CN117849015B - 一种尿酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尿酸检测方法，涉及尿酸检测技术领域。该尿酸检测方法，包括如下具体步骤：步骤一.通过UIO‑66‑NH2制备UIO‑66‑NH2@Hemin；步骤二.向20份的UIO‑66‑NH2@Hemin中分别加入OPD和不同浓度的H2O2标准溶液，用PBS溶液调整体系pH，于60‑65℃下孵育20‑23min，记录396nm激发波长下的发射光谱。本发明的方法具有较低的检测限，较宽的线性范围，对于实际尿液样品中尿酸的检测及加标实验均显示出令人满意的结果，该方法可以为尿酸的临床检测提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及尿酸检测技术领域，具体为一种尿酸检测方法。
背景技术
尿酸（2,6,8-三羟基嘌呤），是嘌呤代谢的终产物。尿酸在体液中的溶解度低，过饱和的尿酸将会形成尿酸盐沉积，是引发痛风，肾结石，肾功能衰竭和lesch-nyhan综合征的主要原因。因此，有效地监测尿酸水平在临床诊断中具有重要意义。尿酸的检测通常利用其与UOx间的特异性酶促反应，通过对产物H2O2的检测来实现的。
人体中存在一系列产生H2O2的酶促反应，在尿酸氧化酶（UOx）需氧氧化酶催化下，相应的底物被氧化的同时伴有H2O2的产生。底物氧化前后化学性质较稳定，不易建立特征性化学检测方法。而副产物H2O2性质活泼，通过建立专一性的H2O2传感系统偶联相应的氧化酶催化体系，已成为体内重要内源性物质间接检测的新靶点、新思路。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿酸检测方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种尿酸检测方法，包括如下具体步骤：
步骤一.通过UIO-66-NH2制备UIO-66-NH2@Hemin；
步骤二.向20份的UIO-66-NH2@Hemin中分别加入OPD和不同浓度的H2O2标准溶液，用PBS溶液调整体系pH，于60-65℃下孵育20-23min，记录396nm激发波长下的发射光谱，通过计算OPD氧化产物oxOPD在565nm处荧光强度与UIO-66-NH2@Hemin在432nm处荧光强度的比值完成H2O2的准确定量；
步骤三.称取UOx溶解在PBS缓冲液中得到孵育溶液，将孵育溶液与人体尿液的硼酸缓冲液混合，于40-45℃下孵育40-45min，完成酶促反应，向其中加入UIO-66-NH2@Hemin、OPD和PBS缓冲液并于60-65℃下继续反应20-25min，在396nm处监测反应体系的荧光发光行为，完成对尿酸的检测。
优选的，步骤一的具体操作方法为：
A1.将ZrCl4和NH2-BDC超声溶解于DMF中，加入冰醋酸以调节体系pH，将混合溶液转移至100mL容积的反应釜中，于120-122℃反应24-24.5h后自然冷却至室温，将所得产物离心处理，再用DMF和无水乙醇各洗涤沉淀三次得到纯化后的UIO-66-NH2，再将纯化后的UIO-66-NH2置于60-65℃下真空干燥3.5-3.7h；
A2.称取A1中纯化后的UIO-66-NH2超声分散于无水乙醇中得到第一溶液，将Hemin分散于无水乙醇中得到第二溶液，将第一溶液和第二溶液混合，在室温下连续搅拌2.0-2.3h，混合液由最开始的黑灰色变为最终红褐色反应成功得到最终溶液，将最终溶液离心处理，并用无水乙醇洗涤沉淀三次，于60-65℃下真空干燥，得米色UIO-66-NH2@Hemin固体，将米色UIO-66-NH2@Hemin配置成浓度为4.0-4.2mg.mL-1的溶液储存。
优选的，步骤二中20份的UIO-66-NH2@Hemin用量均为40.0-40.5μL，OPD浓度为2.0-2.3mmol.L-1且用量为200.0-200.5μL，H2O2的用量为200.0-200.5μL且溶度范围为5-1600μmol.L-1，PBS的用量为1.0-1.5mL且浓度为0.10-0.12mmol.L-1。
优选的，步骤三中UOx的用量为1.0-1.3mg且浓度为43.65-43.68U.mg-1，PBS缓冲液的浓度为0.10-0.12mol.L-1且用量为1.0-1.3ml，PH值为7.0-7.5，孵育溶液的用量为1.0-1.2U，人体尿液的硼酸缓冲液用量为200.5-200.3-8μL，且硼酸缓冲液的浓度为0.5-0.6mol.L-1,PH值为8.5-9.0，UIO-66-NH2@Hemin的用量为40.0-40.5μL，OPD浓度为2.0-2.3mmol.L-1且用量为200.0-200.5μL，PBS缓冲液的用量为1.0-1.5mL且浓度为0.10-0.12mmol.L-1。
优选的，A1中ZrCl4的用量为233.0-233.5mg且浓度为1.0-1.2mmol.L-1，NH2-BDC的用量为181.2-181.5mg且浓度为1.0-1.3mmol.L-1，DMF的用量为40.0-40.3mL，冰醋酸的用量为2.0-2.3mL，离心数据为10000-10200rpm，15-16min。
优选的，A2中所述A1中纯化后的UIO-66-NH2用量为150-155mg，第一溶液中无水乙醇的用量为15.0-15.2mL，Hemin的浓度为0.05-0.06mmol.L-1且用量为32.0-32.3mg，第二溶液中的无水乙醇的用量为3.0-3.5mL，离心数据为10000-10200rpm，15-16min。
本发明提供了一种尿酸检测方法。具备以下有益效果：
本发明以Hemin的过氧化物酶活性为基础，利用UIO-66-NH2@Hemin及其催化H2O2氧化OPD产生的发光产物oxOPD间的FRET机制，构建了一种H2O2灵敏检测的比率荧光探针，结合UOx的特异性催化性能进一步实现了尿酸的传感，该方法具有较低的检测限，较宽的线性范围，对于实际尿液样品中尿酸的检测及加标实验均显示出令人满意的结果，该方法可以为尿酸的临床检测提供新的技术支持。
附图说明
图1为本发明的UIO-66-NH2@Hemin结构表征图；
图2为本发明的Hemin、UIO-66-NH2、UIO-66-NH2@Hemin和UIO-66-NH2@Hemin在PBS溶液中的XRD图；
图3为本发明a为UIO-66-NH2@Hemin的XPS测量扫描图；b为Zr3d的相应高分辨率XPS图；c为C1s的相应高分辨率XPS图、d为N1s的相应高分辨率XPS图；e为O1s的相应高分辨率XPS图和f为Fe2p的相应高分辨率XPS图；
图4为本发明Hemin、NH2-BDC、UIO-66-NH2和UIO-66-NH2@Hemin的FT-IR光谱图；
图5为本发明中a为UIO-66-NH2@Hemin和b为NH2-BDC的荧光激发和发射光谱图；
图6为本发明不同浓度的UIO-66-NH2@Hemin的荧光强度随时间的变化趋势图；
图7为本发明中a为UIO-66-NH2@Hemin在0min时不同溶剂中的紫外－可见光谱图；b和c为UIO-66-NH2@Hemin在水、乙醇和中不同浓度的PBS溶液在90min后与0min时的紫外－可见光谱图；d为确认UIO-66-NH2@Hemin在PBS溶液中的浸出组成图（插图：左边为UIO-66-NH2@Hemin在水中的图，右边为PBS溶液中的渗滤液的图像）；
图8为本发明中a为UIO-66-NH2@Hemin在PBS溶液中和加入oxOPD（λex=337nm）后的时间分辨荧光衰减光谱；b为UIO-66-NH2@Hemin和oxOPD混合物的紫外-可见光谱；c为UIO-66-NH2@Hemin的激发和发射光谱和oxOPD的紫外-可见光谱图；
图9为本发明中a为OH、1O2和O2 ·−的ESR光谱图，b为UIO-66-NH2@Hemin、OPD等参与反应物质共孵育后的荧光发射光谱图；
图10为图1中h位置的放大图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例，本发明实施例提供一种尿酸检测方法，包括如下具体步骤：
步骤一.通过UIO-66-NH2制备UIO-66-NH2@Hemin，具体的方法如下：
A1.将233.5mg浓度为1.2mmol.L-1的ZrCl4和181.5mg浓度为1.3mmol.L-1的NH2-BDC超声溶解于40.3mL的DMF中，加入2.3mL的冰醋酸以调节体系pH，将混合溶液转移至100mL容积的反应釜中，于120-122℃反应24-24.5h后自然冷却至室温，将所得产物离心处理，离心数据为10000rpm，15min，再用DMF和无水乙醇各洗涤沉淀三次得到纯化后的UIO-66-NH2，再将纯化后的UIO-66-NH2置于60-65℃下真空干燥3.5-3.7h；
A2.称取155mg的A1中纯化后的UIO-66-NH2超声分散于15.2mL无水乙醇中得到第一溶液，将32.3mg浓度为0.06mmol.L-1的Hemin分散于3.5mL的无水乙醇中得到第二溶液，将第一溶液和第二溶液混合，在室温下连续搅拌2.0-2.3h，混合液由最开始的黑灰色变为最终红褐色反应成功得到最终溶液，将最终溶液离心处理，离心数据为10200rpm，16min，并用无水乙醇洗涤沉淀三次，于60-65℃下真空干燥，得米色UIO-66-NH2@Hemin固体，将米色UIO-66-NH2@Hemin配置成浓度为4.0mg.mL-1的溶液储存；
步骤二.向20份40.5μL的UIO-66-NH2@Hemin中分别加入200.5μL浓度为2.3mmol.L-1的OPD和200.5μL不同浓度的H2O2标准溶液，且浓度范围为5-1600μmol.L-1，用1.5mL浓度为0.12mmol.L-1的PBS溶液调整体系pH，于60-65℃下孵育20-23min，记录396nm激发波长下的发射光谱，通过计算OPD氧化产物oxOPD在565nm处荧光强度与UIO-66-NH2@Hemin在432nm处荧光强度的比值完成H2O2的准确定量；
步骤三.称取1.3mg浓度为43.68U.mg-1的UOx溶解在1.3ml浓度为0.12mol.L-1的PBS缓冲液中得到孵育溶液，PBS缓冲液的PH值为7.0，将1.2U孵育溶液与200.8人体尿液的硼酸缓冲液混合，且硼酸缓冲液的浓度为0.5-0.6mol.L-1且PH值为8.5，于40-45℃下孵育40-45min，完成酶促反应，向其中加入40.5μL的UIO-66-NH2@Hemin、200.5μL浓度为2.3mmol.L-1的OPD和1.5mL浓度为0.12mmol.L-1的PBS缓冲液并于60-65℃下继续反应20-25min，在396nm处监测反应体系的荧光发光行为，完成对尿酸的检测。
结果数据展示：
一.UIO-66-NH2@Hemin结构表征：如图1所示，通过SEM，TEM表征了UIO-66-NH2和UIO-66-NH2@Hemin的形貌，SEM结果显示UIO-66-NH2为具有均匀八面体形状的纳米晶体（图1中a）；UIO-66-NH2@Hemin保留了相似的形貌特征（图1中b），也进一步说明Hemin并不会影响UIO-66-NH2的结构；能量色散光谱（EDS）证实了C、N、O、Zr、Fe的存在（图1中g），也进一步说明Hemin的成功修饰；各元素的映射与所选区域的SEM图像相似，呈现出均匀分布的状态（图1中h和图10），通过对TEM图像的观察也得到了近似的结果，Hemin修饰前后UIO-66-NH2均具有光滑干净的表面（图1中d和e）。
UIO-66-NH2@Hemin及其前体物质的晶相结构通过XRD的表征得到进一步确证，合成的UIO-66-NH2的XRD谱图与UIO-66匹配一致，具有2θ=7.4°、8.5°和25.7°处所有特征衍射峰，形成了以UIO-66晶体结构为基础的氨基化材料，如图2所示，Hemin改性前后UIO-66-NH2的XRD图极为相似，表明Hemin的引入并未改变UIO-66-NH2的晶体结构，UIO-66-NH2@Hemin中不存在任何有关Hemin的特征峰，也并没有发现Hemin中Fe有关的特征衍射峰出现在UIO-66-NH2@Hemin的XRD图谱中，具体是Hemin的负载量较低或高度分散导致。
通过XPS进一步表征了UIO-66-NH2@Hemin的元素组成及化学环境，如图3中a，XPS全谱显示了UIO-66-NH2@Hemin中的C、N、O、Zr和Fe元素，证明Hemin成功地结合到了UIO-66-NH2上，各元素结合能均按照污染碳的C1s（284.8eV）进行校准，对于C1s谱（图3中c），位于284.8eV的峰拟合为284.8、286.3和288.7eV的三个峰，代表C=C/C-C、C-O/C-N及C=O/C=N。N1s在398.6eV处的特征峰分成398.5和399.7eV两个峰（图3中d），归属于C=N及-NH2，位于531.7eV处的O1s特征峰被拟合成三个峰（图3中e），分别位于530.5eV处的Zr-O键，531.7eV处的C=O及533.2eV处的C-OH/C-O-C和Zr-O键的形成证明了Zr与O之间强烈的配位作用，此外，Zr3d（182.8eV）的高分辨图谱在182.8和185.2eV处的两个峰对应于Zr3d5/2和Zr3d3/2（图3中b），典型的双峰特性证明Zr4+的存在，UIO-66-NH2@Hemin中的铁元素Fe2p3/2和Fe2p1/2的结合能分别为710.7和724.7eV（图3中f），相较于单纯的Hemin中Fe2p的结合能712.5eV（Fe2p3/2）和726.3eV（Fe2p1/2）有显著的位移，表明Hemin与UIO-66-NH2不是简单的混合，其间必然存在着电荷的相互作用。
如图4比较了合成UIO-66-NH2@Hemin过程中几种重要原料及中间产物的FT-IR光谱，配体NH2-BDC在3508和3387cm-1处的双峰归因于伯胺中N-H的不对称及对称伸缩振动，对应的UIO-66-NH2在高频区仍显示出类似的伯胺性质并伴有双峰的红移，这是由于Zr4+与NH2-BDC配位后由于共轭程度增加导致，UIO-66-NH2@Hemin的合成导致N-H的伸缩振动消失，并在高波数区形成了一个宽带，表明UIO-66-NH2@Hemin中含有羟基结构，伯胺基团的消失是Hemin中的羧基与UIO-66-NH2中氨基形成酰胺结构导致，有机配体NH2-BDC在1691cm-1处呈现出芳香羧基中C=O伸缩振动的特征峰，与Zr4+配位后所形成的UIO-66-NH2及UIO-66-NH2@Hemin在1660-1575cm-1和1437-1386cm-1处检测到羧酸根阴离子的不对称和对称伸缩振动的谱带，表明NH2-BDC和Zr4+的配位作用导致羧基的去质子化，配体NH2-BDC中以3000cm-1为中心（宽而钝）和914cm-1处所分别对应的羧基中O-H的伸缩振动及面外弯曲振动的消失也证明了羧基去质子化的观点。
二.UIO-66-NH2@Hemin光学行为分析：图5中a显示UIO-66-NH2@Hemin在PBS缓冲液中的最大激发波长为337nm，对应的最大发射波长为429nm为非激发光依赖性材料，呈现出强烈的蓝色荧光，Abs-QY为65.91%，λem=429nm所对应的激发光谱中存在四个明显的峰位（259nm、337nm、520nm和633nm），当以259nm或337nm波长激发时在429nm处有荧光发射，存在斯托克斯位移，但以520nm或653nm波长激发时存在反斯托克斯位移，提示UIO-66-NH2@Hemin具有上转换发光的性质，UIO-66-NH2@Hemin与有机配体NH2-BDC荧光光谱（图5中b）的相似性证明UIO-66-NH2@Hemin发光的行为完全依赖于NH2-BDC。
UIO-66-NH2@Hemin的发光行为具有溶剂依赖性，如图6所示，UIO-66-NH2@Hemin在水，NaCl（0.3mol.L-1）溶液，乙醇中的荧光强度极弱，当分散在PBS缓冲液中，UIO-66-NH2@Hemin荧光明显增强，且随着PBS缓冲液浓度的增加，荧光增强速率依次变大，具有达到相近荧光强度的趋势。
UIO-66-NH2@Hemin在不同溶剂和不同时间下的UV-vis吸收光谱可以清楚地揭示这一过程，以UIO-66-NH2@Hemin刚加入水、乙醇和PBS缓冲液（0.025、0.1和0.3mol.L-1）中为0时间点记录此时的UV-vis吸收光谱，如图7中a所示，UIO-66-NH2@Hemin在所有溶剂中均出现325-450nm范围内的吸收带，为hemin中C=O/C=N的n-π*跃迁，室温静置90min后（图7中b），在水和乙醇中分散的UIO-66-NH2@Hemin峰位及峰强度并无明显变化，证明MOF结构并无破坏，也进一步说明MOF结构的完整性是其不发光的原因，而无论是在何种浓度的PBS缓冲液中，UIO-66-NH2@Hemin均在300-350nm范围内出现新的吸收带（图7中c），在同一溶剂中UV-vis吸收光谱发生较大的变化，是由于MOF结构的破坏，UIO-66-NH2@Hemin发光的原因是有机配体NH2-BDC的发光，结合图7中d进一步比较了UIO-66-NH2@Hemin90min后在水、乙醇和PBS缓冲液及NH2-BDC在水、乙醇和PBS缓冲液中的UV-vis吸收光谱，发现图7中c中300-350nm处新产生的吸收带与NH2-BDC在PBS缓冲液中C=O的n-π*跃迁相吻合，证明UIO-66-NH2@Hemin发光是由于有机配体溶解在PBS中导致，与此同时，通过对UIO-66-NH2@Hemin在PBS缓冲液中的浸出液（将UIO-66-NH2@Hemin溶解于PBS缓冲液后离心所获得的上清液）进一步分析，发现浸出液呈现红棕色（图7中d中的插图），这与Hemin溶液的颜色相同，在300-350nm范围内，浸出液的UV-vis吸收光谱与UIO-66-NH2@Hemin新产生的吸收带和NH2-BDC在PBS缓冲液中的吸收带相同并在400nm处出现Hemin中C=O/C=N的n-π*跃迁，以上现象充分说明由于NH2-BDC溶解于PBS缓冲液导致UIO-66-NH2@Hemin结构破坏，Hemin从UIO-66-NH2表面释放，所以在PBS缓冲液中的UIO-66-NH2@Hemin既具有Hemin的过氧化物酶活性，又具有有机配体NH2-BDC的荧光特性，而水和乙醇中的UIO-66-NH2@Hemin结构无明显变化是由于NH2-BDC在水或乙醇中溶解度较低，MOF结构得到很好的保留，更多的NH2-BDC与Zr4+发生配位作用，导致荧光丧失，NH2-BDC（pKa=3.95）在PBS缓冲液中的高溶解度是由于其结构中具有较强酸性的羧基与PBS缓冲液中Na2HPO4反应，置换出酸性较弱的NaH2PO4（pKa=7.21）并伴随着羧基的成盐。
对比研究了UIO-66-NH2@Hemin在水及PBS缓冲液中SEM、TEM和XRD的表征结果也与上述推论一致，通过对图1中c和f中SEM和TEM图像边缘结构的观察发现溶解于PBS缓冲液中的UIO-66-NH2@Hemin有较明显的边缘侵蚀现象，表明结构遭到了破坏，而图2中所产生典型的非晶型XRD图谱是UIO-66-NH2@Hemin骨架坍塌的最直接证据。
三.UIO-66-NH2@Hemin荧光猝灭机理探究：UIO-66-NH2是Hemin的载体，具有类过氧化物酶活性的UIO-66-NH2@Hemin催化H2O2氧化OPD产生荧光物质oxOPD，将oxOPD使UIO-66-NH2@Hemin荧光猝灭归结于荧光共振能量转移（FRET）过程，荧光猝灭机理主要分为静态猝灭和动态猝灭，静态猝灭是处于基态的荧光团结合猝灭剂形成了不发光的基态复合物。动态猝灭是处于激发态的荧光团与猝灭剂间的碰撞导致激发态能量损失进而以非辐射跃迁回到基态，荧光寿命是判断荧光猝灭机理的首要参数，如图8中a所示，当oxOPD存在时，UIO-66-NH2@Hemin的荧光寿命从自身的14.10ns缩短至12.30ns，揭示了oxOPD的猝灭机理为动态猝灭过程，静态猝灭与动态猝灭的另一显著区别为是否形成了基态的复合物，基态复合物的形成会使原发光物质的UV-vis吸收光谱发生改变，图8中b中荧光物质UIO-66-NH2@Hemin与猝灭剂oxOPD混合前后在332-367nm（填色区域：为减少吸光度加和性带来的影响，在UIO-66-NH2@Hemin出现特征吸收峰附近选取oxOPD吸光度影响最小的范围）范围内吸收光谱并无明显变化也进一步证实了动态猝灭的机理，利用猝灭剂的UV-vis吸收光谱与荧光团的激发和发射光谱间的关系进一步探究了动态猝灭的机制，在这一猝灭过程中oxOPD的UV-vis吸收光谱与UIO-66-NH2@Hemin的发射光谱高度重叠，这表明他们之间形成了以UIO-66-NH2@Hemin为能量供体，oxOPD为能量受体的FRET系统。
四.UIO-66-NH2@Hemin的催化机理：HRP的过氧化物酶样催化活性由辅基Hemin决定，全酶中的酶蛋白部分又决定了酶促反应的高效性，UIO-66-NH2@Hemin的合成实现了以UIO-66-NH2仿生酶蛋白结构分散负载Hemin，作为一种MOF材料，对Hemin有较大的吸附量，弥补了HRP只能存在一个Hemin辅基的缺陷，为明确UIO-66-NH2@Hemin类过氧化物酶的催化机理，借助自旋捕捉剂（DMPO）和ESR光谱鉴定了产生活性氧（ROS）的种类，图9中a中显示了相对强度为1:2:2:1的DMPO-·OH精细分裂峰，证明Hemin可引发H2O2参与的芬顿反应产生羟基自由基（·OH），生成于过氧化物酶催化体系的单线态氧（1O2）被认为是氧化OPD的强氧化剂，观察到等高的三重峰为DMPO捕捉到DMPO-1O2的特征性ESR信号，表明UIO-66-NH2@Hemin-H2O2体系可产生1O2。此外，典型的四线ESR光谱证实了超氧自由基（O2 ·−）的存在，进一步证明UIO-66-NH2@Hemin可催化水中溶解氧产生O2 ·−，而溶剂中的大部分溶解氧来自于UIO-66-NH2@Hemin-H2O2体系，因为Hemin同为过氧化氢酶的辅基，图9中b中的对照实验探讨了影响OPD催化氧化的因素，仅有在UIO-66-NH2@Hemin与H2O2或是产生H2O2的尿酸-UOx体系下才会有明显的OPD氧化，而UIO-66-NH2@Hemin与OPD间并不能发生显著的氧化反应，表明具有极弱类氧化酶活性的UIO-66-NH2@Hemin不能直接催化溶剂中的溶解氧产生O2 ·−氧化OPD，上述的分析结果能充分证明UIO-66-NH2@Hemin发挥类过氧化物酶活性的机理，即TMB的氧化源于H2O2介导的·OH、1O2和O2 ·−的产生。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种尿酸检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤一.通过UIO-66-NH2即2-氨基对苯二甲酸制备UIO-66-NH2@Hemin；
步骤二.向20份的UIO-66-NH2@Hemin中分别加入OPD即邻苯二胺和不同浓度的H2O2标准溶液，用PBS溶液即磷酸二氢钠溶液调整体系pH，于60-65℃下孵育20-23min，记录396nm激发波长下的发射光谱，通过计算OPD氧化产物oxOPD在565nm处荧光强度与UIO-66-NH2@Hemin在432nm处荧光强度的比值完成H2O2的准确定量；
步骤三.称取UOx即尿酸氧化酶溶解在PBS缓冲液中得到孵育溶液，将孵育溶液与人体尿液的硼酸缓冲液混合后，于40-45℃下孵育40-45min，完成酶促反应，向其中依次加入UIO-66-NH2@Hemin、OPD和PBS缓冲液并于60-65℃下继续反应20-25min，在396nm处监测反应体系的荧光发光行为，完成对尿酸的检测。
2.根据权利要求1所述的一种尿酸检测方法，其特征在于，步骤一的具体操作方法为：
A1.将ZrCl4即四氯化锆和NH2-BDC即2-氨基对苯二甲酸超声溶解于DMF即N,N-二甲基甲酰胺中，加入冰醋酸以调节体系pH，将混合溶液转移至100mL容积的反应釜中，于120-122℃反应24-24.5h后自然冷却至室温，将所得产物离心处理，再用DMF和无水乙醇各洗涤沉淀三次得到纯化后的UIO-66-NH2，再将纯化后的UIO-66-NH2置于60-65℃下真空干燥3.5-3.7h；
A2.称取A1中纯化后的UIO-66-NH2超声分散于无水乙醇中得到第一溶液，将Hemin即氯化血红素分散于无水乙醇中得到第二溶液，将第一溶液和第二溶液混合，在室温下连续搅拌2.0-2.3h，混合液由最开始的黑灰色变为最终红褐色反应成功得到最终溶液，将最终溶液离心处理，并用无水乙醇洗涤沉淀三次，于60-65℃下真空干燥，得米色UIO-66-NH2@Hemin固体，将米色UIO-66-NH2@Hemin配置成浓度为4.0-4.2mg.mL-1的溶液储存。
3.根据权利要求1所述的一种尿酸检测方法，其特征在于，步骤二中20份的UIO-66-NH2@Hemin用量均为40.0-40.5μL，OPD浓度为2.0-2.3mmol.L-1且用量为200.0-200.5μL，H2O2的用量为200.0-200.5μL且浓度范围为5-1600μmol.L-1，PBS的用量为1.0-1.5mL且浓度为0.10-0.12mmol.L-1。
4.根据权利要求1所述的一种尿酸检测方法，其特征在于，步骤三中UOx的用量为1.0-1.3mg且浓度为43.65-43.68U.mg-1，PBS缓冲液的浓度为0.10-0.12mol.L-1且用量为1.0-1.3ml，PH值为7.0-7.5，孵育溶液的用量为1.0-1.2U，人体尿液的硼酸缓冲液用量为200.5-200.8μL，且硼酸缓冲液的浓度为0.5-0.6mol.L-1,PH值为8.5-9.0，UIO-66-NH2@Hemin的用量为40.0-40.5μL，OPD浓度为2.0-2.3mmol.L-1且用量为200.0-200.5μL，PBS缓冲液的用量为1.0-1.5mL且浓度为0.10-0.12mmol.L-1。
5.根据权利要求2所述的一种尿酸检测方法，其特征在于，A1中ZrCl4的用量为233.0-233.5mg且浓度为1.0-1.2mmol.L-1，NH2-BDC的用量为181.2-181.5mg且浓度为1.0-1.3mmol.L-1，DMF的用量为40.0-40.3mL，冰醋酸的用量为2.0-2.3mL，离心数据为10000-10200rpm，15-16min。
6.根据权利要求2所述的一种尿酸检测方法，其特征在于，A2中所述A1中纯化后的UIO-66-NH2用量为150-155mg，第一溶液中无水乙醇的用量为15.0-15.2mL，Hemin的浓度为0.05-0.06mmol.L-1且用量为32.0-32.3mg，第二溶液中的无水乙醇的用量为3.0-3.5mL，离心数据为10000-10200rpm，15-16min。
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- 2024-03-04 CN CN202410243288.9A patent/CN117849015B/zh active Active
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