CN115074112A - 一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针及其制备和应用 - Google Patents

一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针及其制备和应用，基于表面增强荧光效应和分子印迹技术，在金属纳米结构衬底AuNPs与发光碲化镉量子点CdTe QDs之间引入一层分子印迹MIP有机隔离层，该MIP隔离层以抗生素作为模板分子，3‑氨丙基三乙氧基硅烷APTES为功能单体，正硅酸乙酯TEOS为交联剂，通过溶胶凝胶法在单颗金纳米颗粒表面发生聚合，得到厚度可控的核壳结构的分子印迹聚合物AuNPs@OTC‑MIP。通过偶联剂将CdTe QDs共价偶联至AuNP@OTC‑MIP表面，经洗脱后得到AuNP@OTC‑ir‑MIP@CdTe QDs。利用该MIP隔离层不仅可精确控制金属纳米结构衬底与发光碲化镉量子点之间的间距，有效地调控分子的荧光辐射行为，增加探针的荧光强度，还可利用分子印迹技术的特异性识别大大增强探针的选择性检出。

Description

一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针及其制 备和应用
技术领域
本发明属于纳米材料制备和环境化学检测技术领域，涉及一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针及其制备和应用。
背景技术
随着生活质量及医疗水平的提高，个人护理品及药品作为一种新兴污染物已经严重影响人们的生活，特别是抗生素的大量滥用。抗生素被服用或者注射到人体内部后并不会完全被人体吸收，未被吸收的部分会随着排泄物进入城市污水系统，且都以痕量浓度存在于水环境中。因此开发快速灵敏检测抗生素的新型纳米探针可为水污染事故的风险评估及应急处置提供强有力的技术支持。
荧光光谱技术作为无损检测技术，具有高灵敏度、高选择性和低成本的优点，已经成功被应用在环境分析化学领域。但随着实际工程领域对检测灵敏度要求的不断提高，传统荧光光谱技术的灵敏度难以满足相应指标要求，这在很大程度上限制了光谱技术开展的应用推广。因此，探索能够有效提高光谱灵敏度的有效途径、拓展光谱技术应用领域，是当前光谱学研究的热点问题之一。
表面增强荧光效应(Surface Enhanced Fluorescence,SEF)借助表面等离激元共振效应使光限域在纳米尺度内并进行调控，进而增强光与之距离相近的荧光分子、量子点等发光体之间的相互作用，最终实现其激发和发射行为的调控。但是当发光基团与金属表面直接接触后，容易产生荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)而使其荧光强度发生猝灭，因此如何有效控制发光基团和金属之间的距离就显得格外重要。除此之外，实际水体中通常存在复杂干扰物质，不仅会降低检测的灵敏度，而且严重影响荧光探针的选择性，所以如何提高在复杂水体中检测的选择性显得尤为重要。
分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)对靶分子有特异性识别和选择性吸附的能力、制备成本低廉、稳定性好和可重复性使用等优点。因此，将表面增强荧光效应与分子印迹技术相结合，既保留荧光纳米探针高灵敏度、高效等优点，同时又进一步提高其选择性。因此，如何构建表面增强荧光纳米材料、制备分子印迹聚合物及高光学性能的荧光材料以制备出具有低成本、高选择性、高灵敏度的基于表面增强荧光技术的分子印迹荧光纳米探针具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法及其在水环境检测中的应用。所得到的基于发光量子点(Quantum Dots,QDs)的具有核-壳结构的分子印迹增强荧光纳米探针不仅集合了量子点其优秀的光学性能，并且拥有MIP的特异性识别能力的双重优势。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一提供了一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)以抗生素作为模板分子，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体，正硅酸乙酯(TEOS)为交联剂，通过溶胶凝胶法在AuNPs表面发生聚合反应，得到厚度可控的核壳结构的分子印迹聚合物AuNP@OTC-MIP(即表面带氨基的AuNP@分子印迹聚合物)；
(2)通过偶联剂1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，将水溶性羧基化MPA-CdTe QDs共价偶联至AuNP@OTC-MIP表面，在其表面形成一层致密的CdTe QDs壳层，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs，再采用洗脱液洗脱去除模板分子，从而形成对待测物具有特异性识别的分子印迹空穴，得到AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs，即为目标产物。
进一步的，步骤(1)中，溶胶凝胶法过程具体为：
取AuNPs溶解于乙醇中，加入氨水，随后加入正硅酸乙酯，搅拌反应，随后老化，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和抗生素，继续加热反应，离心浓缩，即得到AuNP@OTC-MIP。
更进一步的，AuNPs以溶液形式添加，以其按(3.0-5.0)×1010particles/mL的浓度加入(10-20)mL为基准计，对应的，所述氨水按照28％质量分数的浓度加入(0.5-1)mL，所述正硅酸乙酯以溶液形式按(0.01-0.05)M的浓度加入(1-10)mL，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷加入(1-10)μL，所述抗生素以溶液形式按(1.0-3.0)×10-3mol/L的浓度加入(0.7-1.0)mL。更优选的，AuNPs溶液的具体制备过程为：将(50-200)mL的(1.0-5.0)×10-3M HAuCl4溶液加热至90-100℃，逐滴加入(0.1-10)mL的1-2％(w/w)柠檬酸三钠溶液，持续加热25-35min，随后冷却至室温。将该溶液在6000-9000r/min条件下高速离心10-15min，去除上清液，即得到AuNPs溶液。
上述溶胶凝胶法中，更进一步的，搅拌反应的温度为25℃，时间为12-24h；
老化的时间为12-24h；
加热反应的温度为50℃，时间为1-2h。
进一步的，水溶性的羧基化碲化镉量子点(MPA-CdTe QDs)可以采用Gao法(J.Phys.Chem.B,1998,102(43):8360–8363)制备。具体的，通过预先合成的NaHTe作为碲源，以CdCl2为镉源，以NaHB4为还原剂，以MPA为稳定剂，在水相体系中，快速制备荧光效率高、稳定性好的水溶性MPA-CdTe QDs。
更具体的，1)预先合成NaHTe：
取25-50mg Te粉和30-60mg NaHB4于烧瓶中，在氮气保护下，加入2-4mL无氧水快速搅拌2-4h，直至颜色从墨黑色变为澄清透明的淡紫色，得到NaHTe溶液。
2)制备MPA-CdTe QDs：
将30-50μL MPA在超声环境下加入30-50mL的0.01-0.03M CdCl2溶液中，并通过滴加NaOH溶液使其pH值调至9-10，该溶液呈白色乳液状。将上述新鲜制备的NaHTe溶液快速加入上述CdCl2溶液中，通过加热回流4-12h得到发绿光的水溶性的(0.05-0.5)mg/mL的MPA-CdTe QDs。
本发明中所加入的MPA-CdTe QDs，其激发波长为340-360nm，其发射波长为525-560nm，发绿色荧光。
进一步的，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs的过程具体为：
取1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐加入水溶性羧基化MPA-CdTe QDs中，在冰浴条件下，搅拌，再加入AuNP@OTC-MIP，在冰浴条件下继续搅拌，随后升温回流，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs。
更进一步的，以(0.01-0.05)M1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐按添加量(0.1～0.5)mL为计量基准，对应的，所述AuNP@OTC-MIP浓度为(0.05-0.5)mg/mL，以溶液形式加入(5-10)mL。
更进一步的，升温回流的温度为25℃，回流时间为4-6h。
进一步的，所述的抗生素为土霉素、金霉素、强力霉素中的任一种。
进一步的，所用洗脱液为由乙醇、氨水及水以体积比(5-7):(1-2):(1-2)混合得到的混合液。
进一步的，洗脱方法具体为：将浓缩后的AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs放入洗脱液中超声洗脱10-20min，离心洗涤，反复2次，直至用HPLC检测洗脱液中无模板分子，即得到分子印迹表面增强荧光纳米探针。
本发明以粒径为30-50nm的金纳米颗粒(AuNP)作为金属纳米结构衬底，在其表面包覆一层厚度约为10～30nm的以抗生素为模板分子的氨基化MIP壳层。利用偶联剂1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在MIP壳层表面修饰发绿光的以疏基乙酸(MPA)为稳定剂的碲化镉量子点(MPA-CdTe QDs)。在外光场激励下，AuNPs表面所形成的集体电子振荡模式可有效调制其局域电磁场分布，对居于衬底附近的CdTe QDs荧光辐射产生调控，从而使其产生荧光增强效应。此方法制备的分子印迹表面增强荧光纳米探针既保留量子点荧光传感器高灵敏度，又大大保护了量子点的化学稳定性，进而提高抗生素检测的选择性以及定量检测的准确性。
本发明的技术方案至二提供了一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针，其采用如上任一所述的制备方法制备而成。
本发明的技术方案之三提供了一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的应用，该分子印迹荧光纳米探针用于抗生素类物质的选择性荧光检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)传统荧光光谱技术的灵敏度难以满足相应指标要求，在很大程度上限制了光谱技术开展的工程应用推广。为提高荧光检测信号的灵敏度和信噪比，解决传统光谱技术所面临的问题，本发明中利用表面增强荧光效应，在金属纳米结构衬底AuNP与发光CdTe QDs之间引入一层有机隔离层，该隔离层除了可精确控制AuNP与CdTe QDs之间的间距，有效地调控分子的荧光辐射行为，有效增强荧光光谱信号。
2)本发明中采用分子印迹技术，以AuNP作为载体，可有效增加MIP的比表面积，暴露更多的特异性识别位点，利用MIP的特异性识别能力大大增强探针的选择性检出。本发明中制备的MIP壳层光学透明，减少了MIP自身对CdTe QDs的猝灭，极大的保留了CdTe QDs原先的荧光强度，从而显著提高该荧光传感器的重现性和稳定性。
3)本发明所述的基于表面增强荧光技术的分子印迹荧光纳米探针对土霉素的线性检测范围为0.5-8μM，检测限为0.01μM，线性回归方程分别为：F0/F-1＝0.08727+0.1771x(R2＝0.99006)。并且在含有类似同系物的选择性检测中，改传感器对土霉素有很好的选择性。
附图说明
图1为本发明中一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs制备流程示意图；
图2为实施例1-3分别制备得到的不同厚度MIP壳层的AuNP@OTC-MIP的紫外－可见吸收光谱图；
图3为实施例1-4分别制备得到的不同厚度MIP壳层的AuNP@OTC-ir-MIP@CdTeQDs、CdTe QDs及AuNP@CdTe QDs纳米材料的荧光光谱；
图4为实施例1和7制备的分子印迹荧光增强纳米探针与非印迹荧光增强纳米探针对土霉素分子的吸附曲线；
图5为实施例1中制备的分子印迹荧光增强纳米探针对不同浓度的土霉素的荧光响应线性曲线；
图6为实施例1和7制备的分子印迹荧光增强纳米探针与非印迹荧光增强纳米探针对于土霉素、金霉素、强力霉素的选择性响应情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
实施例1：
本实施例涉及一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备，具体流程参见图1，包括如下步骤：
S1：将50mL的1.0×10-3M HAuCl4溶液加热至100℃，逐滴加入10mL的1％(w/w)柠檬酸三钠溶液，持续加热30min，冷却至室温。随后将该溶液在8000r/min条件下高速离心10min，去除上清液，即得到AuNPs溶液；将10mL所得AuNPs溶液溶解于40mL乙醇中，加入0.7mL NH3H2O(28％，w/w)搅拌5min，随后加入1mL 0.05M TEOS搅拌反应12h(25℃)，随后老化12h。待老化完毕，将10μL APTES和0.7mL 1mM模板分子土霉素加入上述溶液中，在50℃下加热1h，离心浓缩后，得到表面带氨基的AuNP@OTC-MIP。
S2：取26.8mg Te粉和40mg NaHB4于烧瓶中，在氮气保护下，加入2mL无氧水快速搅拌2h，直至颜色从墨黑色变为澄清透明的淡紫色，得到NaHTe溶液。
将30μL的MPA在超声环境下加入40mL的0.01M CdCl2溶液中，并通过滴加NaOH溶液使其pH值调至10，该溶液呈白色乳液状。将上述新鲜制备的NaHTe溶液快速加入上述CdCl2溶液中，通过加热回流10h得到发绿光的水溶性的MPA-CdTe QDs(约为0.2mg/mL)。
S3：制备分子印迹表面增强荧光纳米探针(AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs):
将0.5mL 10mM的EDC溶液加入步骤S2制备的10mL MPA-CdTe QDs(0.2mg/mL)，在冰浴条件下，搅拌15min；继续将步骤S1制备的5mL 0.1mg/mL AuNP@OTC-MIP加入上述10mL0.05mg/mL CdTe QDs溶液中，在冰浴条件下，搅拌2h，随后在25℃回流4h，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs。经离心、浓缩后，可置于4℃以下的环境内保存。将浓缩后的AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs放入洗脱液(乙醇、氨水及水的体积比7:2:1)中超声洗脱10-20min，离心洗涤，反复多次，直至用HPLC检测洗脱液中无模板分子，得到分子印迹表面增强荧光纳米探针AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs。
实施例2：
本实施例中，步骤S1中，老化后，在50℃下加热3h，其余同实施例1。
实施例3：
本实施例中，步骤S1中，老化后，在50℃下加热5h，其余同实施例1。
根据实施例1-3，制备出不同厚度的OTC-ir-MIP壳层，通过紫外光谱分析可以得出壳层厚度分别约为3～5nm、8～12nm、15～20nm左右(图2)。
实施例4：
本实施例中，步骤S1中，绝大部分都相同，除了省去了OTC-MIP壳层的制备，即制备AuNPs溶液即可，S3步骤中将步骤S1制备的5mL 0.1mg/mL AuNP加入10mL 0.05mg/mL CdTeQDs溶液中，其余同实施例1，即获得AuNP@CdTe QDs，中间无印迹壳层。
根据实施例1-4，制备出不同厚度壳层的AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs、CdTe QDs及AuNP@CdTe QDs。各类纳米材料的荧光光谱如图3所示，当OTC-ir-MIP壳层为12nm左右时，荧光强度最强，无OTC-ir-MIP壳层时，由于AuNP的LSPR导致CdTe QDs发生猝灭，荧光强度最弱。
实施例5：
本实施例中，步骤S1中模板分子为金霉素，其余同实施例1
实施例6：
本实施例中，步骤S1中模板分子为强力霉素，其余同实施例1
实施例7：
本实施例中，步骤S1中不加入模板分子，即制备非印迹纳米探针，无需洗脱过程，其余同实施例1。
由图4可见，实施例1制备的印迹荧光纳米探针相对于实施例7制备非印迹纳米探针，其具有更好的吸附效率，在10min内完成吸附，且猝灭率远远大于非印迹探针。
实施例8：
将实施例1中制备的AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs分子印迹荧光传感器进行待测物荧光检测，步骤如下：
1)标准溶液配制：配制一组土霉素的标准水溶液(pH＝8)，包含不同浓度(0.5μM；1μM；1.5μM；2μM；3μM；4μM；6μM；8μM)的土霉素溶液，以及空白标样。
2)将2mL的AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs纳米探针分别加入上述1)中配置的不同浓度的2mL土霉素标准溶液中，静置10min，使待测分子和AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs的空穴充分有效地特异性结合。用荧光分光光度计测定每个样品的荧光光谱。
荧光测量实验的设置为：激发波长360nm，激发和发射的狭缝宽度为10nm。
实施例9：
当采用实施例1制备AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs纳米探针，按上述方法进行目标分子荧光测试，该荧光纳米探针对土霉素在0.5-8μM范围内分别呈现良好的线性关系(如图5所示)，检测限为0.01μM，线性回归方程分别为：F0/F-1＝0.08727+0.1771x(R2＝0.99006)。
实施例10：
本实施例中，将上述实施例1制备印迹荧光纳米探针和实施例7制备非印迹纳米探针进行选择性荧光检测，步骤如下：
1)标准溶液配制：分别配制土霉素、金霉素、强力霉素标准溶液，其中三种抗生素的浓度均为3μM，
2)分别将2mL的土霉素、金霉素、强力霉素标准水溶液分别加入印迹荧光纳米探针和2mL的非印迹荧光纳米探针，静置10min，使待测分子和AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs或AuNP@OTC-NIP@CdTe QDs充分结合。用荧光分光光度计测定每个样品的荧光光谱。
荧光测量实验的设置为：激发波长360nm，激发和发射的狭缝宽度为10nm。
如图6所示，展示了分子印迹荧光传感器材料对土霉素的特异选择性。可以看到土霉素对传感器的猝灭率为其他抗生素的4倍以上，并且各抗生素对分子印迹荧光传感器的猝灭效果远强于非印迹荧光聚合物。
实施例11：
对上海市黄浦江中土霉素、金霉素、强力霉素进行检测。取一定量的样品，以未加入抗生素的水样为空白，加入一定质量浓度的抗生素标准溶液，进行加标回收实验。按照实施例1、4和5制备AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs，按照实施例8中所提到的检测步骤，分别对三种抗生素进行检测，检测结果见表1：
表1上海市黄浦江中抗生素的检测结果
Figure BDA0003619440930000081
Figure BDA0003619440930000091
由结果可见本发明中制备的实施例1、4和5制备的AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs分子印迹荧光传感器分别对针对上海市黄浦江中三类抗生素的检出回收率均接近100％，可见基于表面增强荧光技术的分子印迹荧光纳米探针的灵敏度较好，检出限较低。
实施例12：
本实施例涉及一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备，具体流程参见图1，包括如下步骤：
S1：将50mL的1.0×10-3M HAuCl4溶液加热至100℃，逐滴加入0.1mL的2％(w/w)柠檬酸三钠溶液，持续加热25min，冷却至室温。随后将该溶液在6000r/min条件下高速离心10min，去除上清液，即得到AuNPs溶液；将10mL所得AuNPs溶液溶解于于40mL乙醇中，加入0.5mL NH3H2O(28％，w/w)搅拌5min，随后加入1mL 0.01M TEOS搅拌反应12h(25℃)，随后老化12h。待老化完毕，将1μL APTES和0.7mL 1.0mM模板分子土霉素加入上述溶液中，在50℃下加热1h，离心浓缩后，得到表面带氨基的AuNP@OTC-MIP。
S2：取25mg Te粉和30mg NaHB4于烧瓶中，在氮气保护下，加入2mL无氧水快速搅拌2h，直至颜色从墨黑色变为澄清透明的淡紫色，得到NaHTe溶液。
将30μL的MPA在超声环境下加入30mL的0.01M CdCl2溶液中，并通过滴加NaOH溶液使其pH值调至9，该溶液呈白色乳液状。将上述新鲜制备的NaHTe溶液快速加入上述CdCl2溶液中，通过加热回流4h得到发绿光的水溶性的MPA-CdTe QDs(0.05mg/mL)。
S3：制备分子印迹表面增强荧光纳米探针(AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs):
将0.1mL10 mM的EDC溶液加入步骤S2制备的10mL MPA-CdTe QDs(0.05mg/mL)，在冰浴条件下，搅拌15min；继续将步骤S1制备的5mL 0.1mg/mL AuNP@OTC-MIP加入上述10mL0.05mg/mL CdTe QDs溶液中，在冰浴条件下，搅拌2h，随后在25℃回流4h，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs。经离心、浓缩后，可置于4℃以下的环境内保存。将浓缩后的AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs放入洗脱液(乙醇、氨水及水的体积比7:2:1)中超声洗脱10min，离心洗涤，反复多次，直至用HPLC检测洗脱液中无模板分子，得到分子印迹表面增强荧光纳米探针AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs。
实施例13：
本实施例涉及一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备，具体流程参见图1，包括如下步骤：
S1：将200mL的5.0×10-3M HAuCl4溶液加热至100℃，逐滴加入10mL的1％(w/w)柠檬酸三钠溶液，持续加热35min，冷却至室温。随后将该溶液在9000r/min条件下高速离心15min，去除上清液，即得到AuNPs溶液；将20mL所得AuNPs溶液溶解于于50mL乙醇中，加入1mL NH3H2O(28％，w/w)搅拌10min，随后加入10mL 0.05M TEOS搅拌反应24h(25℃)，随后老化24h。待老化完毕，将10μL APTES和1.0mL 3.0mM模板分子土霉素加入上述溶液中，在50℃下加热2h，离心浓缩后，得到表面带氨基的AuNP@OTC-MIP。
S2：取50mg Te粉和60mg NaHB4于烧瓶中，在氮气保护下，加入4mL无氧水快速搅拌2h，直至颜色从墨黑色变为澄清透明的淡紫色，得到NaHTe溶液。
将50μL的MPA在超声环境下加入50mL的0.03M CdCl2溶液中，并通过滴加NaOH溶液使其pH值调至10，该溶液呈白色乳液状。将上述新鲜制备的NaHTe溶液快速加入上述CdCl2溶液中，通过加热回流12h得到发绿光的水溶性的MPA-CdTe QDs(0.5mg/mL)。
S3：制备分子印迹表面增强荧光纳米探针(AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs):
将0.5mL10 mM的EDC溶液加入步骤S2制备的20mL MPA-CdTe QDs(0.5mg/mL)，在冰浴条件下，搅拌15min；继续将步骤S1制备的10mL 0.1mg/mL AuNP@OTC-MIP加入上述10mL0.05mg/mL CdTe QDs溶液中，在冰浴条件下，搅拌2h，随后在25℃回流4h，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs。经离心、浓缩后，可置于4℃以下的环境内保存。将浓缩后的AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs放入洗脱液(乙醇、氨水及水的体积比7:2:1)中超声洗脱20min，离心洗涤，反复多次，直至用HPLC检测洗脱液中无模板分子，得到分子印迹表面增强荧光纳米探针AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs。
实施例14：
本实施例涉及一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备，具体流程参见图1，包括如下步骤：
S1：将100mL的2.5×10-3M HAuCl4溶液加热至100℃，逐滴加入5mL的1-2％(w/w)柠檬酸三钠溶液，持续加热30min，冷却至室温。随后将该溶液在7000r/min条件下高速离心12min，去除上清液，即得到AuNPs溶液；将15mL所得AuNPs溶液溶解于于45mL乙醇中，加入0.75mL NH3H2O(28％，w/w)搅拌7min，随后加入5mL 0.025M TEOS搅拌反应18h(25℃)，随后老化18h。待老化完毕，将5μL APTES和0.85mL 2mM模板分子土霉素加入上述溶液中，在50℃下加热1.5h，离心浓缩后，得到表面带氨基的AuNP@OTC-MIP。
S2：取35mg Te粉和45mg NaHB4于烧瓶中，在氮气保护下，加入3mL无氧水快速搅拌2h，直至颜色从墨黑色变为澄清透明的淡紫色，得到NaHTe溶液。
将40μL的MPA在超声环境下加入40mL的0.02M CdCl2溶液中，并通过滴加NaOH溶液使其pH值调至9.5，该溶液呈白色乳液状。将上述新鲜制备的NaHTe溶液快速加入上述CdCl2溶液中，通过加热回流8h得到发绿光的水溶性的MPA-CdTe QDs(0.25mg/mL)。
S3：制备分子印迹表面增强荧光纳米探针(AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs):
将0.3mL10 mM的EDC溶液加入步骤S2制备的15mL MPA-CdTe QDs(0.25mg/mL)，在冰浴条件下，搅拌15min；继续将步骤S1制备的7mL 0.1mg/mL AuNP@OTC-MIP加入上述10mL0.05mg/mL CdTe QDs溶液中，在冰浴条件下，搅拌2h，随后在25℃回流4h，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs。经离心、浓缩后，可置于4℃以下的环境内保存。将浓缩后的AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs放入洗脱液(乙醇、氨水及水的体积比7:2:1)中超声洗脱15min，离心洗涤，反复多次，直至用HPLC检测洗脱液中无模板分子，得到分子印迹表面增强荧光纳米探针AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以抗生素作为模板分子，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂，通过溶胶凝胶法在AuNPs表面发生聚合反应，得到厚度可控的核壳结构的分子印迹聚合物AuNP@OTC-MIP；
(2)通过偶联剂1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐,将水溶性羧基化MPA-CdTeQDs共价偶联至AuNP@OTC-MIP表面，在其表面形成一层致密的CdTe QDs壳层，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs，再采用洗脱液洗脱去除模板分子，得到AuNP@OTC-ir-MIP@CdTe QDs，即为目标产物。
2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，溶胶凝胶法过程具体为：
取AuNPs溶解于乙醇中，加入氨水，随后加入正硅酸乙酯，搅拌反应，随后老化，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和抗生素，继续加热反应，离心浓缩，即得到AuNP@OTC-MIP。
3.根据权利要求2所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，AuNPs以溶液形式添加，以其按(3.0-5.0)×1010particles/mL的浓度加入(10-20)mL为基准计，对应的，所述氨水按照28％质量分数的浓度加入(0.5-1)mL，所述正硅酸乙酯以溶液形式按(0.01-0.05)M的浓度加入(1-10)mL，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷加入(1-10)μL，所述抗生素以溶液形式按(1.0-3.0)×10-3mol/L的浓度加入(0.7-1.0)mL。
4.根据权利要求2所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，搅拌反应的温度为25℃，时间为12-24h；
老化的时间为12-24h；
加热反应的温度为50℃，时间为1-2h。
5.根据权利要求1所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs的过程具体为：
取1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐加入水溶性羧基化MPA-CdTe QDs中，在冰浴条件下，搅拌，再加入AuNP@OTC-MIP，在冰浴条件下继续搅拌，随后升温回流，得到AuNP@OTC-MIP@CdTe QDs。
6.根据权利要求5所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，以1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐按添加量(0.1～0.5)mL为计量基准，对应的，所述AuNP@OTC-MIP以溶液形式加入，其浓度为(0.05-0.5)mg/mL，加入量为(5-10)mL。
7.根据权利要求5所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，升温回流的温度为25℃，回流时间为4-6h。
8.根据权利要求1所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的抗生素为土霉素、金霉素、强力霉素中的任一种。
9.一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针，其特征在于，其采用如权利要求1-8任一所述的制备方法制备而成。
10.如权利要求9所述的一种基于表面增强荧光效应的分子印迹荧光纳米探针的应用，其特征在于，该分子印迹荧光纳米探针用于抗生素类物质的选择性荧光检测。
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