CN108610270A - 双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针及其合成方法和应用 - Google Patents

双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针及其合成方法和应用，所述探针以双氰基二苯代乙烯(DCS)为双光子荧光母体制备。该探针分子体积小，在水溶解度良好且适于溶剂极性的检测，另外该探针的荧光强度、双光子吸收截面随粘度的增加而发生明显变化，显示了很宽的溶剂生色范围、大的双光子吸收截面和超大斯托克斯位移，大大提高了检测灵敏度、成像清晰度、灵敏度与横纵向分辨率，以及检测的准确度；细胞显微成像实验表明其在细胞或组织中具有良好的生色范围和吸收效果，可以很好的检测和反映出细胞粘度的变化情况，且本身对细胞没有毒副作用。在生物、医药领域中具有极大的应用价值。

Description

双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针及其合 成方法和应用
技术领域
本发明涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针及其合成方法和应用。
背景技术
细胞内的粘度强烈地影响细胞内的物质转运与信号传输、生物大分子间的相互作用和活性代谢产物如ROS(Reactive oxygen species)和RNS(reactive nitrogenspecies)等的扩散。细胞内的粘度变化与许多疾病和病理密切相关。目前粘度的测定方法主要利用毛细管粘度计、落球粘度计和旋转粘度计，但这些方法均不能用于细胞内尤其是活细胞中粘度的测定。鉴于此，Luby-Phelps报道了一个用于细胞内粘度测定的单光子荧光探针。
最近开发的分子转子，实为荧光分子，能用于溶液或生物流体中的粘度测定。这样的分子转子一般是一个共轭体系，在粘度为零或很低时能自由旋转，以便通过非辐射跃迁回落至电子激发态的松弛态(激发态S1)(能量略低于最高激发态S2)，实质是溶剂化效应以稳定激发态分子的存在。分子的这种旋转受制于环境粘度，伴随这种旋转的是分子荧光强度和荧光寿命的衰减。但单光子荧光激发波长一般在350-560nm，易产生光致毒与光漂白；而双光子荧光采用800-1100nm的高强度激光作为激发光源，不仅能克服单光子荧光的缺点，还能实现深层暗场成像与定点激发，避免组织自发荧光干扰以及降低组织吸光系数，从而显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与分辨率。
但是目前已报道的双光子溶剂生色探针较单光子的要少得多，其中能用于生物成像的不多。此外，溶剂生色范围窄和双光子吸收截面(δTPA)均比较小。
现有报道的检测细胞粘度的双光子荧光探针，如CN201610927295.6(专利1)一种线粒体双光子荧光粘度探针及其制备方法，公开了该探针的结构式，以及其识别线粒体粘度变化、跟踪线粒体在活细胞中的变化的应用，该探针是以乙烯基吡啶硝酸盐衍生物为母体，侧重于监测线粒体的粘度变化，从线粒体的形态变化进一步为爱茨海默病等相关疾病诊断和治疗提供辅助，但该专利探针属于吡啶盐，专利未给出荧光量子产率，一般这类盐荧光量子产率极低，其检测的灵敏度与准确度大打折扣，成像清晰度与分辨率也极大地受影响，并非理想的粘度探针(见文献Feng X J,Wu P L,Bolze F,等.[J].Organic Letters,2010,12(10):2194-7.)；CN201710175952.0(专利2)一种细胞粘度荧光探针及其制备和应用，公开了该探针的结构式和制备方法，以及在溶液和细胞中对粘度进行传感检测的应用，该探针是以环戊酮和4-二甲氨基苯丙烯醛为原料，反应后重结晶得到，应用方面是利用染料的上转换成像性质，实现对细胞或组织中粘度的检测，但是该探针是个体积相当大的刚性分子，不利于细胞膜的穿透；且探针分子中不含水溶性基团，因此不溶于水，另外探针的生色范围未知，从探针结构可判断其溶剂生色范围比较窄，故而细胞成像结果不够清晰和理想。CN201310160611.8(专利3)一种萘酰亚胺荧光染料及其制备和应用，公开了该染料的结构式和制备方法，以及在检测环境和细胞内粘度变化的应用，该染料主体为萘酰亚胺，利用PET机理(光致电子转移)设计合成，通过对细胞进行药物刺激，达到检测细胞内粘度变化目的，但是该探针同样分子体积较大，不利于细胞膜的穿透，且分子(目标化合物Ⅴ)不含水溶性基团(分子量大的芳叔胺不溶于水)，不能与细胞兼容，因此细胞成像的清晰度、灵敏度不够理想。
另外，从现有文献可知萘酰亚胺为母体的双光子染料或探针，其双光子吸收截面和溶剂生色范围相当小。例如文献[Y.Dai,B.-K.Lv,X.-F.Zhang,Y.Xiao,ChineseChemical Letters,2014,25:1001–1005]报道的以萘酰亚胺为母体的线粒体定位双光子荧光探针(PAHPN)，即便在非极性溶剂甲苯中，Φδ(Φ为荧光量子产率，δ为双光子吸收截面)才90GM，此时的Φ＝0.96，则δ＝94GM；要是在极性溶剂DMSO或水中，其双光子吸收截面要远远小于94GM，因为极性越大，双光子吸收截面越小。又如文献[Y.Dai,B.-K.Lv,X.-F.Zhang,Y.Xiao,Chinese Chemical Letters,2014,25:1001–1005]报道的相类似的以萘酰亚胺为母体的线粒体定位双光子荧光探针(PAHPN)，在甲苯、THF、乙酸乙酯、丙酮与乙腈中的发射波长分别为500、505、506、517和523nm，在非极性溶剂甲苯和强极性溶剂乙腈中的发射波长仅相差23nm，这即为溶剂生色范围；在乙腈中的吸收与发射波长分别为446和523nm，斯托克斯位移为77nm。
因此，研究出适合于活细胞内粘度大小检测，实现对细胞粘度的监测并进一步辅助相应疾病和病理的研究，是本领域人员需要不断去探索和创造的内容。而本发明研究人员此前在对双光子荧光探针的研究过程中，针对细胞内汞离子、锌离子、银离子的检测，细胞内糖链抗原的活性检测以及温度传感检测等方面进行了研究，但基于双氰基二苯代乙烯的用于细胞粘度变化监测的发明未见报道。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种适用于细胞内粘度检测与成像用的双光子荧光溶剂生色水溶性探针，该探针基于双氰基二苯代乙烯(DCS)为双光子荧光母体，具有分子体积小、水溶性良好、溶剂生色范围宽、双光子吸收截面(δTPA)大、能避免入射光对发射荧光的干扰的优点，使探针在细胞粘度检测过程中灵敏度高、准确度高、性能良好，具有良好的成像清晰度与横纵向分辨率。
具体来说，本发明提供了如下的技术方案：
一种双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP，具有以下分子结构：
所述的双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP的合成路线如下所示：
所述探针VP的合成方法包括以下步骤：
(1)中间体9的合成：将中间体8置于圆底单口烧瓶中，再加入THF和NaH，抽真空充氩气保护，于冰水浴下边搅拌边滴加中间体5即1,4-二氰基-2-甲基-5-(二乙基磷酰基甲基)苯的THF溶液；滴加完后再于冰水浴下反应1-2h，撤去冰水浴于室温下反应12-15h，并于室温下继续反应一夜；旋干，用10mlCH2Cl2洗提3-4次，然后用10ml的H2O洗涤2-3次，加无水Na2SO4干燥，过滤、旋干、烘干待用；
(2)目标化合物VP的合成：步骤(1)获得的中间体9的粗品和10％的Na2CO3，加入10ml乙醇中，在50-60℃下搅拌反应1.5-2.5h，反应完毕后加入1mol·L-1盐酸5mL，15-20ml乙酸乙酯萃取3-4次，无水硫酸钠干燥，过滤，真空脱去溶剂，粗品柱色谱分离，先用V(丙酮):V(二氯甲烷)＝2:3洗脱，分离完成后丙酮重结晶，即得黄色粉末VP。
其中，所述步骤(1)中，中间体8、THF、NaH的摩尔体积比为中间体8：THF：NaH＝1.7mmol:1ml:1.8mmol，中间体8、中间体5和THF的摩尔体积比为中间体8：中间体5：THF＝5mmol:5mmol:9ml。
其中，所述步骤(2)中，中间体9和碳酸钠的质量体积比为中间体9：碳酸钠＝80:1。
如前所述的双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP，应用于细胞内粘度的测定、细胞粘度变化监测。
所述的细胞为成纤维细胞。
所述的双光子荧光溶剂生色水溶性探针，其应用方法是：将VP溶于生理盐水中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，在培养小鼠成纤维细胞后的培养基中加入1μmol·L-1荧光探针分子VP，并在30-40℃、含2-10％CO2的细胞培养箱中孵育0.5-2h，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3-4次，洗去多余的VP，然后用共聚焦激光扫描显微镜(λex＝800nm,～1.5W)将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞内粘度区域分布和粘度高低信息，实现对细胞粘度的检测和变化情况监测。
本发明以双氰基二苯代乙烯(DCS)为双光子荧光母体，通过特定的合成方法获得能快速、简便、灵敏的用于细胞粘度检测与成像的双光子荧光溶剂生色水溶性探针(VP)。该探针分子对生理pH变化不敏感，响应时间极短，检测灵敏度较高，细胞渗透性良好，双光子吸收截面大且对荧光的干扰低，对细胞的毒副作用小，使得该探针作为测定活细胞或组织内粘度变化的试剂是极其有用的。本发明的探针具有如下特点：
1、本发明双光子荧光溶剂生色水溶性探针显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与横纵向分辨率，荧光量子产率高，双光子吸收截面大，分子体积小，并且化学/光稳定性好；
2、该探针不仅分子体积小，而且含有两个水溶性羟基，在水中溶解度高，因此能顺利穿透细胞膜，能与细胞环境兼容，非常适合用于生物细胞检测与成像；探针VP在各种溶剂中的荧光谱随溶剂极性的增加而发生显著的红移，具有宽的溶剂生色范围(453(环己烷)和629nm(DMSO)，176nm)，大大提高检测灵敏度；δTPA随溶剂极性的增加而显著降低，具有大的双光子吸收截面(1350(环己烷)和1580GM(DMSO))，提高成像清晰度、灵敏度与横纵向分辨率；并且具有超大斯托克斯位移(268nm)(λabs＝361nm,λem＝629nm,DMSO)，避免入射光对发射荧光的干扰，提高检测的准确度。
3、荧光量子产率(Φ)在极性溶剂中也显著降低，表明探针VP的溶剂生色效应好，能用于溶剂极性的检测；
4、探针VP的荧光强度随粘度的增加而显著增大，成纤维细胞的双光子成像照片显示在细胞中不同粘度区域有良好的显色效果，表明本发明探针具有检测效果明显、细胞粘度变化监测灵敏度高等优点，在生物、医药领域具有极大的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明的探针VP在水中的单光子荧光强度与其浓度的关系图(λex＝410nm)；
图2是本发明的探针VP在各种溶剂(从左至右：C-hexane,toluene,benzene,dioxane,CHCl3,THF,acetone,MeCN,DMF,DMSO)中的归一化单光子发射谱；
图3是本发明的探针VP(c＝1μmol·L-1,λex＝365nm)在不同溶剂中的荧光照片；
图4是本发明的探针VP(c＝10μmol·L-1)的发射最大与各种溶剂参数间的线性关联图；
图5是本发明的探针VP(c＝1μmol·L-1)在各种粘度中的单光子发射谱(λex＝410nm，1cp＝1mPa.s)；
图6是本发明的探针VP(c＝1μmol·L-1)在各种粘度中的双光子发射谱(λex＝790nm，1cp＝1mPa.s)；
图7是本发明的探针VP(c＝1μmol·L-1)的单光子荧光强度对粘度的线性拟合图(λex＝410nm，1cp＝1mPa.s)；
图8是本发明的探针VP(c＝10μmol·L-1)在不同溶剂中的双光子吸收截面与激发波长的关系图；
图9是本发明的探针VP(1μmol·L-1)标记的小鼠成纤维细胞的双光子成像照片((a)空白图像；(b)SP标记的双光子显微照片)。
具体实施方式
为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1分子结构及合成路线
一种双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP，具有下列分子结构：
合成路线为：
其中，中间体2、3、4、5、7、8均根据以下文献合成：
[1]H.Huang,Q.He,H.Lin,F.Bai,Z.Sun and Q.Li,Polym.Adv.Technol.,2004,15():84—88
[2]Huang C.,Fan J.,Peng X.,Lin Z.,Guo B.,Ren A.,Cui J.,Sun S.,J.Photochem.Photobio.A:Chem.,2008,199(2–3):144—149
[3]Moon K.-J.,Shim H.-K.,Macromolecules,1996,29:861
实施例2中间体9和目标化合物VP的合成
合成方法：(1)将中间体8(1.49g,5.1mmol)置于25mL圆底单口烧瓶中，再加入3mLTHF和NaH(130mg，5.4mmol)，抽真空充氩气保护，于冰水浴下边搅拌边滴加1,4-二氰基-2-甲基-5-(二乙基磷酰基甲基)苯(5)(1.46g，5.0mmol)的THF(9mL)溶液。滴加完后再于冰水浴下反应1h，撤去冰水浴于室温下反应12h。并于室温下继续反应一夜。旋干，用CH2Cl2(4×10mL)洗提，CH2Cl2洗提液用H2O(2×10mL)洗涤后加无水Na2SO4干燥，过滤旋干并烘箱烘干为下一步备用；
(2)中间体9(400mg)的粗品和Na2CO3(5mL，10％)于乙醇(10mL)中在50℃下搅拌反应2h，反应完毕后加入5mL盐酸(1mol·L-1)，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，真空脱去溶剂，粗品粗品柱色谱分离(先用V(丙酮):V(二氯甲烷)＝2:3洗脱)，丙酮重结晶得黄色粉末，产率96％，熔点136–138℃。
1H NMR(CD3C＝OCD3,400MHz)δ:8.290(s,1H),7.804(s,1H),7.545(d,J＝16.4Hz,1H),7.495(d,J＝8.4Hz,2H),7.127(d,J＝16.4Hz,1H),6.816(d,J＝8.8Hz,2H),3.773(t,J1＝6.0Hz,J2＝5.6Hz,4H),3.628(t,J1＝5.6Hz,J2＝6.0Hz,4H),3.038(s,2H),2.552(s,3H)。13C NMR(CD3C＝OCD3,400MHz)δ:149.548,139.961,139.232,135.588,134.510,128.954,128.886,123.648,117.446,116.900,116.733,116.300,113.469,112.171,59.521,54.306,19.024.MS(EI)m/z(％)(HRMS calcd for C21H21N3O2 347.1634,found347.1631)。
实施例3探针VP的水溶性研究
为了研究探针VP在水中的溶解性，设计了如附图1所示的实验。由附图1可知，当VP的浓度从0逐渐增加到6000μmol L-1，其溶液的单光子荧光强度亦逐渐增大，且与浓度成正比例；当浓度再进一步增大时，单光子荧光强度增加得很缓慢，由VP的浓度与单光子荧光强度构成的数据点背离了原来的直线，均落在原来直线的下方。由于荧光物质的荧光强度与其浓度呈正比例的，可以断定当VP的浓度大于6000μmol L-1时，VP未能完全溶解，否则数据点不会背离原来的直线。由此可见，VP在水中的溶解度为6000μmol L-1，此时相当于1升水中溶解2.082克VP。足见VP的溶解度比较大，用于生物细胞检测与成像绰绰有余。
实施例4探针VP在极性溶剂中的荧光显色研究
结合附图2和3，探针VP在各种溶剂(环己烷，甲苯，苯，二噁烷，THF，CHCl3，丙酮，DMF，DMSO和MeCN)中的荧光谱随溶剂极性的增加而发生显著的红移。探针VP的发射最大波长(λEM)从453nm(环己烷)红移至629nm(DMSO)，亦即探针VP的荧光颜色随溶剂极性的增大而逐渐由蓝色(环己烷)转变为橙红色(DMSO)。因此可以根据探针VP的荧光颜色确定溶剂种类。
结合附图4，通过对发射最大波长(λEM)(波数)同溶剂参数，例如ET(30)、Kosower参数(Z)、溶剂活化吉布斯自由能(δΔG≠)、溶剂偶极/极化率指数(π*)和Lippert-Mataga极性参数(Δf)之间的线性拟合，可以获得优良的线性相关性(r2＝0.91、0.91、0.91、0.81、0.85)。这进一步验证了探针VP的溶剂生色效应，能用于溶剂极性的检测。
结合附图9，VP的吸收截面δTPA随溶剂极性的增加而显著降低(1350GM(环己烷)和130GM(DMF))。这归因于光反应的缺失率(Φ)在极性溶剂中也显著降低(0.982(dioxane)和0.016(MeCN))。说明若溶液粘度极低则不发荧光，粘度越大，荧光越强。相应地，用于细胞成像，细胞中粘度大的地方，荧光则强；粘度小，荧光弱甚至看不到荧光。显示出荧光开关特性。
实施例5探针VP在各种粘度中的单、双光子荧光显色研究
结合附图5-7，探针VP的荧光强度随粘度的增加而显著增大。将荧光强度与粘度进行双对数线性拟合，如附图7中的直线所示。相关系数为R2＝0.9958，显示较好的线性相关，函数表达式：
LogIF＝0.2446Logη+1.5434
实施例6细胞粘度检测
小鼠成纤维细胞的培养：
根据文献[黄池宝，陈华仕，曾伯平，陈晓远.分析化学，2015，43(4),507—511]的培养方法进行成纤维细胞的培养。
将10％FBS、青霉素(100units/mL)和链霉素(100μg/mL)补加到细胞培养基DMEM(HyClone，Dulbecco's Modified Eagle's Medium，达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基)中并混合均匀，于此溶液中培养小鼠成纤维细胞。成像前两天进行细胞筛选处理。为了标记，先除去培养介质，再换上不含FBS的DMEM介质。
细胞显微成像：
对于双光子体外成像，使用一个激光共聚焦显微镜(Zeiss 510LSM META)，配有飞秒脉冲钛蓝宝石激光器(Mira 900-F,Coherent)，激发光光源为飞秒脉冲激光，激光波长可调范围为700～980nm(λex＝800nm,～1.5W)，配有二色分光镜(HFT 650，Carl Zeiss,Inc.)的显微镜将射入的激光通过一个油浸物镜(NA 1.4)共聚焦于细胞上。激光条码扫描器(LSM510META NLO)采集数据窗口宽度在630nm处是10.7cm，600-650nm的旁路过滤用于收集样品的发射光。双光子激发波长为790nm，收集600～650nm通道的荧光。
将VP溶于生理盐水中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，用此溶液孵化小鼠成纤维细胞，取出细胞并用缓冲溶液洗去多余的VP，在显微镜下能够看到均匀的橙红色荧光。
图9a)是白光下的成纤维细胞照片；图9b)是在成纤维细胞培养基中加入1μmol·L-1荧光探针分子VP并在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育30min，然后用PBS洗3次，并于无色血清游离介质中再孵化15min后成像照片。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，20倍目镜。
探针VP在MeCN中的荧光量子产率(Φ＝0.016)相当小，在水中就更小了，甚至看不到荧光；但在细胞中却发出强烈的荧光，显示出荧光关-开(水-细胞)特性。这与细胞粘度较大密切相关，粘度大的区域亮度较高，VP能够检测活细胞中的粘度大小且无细胞毒性。

Claims (8)

1.一种双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP，其特征在于：所述双光子荧光溶剂生色水溶性探针具有以下分子结构：
。
2.一种如权利要求1所述的双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP的合成方法，其特征在于：合成路线如下所示：
。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)中间体9的合成：将中间体8置于圆底单口烧瓶中，再加入THF和NaH，抽真空充氩气保护，于冰水浴下边搅拌边滴加中间体5即1,4-二氰基-2- 甲基-5-(二乙基磷酰基甲基)苯的THF溶液；滴加完后再于冰水浴下反应1-2h，撤去冰水浴于室温下反应12-15h，并于室温下继续反应一夜；旋干，用10mlCH2Cl2洗提3-4次，然后用10ml的H2O洗涤2-3次，加无水Na2SO4干燥，过滤、旋干、烘干待用；
(2)目标化合物VP的合成：步骤(1)获得的中间体9的粗品和10％的Na2CO3，加入10ml乙醇中，在50-60℃下搅拌反应1.5-2.5h，反应完毕后加入1mol·L-1盐酸5mL，15-20ml乙酸乙酯萃取3-4次，无水硫酸钠干燥，过滤，真空脱去溶剂，粗品柱色谱分离，先用V(丙酮):V(二氯甲烷)＝2:3洗脱，分离完成后丙酮重结晶，即得黄色粉末VP。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中，中间体8、THF、NaH的摩尔体积比为中间体8：THF：NaH＝1.7mmol:1ml:1.8mmol，中间体8、中间体5和THF的摩尔体积比为中间体8：中间体5：THF＝5mmol:5mmol:9ml。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述步骤(2)中，中间体9和碳酸钠的质量体积比为中间体9：碳酸钠＝80:1。
6.根据权利要求1所述的双氰基二苯代乙烯型双光子荧光溶剂生色水溶性探针VP或如权利要求2-5所述的合成方法得到的探针VP应用于细胞内粘度的测定、细胞粘度变化监测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的细胞为成纤维细胞。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的双光子荧光溶剂生色水溶性探针，其应用方法是：将VP溶于生理盐水中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，在培养小鼠成纤维细胞后的培养基中加入1μmol·L-1荧光探针分子VP，并在30-40℃、含2-10％CO2的细胞培养箱中孵育0.5-2h，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3-4次，洗去多余的VP，然后用共聚焦激光扫描显微镜(λex＝800nm,～1.5W)将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞内粘度区域分布和粘度高低信息，实现对细胞粘度的检测和变化情况监测。
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