CN108680547A - 铜纳米簇作为荧光探针特异性检测溶液中利福平药物含量方面的应用 - Google Patents
铜纳米簇作为荧光探针特异性检测溶液中利福平药物含量方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了铜纳米簇作为荧光探针特异性检测溶液中利福平药物含量方面的应用。本发明采用荧光猝灭“turn off”模式实现了对利福平进行免标记、高灵敏、选择性的检测方法，该方法简单、快捷，可以实现对利福平的痕量检测，检测线性范围宽，检出限低，本发明具有较好的检测灵敏度和选择性，在生物体系检测和临床应用等方面具有很好的应用前景。
Description
本专利得到国家自然科学基金面上项目(21375095)、天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800），天津师范大学博士基金项目（No.52XB1510），天津师范大学“无机—有机杂化功能材料化学教育部重点实验室”、“天津市功能分子结构与性能重点实验室”开放基金项目和天津师范大学“未来千人计划”项目的支持。
技术领域
本发明属于金属纳米簇在荧光传感方面的应用领域，具体涉及铜纳米簇采用荧光猝灭“turn off”模式，免标记、高效、选择性检测复杂体系中利福平含量方面的应用。
背景技术
结核病是一种影响全世界数百万人的一种传染性疾病，它是由很多种分枝杆菌菌株和典型的结核杆菌引起，而由于这些细菌对于疏水性抗生素的渗透性较低，生存能力较强，因此，结核病的治疗是非常困难的，经研究发现，目前在治疗结核病的过程中，利福平表现出了良好的抑菌活性。利福平(RIFA)是利福霉素组中一种重要的杀菌性抗生素药物，它能够和RNA聚合酶结合从而延缓、抑制细菌的生长。同时，利福平还和其他的药物一起被广泛用于治疗芽孢杆菌和李斯特菌菌株引起的肺结核、与骨髓炎相关的感染疾病和脑膜炎，在急性脑损伤和慢性神经退行性疾病中也表现出了很好的神经保护作用。在治疗疾病方面，通常将利福平和其他的药物结合使用，治疗周期较长，而在用药期间，持续不当的剂量会引起细菌的抗药性从而导致病人死亡。因此，在治疗过程中监控药物的剂量是至关重要的。目前，评估利福平药物剂量最简单的方法是测定病人尿液中利福平代谢物的含量，然而，这个结果可能是不准确的。由于摄入量的增加和药物在肝中的累积会增加肝中毒的危险，因此，又有很多新的检测利福平含量的方法被建立，分别是常规的药物分析方法、分光光度法、电化学方法和高效液相色谱法等，但由于其检测过程的复杂性、检测前处理的苛刻要求、检测纯度的较高要求、检测灵敏度低等问题都限制了这些方法的广泛应用。众所周知，荧光测定的方法过程快速，操作便捷，无需复杂的前处理过程，灵敏度高，具有较低的检出限，可达到微量甚至痕量的数量级，因此，建立一种利用荧光分光光度法分析检测利福平含量的方法在实际应用方面具有重大的意义。本发明以谷胱甘肽为保护剂和还原剂合成铜纳米簇，并利用谷胱甘肽与利福平的特异性作用实现了对溶液中利福平的含量进行无标记、高灵敏的检测。
发明内容
本发明的目的在于克服传统复杂的药物检测方法，建立一种利用荧光分光光度法，方便、快速的选择性检测复杂体系中利福平含量的方法，本发明提供了一种基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇作为荧光探针，采用荧光猝灭“turn off”模式实现了对利福平进行免标记、高灵敏、选择性的检测方法，该方法简单、快捷，可以实现对利福平的痕量检测，检测线性范围宽，检出限低，在本发明中采用铜纳米簇检测利福平，具有较好的检测灵敏度和选择性，在生物体系检测和临床应用等方面具有很好的应用前景。
为实现上述目的，本发明公开了铜纳米簇作为荧光探针特异性检测溶液中利福平药物含量方面的应用。实验结果表明，利福平浓度在0.25~50 nM范围内，铜纳米簇的荧光强度猝灭值与利福平的浓度呈现线性关系，线性方程为F0-F=1.25214 C+30.49851，线性相关系数为0.993，检出限为0.16 nM。
本发明进一步公开了采用铜纳米簇检测溶液中利福平药物含量的方法如下：
(1) 4 mM利福平母液的配制：称取0.0329 g 利福平溶于10 mL高纯水中，低温保存待用；
(2) 一系列利福平不同浓度溶液的配制：
将4 mM利福平溶液分别稀释到5 nM、10 nM、100 nM、200 nM、1000 nM不同浓度，稀释后的溶液均补水至4mL；
(3) 将制备好的基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇均匀分散到高纯水中，配制成浓度为1.2 mM，体积为4 mL的检测体系，并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度，在激发波长354 nm的激发下，该荧光探针在632.02 nm处表现出较强发射；
(4) 将1.6 mL铜纳米簇均匀分散到2.2 mL高纯水中，混合均匀后，向混合溶液中加入200 μL 高纯水，测试体系的荧光强度，此时的荧光强度作为初始荧光强度；
(5) 向离心管中加入2.2 mL高纯水中，1.6 mL铜纳米簇溶液，混合均匀后，向混合溶液中加入200 μL利福平溶液，利福平与铜纳米簇充分作用，使得荧光发生猝灭并检测其荧光发射光谱，通过与初始荧光强度对比，荧光发射光谱强度的变化值证明该铜纳米簇作为荧光探针检测利福平的可行性；
(6) 检测溶液中利福平含量线性的测定
向离心管中分别加入0.2~3.4 mL 高纯水，0.4~3.6 mL 铜纳米簇溶液，向混合溶液中分别加入200 μL不同浓度5~1000 nM的利福平溶液，充分反应1~15 min后用荧光分光光度计检测体系的荧光强度。实验结果表明，在利福平浓度在0.25~50 nM范围内，铜纳米簇的荧光强度猝灭值与利福平的浓度呈现线性关系，线性方程为F0-F=1.25214 C+30.49851，线性相关系数为0.993，检出限为0.16 nM。
以上涉及到的铜纳米簇溶液均为基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇，具体的合成方法见实施例1。
本发明所具有的有益效果如下：
(1) 合成的铜纳米簇具有稳定的光学性质，合成材料粒径小，荧光性能好，合成方法简单、快速，合成过程中不需要加热、调节pH、功能化等复杂的过程，合成材料发光位置在632.02 nm，在紫外灯下可看到明显的红色。
(2) 利用合成的具有独特光学性能的铜纳米簇作为荧光探针高效选择性传感利福平的含量，方法简单、快捷，可以直接实现对利福平的选择性检测。
(3)可以利用铜纳米簇作为荧光探针，直接、快捷地检测溶液中利福平的含量，利用荧光内滤效应，可以实现对溶液中利福平的选择性检测，检测线性范围宽，检出限低。
附图说明
图1 为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇的透射电镜图(TEM)，说明了合成的铜纳米簇粒径尺寸均一、粒径较小、且分布均匀；
图2 为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇的荧光激发光谱和发射光谱图，表明其最大激发波长为354 nm，最大发射波长为632.02 nm；
图3为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇和利福平的紫外吸收谱图，表明谷胱甘肽稳定的铜纳米簇的合成以及利用该铜纳米簇可用来特异性检测溶液中利福平的含量；
图4为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇检测溶液中的利福平的线性图，线性范围为0.25~50 nM，检出限是0.16 nM；
图5为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇检测溶液中的利福平的可行性分析。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。所用试剂均为分析纯，所用试剂及生产厂家如下：谷胱甘肽，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；抗坏血酸，天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化铜(99%)，天津光复精细化工有限公司；氢氧化钠，天津市科威有限公司。铜纳米簇的制备方法可参照(Wang, C.; Ling, L.; Yao, Y.; Song, Q. Nano Research 2015,8 (6), 1975-1986)或见实施例1 。
实施例1
以谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇的制备室温条件下按照如下步骤进行：
(1) 0.1 M氯化铜溶液的配制：称取1.7048 g CuCl2∙2H2O溶于100 mL高纯水中，充分溶解后备用；
(2) 铜纳米簇的制备：室温条件下，称取谷胱甘肽0.28 g溶于15 mL H2O中，向其中加入450 μL CuCl2 (0.1M),充分反应后，加入0.1 g抗坏血酸 (AA)，再加入1 mL NaOH (1M)，反应1 h，至白色悬浊液完全溶解变为浅黄色澄清透明溶液，证明铜纳米簇的形成。通过透射电镜图 (TEM)（图1）可以看出铜纳米簇分散均匀，粒径较小。
实施例2
铜纳米簇作为荧光探针特异性检测利福平的方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1) 4 mM利福平母液的配制：称取0.0329 g 利福平溶于10 mL高纯水中，低温保存待用；
(2) 一系列利福平不同浓度溶液的配制：
将4 mM利福平溶液分别稀释到5 nM、10 nM、100 nM、200 nM、1000 nM不同浓度，稀释后的溶液均补水至4mL；
(3) 将制备好的基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇均匀分散到高纯水中，配制成浓度为1.2 mM，体积为4 mL的检测体系，并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度，在激发波长354 nm的激发下，该荧光探针在632.02 nm处表现出较强发射；
(4) 将1.6 mL铜纳米簇均匀分散到2.2 mL高纯水中，混合均匀后，向混合溶液中加入200 μL 高纯水，测试体系的荧光强度，此时的荧光强度作为初始荧光强度；
(5) 向离心管中加入2.2 mL高纯水中，1.6 mL铜纳米簇溶液，混合均匀后，向混合溶液中加入200 μL利福平溶液，利福平与铜纳米簇充分作用，使得荧光发生猝灭并检测其荧光发射光谱，通过与初始荧光强度对比，荧光发射光谱强度的变化值证明该铜纳米簇作为荧光探针检测利福平的可行性；
(6) 检测溶液中利福平含量线性的测定
向离心管中分别加入2.4 mL 高纯水，1.4 mL铜纳米簇溶液，向混合溶液中分别加入200 μL不同浓度5~1000 nM的利福平溶液，充分反应10 min后用荧光分光光度计检测体系的荧光强度。实验结果表明，在利福平浓度在0.25~50 nM范围内，铜纳米簇的荧光强度猝灭值与利福平的浓度呈现线性关系，线性方程为F0-F=1.25214 C+30.49851，线性相关系数为0.993，检出限为0.16 nM。
实施例3
1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、以谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇的激发光谱和发射光谱的测定：
将铜纳米簇分散到高纯水中对材料的荧光激发光谱和荧光发射光谱进行测定，如图2所示，铜纳米簇的最大激发波长为354 nm，在最大激发波长的激发下，荧光发射波长为632.02 nm。
实施例4
1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、以谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇和利福平的紫外吸收光谱的测定：
为了实现以谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇对溶液中利福平的特异性检测，测定了铜纳米簇和利福平的紫外吸收光谱，如图3所示，利福平在342 nm处有紫外吸收，由于利福平的紫外吸收光谱与铜纳米簇的荧光发射光谱有重叠，从而形成了荧光内滤效应检测机理。
实施例5
1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、采用荧光为测试手段，利用以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇特异性检测利福平：
分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水2.2 mL加入到①、②号离心管中，再移取1.6 mL 铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入200 μL高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入200 μL 5 nM利福平溶液，反应5 min,使得荧光发生猝灭并用荧光光度计检测荧光发射强度，激发波长为354 nm，发射波长为632.02 nm；检出限为0.16 nM。
实施例6
1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、采用荧光为测试手段，利用以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇特异性检测溶液中的利福平：分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水2.2 mL加入到①、②号离心管中，再移取1.6 mL 铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入200 μL高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入200 μL 100 nM利福平溶液，反应5min ,使得荧光发生猝灭并用荧光光度计检测荧光发射强度；检出限为0.16 nM。
实施例7
利福平的检测：分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水0.4 mL加入到①、②号离心管中，再移取3.2 mL 铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入200 μL高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入200 μL 100 nM利福平溶液，反应5 min ,使得荧光发生猝灭并用荧光光度计检测荧光发射强度；检出限为0.16nM。
实施例8
利福平的检测：分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水2.8 mL加入到①、②号离心管中，再移取1.0 mL 铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入200 μL高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入200 μL 100 nM利福平溶液，反应5 min ,使得荧光发生猝灭并用荧光光度计检测荧光发射强度。检出限为0.16nM。
Claims (2)
1.铜纳米簇作为荧光探针特异性检测溶液中利福平药物含量方面的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中采用铜纳米簇检测溶液中利福平药物含量的方法如下：
(1) 4 mM利福平母液的配制：称取0.0329 g 利福平溶于10 mL高纯水中，低温保存待用；
(2) 一系列利福平不同浓度溶液的配制：
将4 mM利福平溶液分别稀释到5 nM、10 nM、100 nM、200 nM、1000 nM不同浓度，稀释后的溶液均补水至4mL；
(3) 将制备好的铜纳米簇均匀分散到高纯水中，配制成浓度为1.2 mM，体积为4 mL的检测体系，并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度，在激发波长354 nm的激发下，该荧光探针在632.02 nm处表现出较强发射；
(4) 将1.6 mL铜纳米簇均匀分散到2.2 mL高纯水中，混合均匀后，向混合溶液中加入200 μL 高纯水，测试体系的荧光强度，此时的荧光强度作为初始荧光强度；
(5) 向离心管中加入2.2 mL高纯水中，1.6 mL铜纳米簇溶液，混合均匀后，向混合溶液中加入200 μL利福平溶液，利福平与铜纳米簇充分作用，使得荧光发生猝灭并检测其荧光发射光谱，通过与初始荧光强度对比，荧光发射光谱强度的变化值证明该铜纳米簇作为荧光探针检测利福平的可行性；
(6) 检测溶液中利福平含量线性的测定
向离心管中分别加入0.2-3.4 mL 高纯水，0.4-3.6 mL 铜纳米簇溶液，向混合溶液中分别加入200 μL不同浓度5-1000 nM的利福平溶液，充分反应1-15 min后用荧光分光光度计检测体系的荧光强度。
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