KR20100006080A

KR20100006080A - 형광 자성 실리카 나노입자, 그 제조방법 및 상기를포함하는 생물의학적 조성물

Info

Publication number: KR20100006080A
Application number: KR1020080066254A
Authority: KR
Inventors: 함승주; 허용민; 윤호근; 양재문; 이재원; 강진영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2008-07-08
Publication date: 2010-01-18
Anticipated expiration: 2028-07-08
Also published as: KR101047422B1

Abstract

본 발명은 형광 자성 실리카 나노입자, 그 제조방법, 상기를 포함하는 각종 생물의학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 자성 나노클러스터를 시드로 하여 제조되는 것으로, 내부에 많은 양의 자성체를 포함하여 우수한 자성 민감도를 나타낸다. 또한 본 발명의 나노입자는 형광물질을 포함하는 표면이 양전하로 대전되어 있어 음전하를 띄는 세포막과의 결합력이 탁월하다. 이에 따라 본 발명의 나노입자는 조영제 조성물, 세포 표지용 조성물, 생체물질 분리용 조성물, 약물 전달체 및 약제학적 조성물 등과 같은 다양한 생물의학적 조성물에 효과적으로 적용될 수 있는 장점을 가진다.

자성 나노입자, 자성 나노클러스터, 실리카 셀부, 형광물질, 양이온성 작용기, 포화자화값, 제타전위, 조영제 조성물, 세포 표지용 조성물, 생체 물질 분리용 조성물, 약물 전달체, 약제학적 조성물

Description

형광 자성 실리카 나노입자, 그 제조방법 및 상기를 포함하는 생물의학적 조성물 {Fluorescence magnetic silica nanoparticles, preparation method thereof and biomedical compositions comprising the same}

본 발명은 형광 자성 실리카 나노입자, 그 제조방법, 상기를 포함하는 각종 생물의학적 조성물에 관한 것이다.

나노기술(NT; Nano Technology)은 물질을 원자 또는 분자 수준에서 조절 및 제어하는 기술로서 신물질이나 신소자의 창출에 적합하기 때문에, 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지 및 환경 분야 등 매우 다양하다.

이와 같은 나노기술은 현재 다양하게 발전하고 있으며, 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다. 첫째, 나노소재로 극미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노소자인데 나노크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노기술을 생명공학 분야에 응용하는 나노-바이오 기술에 관한 것이다. 나노-바이오 분야에서 자성 나노입자들은 생체 물질의 분리, 자기공명 영상 진단 프로브, 거 대자기저항센서를 포함한 바이오 센서, 마이크로 유체계 센서, 약물/유전자 전달 및 자성 고온치료 등의 넓은 응용범위에 걸쳐 사용되고 있다.

구체적으로 자성 나노입자는 자기공명영상의 진단 프로브(조영제)로 사용될 수 있다. 자성 나노입자는 나노입자 주변의 물 분자에 포함된 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기공명영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타내 지금까지 공명 영상 진단에 널리 사용되고 있다.

또한 자성 나노입자는 거대 자기-저항 바이오센서(Giant magnetic resistance (GMR) sensor)의 프로브 물질로 작용할 수 있다. 자성 나노입자가 거대자기저항 바이오 센서 표면에 패턴되어 있는 생체 분자를 감지하여 결합하면, 자성 입자에 의해 거대자기저항 센서의 전류 신호가 변하게 되고 이를 이용하면 생체분자를 선택적으로 검출이 가능하다(US 6,452,763 B1; US 6,940,277 B2; US 6,944,939 B2; US 2003/0133232 A1).

또한 자성 나노입자는 생체 분자의 분리에도 응용될 수 있다. 예를 들면, 특정한 생체 마커를 발현하는 세포와 다른 여러 가지 세포들이 섞여 있을 때, 자성 나노입자가 특정한 생체 마커와 선택적으로 결합하게 한 후, 외부에서 자기장을 걸어주면 자기장 방향으로 원하는 세포만 분리할 수 있다 (Whitehead et al. US patent 4,554,088,US 5,665,582, US 5,508,164, US 2005/0215687 A1 ). 또한 세포의 분리 뿐만 아니라, 단백질, 항원, 펩타이드, DNA, RNA 및 바이러스 등 다양한 생체 분자의 분리에 응용될 수 있다. 또한 자성 나노입자는 자성 마이크로 유체 센서에 응용되어 생체 분자를 분리 및 검출할 수 있다. 즉, 칩 위에 매우 작은 채널을 만들어 그 안에 자성 나노입자를 흘려줌으로써 마이크로 단위의 유체계에서 검출과 분리가 가능하다.

한편, 자성 나노입자는 약물 또는 유전자의 전달을 통한 생체 치료에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자성 나노입자에 화학적인 결합 또는 흡착을 통해 약물 또는 유전자를 싣고 외부 자기장을 이용하여 원하는 위치로 이동시켜 특정부위에 약물 및 유전자를 방출을 가능하게 하여 선택적인 치료효과를 가져올 수 있게 한다 (US 6,855,749). 자성 나노입자를 이용한 생체 치료로의 응용의 또 하나의 예로서, 자성 스핀 에너지를 이용한 고온 치료를 들 수 있다 (US 6,530,944, US 5,411,730). 자성 나노입자는 외부의 라디오주파수의 교류전류를 흘려주면 스핀 플립핑 (flipping) 과정을 통해 열을 방출하게 된다. 이때 나노입자 주변의 온도가 40℃ 이상이 되면 세포가 높은 열에 의해 죽게 되어 질병 세포를 선택적으로 사멸 시킬 수 있다.

자성 나노입자들이 전술한 용도에 이용되기 위해서는 자기적 성질이 우수하고, 생체 내의 수용성 환경에서 안정적으로 운반 및 분산되어야 하며, 생체 활성 물질과 쉽게 결합할 수 있어야 한다. 이러한 조건을 만족시키기 위하여 현재까지 다양한 기술들이 개발되어져 왔다.

이 중 대표적인 기술은 마그네타이트(Fe₃O₄)와 같은 자성 나노입자의 표면을 실리카로 코팅하는 기술이다 (Yoon TJ et al., 2005 Angew Chem Int Ed 44 1068). 상기 기술은 나노입자의 표면에서 실리카의 합성이 용이하고, 아민, 카복실, 알데 히드 또는 티올 등의 작용기로 표면을 기능화할 수 있다는 장점을 가져 널리 이용되고 있다. 한편, 상기 기술에서 자성 나노입자의 표면에 실리카를 형성시키는 방법으로는, TEOS(Tetraethyl orthosilicate)와 같은 전구체의 가수 분해 및 축합 반응을 이용하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다 (Stober method). 상기 기술은 온화한 조건(mild condition)에서 반응을 진행할 수 있고, 비용이 저렴하다는 장점을 가진다.

그러나, 현재까지 알려진 기술들에서는 실리카 나노입자의 내부에 많은 양의 자성체(자성 나노입자)를 포함시키거나, 또는 내부 자성체의 함량을 조절하는 것이 어렵다는 단점이 있다. 또한, 현재까지 알려진 기술을 통해 제조된 자성 실리카 나노입자들은 그 구조 및 모폴로지(morphology)가 매우 불규칙하고, 이에 따라 생물의학적(biomedical) 적용 범위가 떨어진다는 문제점을 가지고 있다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 고려하여 이루어진 것으로, 자성 민감도(magnetic sensitivity)가 우수하고, 표면이 양전하로 대전되는 동시에 형광물질을 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자, 그 제조 방법, 상기를 포함하는 조영제 조성물, 세포 표지용 조성물, 생체물질 분리용 조성물, 약물 전달체 및 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 자성 나노클러스터를 포함하는 코어부; 상기 코어부를 둘러싸고 있는 실리카 셀부; 및

상기 실리카 셀부에 도입된 형광물질을 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자를 제공한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 자성 나노클러스터 및 실리카 전구체를 혼합하는 제 1 단계; 및

제 1 단계를 거쳐 자성 나노클러스터 상에 형성된 실리카 셀부에 형광물질을 도입하는 제 2 단계를 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 형광 자성 실리카 나노입자를 포함하는 조영제 조성물, 세포 표지용 조성물, 생체 물질 분리용 조성물 및 약물 전달체를 제공한다.

본 발명의 나노입자는 자성 나노클러스터를 시드(seed)로 하여 제조되는 것으로, 내부에 많은 양의 자성체를 포함하여 우수한 자성 민감도(magnetic sensitivity)를 가진다. 또한 본 발명의 형광 자성 실리카 나노입자는 형광물질을 포함하는 표면이 양전하로 대전되어 있어 음전하인 세포막과의 결합력이 탁월하다. 이에 따라 본 발명의 나노입자는 조영제 조성물, 세포 표지용 조성물, 생체물질 분리용 조성물, 약물 전달체 및 약제학적 조성물 등 다양한 생물의학적(biomedical) 분야에서 효과적으로 적용될 수 있는 장점을 가진다.

본 발명은, 자성 나노클러스터를 포함하는 코어부; 상기 코어부를 둘러싸고 있는 실리카 셀부; 및

상기 실리카 셀부의 표면에 도입된 형광물질을 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자(이하, 『FMSNP』라 칭하는 경우가 있다.)에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 따른 FMSNP를 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 FMSNP는 자성 나노클러스터를 포함하는 코어부; 및 상기 코어부를 둘러싸고 있으며, 외주면에는 형광물질이 도입되어 있는 실리카층(셀부)을 포함한 다. 이 때 상기 자성 나노클러스터는 복수의 자성 나노입자가 응집되어 형성된다. 본 발명에서 사용하는 용어 『자성 나노입자(magnetic nanoparticle, 이하 『MNP』라 칭하는 경우가 있다.)』는 자성을 가지고, 직경이 1 nm 내지 1,000 nm, 바람직하게는 2 nm 내지 100 nm인 입자를 의미하며, 상기와 같은 입자라면 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않으나, 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 것이 바람직하다.

상기에서 금속 물질의 예로는 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있고; 자성 물질의 예로는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄및 M_xO_y(M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr을 나타내고, x 및 y는 각각 식 「0 < x ≤ 3」 및 「0 < y ≤ 5」을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 들 수 있으며; 자성 합금의 예로는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 자성 나노입자가 응집되어 형성되는 본 발명의 자성 나노클러스터는 10 nm 내지 1,000 nm의 입자 직경을 갖는 것이 바람직하다. 입자 직경이 10 nm 미만이면, FMSNP의 자성 민감도가 떨어져, 영상화 효율이 저하될 우려가 있고, 1,000 nm를 초과하면, 생체로 투입된 FMSNP가 혈관을 막는 등 생체로의 적용성이 저하될 우려가 있다. 또한, 상기 자성 나노클러스터는 FMSNP의 전체 중량 대비 1 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 10 중량% 내지 50 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 1 중량% 미만이면, FMSNP의 자성민감도가 떨어질 우려가 있고, 50 중량%를 초과하면, 표면 형태의 일그러짐이 발생하는 등, 나노입자의 구조 및 모폴러지(morpology)가 저하될 우려가 있다.

본 발명의 FMSNP는 또한 1.5 T에서 측정한 포화 자화값(Ms)이 0.1 emu/g 이상인 것이 바람직하다. 상기 포화 자화값(Ms)이 0.1 emu/g 미만이면, FMSNP의 자성 민감도가 떨어질 우려가 있다.

본 발명의 FMSNP의 코어부는 또한 상기 자성 나노클러스터를 둘러싸고 있는 표면 안정제(계면활성제)를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 표면 안정제를 추가로 포함함으로 해서, 자성 나노입자의 응집체인 자성 나노클러스터가 입자 내에서 안정적으로 존재할 수 있게 된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표면 안정제의 구체적인 종류는 전술한 작용을 수행하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 적절한 양친매성 화합물을 사용할 수 있다. 이와 같은 양친매성 화합물의 예에는 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 소듐 도데실 설파이트 및 폴리에틸렌 글라이콜 솔비탄 모노리트 계열 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것을 아니다.

본 발명의 FMSNP는 또한 상기 자성 나노클러스터를 포함하는 코어부를 둘러싸고 있는 실리카 셀부를 포함한다. 이와 같이 자성 나노클러스터가 실리카층에 의해 둘러싸여 표면개질됨으로써, 자성 나노클러스터의 물리화학적 안정성(physicochmical stability) 및 생체기능성(bio-functionality)을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 실리카 셀부는 다수의 세공을 포함하는 다공성 구조이므로, 본 발명의 나노입자가 약물 전달체 등의 용도로 사용될 경우에는 상기 세공이 약물을 담지할 수 있는 공간을 제공하는 역할을 수행할 수도 있다. 이 때 실리카 셀부의 기공 크기(pore size)는 1 Å 내지 100 Å인 것이 바람직하다. 상기 기공 크기가 1 Å 보다 작으면, 약물 전달체로 사용 시에 약물의 방출 효율이 지나치게 떨어질 우려가 있고, 100 Å을 초과하면, 약물의 방출 속도 제어가 어려워질 우려가 있다.

본 발명의 FMSNP는 또한 상기 실리카 셀부의 표면에 도입된 형광물질(fluorescence material)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 나노입자가 형광물질을 포함함으로 해서, 본 발명의 나노입자는 광영상(optical imaging) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging) 분야에서 효과적으로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 나노입자는 높은 공간 해상도(spatial resolution)을 가지며 비침습적(non-invasive)인 자기공명영상 기법의 수행, 그리고 우수한 감도로 인해 마이크로스케일의 영상을 표현할 수 있는 광영상 기법 등의 실현을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 형광물질의 예로는 FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate), 피렌(pyrene), 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide) 및 RITC(Rhodamine isothiocyanate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다. 그러나, 상기는 본 발명에서 사용될 수 있는 형광물질의 일례에 불과하며, 본 발명에서는 상기 외에도 이 분야에서 일반적으로 알려져 있는 형광물질을 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 형광물질은 FMSNP의 전체 중량 대비 0.5 중량% 이상, 바람직하게는 0.8 중량% 이상의 양으로 포함될 수 있 다. 상기 함량이 0.5 중량% 미만이면, FMSNP의 형광성이 저하될 우려가 있다. 또한, 본 발명에서 상기 형광물질 함량의 상한은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 10 중량%이다.

상기와 같은 형광물질을 본 발명의 FMSNP의 실리카 셀부에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 상기 형광물질은 양이온성 작용기를 매개로 실리카 셀부에 도입되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용한 용어 『양이온성 작용기』는 실리카 셀부의 표면에 형광물질을 도입함과 동시에, 나노입자의 표면 전하를 양전하로 대전시킬 수 있는 작용기를 의미한다. 즉, 상기와 같은 작용기는 화학적 결합을 통해 형광물질이 도입될 수 있는 결합 영역을 제공하고, 또한 나노입자의 표면을 양전하로 대전시킴으로써, 일반적으로 음전하를 띄는 세포막과의 결합성을 높일 수 있다. 이와 같은 양이온성 작용기의 예로는 암모니아기, 1차 아민기, 2차 아민기 및 3차 아민기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있고, 상기 작용기는 각각에 대응하는 적절한 전구체를 사용하여 실리카 셀부로 도입될 수 있다.

본 발명의 나노입자는 또한 상기와 같은 양이온성 작용기를 포함함으로써, 전체 제타 전위(Zeta potential)가 +20 mV 이상의 범위로 제어되는 것이 바람직하다. 제타 전위가 +20 mV 미만이면, FMSNP의 엉김 현상이 발생(-20 mV 내지 +20 mV의 범위)하거나, 또는 세포와의 결합 친화도가 지나치게 저하(-20 mV 이하의 범위)될 우려가 있다. 상기 제타 전위의 상한은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 100mV 이다. 상기 제타 전위는 적절한 양의 양이온성 작용기를 나노입자에 도 입함으로써 달성될 수 있고, 이 분야의 평균적 기술자는 목적하는 제타 전위 및 형광물질의 함량에 따라 상기 작용기의 도입량을 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 FMSNP는 또한 상기 실리카 셀부에 도입된 조직특이적 결합성분(tissue-specific binding substance)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 『조직 특이적 결합 성분』은 생체 내의 특정 조직과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 이러한 성분의 도입을 통해 본 발명의 나노입자의 생물의학적 적용 영역을 보다 넓힐 수 있는 이점이 있다. 조직특이적 결합성분의 예에는 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선동위원소 표지 물질 및 종양 마커(tumor marker)와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 사용된 용어 『종양 마커』는 종양 세포에서 발현 및/또는 분비되는 것으로서, 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 의미한다. 당업계에는 이와 같은 다양한 종양 마커뿐만 아니라, 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. 종양 마커는, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다.

[표 1]

종류	종양마커의 예	조직 특이적 결합 성분의 예
리간드	시냅토타그민 I의 C2	포스파티딜 세린
	아넥신 V	포스파티딜 세린
	인테그린	인테그린 수용체
	VEGF	VEGFR
	안지오포이에틴 1, 2	Tie 2 수용체
	소마토스타틴	소마토스타틴 수용체
	바소인테스티날 펩타이드	바소인테스티날 펩타이드 수용체
항원	암성 태아성 항원	허셉틴(Genentech, USA)
	HER2/neu 항원	허셉틴(Genentech, USA)
	전립선 특이 항원	리툭산(Genentech, USA)
수용체	폴산 수용체	폴산

종양 마커가 리간드인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 FMSNP에 도입할 수 있고, 그 예로는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체를 들 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민(synaptotagmin)의 C2와 포스파티딜 세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜 세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 종양 마커가 항원인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 FMSNP에 도입할 수 있는데, 이와 같은 물질의 대표적인 예로는 항체를 들 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항 원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다.

종양 마커가 수용체인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명의 FMSNP로 도입될 수 있고, 그 예로는 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체를 들 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이 항체는 본 발명에 있어서 특히 바람직한 조직특이적 결합성분이다. 항체는 특정 대상과만 선택적이고 안정적으로 결합하는 성질을 갖고 있으며, Fc 영역에 있는 리신의 -NH₂, 시스테인의 -SH, 아스파라긴산 및 글루탐산의 -COOH는 항체를 FMSNP로 도입할 때에 유용하게 이용될 수 있다.

이와 같은 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 항체를 수득하기 위한 방법의 일 예를 들면 하기와 같다.

우선, 포유동물(예, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다. 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청을 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용 시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.

한편, 상기 『핵산』은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있다. 그러므로 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 이에 따라 상기 리간드, 항원 또는 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 FMSNP의 조직 특이적 결합 성분으로 이용할 수 있다. 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH₂, -SH 및 -COOH 등의 작용기가 있고, 이러한 작용기는 나노입자로의 도입 시에 유용하게 이용될 수 있다. 이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 그 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).

이상 설명한 바와 같은 조직특이적 결합성분을 본 발명의 FMSNP에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 나노입자의 실리카 셀부에 각각에 결합성분에 대응하는 결합영역(ex. 작용기)을 도입하고, 상기 작용기를 매개로 도입하는 방법을 들 수 있다. 이때 도입되는 결합 영역의 구체적인 예는 조직특이적 결합성분의 종류에 따라서 결정되며, 특별히 한정되는 것은 아니다.

이상과 같은 성분을 포함하는 본 발명의 FMSNP는 입자 직경이 1 nm 내지 1,000 nm인 것이 바람직하고, 20 nm 내지 100 nm인 것이 보다 바람직하다. 나노입 자의 직경이 상기 범위를 벗어나는 경우, 생체로의 적용이 어려워져, 생물의학적 이용가능성이 떨어질 우려가 있다.

본 발명은 또한, 자성 나노클러스터 및 실리카 전구체를 혼합하는 제 1 단계; 및

제 1 단계를 거쳐 자성 나노클러스터 상에 형성된 실리카 셀부에 형광물질을 도입하는 제 2 단계를 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자의 제조 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 제조 방법의 각 단계를 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 제 1 단계에서는 자성 나노클러스터 및 실리카 전구체를 혼합하고, 상기 전구체의 가수 분해(hydrolysis) 및 축합(condensation) 반응이 유도하여, 자성 나노클러스터의 표면에 실리카층을 형성한다. 제 1 단계에서는 자성 나노클러스터가 실리카 셀부가 형성될 시드(seed 또는 karnel)의 역할을 한다. 이에 따라 본 발명에서는 나노입자 내부에 많은 양의 자성 물질을 포함시켜 자성 민감도를 높일 수 있으며, 또한 제조된 나노입자는 규칙적인 구조 및 모폴로지(morphology)를 갖을 수 있다.

제 1 단계에서 사용되는 자성 나노클러스터를 제조하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, (1) 자성 나노입자를 유기 용매에 용해시켜 오일상을 제조하는 단계;

(2) 표면 안정제를 수성 용매에 용해시켜 수용상을 제조하는 단계;

(3) 상기 오일상 및 수용상을 혼합하여 에멀션을 형성하는 단계; 및

(4) 상기 에멀션으로부터 오일상을 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

이 때 자성 나노클러스터의 제조에 사용되는 자성 나노입자를 제조하는 방법 역시 특별히 한정되지 않으나, 제조된 나노입자가 탁월한 자기적 특성, 단분산성 및 모폴로지 특성을 갖는다는 관점에서 열분해법(thermal decomposition method)으로 제조되는 것이 바람직하다.

즉, 예를 들면, 상기 자성 나노입자는, (i) 용매의 존재 하에 나노입자 전구체 및 유기성 표면 안정제를 반응시키는 단계; 및

(ii) 상기 반응물을 열분해하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 단계 (i)는 유기성 표면 안정제가 포함된 용매에 나노입자 전구체를 투입하여, 나노입자 표면에 유기성 표면 안정제를 배위시키는 단계이다. 이 때 사용될 수 있는 나노입자 전구체의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 그 예로는 금속과 -CO, -NO, -C₅H₅, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속화합물을 들 수 있고, 구체적으로는 아이언펜타카르보닐(iron pentacarbonyl, Fe(CO)₅), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn₂(CO)₁₀) 등의 금속 카르보닐 계열의 화합물; 또는 철 아세틸아세토네이트(Fe(acac)₃) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 등의 각종 유기금속화합물을 사용할 수 있다. 또한 나노입자 전구체로는 금속과 Cl^- 또는 NO₃ ^- 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염을 사용할 수 있으며, 그 예로는 삼클로로화철(FeCl₃), 이클로로화철(FeCl₂) 또는 철 나이트레이트 (Fe(NO₃)₃) 등을 들 수 있다. 만약, 합금 나노입자 및 복합 나노입자 등을 합성하고자 하는 경우에는 상기에서 언급한 2종 이상의 금속의 전구체의 혼합물을 사용하면 된다. 또한, 본 발명의 단계 (i)에서 사용될 수 있는 유기성 표면 안정제의 예로는 알킬 트리메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide), 포화 또는 불포화 지방산, 트리알킬포스핀 옥사이드(trialkylphosphine oxide), 알킬아민(alkyl amine), 알킬티올(alkyl thiol), 소디움 알킬 설페이트(sodium alkyl sulfate), 및 소디움 알킬 포스페이트(sodium alkyl phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다.

또한 상기 단계 (i)에서 사용될 수 있는 용매는 나노입자 전구체 표면에 유기성 표면 안정제가 배위된 착화합물의 열분해 온도에 근접하는 높은 끊는 점을 가지는 것이 바람직하며, 이러한 용매의 예로는 에테르계 화합물, 헤테로고리화합물, 방향족화합물, 술폭사이드화합물, 아마이드화합물, 알코올, 탄화수소 및/또는 물 등을 들 수 있다. 구체적으로 상기 용매는 옥틸 에테르(octyl ether), 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether), 또는 데실 에테르(decyl ether)와 같은 에테르계 화합물; 피리딘, 또는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 헤테로고리화합물; 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌, 또는 벤젠과 같은 방향족화합물: 디메틸술폭사이 드(DMSO)와 같은 술폭사이드화합물; 디메틸포름아마이드(DMF)와 같은 아마이드화합물; 옥틸알코올, 또는 데칸올과 같은 알코올; 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 또는 헥사데칸과 같은 탄화수소, 또는 물을 사용할 수 있다.

상기 단계 (i)의 반응 조건은 특별히 제한되지 않으며, 금속전구체 및 표면 안정제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 예를 들면, 상기 반응은 실온 또는 그 이하의 온도에서도 진행될 수 있고, 통상적으로는 약 30℃ 내지 200℃의 범위로 가열 및 유지시키는 것이 바람직하다.

상기 단계 (ii)는 나노입자 전구체 표면에 유기성 표면 안정제가 배위된 착화합물을 열분해하여 나노입자를 성장시키는 단계이다. 이 때 반응조건에 따라 균일한 크기 및 형상의 나노입자를 형성할 수 있으며, 상기 열분해 온도는 금속전구체 및 표면 안정제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 바람직하게는 약 50℃ 내지 500℃에 반응시키는 것이 적절하다. 상기 단계 (b)에서 제조된 나노입자는 공지의 수단을 통하여 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에서는 상기와 같이 제조된 자성 나노입자 및 전술한 단계 (1) 내지 (4)의 방법을 사용하여 자성 나노클러스터를 제조한다. 이 때 사용되는 자성 나노입자의 구체적인 종류는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법에서 자성 나노클러스터를 제조하는 상기 방법의 구체적인 조건을 특별히 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 자성 나노클러스터는 클로로포름, 헥산, 벤젠, 톨루엔, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 디클로로메탄 등과 같 은 오일상; 초순수, 증류수, PBS(phosphate-buffered saline), 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세트산(acetic acid) 또는 포름산(formic acid) 등과 같은 수용상; 및 상기한 바와 같은 표면 안정제를 사용하여 이 분야의 통상의 에멀션법을 통하여 제조될 수 있다(nanoemulsion). 또한, 상기 자성 나노클러스터의 제조 시에는 올레인산 칼륨(potassium oleate) 또는 올레인산 나트륨(sodium oleate)과 같은 비누; 에어로졸OT(aerosolOT), 콜산염 나트륨(sodium cholate) 또는 카프릴산 나트륨(sodium caprylate)과 같은 음이온성 세제(anionic detergent); 염화 세틸피리디늄(cetylpyridynium chloride), 브롬화 알킬트리메틸암모늄(alkyltrimethylammonium bromide), 염화 벤잘코늄(benzalkonium chloride) 또는 브롬화 세틸디메틸에틸암모늄(cetyldimethylethylammonium bromide)과 같은 양이온성 세제; N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판설페이트(N-alkyl-N,N-dimethylammonio-1-propanesulfate) 또는 CHAPS와 같은 양성이온성 세제(zwitterionic detergent); 폴리옥시에틸렌 에스테르(polyoxyethylene ester), 폴리옥시에틸렌솔비탄 에스테르(polyoxyethylenesorbitan ester), 솔비탄 에스테르(sorbitan ester) 또는 각종의 트리톤(triton) (예를 들면, TX-100 또는 TX-114)과 같은 비이온성 세제의 1종 또는 2종 이상의 혼합물과 같은 적절한 계면 활성제의 존재 하에 수행될 수 있다. 이와 같은 계면 활성제는 수용상과 오일상 사이의 표면장력(interfacial tension)을 감소시켜서, 에멀젼 내에 분산된 오일상 또는 수용상이 열역학적으로 안정한 상태로 존재할 수 있게 한다.

본 발명의 제 1 단계에서는 상기와 같이 제조된 자성 나노클러스터 및 실리카 셀부를 형성할 실리카 전구체를 적절한 용매에서 혼합함으로써, 상기 전구체의 클러스터로의 결합, 가수 분해 반응 및 축합에 의한 겔화 반응을 진행시킨다. 이 때 사용될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정되지 않고, 이 분야에서 공지된 각종의 수성 및 유기 용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 물과 알코올의 혼합 용매를 사용한다. 상기 혼합 용매 중 물은 첨가된 실리카 전구체의 가수 분해 반응을 진행시키는 역할을 하게 되는데, 이 단계에서 축합 및 겔화 반응을 진행시킬 수 있는 히드록실기가 실리카 전구체 내의 규소 원자로 도입되게 된다. 통상 실리카 전구체는 물에 잘 용해되지 않기 때문에 알코올과 같은 적절한 유기 용매와 혼합하여 사용한다. 알코올은 물과 실리카 전구체 양자를 모두 용해시킬 수 있고, 이에 따라 물과 실리카 전구체를 균질하게 혼합시켜 가수 분해 반응을 진행시킬 수 있다. 이 때 물과 알코올의 혼합 비율은 특별히 제한되는 것은 아니며, 이 분야의 당업자는 적절한 혼합 비율을 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 제 1 단계에서 첨가되는 실리카 전구체는 자성 나노클러스터 상에 실리카 셀부를 형성할 수 있다면 특별히 한정되는 것은 아니지만 테트라메톡시 실란(tetramethoxy silane) 및/또는 테트라에톡시 실란(tetraethoxy silane)과 같은 알콕시 실란을 사용하는 것이 바람직하며, 이 중 테트라에톡시 실란을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 제 1 단계에서는 상기 알콕시 실란의 사용량을 조절하여 목적하는 셀부의 두께를 제어할 수 있는데, 상기 사용량은 이 분야의 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 제 1 단계에서 실리카 전구체 의 가수 분해 반응을 진행시키는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 환류(reflux) 조건 하에서 교반시키는 일반적인 방법으로 진행할 수 있다. 또한 본 발명의 제 1 단계에서는 산성 촉매(ex. HCl, CH₃COOH 등) 또는 염기 촉매(ex. KOH, NH₄OH 등) 등의 적절한 촉매를 첨가하여 상기 가수 분해 반응을 촉진시킬 수도 있다. 본 발명의 제 1 단계에서 상기와 같은 가수 분해 및 축합에 의한 겔화 반응을 통해 실리카 셀부가 형성되며, 가수 분해된 전구체는 클러스터 표면에 실록산 결합(-Si-O-Si-)을 형성하며 축합 및 겔화된다.

본 발명의 제 2 단계는 상기와 같은 방법으로 실리카 셀부가 형성된 나노입자에 형광물질을 도입하는 단계이다. 특별히 한정되는 것은 아니나, 상기 제 2 단계는, (a) 실리카 셀부의 표면에 양이온성 작용기를 도입하는 단계; 및

(b) 단계 (a)에서 도입된 작용기에 형광물질을 결합시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (a)의 작용기의 도입은 이 분야의 일반적인 방법을 통하여 수행될 수 있다. 즉, 본 발명에서는 제조된 나노입자의 표면을 도입하고자 하는 작용기에 대응되는 전구물질로 처리함으로써 작용기를 도입하고, 상기 작용기 및 형광물질을 접촉시켜 화학적 결합을 유도함으로써 수행될 수 있다. 이 때 사용될 수 있는 전구 물질의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 아미노알킬 트리알콕시 실란(ex. 3-아미노프로필 트리메톡시 실란, 3-아미노프로필 트리에톡시 실란)을 사용할 수 있다. 또한, 상기 작용기에 도입되는 형광물질의 구체적인 종류는 전술한 바와 같다.

상기와 같이 제조되는 본 발명의 FMSNP는 다양한 생물의학적 분야에 적용될 수 있다.

즉, 본 발명은 전술한 FMSNP 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물; 세포 표지용 조성물; 생체물질 분리용 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명의 FMSNP의 생물의학적 적용 분야에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 FMSNP는 우선 적절한 담체를 포함하여 조영제 조성물에 이용될 수 있다. 이러한 조영제로의 이용 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 본 발명의 조영제 조성물을 생체 또는 시료에 투여하고, 상기 생체 또는 시료 내의 FMSNP에서 발산되는 신호를 감지함으로써 사용이 가능하다.

이 때 생체 또는 시료로부터 발산되는 신호는 자기장 등을 이용하는 각종 장비들에 의해서 감지될 수 있으며, 특히 자기공명영상 장치(MRI)가 바람직하다. 자기공명영상 장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵이 에너지를 흡수하여 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고, 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대 하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기 공명 영상 장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치인 것이 바람직하다.

본 발명의 FMSNP는 또한 세포 표지용 조성물에 이용될 수 있다. 상기에서 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포를 포함하며, 구체적으로는 암 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다. 상기의 사용방법의 예로는 본 발명의 FMSNP 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 표적 세포가 존재하는 시료 또는 인체 내에, FMSNP와 표적 세포가 결합할 수 있는 조건 (예를 들면, 항원-항체 결합이 가능한 조건)에서 도입하여 표적 세포를 표지하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 따른 FMSNP는 또한 생체물질 분리용 조성물에 이용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 마커를 발현하는 표적 물질과, 항원과 같은 조직 특이적 결합 물질이 도입된 FMSNP 및 담체를 포함하는 조성물을 선택적으로 결합하게 한 후, 외부에서 자기장을 걸어주면 자기장 방향으로 원하는 표적 물질만 분리할 수 있다. 상기에서 표적 물질은 세포, 단백질, 항원, 펩타이드, DNA, RNA 또는 바이러스 등 다양한 생체 분자를 포함한다.

본 발명은 또한 전술한 본 발명의 FMSNP 및 약제학적 활성성분을 포함하는 약물 전달체; 및 상기 약물 전달체 및 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 즉, 전술한 바와 같이 본 발명의 FMSNP의 실리카 셀부는 다수의 세공을 포함하기 때문에, 상기 세공 내에 약제학적 활성성분을 담지한 후, 치료를 요하는 부위에 이동시켜 질병의 치료에 이용할 수 있다. 본 발명에서는 FMSNP에 도입되는 물질을 다양하게 변경함으로써 각종의 질병의 진단 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 약물 전달체 내에 도입될 수 있는 약제학적 활성 성분의 종류는 특별히 제한되지 않고, 이 분야에서 공지된 각종의 성분을 사용할 수 있다. 상기와 같은 약제학적 활성 성분의 예로는 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다. 상기에서 항암제의 구체적인 예로는 에피루비신(Epirubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 젬시타빈(Gemcitabine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 택솔(taxol), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen) 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin) 및/또는 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 약제학적 활성 성분을 본 발명의 FMSNP에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 적절한 용매 내에서 나노입자 및 약제학적 활성 성분을 함께 혼합하는 방법 등을 사용하여 도입할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 약물 전달체가 적용될 수 있는 질병의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및/또는 자궁경부암 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 약물 전달체의 용도는 상기 질병에 한정되지 않고, 내부에 함유되는 약제학적 활성 성분을 다양하게 조절하여, 각종 용도로 사용될 수 있다.

이상 설명한 본 발명의 각종 생물의학적 조성물에 이용될 수 있는 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질 (예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질 (예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 이상의 생물의학적 용도의 설명에서 사용된 용어 “시료”는 용어는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 조성물을 생체 또는 시료에 주입할 때에는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로 를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 하나의 태양으로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물의 다른 바람직한 태양는 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1.

하기에 제시된 각 단계를 거쳐서 형광 자성 실리카 나노입자(FMSNP)를 제조하였으며, 이러한 제조 과정의 개념도는 도 1에 나타내었다.

(1) 단분산 자성 나노입자( MNP )의 합성

6 nm의 산화철 나노입자(MnFe₂O₄)는 라우르산(lauric acid)(0.6M) 및 라우릴 아민(0.6M)을 포함하는 290℃의 벤질에테르 용매에서 철 트리아세틸아세토네이트(Aldrich) 및 망간 트리아세틸아세토네이트를 열분해 화학반응(thermal decomposition)시켜 합성하였다(1시간). 또한, 12 nm의 산화철 나노입자는 라우르산(0.1 M), 라우릴 아민(0.1 M), 상기 6 nm 산화철 나노입자(8 mg/ml), 철 트리아세틸아세토네이트 및 망간 트리아세틸아세토네이트를 포함하는 벤질에테르 용액을 300℃에서 1시간 동안 가열하여 제조하였다. 제조된 12 nm의 산화철 나노입자(MNP)의 투과전자현미경 사진(TEM)(JEM-2100, JEOL Ltd.)은 도 2a에 나타내었다.

(2) 자성 나노클러스터( MK )의 합성

상기에서 제조된 MNP를 사용하여 실리카 코팅 시 시드(seed, kernel)의 역할을 하게 될 MK를 오일상/수용상 에멀젼(O/W emulsion)방법으로 제조하였다. 구체적으로는 폴리비닐알코올(PVA) 600 mg을 20 ml의 수용상(초순수)에 용해시키고, 상기 제조된 12 nm의 MNP 5 mg을 오일상인 클로로포름(chloroform)에 용해시켰다. 이어서, 상기 수용상 및 오일상을 혼합하고, 200W에서 초음파 분쇄기(ULH700S, Ulssohitech, KOREA)로 10분 동안 처리하여 에멀션을 제조하고, 제조된 에멀션을 6 시간 동안 교반하여, 오일상을 증발시켰다. 이어서, 수회의 원심분리를 통해 불순물을 제거하여 일정한 사이즈로 뭉쳐있는 MK를 얻었다. 제조된 MK의 투과전자현미경 사진(TEM)(JEM-2100, JEOL Ltd.)을 도 2b에 나타내었다. 또한, 레이저 산란 방법에 의해 분석한 상기 MK의 크기는 32.7 ± 5.3 nm였다 (도 4 참조).

(3) 자성 실리카 나노입자( MSNP )의 합성

상기 (2)에서 제조된 MK를 초순수 1 ml, 에탄올 4ml 및 암모니아수 0.1 ml의 혼합물에 재분산시켰다. 이어서, TEOS(tetraethyl orthosilicate)(60 ㎕)를 상기 현탁액에 서서히 첨가하고, 12 시간 동안 교반시켜, TEOS의 가수 분해 및 축합 반응을 유도시켰다. 이에 따라 상기 MK를 핵(seed)으로 한 TEOS의 축합 반응을 통해 MSNP를 제조하였다. 제조된 MSNP의 투과전자현미경 사진(TEM)(JEM-2100, JEOL Ltd.)을 도 2c에 나타내었다. 상기 과정을 통해 MK가 성공적으로 실리카로 코팅되었는 지 여부를 확인하기 위하여, FT-IR 분석(ExcaliburTM series, Varian Inc.)을 수행하였다.

첨부된 도 3a는 MSNP의 FT-IR 스펙트럼을 나타내는데, 마그네타이트의 Fe-O 피크가 575 cm^-1에서 나타나고, 실리카에 의한 Si-O 밴드의 스펙트럼이 1,020 cm^-1에서 특징적인 밴드를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, MNP의 결정성 및 MSNP 내에 실리카의 존재를 평가하기 위해 XRD 패턴(ESCAL 220i-XL, VG Scientific Instrument)을 분석하고 그 결과를 도 3b에 나타내었다. 상기 도 3b에 나타난 바와 같이, MK가 MSNP의 코어부에 존재하면서, 그 결정성은 유지되고 있음을 확인할 수 있다.

(4) 형광 자성 실리카 나노입자( FMSNP )의 합성

형광물질을 MSNP에 도입하기 위하여, 3-아미노프로필 트리메톡시실란(APTMS)를 사용하여, 아민기로 치환된 자성 실리카 나노입자(AMSNP)를 합성하였다. 구체적으로는 상기 (3)에서 제조된 MSNP 10 mg을 포함하는 현탁액을 3-아미노프로필 트리메톡시실란 0.1 mL를 함유하는 탈이온수에 첨가하고, 온도를 90℃로 유지한 상태에서 24 시간 동안 격렬하게 교반하여 반응시켰다. 생성물을 원심 분리를 통해 수회 세척한 후, 암실에서 FITC 용액 (2 mg/mL) 0.5 mL를 AMSNP(10 mg)와 2 시간 동안 혼합하였다. 이어서, 불순물의 제거를 위하여 원심 분리를 3회 수행하여 정제함으로써 FMSNP를 제조하였다. .

시험예 1. 모폴로지 및 크기 분포의 평가

상기에서 제조된 MK, MSNP, AMSNP 및 FMSNP의 크기 분포 및 표면 전하를 레이저 산란법(ELS-Z, Otsuka electronics)에 의해 분석하였다. 측정된 MK의 크기는 32.7 ± 5.3 nm였으며(제타 전위: 0 mV), MSNP의 크기는 57.5 ± 7.3 nm(제타 전위: -37.3 ± 5.1 mV), AMSNP의 크기는 57.5 ± 7.3 nm(제타 전위: 27 ± 7.1 mV), FMSNP의 57.5 ± 7.3 nm(제타 전위: 21 ± 4.3 mV)였다 (도 4 참조). 상기에서 알 수 있는 바와 같이 비이온성이 폴리비닐알코올로 코팅된 MK가 실리카로 MSNP로 변환되면서 표면전하가 0에서 음수값으로 변화(shifting)하고, 상기 MSNP가 양이온성 작용기인 아민기로 표면개질되면서, 다시 양수값으로 변화하였다.

시험예 2. FMSNP 의 자성 민감도 평가

MSNP의 감도 및 자기 특성(magnetic property)의 평가를 위해, 진동 시료 자력계(Vibrating-sample magnetometer)를 사용하여 자기이력곡선(magnetic hysteresis loop)을 기록하고, MR 신호 강도를 평가하였다(도 5a). 그 결과, MNP 및 MSNP는, 300K에서 자기이력이 없이도 초상자성 거동(superparamagnetic behavior)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. MNP 및 MSNP의 포화 자화값(Ms)은 1.5 T에서 각각 73.6 및 47.5 emu/g로 나타났는데, 실리카 셀부의 존재로 인하여, MSNP의 포화자화값은 MNP보다 작게 나타났다. 도 5b는 MSNP의 농도에 따른 MR 이미지색의 변화를 나타낸다. 도 5b에 나타난 바와 같이 MSNP의 농도가 증가함에 따라, T2-강조 MR 이미지(T2-weighted MR image)가 보다 어두운 색을 나타내었다. 또한, MSNP의 이완성(relaxivity)은 336.1 mM^-1S^- ¹였으며(도 5c), 이러한 결과는 종래 기술에 비하여, MK가 MSNP의 이완성을 향상시켰음을 나타낸다. 첨부된 도 6은 FMSNP의 미세영상(microscopic image)을 나타내는데, MSNP의 표면에 결합된 FITC의 존재로 인해 녹색 형광이 방출되는 것을 확인할 수 있다. FMSNP의 자성 감도를 조 사하기 위해, 외부 자기장이 없는 경우(도 6a) 및 외부 자기장이 있는 경우(Nd-Fe-B magnet, 0.35T)(도 6b)의 미세영상을 분석한 결과, 외부 자기장이 인가될 경우, FMSNP가 외부 자기장을 따라 배열하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3. FMSNPs 의 세포 독성

FMSNP의 자기 및 광학 영상 프로브로의 적용 가능성을 평가하기 위하여, MDA-MB-231 세포(ATCC, Manassas, VA)에 대한 FMSNP의 세포 독성을 MTT 분석 기법을 사용하여 조사하였다. 즉, 세포 독성은 MTT 분석을 사용하여 세포 성장의 억제 정도를 측정함으로써 평가하였는데, 구체적으로는 96-웰 플레이트에 4 × 10³ cells/mL의 밀도로 MDA-MB-231 세포를 배양하고, 10^-4 내지 10⁰ mg/ml의 농도에서 72 시간 동안 FMSNP로 처리하였다. 세포 생존도(cell viability)는, FMSNP로 처리되지 않은 대조 세포에 대하여, 처리된 배양액 내의 생존 세포의 비율을 계산하여 구하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 수행되었다. 도 7a는 FMSNP의 농도에 따른 세포 생존도를 나타낸다. 도 7a에 나타난 바와 같이, 높은 FMSNP의 농도에서도 세포 생존율은 감소하지 않고, 그대로 유지되었다.

시험예 4. FMSNP 의 세포 결합 친화도 측정

MDA-MB-231 세포에 대한 FMSNP의 세포 결합 친화도의 측정을 위하여 FACS(Fluorescence Activated Cell Sortin) 분석을 수행하였다. 구체적으로는 5% CO₂ 분위기(5% CO₂ humidified atmosphere) 하에서, 상기 시험예 3에서 설명한 배지 내에서 FMSNP로 배양(37℃에서 4 시간)한 0.1 mg/mL 스트렙토마이신(1 × 10⁶ cells), 10%(v/v) FBS(Fetal Bovine Serum) 및 100 U/mL 페니실린을 함유하는 배지 내에서 MDA-MB-231 세포를 유지시켰다. 그 후 상기 배지를 PBS로 2회 세척하고, 트립신 처리법(trypsinization)에 의해 세포를 수집하였다. 얻어진 세포를 3회 세척(0.2% FBS and 0.02% NaN₃ in PBS)하고, 4% 파라포름알데히드(400 ㎕)에 재현탁시켰다. 그 후 FACScalibur (Beckton-Dickinson, Mansfield, MA)를 사용하여 분석을 수행하였다 (파장: 488 nm). 첨부된 도 7b는 이와 같은 FACS의 분석 결과를 나타내고, 7c는 상대적 형광 강도 및 T2 그래프를 나타낸다. 상기 도 7b 및 7c로부터, FMSNP로 처리된 MDA-MB-231 세포는 비처리된(non-treated) MDA-MB-231 세포에 비하여 16배 정도 높은 형광 강도를 보이는 것을 알 수 있다. 또한, FMSNP로 배양된 MDA-MB-231 세포는, 비처리된 세포에 비하여 검은색을 나타내었고, 계산된 T2 수치는 각각 20.7 및 160.3 msec였다(도 7c). MDA-MB-231 세포의 MR 영상에 대응하는 컬러맵(color map)은 도 7d에 나타나 있고, 상기 결과는 FACS에서와 유사하다. 즉, 도 7d에 따르면, FMSNP로 배양된 MDA-MB-231 세포는 적색을 나타내고, 비처리된 MDA-MB-231 세포는 청색을 나타내는데, 이 때 적색은 낮은 T2 수치를 의미하고, 청색은 높은 T2 수치를 의미한다.

시험예 5. FMSNP 의 영상 프로브로서의 자성 민감성 평가

생물의학적 영상 프로브로서 FMSNP의 자성 민감성의 평가를 위하여, FMSNP로 처리된 MDA-MB-231 세포를 보로실리케이트 마이크로채널(borosilicate micro-channel)(sq I.D. 500 ㎛)에 주입하였다. 그 후, FMSNP로 배양된 MDA-MB-231 세포에 대한 Nd-B-Fe 자석(0.35 T)에 의한 자성 유도 움직임(magnetic induced mobility)을 형광 미세영상(fluorescence microscopic image)을 사용하여 조사하였다. 도 8a에서 MDA-MB-231 세포의 녹색 및 청색을 관찰할 수 있다. 상기 녹색은 세포 표면에 부착된 FMSNP를 나타내고, 청색은 4',6-디아미디노-2-페닐리노돌(4',6-diamidino-2-phenylinodole)에 의한 세포의 핵 부위(nuclear site)를 나타낸다. 실험 결과, 외부 자기장이 인가될 때, FMSNP로 처리된 MDA-MB-231 세포는 자석을 향하여 모였다(도 8b). 이러한 결과는 FMSNP가 적합한 세포 결합 효율을 나타낸다는 점을 의미한다. 추가로, 자기장이 없이도, FMSNP로 처리된 MDA-MB-231 세포는 PCR 튜브의 PBS 내에서 잘 분산되었으나, 자석에 위치된 후에는 상기 세포가 곧 측벽에 모였다(도 8c 및 도 8d). 이러한 결과는, FMSNP는 MR 영상 및 세포 분리와 같은 다양한 생물의학적 적용에 적합하게, 외부 자기장에 충분한 감도를 가진다는 점을 나타낸다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 형광 자성 실리카 나노입자를 제조하는 과정을 나타내는 개념도이다.

도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 MNP, MK 및 MSNP의 투과전자현미경 사진을 나타내는 도면이다.

도 3는 MSNP의 FT-IR 스펙트럼(3a), 및 MNP 및 MSNP의 XRD 분석 결과(3b)를 나타내는 도면이다.

도 4는 실시예에서 제조된 MNP, MK, MSNP, AMSNP 및 FMSNP으 lzmrl 분포 및 제타 전위의 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 MSNP의 자기이력곡선(5a), MSNP의 T2-강조 MR 영상 및 칼라맵(5b), MSNP의 이완성(5c)을 나타내는 도면이다.

도 6은 FMSNP의 미세영상을 나타내는 도면이다.

도 7은 FMSNP의 농도에 따른 세포 생존도(7a), FACS 분석 결과(7b), 상대적 형광 강도 및 T2 그래프(7c), T2-강조 MR 영상(7d)을 나타내는 도면이다.

도 8은 자기장 인가 전후의 FMSNP로 처리된 세포의 이동을 나타내는 형광 미세영상을 나타내는 도면이다.

Claims

자성 나노클러스터를 포함하는 코어부; 상기 코어부를 둘러싸고 있는 실리카 셀부; 및

상기 실리카 셀부에 도입된 형광물질을 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

자성 나노클러스터는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금을 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 2 항에 있어서,

금속 물질이 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고; 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄ 및 M_xO_y (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr을 나타내고, x 및 y는 각각 식 「0 < x ≤ 3」 및 「0 < y ≤ 5」을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며; 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

자성 나노클러스터는 입자 직경이 10 nm 내지 1,000 nm인 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

자성 나노클러스터는 전체 중량 대비 1 중량% 내지 50 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

코어부는 자성 나노클러스터를 둘러싸고 있는 표면 안정제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 6 항에 있어서,

표면 안정제가 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 소듐 도데실 설파이트 및 폴리에틸렌글리콜 솔비탄 모노리트 계열 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

형광물질이 FITC, 피렌, 프로피디움 요오드화물 및 RITC로 이루어진 군으로 부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

형광물질은 전체 중량 대비 0.5 중량% 이상의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,

형광물질이 양이온성 작용기를 매개로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
제 10 항에 있어서,

양이온성 작용기가 암모니아기, 1차 아민기, 2차 아민기 및 3차 아민기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형광 자성 실리카 나노입자.
자성 나노클러스터 및 실리카 전구체를 혼합하는 제 1 단계; 및

제 1 단계를 거쳐 자성 나노클러스터 상에 형성된 실리카 셀부에 형광물질을 도입하는 제 2 단계를 포함하는 형광 자성 실리카 나노입자의 제조 방법.
제 12 항에 있어서,

제 1 단계의 자성 나노클러스터는, (1) 자성 나노입자를 유기 용매에 용해시켜 오일상을 제조하는 단계; (2) 표면 안정제를 수성 용매에 용해시켜 수용상을 제조하는 단계; (3) 상기 오일상 및 수용상을 혼합하여 에멀션을 형성하는 단계; 및 (4) 상기 에멀션으로부터 오일상을 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,

실리카 전구체가 알콕시 실란인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,

제 2 단계는, (a) 실리카 셀부의 표면에 양이온성 작용기를 도입하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 도입된 작용기에 형광물질을 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 형광 자성 실리카 나노입자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 형광 자성 실리카 나노입자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 세포 표지용 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 형광 자성 실리카 나노입자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 생체물질 분리용 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 형광 자성 실리카 나노입자; 및 약제학적 활성 성분을 포함하는 약물 전달체.
제 19 항에 있어서,

약제학적 활성 성분이 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
제 20 항에 있어서,

항암제가 에피루비신, 도세탁셀, 젬시타빈, 파클리탁셀, 시스플라틴, 카르보플라틴, 택솔, 프로카르바진, 시클로포스파미드, 디악티노마이신, 다우노루비신, 에토포시드, 탁목시펜, 독소루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 플리코마이신, 트랜스플라티눔, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.