行活化7min,用耦合缓冲溶液配制浓度为30μg/mL的BPA-BSA,结合反应20min,以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min,0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生时间为2min。依照前述程序重复1次。
预先在不含石墨烯修饰的SPR芯片表面固定不同浓度的BPA-BSA,监测SPR角偏移曲线图。结果如图6所示,确定BPA-BSA的最佳固定浓度为25μg/mL时,其固定量接近饱和(SPR响应值不会随BPA-BSA的浓度增加而改变)。
步骤2:SPR间接竞争免疫测定
在测定样品中BPA含量之前需确定BPA-mAb抗体的浓度。如图12所示,采用不同浓度的BPA-mAb进样,监测其与SPR芯片(不含石墨烯修饰)上BPA-BSA结合产生的SPR角偏移曲线,最终确定BPA-mAb抗体浓度为3.906μg/mL。
采用0.05M的NaOH溶液再生2次,再进行BPA的测定。
在测定时,将7.812μg/mL的BPA-mAb与不同浓度梯度的BPA标准溶液进行等体积混合,监测响应信号,响应信号值如图13所示。如图14所示,LOD(检测限)值为0.419ng/mL,IC50为9.863ng/mL,检测范围1.592-43.349ng/mL。由实施例1和对比例1相比,对比例1的LOD值是实施例1的20倍,IC50是实施例1的4.6倍。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上,还采用磁性石墨烯对待测样品中的双酚A进行富集的前处理,处理后得到待测试样,该前处理具体为:
采用高效液相色谱优化富集条件,用30mg磁性石墨烯在pH为5-6的条件下对稀释的BPA标准样品中的双酚A进行吸附5min,过滤后,对磁性石墨烯用2mL乙腈洗脱5min,氮气吹干定容至200μL,作为待测试样。
其他步骤与条件均参照实施例1进行。
实验结果表明:在引入磁性石墨烯富集的前处理步骤后,用羧基化氧化石墨烯修饰的表面等离子共振生物传感器间接竞争法检测BPA,监测响应信号,响应信号值如图15所示。实验结果如图16所示,LOD值为5.169×10-5ng/mL,IC50为5.137×10-3ng/mL,检测范围2.288×10-4ng/mL~9.211×10-2ng/mL。
与实施例1相比,实施例1的LOD值是实施例2的387倍,IC50是实施例2的413倍。
对比例2
本对比例采用间接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法测定BPA的含量。以BPA-BSA为包被原,BPA-mAb为一抗,IgG:HRP为二抗,OVA作为封闭液,以TMB溶液作为显色剂。BPA-BSA和BPA单抗的最佳稀释倍数分别为1/81000(0.104μg/ml)和1/128000(0.021μg/ml)。
实验结果如图17所示,LOD值为1.37ng/mL,IC50为12.78ng/mL,检测范围2.79-65.82ng/mL。
上述几种间接竞争免疫检测方法使用相同的全抗原和抗体。
实施例1、实施例2、对比例1、对比例2四种检测方法的实验结果记录如表4所示,比较ELISA与未经石墨烯修饰的传统SPR实验结果可以看出:SPR检测方法较ELISA方法具有更低的检测限和更宽的检测范围,缺点是抗体的使用量较大。而当使用氧化石墨烯对芯片表面进行修饰以后,SPR的检出限进一步降低,灵敏度大约提高了4倍,并且具有更广阔的检出范围。而按照本发明,进一步引入磁性石墨烯的前处理的富集步骤后,检出限降低了大约7700多倍,尤其适合对低浓度样品的中BPA含量的检测。
表4
应当说明的是,上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法,其特征在于,其包括步骤:
S1:试样准备
使用磁性石墨烯为吸附剂,对待测样品中的双酚A进行吸附富集、并用洗脱液洗脱,将洗脱下来的双酚A定容,得到待测试样;
S2:对SPR芯片进行修饰:将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净,并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯;
所述SPR芯片的贵金属片为金片,具体步骤为:
步骤1:采用体积比为H2O2:H2SO4=1:3配制成piranha溶液,在室温下浸泡SPR芯片的金片,去除金片表面的有机物,用去离子水清洗、无水乙醇清洗,最后氮气吹干;其中H2O2为质量百分含量30%的双氧水;
步骤2:将所述SPR芯片的金片浸泡到巯基丙酸MPA的醇溶液中,放置过夜,取出并用乙醇冲洗金片以去除多余的巯基丙酸MPA,用去离子水冲洗以去除多余的醇,取出后氮气吹干金片;通过浸泡,巯基丙酸MPA与金片形成金硫键并引入带负电荷的羧基;
步骤3:将所述SPR芯片的金片浸泡到聚(烯丙胺·盐酸)PAH溶液中,取出后用去离子水冲洗,氮气吹干金片;通过浸泡和静电作用,使金片表面连接带正电荷的聚(烯丙胺·盐酸)PAH;
步骤4:将带有正电荷的金片浸泡在羧基化氧化石墨烯的分散液中,通过浸泡和聚(烯丙胺·盐酸)PAH的静电作用,使羧基化氧化石墨烯连接到金片表面;
S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定双酚A的全抗原BPA-BSA,固定BPA-BSA的方法为:
将SPR芯片及金片装入传感器中,以1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐EDC溶液和N-羟基琥珀酰亚胺酯NHS溶液对芯片表面的羧基进行活化5-10min; 以pH=4-5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液,用所述耦合缓冲液配制 BPA-BSA的溶液反应15-30min,以乙醇胺为封闭液反应5-20min,以0.05 mol/L的NaOH溶液为再生液再生1-3min,依次重复循环1-3次,使BPA-BSA与SPR芯片的金片表面带羧基的氧化石墨烯连接,实现BPA-BSA的固定化;
S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中双酚A的浓度:将含BPA的待测试样和BPA的单克隆抗体BPA-mAb溶液混合进样,待测试样中的BPA与被固定在SPR芯片表面的BPA-BSA共同竞争BPA-mAb,SPR产生的信号与待测试样中BPA的浓度呈反比。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S1中,磁性石墨烯按照如下方法制备得到:以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料,其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2;向所述原料中加入浓盐酸后,超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中,机械搅拌12-24h,加入浓氨水调节pH>10,在加热条件下继续搅拌,得到沉淀物,分离该沉淀物;加入超纯水和无水醇清洗,并采用磁分离器去除无磁性杂质,将所得物分散到无水醇中,低温烘干,即得到磁性石墨烯。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S1中:采用磁性石墨烯为吸附剂,在pH为酸性条件下对待测样品中的双酚A进行吸附富集,吸附时间为4-10min,采用乙腈为洗脱液,将被磁性石墨烯吸附的双酚A洗脱下来,氮气吹干定容至100-250μL。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S3中,活化时,EDC浓度为0.4 mol/L,NHS浓度为0.1 mol/L,活化时间为7min;耦合缓冲溶液pH为4.5;其中用所述耦合缓冲液配制BPA-BSA的溶液反应20min,以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min,以0.05 mol/L的NaOH溶液为再生液再生2min。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S3中,在固定BPA-BSA时,BPA-BSA浓度为100μg/mL,此时SPR的响应值为605.46m°。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S4中,将含BPA的待测试样和BPA-mAb溶液是以体积比1:1进行混合后,室温孵育加入样品池中进样检测,进样中游离的BPA和固定在传感基芯片上的BPA-BSA共同竞争BPA-mAb,测定SPR响应值;其中BPA-mAb溶液的BPA-mAb浓度为12.50μg/mL,进样中BPA-mAb浓度为6.25μg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括步骤S5,SPR的再生:采用0.05mol/LNaOH 溶液120min/次,再生2次以上,使抗体去除率达到99.75%以上。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010246411.4A CN111398220B (zh) | 2020-03-31 | 2020-03-31 | 一种利用石墨烯多重信号放大spr传感测定双酚a的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010246411.4A CN111398220B (zh) | 2020-03-31 | 2020-03-31 | 一种利用石墨烯多重信号放大spr传感测定双酚a的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111398220A CN111398220A (zh) | 2020-07-10 |
CN111398220B true CN111398220B (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=71436773
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010246411.4A Active CN111398220B (zh) | 2020-03-31 | 2020-03-31 | 一种利用石墨烯多重信号放大spr传感测定双酚a的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111398220B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023123142A1 (zh) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102628801A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-08-08 | 王利兵 | 一种基于表面等离子共振技术的塑料玩具中有害化合物检测方法 |
CN106018349A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 南京理工大学 | 一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法 |
-
2020
- 2020-03-31 CN CN202010246411.4A patent/CN111398220B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102628801A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-08-08 | 王利兵 | 一种基于表面等离子共振技术的塑料玩具中有害化合物检测方法 |
CN106018349A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 南京理工大学 | 一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Highly sensitive carboxyl-graphene oxide-based surface plasmon resonance immunosensor for the detection of lung cancer for cytokeratin 19 biomarker in human plasma;Nan-Fu Chiu;《Sensors and Actuators, B. Chemical》;20180314;第265卷;第264-272页 * |
磁性石墨烯固相萃取荧光光度法测定一次性水杯中双酚A溶出量;叶青等;《分析试验室》;20160731;第35卷(第7期);第806-808页 * |
郑明辉.竞争酶联免疫吸附分析法.《二恶英类生物检测技术》.2013,第28-29页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111398220A (zh) | 2020-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wu et al. | Ultrasensitive magnetic field-assisted surface plasmon resonance immunoassay for human cardiac troponin I | |
Zhang et al. | Robust immunosensing system based on biotin-streptavidin coupling for spatially localized femtogram mL− 1 level detection of interleukin-6 | |
US7410811B2 (en) | Analytical method and device utilizing magnetic materials | |
EP2545367B1 (en) | Magnetic sensor based quantitative binding kinetics analysis | |
US20130029428A1 (en) | Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and immuno-fluoroscence slide prepared thereby | |
CN101441210B (zh) | 纳米磁性粒子层析试纸检测方法 | |
Wu et al. | Magnetic field-assisted SPR biosensor based on carboxyl-functionalized graphene oxide sensing film and Fe3O4-hollow gold nanohybrids probe | |
Gao et al. | A highly sensitive tetracycline sensor based on a combination of magnetic molecularly imprinted polymer nanoparticles and surface plasmon resonance detection | |
JP3693680B2 (ja) | 磁性粒子を使用するアッセイ | |
US20210031166A1 (en) | Solid Phase Microextraction Membranes Impregnated with Gold Nanoparticles: Creation of Novel SERS-Enhancing Substrates | |
Ying et al. | Poly (glycidyl methacrylate) nanoparticle-coated capillary with oriented antibody immobilization for immunoaffinity in-tube solid phase microextraction: Preparation and characterization | |
Lu et al. | Flow injection chemiluminescence immunoassay of microcystin-LR by using PEI-modified magnetic beads as capturer and HRP-functionalized silica nanoparticles as signal amplifier | |
CN111398220B (zh) | 一种利用石墨烯多重信号放大spr传感测定双酚a的方法 | |
JP2009020097A (ja) | 生化学的分析方法 | |
Kuo et al. | Magnetic particle-linked anti hCG β antibody for immunoassay of human chorionic gonadotropin (hCG), potential application to early pregnancy diagnosis | |
Liu et al. | Rapid and regenerable surface plasmon resonance determinations of biomarker concentration and biomolecular interaction based on tris-nitrilotriacetic acid chips | |
KR20190070726A (ko) | 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법 | |
JP2021081359A (ja) | 分子間相互作用の解析方法および解析装置 | |
CN111398221B (zh) | 一种基于石墨烯多重信号放大spr传感测定己烯雌酚的方法 | |
CN109917139A (zh) | 一种gmr芯片及包括其的磁敏免疫检测卡 | |
Chen et al. | Tyramine signal amplification on polystyrene microspheres for highly sensitive quantification of Aflatoxin B1 in peanut samples | |
KR100838323B1 (ko) | 비스페놀a 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한검출방법 | |
CN111398219B (zh) | 采用石墨烯多重信号放大spr传感测定雌二醇的方法 | |
Alipour et al. | Designing a magnetic inductive micro-electrode for virus monitoring: modelling and feasibility for hepatitis B virus | |
CN112526120B (zh) | 一种基于spr技术检测沙丁胺醇的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |